Podstawowa opieka i utrzymanie piskląt kurzych

Zarodki kurcząt stanowią doskonały model do badania wczesnego rozwoju kręgowców, częściowo dlatego, że ich utrzymanie jest łatwe i niedrogie. W przeciwieństwie do większości organizmów modelowych, które są hodowane w laboratorium, zapłodnione jaja kurze nabywa się od zewnętrznego dostawcy. Ponadto utrzymanie i praca z jajami wymaga niewielkiej ilości specjalistycznego sprzętu. Niniejszy film zapewni ogólne informacje na temat pozyskiwania i utrzymywania jaj kurzych, technik niezbędnych do pracy z rozwijającymi się zarodkami oraz praktycznych zastosowań tych metod.

Zanim omówimy pracę z kurczętami w laboratorium, przyjrzyjmy się temu, jak kury opiekują się swoimi jajami w naturze. Chociaż jaja są już zapłodnione w momencie zniesienia, rozwój zarodka zatrzymuje się, gdy jaja są narażone na niższe temperatury zewnętrzne. Po zniesieniu około 12 jaj kura siada na gnieździe, aby wznowić rozwój embrionu. Podczas inkubacji kura obraca jaja, aby ogrzać je równomiernie i zapobiec przywieraniu zarodka do skorupki. Jeśli wszystko pójdzie pomyślnie, 21 dni później matka ma już cały lęg kurcząt.

Zatem w jaki sposób naukowcy gromadzą wystarczającą liczbę jaj do swoich eksperymentów? Cóż... mogłoby to zająć sporo czasu. Ponieważ kury są powszechnie udomowione, zapłodnione jaja można łatwo pozyskać z wylęgarni lub fermy hodowlanej. Można nawet zamawiać jaja na konkretnych etapach rozwoju.

Po dostarczeniu jaj do laboratorium można je przechowywać w temperaturze 13 - 16 °C do 5 dni. Gdy nadejdzie czas ich rozwoju, należy pozwolić jajom ogrzać się do temperatury pokojowej, a następnie przenieść je do inkubatora kołyszącego w temperaturze 37 °C i wilgotności 60% aż do osiągnięcia pożądanego stadium.

Większość eksperymentów przeprowadzanych na pisklętach wymaga kilku kroków przygotowawczych, takich jak sprawdzenie, czy otrzymane jaja były w ogóle zapłodnione. Prostym sposobem jest użycie jasnego źródła światła lub inkubatora do prześwietlania jaj (kandlera). Dzięki tej technice, znanej jako świecenie jaj, można zwizualizować struktury wewnętrzne, takie jak naczynia krwionośne, aby potwierdzić obecność zarodka.

Pozostawienie jaja w nienaruszonym stanie zwiększa przeżywalność pisklęcia, jednak skorupa uniemożliwia dostęp do zarodka. Aby rozwiązać ten problem, badacze stosują technikę zwaną wycinaniem okienka.

Należy rozpocząć od ułożenia jaj na boku i zaznaczenia góry, aby zidentyfikować stronę, ku której uniesie się zarodek. Aby zapobiec uszkodzeniu żółtka podczas wycinania okienka, usuwa się niewielką ilość albuminy (białka jaja), aby obniżyć zarodek i oddalić go od skorupy. W tym celu należy najpierw wysterylizować skorupę, przecierając ją 70% etanolem. Po wyschnięciu skorupy, na tępy koniec jaja nakleja się kawałek taśmy. Następnie za pomocą sterylnej igły należy przebić taśmę i skorupę. Igłę wprowadza się w dół, aby uniknąć uszkodzenia żółtka, i odsysa 5 ml albuminy. Na koniec, aby zapobiec wyciekaniu albuminy, otwór należy zabezpieczyć kolejnym kawałkiem taśmy.

Aby wyciąć otwór w skorupie, na obszarze planowanego okienka należy nakleić kawałek taśmy. Za pomocą nożyczek wykonuje się niewielki otwór w skorupie, a następnie wycina się okrągłe okienko. Podczas tego procesu taśma zapobiega wpadaniu fragmentów skorupy na zarodek.

Nawet po wykonaniu okienka zarodki we wczesnych stadiach rozwoju mogą być trudne do wizualizacji ze względu na mały rozmiar i przezroczystość. W celu poprawy kontrastu między zarodkiem a żółtkiem można zastosować rozcieńczony, nietoksyczny tusz indyjski. Tusz wstrzykuje się do żółtka pod zarodkiem i pozwala mu dyfundować. Dzięki temu zarodek jest widoczny z większym kontrastem na ciemnym tle. Po manipulacjach eksperymentalnych okienko należy ponownie zabezpieczyć taśmą, a jajo umieścić z powrotem w inkubatorze.

Po zapoznaniu się z podstawowymi technikami pracy z jajami, zobaczmy, w jaki sposób metody te są wykorzystywane do przeprowadzania eksperymentów na embrionach kurczęt.

Na początek, metodę prześwietlania (kandlowania) można wykorzystać do zidentyfikowania położenia struktur embrionalnych w nienaruszonych jajach. Na przykład błony pozazarodkowe embrionu kurczęcia są powszechnie stosowane do namnażania wirusów. Aby zainfekować błonę, przeprowadza się prześwietlanie w celu zlokalizowania granicy między jamą alantoidalną a komorą powietrzną, co pozwala na wstrzyknięcie wirusa bezpośrednio do jamy alantoidalnej bez uszkodzenia embrionu. Po kilku dniach inkubacji z płynu alantoidalnego można zebrać dużą liczbę cząstek wirusowych.

Wycinanie okienka w skorupie jaja jest niezwykle użyteczną praktyką, ponieważ umożliwia dostęp do embrionu w celu przeprowadzenia eksperymentów. Wiele doświadczeń rozpoczyna się od wprowadzenia DNA do określonych tkanek za pomocą mikroiniekcji. Następnie wokół badanej tkanki umieszcza się elektrody i przykłada pole elektryczne, aby tymczasowo zwiększyć przepuszczalność błony komórkowej i wprowadzić kwasy nukleinowe do wnętrza komórki.

Podczas przeprowadzania eksperymentów na wczesnych embrionach, wstrzykiwanie tuszu chińskiego jest szczególnie przydatne do wizualizacji przezroczystych tkanek. Zwiększony kontrast pozwala badaczom na mikroiniekcję roztworu DNA do precyzyjnie określonych obszarów tkanki. Ostatecznie technika ta pozwala na uzyskanie pojedynczo znakowanych komórek, które można monitorować w czasie, aby śledzić podziały komórkowe.

Właśnie obejrzeli Państwo materiał wideo JoVE na temat hodowli piskląt. Niniejsza prezentacja omówiła podstawy obchodzenia się z jajami kurzymi i ich inkubacji, powszechne techniki pracy z pisklętami oraz przykłady zastosowania tych metod w badaniach biologicznych. Dziękujemy za uwagę!