Analiza fosfopeptydowa plemników najądrzy gryzoni

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ilościowe określenie zmian peptydu fosfo, które zachodzą w plemnikach podczas dojrzewania plemników. Osiąga się to poprzez usunięcie najądrza rozpieszczonego z myszy, wykonanie wstecznego płukania plemników i zebranie komórek do mikrorurki kapilarnej. Następnie plemniki są wypływać do zbilansowanego roztworu soli, który umożliwia usunięcie zanieczyszczających białek, a następnie są myte, kłamane i wytrącane w celu usunięcia zanieczyszczających soli i tłuszczów.

Białka gruczołowe są trawione za pomocą trypsyny, a następnie wzbogacane dwutlenkiem tytanu w celu wzbogacenia w peptydy fosfo. Wyniki pokazują ilościowe zmiany w statusie fosforylacji białek na podstawie chromatografii cieczowej, analizy spektrometrii mas. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu, takie jak zmiany fosfoproteomiczne podczas przechodzenia plemników przez EPI lub podczas kapacytacji.

Chociaż metoda ta zapewniła wgląd w biologię plemników, można ją również zastosować do organizmów modelowych, badań nad chorobami, takimi jak rak, patologie neurologiczne i ogólne szlaki transdukcji sygnału. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ trudno jest określić anatomię obszarów, w których będą manipulowane EPI. Zacznij od przygotowania 200 mililitrów roztworu roboczego łodygi Biggers, Whitten and Whitten lub BWW, dodając następujące ilości do jednego litra wody Milli Q, aby uzyskać kaniulę.

Stosowanie rurek polietylenowych o średnicy wewnętrznej i zewnętrznej odpowiednio 0,4 milimetra i 1,1 milimetra. Trzymaj go na małym ogniu, aż rurka zacznie się topić. Natychmiast pociągnij końce rurki na zewnątrz, aby ją rozciągnąć, zmniejszając w ten sposób średnicę zewnętrzną.

Przetnij rurkę, aby uzyskać zwężenie jednego końca, co pozwoli na łatwiejszą kaniulację S deens. Przytnij przeciwległy koniec na około 15 centymetrów. Następnie włóż igłę o rozmiarze 30 do końca i przymocuj do niej całkowicie schowaną trzymililitrową strzykawkę.

Wykonaj ustnik ssący, przecinając rurkę PE o długości 20 centymetrów i włóż ją do jednego końca kaniuli. Włóż uchwyt szklanej rurki mikrokapilarnej i szklaną mikrokapilę. Po eutanazji myszy zgodnie z protokołem tekstowym wykonaj małe nacięcie w mosznie, aby odsłonić epi.

Następnie użyj pary zegarmistrzów. Numer pięć kleszczy do wyciągania jądra i najądrza z jamy. Wytnij, aby usunąć wszystko, z wyjątkiem około jednego do dwóch centymetrów ogromnego szacunku od najądrza kata.

Następnie wytnij, aby usunąć proksymalne przewody laryngologiczne i tkankę łączącą najądrze z jądrem i usuń cały męski tor rozrodczy pod mikroskopem preparacyjnym przy użyciu powiększenia od pięciu do 40 razy. Umieść jeden do dwóch centymetrów zwężonego końca kaniuli w polu widzenia i za pomocą taśmy zabezpiecz ją kleszczami zegarmistrzowskimi numer pięć. Delikatnie zapnij każdą stronę ogromnego szacunku i przeciągnij go po widocznej części kaniuli.

Następnie za pomocą niewchłanialnego czarnego plecionego jedwabiu zawiąż bezpieczny węzeł wokół kaniulowanej tkanki za pomocą zegarmistrzów. Kleszcze numer pięć. Chwyć dystalny koniec kata epi ides i usuń osłonkę Eugenii.

Aby odsłonić pojedynczy kanalik naskórkowy, delikatnie odsłoń kanalik i rozsuń go, aby stworzyć otwór, przez który plemniki mają zostać uwolnione. Następnie delikatnie wciśnij tłok strzykawki, aby wypuścić powietrze do rozległego miejsca. Ciśnienie spowoduje, że plemniki wyjdą z przerwanego kanalika.

Następnie zastosuj ssanie do ustnika, aby wciągnąć plemniki do szklanej kapilary. Delikatnie dmuchnąć w ustnik lub założyć strzykawkę i wydalić plemniki ze szklanej kapilary do jednego mililitra przedwojennego roztworu B WW. I użyj roztworu do trzykrotnego przemycia komórek, aby usunąć wszelkie zanieczyszczające białka.

Po usunięciu ostatniego płukania zamroź plemniki do późniejszego wykorzystania lub użyj 4% chaps, dwóch molowych tiomocznika i 50 milimolowych tris pH 7,4, aby rozpuścić białka inkubować przez godzinę z przerywanym wirowaniem. Następnie odwirować roztwór o stężeniu 10 000 GS przez 20 minut i przenieść supernatant do nowej probówki w celu redukcji wiązań dwusiarczkowych i alkilowania białek w DTT przy końcowym stężeniu 10 milimolów do roztworu białka. Wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie dodaj 50 milimolów octamidu IO do wiru lizatu i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Aby wytrącić białka, połącz jedną objętość lizatu, jedną objętość metanolu i 0,5 objętości chloroformu. Po wirowaniu próbki obracaj ją z prędkością 10 000 G przez dwie minuty, zbierz górną warstwę, pozostawiając około dwóch milimetrów, aby uniknąć zasysania interfejsu.

Po dodaniu jednej objętości metanolu delikatnie odwróć rurkę i ponownie odwiruj. Wyrzuć supernatant i wysusz osad na powietrzu przez trzy do czterech minut, aby przeprowadzić trypsynę, trawienie i wzbogacenie peptydów fosfo. Zacznij od użycia 25-milimolowego wodorowęglanu amonu zawierającego jeden molowy mocznik.

Aby rozpuścić trypsynę, należy połączyć F 50 do jednego stosunku wagowego białka do trypsyny i inkubować w mieszalniku termicznym w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 700 obr./min przez noc. Po odwirowaniu w celu osadzenia niestrawionego materiału, przenieść supernatant do nowej probówki. Używając buforu DHB przygotowanego zgodnie z protokołem tekstowym, rozcieńczyć próbne peptydy dziesięciokrotnie i nałożyć go na 200 mikrogramów suchych kulek dwutlenku tytanu inkubować na rotatorze przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po inkubacji, użyć buforu DHB, aby ponownie przepłukać próbkę przed użyciem buforu płuczącego składającego się z 80% A CN i 2% TFA, aby przemyć próbkę trzy razy po końcowym odwirowaniu wymyć peptydy fosfo przez dodanie 2,5% wodorotlenku amonu natychmiast po odwirowaniu i zebraniu supernatantu.

Użyj 0,3 mikrolitra kwasu mrówkowego do zakwaszenia próbki, jak pokazano tutaj. Jedną z zalet tego protokołu jest to, że plemniki są izolowane. W stanie spoczynku wiele komórek zlepia się tuż po wydaleniu do pożywki B WW.

Jednak po 10 minutach stają się modalne, a roztwór staje się jednorodny. Preparat opisany w tym filmie typowo wytwarza 200 razy 10 do sześciu zoa. Rysunek ten pokazuje czystość plemników z AR szczura Cota epididymus.

Jednym z głównych problemów związanych z przygotowaniem próbek jest wydajność z wycieczek i trawienia. W przeciwieństwie do wytrącania TCA, które często wymaga dostosowania pH próbki, wytrącanie chloroformu fenolowego jest szybkie i nie zakwasza pokazanej tutaj próbki to osad białka zwykle widoczny ze 100 mikrogramów próbki między dolną i górną granicą fazy. Oto powtarzalność tego protokołu.

Niebieskie smugi pojawiające się z czasem to peptydy nawiązujące do nanokolumny C 18. Wraz ze wzrostem stężenia acetonitrylu w populacji modalnej pojawia się klaster peptydowy o stężeniu około 651,5 daltonów, który jest całkowicie nieobecny w zakresie pozazakresowym. Kiedyś protokół wzbogacania peptydów fosforanowych jest skuteczną techniką.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że przygotowanie próbki jest kluczowym aspektem uzyskania powtarzalnych wyników dla proteomiki. Metodę tę można dostosować do izolowania glikoprotein, które można wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, które białka ulegają zmianie zawartości kwasu sic w ich proteomie.