Name: Dynamika Aip1p jest zmieniona przez mutację R256H w aktynie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj dynamikę białka Aip1p w drożdżach z mutacją R256H w aktynie przy użyciu mikroskopii TIRF. Ta metoda pozwala wizualizować ruch białek wiążących aktynę i badać wpływ mutacji na dynamikę cytoszkieletu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Peterowi Rubensteinowi za użyteczne dyskusje i porady techniczne oraz Davidowi Pellmanowi za oryginalny klon PB1996. Praca ta została wsparta grantem z March of Dimes oraz funduszem z Ride for the Kids.

1. Klonowanie do plazmidu PB1996
<ol>
	<li>Zaprojektuj i zamów startery DNA z firmy produkującej oligonukleotydy, które otaczają sekwencję docelową i zawierają unikalne miejsca restrykcyjne w wybranym plazmidzie macierzystym. UWAGA: W tym przypadku startery zostały zaprojektowane do amplifikacji 400 par zasad na końcu 5' sekwencji Aip1. Miejsce restrykcyjne XhoI zostało włączone do startera około 20 pz przed sekwencją Aip1, a XmaI zostało włączone około 20 pz po docelowej sekwencji Aip1. Plazmid użyty do klonowania to PB1996, który zawiera znacznik 3XGFP do fluorescencji, gen URA do selekcji szczepów drożdży i gen oporności na ampicylinę do selekcji bakterii.</li>
	<li>Oczyść genomowe DNA z haploidalnego szczepu Ura-drożdży. Uwaga: Patrz rysunek 1, aby zapoznać się ze schematem procesu klonowania.</li>
	<li>Przeprowadź standardową reakcję PCR przy użyciu dwóch starterów i genomowego DNA drożdży w celu amplifikacji genu Aip1p z miejscami restrykcyjnymi na obu końcach. Produkt PCR i plazmid PB1996 należy roztrawić enzymami restrykcyjnymi w oddzielnych reakcjach zgodnie z protokołami zalecanymi przez producenta. W tym przypadku XmaI i XhoI stosowano wraz z towarzyszącym buforem w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Uruchom 0,8% żel do elektroforezy agarozowej, aby oddzielić strawione fragmenty DNA. Do jednej studzienki załaduj drabinkę o niskiej masie DNA, a w oddzielnych studzienkach załaduj całą reakcję z każdego trawienia. Uruchom żel pod napięciem 100 woltów przez około 1 godzinę, aż przód barwnika znajdzie się blisko końca żelu. Wizualizuj żel pod światłem UV i oczyść segment odpowiadający segmentowi białka i ciętemu plazmidowi.</li>
	<li>Zliguj strawiony segment Aip1 i plazmid PB1996. Przekształć produkt w komórki DH5α za pomocą protokołów producenta (10 μl DNA ze 100 μl komórek przez 30 minut na lodzie, szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 2 minuty, wzrost w pożywce SOC przez 2 godziny w temperaturze 37 °C) i płytka na płytkach hodowlanych, które zawierają antybiotyk do selekcji, w tym przypadku płytki LB+Amp. Wybierz i wyhoduj jedną kolonię w płynnej kulturze. Oczyść nowo zaprojektowany plazmid.</li>
</ol>
2. Generacja zmutowanego szczepu drożdży
<ol>
	<li>Użyj haploidalnego szczepu drożdży, w którym allel aktyny został usunięty, aby zbudować zmutowany szczep drożdży. Uwaga: W tym przypadku szczep macierzysty był hojnym darem od dr Petera Rubensteina (University of Iowa), a konstrukcja została opisana przez Cooka i wsp.20 Szczep ten nie ma chromosomalnego genu aktyny i zawiera plazmid, który koduje aktynę drożdży typu dzikiego i uracyl.</li>
	<li>Użyj plazmidu pRS kodującego aktynę drożdży typu dzikiego z selekcją Trp+ jako plazmid podstawowy dla mutagenezy21.</li>
	<li>Przeprowadź mutagenezę ukierunkowaną na miejsce na plazmidzie pRS, aby zaprojektować mutację missense w aktynę.
	<ol>
		<li>W przypadku mutacji R256H w aktynie, wykonaj starter 5' ggtaacgaaagattccatgccccagaagc 3', aby zmienić Arg256 na His256. Przeprowadź standardową reakcję mutagenezy PCR z plazmidem z kroku 2.2.</li>
		<li>Przekształć zmutowany plazmid aktynowy z PCR w komórki DH5α. Wyizoluj plazmidowe DNA i zsekwencjonuj gen aktyny, aby zweryfikować mutację.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przekształć zmutowaną aktynę drożdży kodującą plazmid w haploidalny szczep drożdży z kroku 2.1.</li>
	<li>Hoduj przekształcone komórki na płytkach Trp, aby wybrać drożdże zawierające Trp + zawierające zmutowany plazmid aktyny drożdży.</li>
	<li>Wybrać komórki pozbawione oryginalnego plazmidu, który koduje aktynę i uracyl typu dzikiego (opisanego w 2.1) poprzez subhodowlę komórek z płytek Trp na płytkach zawierających kwas 5-fluoroorotyczny (5-FOA). 5-FOA jest przekształcany w formę toksyczną, 5-flurouracyl, w szczepach yeas wykazujących ekspresję funkcjonalnego genu URA3. Komórki, które rosną po stopniowej selekcji, będą zawierały tylko zmutowany plazmid aktyny.</li>
	<li>Oczyść plazmidowe DNA z nowego szczepu drożdży. Zsekwencjonuj plazmid, aby upewnić się, że zmutowany gen aktyny jest obecny. Wykorzystaj ten szczep w dalszych badaniach. Proces ten przedstawiono na rysunku 2.</li>
</ol>
3. Przekształcanie plazmidu w komórki drożdży
<ol>
	<li>Trawić plazmid Aip1p-GFP enzymem restrykcyjnym, aby umożliwić integrację z chromosomem drożdży. UWAGA: Miejsce restrykcji musi znajdować się poza blokiem sekwencji, który zawiera znacznik fluorescencyjny, gen będący przedmiotem zainteresowania i marker selekcyjny. W takim przypadku należy użyć 1 μl enzymu restrykcyjnego HpaI z 8 μl DNA i 1 μl dołączonego 10-krotnego buforu przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Hodowla komórek S. cerevisiae (od kroku 2.5), które nie są w stanie syntetyzować uracylu (szczepu Ura) przez noc w 5 ml w pożywce YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu i 2% dekstrozy) na kole w temperaturze 30 °C. Wirować 1 ml komórek przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g.</li>
	<li>Zrób mieszankę PLATE. Wykonaj 10XTE, dodając 5 ml 1 M Tris pH 7,5 i 2 ml 250 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do 43 ml ddH2O. Dodaj 0,204 g octanu litu do 20 ml 1XTE, a następnie 8 g glikolu polietylenowego (PEG) (MW ~ 3,300) i wysterylizuj filtr.</li>
	<li>Zdekantować supernatant z komórek odwirowanych w kroku 3.2 i ponownie zawiesić komórki w pozostałej cieczy. Do zawieszonych komórek dodać 2 μl 10 mg/ml DNA nosiciela jąder łososia. Dodać 10 μl strawionego plazmidowego DNA z kroku 3.1 i odwirować. Dodać 0,5 ml PLATE i odwirować. Dodać 20 μl 1 M naziemnej telewizji cyfrowej i odwirować.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę przez 6-8 godzin w temperaturze 25 °C. Szok termiczny komórek w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 10 minut. Umieścić 100 μl komórek z dna probówki mikrowirówkowej, w której osiadły, na płytce –Ura. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni lub do momentu powstania kolonii.</li>
	<li>Wybierz poszczególne kolonie i rozłóż je na płytce –Ura. UWAGA: Komórki te zawierają plazmid z genem Aip1-GFP i Ura zintegrowanym z chromosomem, umożliwiającym wzrost. Komórki te zostaną następnie wykorzystane w mikroskopii.</li>
</ol>
4. Wizualizacja ruchu białka Aip1p za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem
<ol>
	<li>Wyhodować przez noc kulturę komórek drożdży z wbudowanym Aip1p-GFP w YPD na kole w temperaturze 30 °C. Subkultura 1 ml kultury przez noc w 9 ml pożywki –Ura. Hoduj komórki przez dodatkowe 3-4 godziny na wytrząsarce w temperaturze 30 °C, aby upewnić się, że są w fazie wzrostu logarytmicznego.</li>
	<li>Dodać 3 μl komórek do szklanego szkiełka mikroskopowego i dodać szkiełko nakrywkowe. Pozwól komórkom osiąść na szkiełku przez 5 minut. Umieść suwak w wsporniku stage płyta.</li>
	<li>Obserwuj białko Aip1p-GFP za pomocą mikroskopu fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) (488 nm) przy użyciu obiektywu TIRF z zanurzeniem w oleju 100X i cyfrowej kamery CCD. Za pomocą oprogramowania SlideBook 5.0 uzyskuj obrazy przez 20 sekund z szybkością 5 klatek/s (poszczególne klatki pozyskanych obrazów przedstawiono na rysunku 2A).
	<ol>
		<li>Aby ustawić ostrość na komórkach, otwórz oprogramowanie SlideBook 5.0 i kliknij w przycisk okna ostrości na pasku narzędzi, aby uzyskać dostęp do elementów sterujących ostrością. Wybierz zakładkę Scope (Zakres) i wybierz obiektyw 100X-TIRF. Włącz lampę i przesuń lamp pasek do 15%. Zmień ustawienie Kosz na 2 x 2. Zmień filtr na jasne pole.</li>
		<li>W mikroskopie użyj pokrętła precyzyjnej ostrości, aby ustawić ostrość komórek, jak widać na ekranie komputera.</li>
		<li>Korzystając z elementów sterujących w oknie ostrości, wyłącz lampę, zmień filtr na Na żywo i kliknij przycisk TIRFM.</li>
		<li>Na iluminatorze TIRFM podłączonym do portu po prawej stronie mikroskopu ustaw emisję lasera w pozycji Wł.</li>
		<li>Wybierz kartę Strumień w oknie ostrości, zaznacz pole obok opcji Rozpocznij nagrywanie, a następnie kliknij przycisk jasnego pola.</li>
		<li>Na iluminatorze TIRFM obróć mikrometr, aby wyregulować kąt padania lasera. Służy to do optymalizacji emisji fluorescencji z ognisk Aip1-GFP i zminimalizowania fluorescencji tła z komórek i szkiełka.</li>
		<li>Po wyświetleniu żądanego obrazu naciśnij przycisk Start. Po 20 sekundach naciśnij przycisk Stop. Zapisz obrazy. Na karcie Plik na pasku menu głównego wybierz opcję Zapisz slajd jako, a następnie wprowadź lokalizację i nazwę pliku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj oprogramowania ImageJ do analizy obrazów. Użyj wtyczki makr "Manual Tracker", aby śledzić ruch i szybkość fluorescencyjnych ognisk Aip1p. Zmień parametr przedziału czasowego na 0,2 sekundy.
	<ol>
		<li>Korzystając z wyboru dodawania ścieżki, wybierz i śledź pojedyncze białko fluorescencyjne przez cztery do ośmiu ramek łączących. Użyj polecenia ścieżki końcowej, a prędkość ruchu białka między każdą klatką zostanie wyświetlona w oknie wyników.</li>
		<li>Określ średnią szybkość między każdą klatką za pomocą arkusza kalkulacyjnego Microsoft Excel. Użyj tych wartości, aby obliczyć średnią prędkość ruchu Aip1p dla każdego interesującego szczepu komórki. UWAGA: Wykres punktowy prędkości ruchu Aip1p i średniej prędkości nieliniowej pokazano na rysunku 2B.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lehtonen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+a+missense+variant+in+enteric+smooth+muscle+actin+gamma-2+with+autosomal+dominant+familial+visceral+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy.</a> Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).</li>
<li>Matsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-cardiac+actin+mutations+produce+atrial+septal+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Alpha-cardiac actin mutations produce atrial septal defects.</a> Hum Mol Genet. 17, 256-265 (2008).</li>
<li>Zhu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gamma-actin+gene+%28ACTG1%29+are+associated+with+dominant+progressive+deafness+%28DFNA20%2F26%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gamma-actin gene (ACTG1) are associated with dominant progressive deafness (DFNA20/26).</a> Am J Hum Genet. 73, 1082-1091 (2003).</li>
<li>Nowak, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+skeletal+muscle+alpha-actin+gene+in+patients+with+actin+myopathy+and+nemaline+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene in patients with actin myopathy and nemaline myopathy.</a> Nat Genet. 23, 208-212 (1999).</li>
<li>Olson, T. M., Michels, V. V., Thibodeau, S. N., Tai, Y. S., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+mutations+in+dilated+cardiomyopathy%2C+a+heritable+form+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure.</a> Science. 280, 750-752 (1998).</li>
<li>Riviere, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+mutations+in+the+actin+genes+ACTB+and+ACTG1+cause+Baraitser-Winter+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">De novo mutations in the actin genes ACTB and ACTG1 cause Baraitser-Winter syndrome.</a> Nat Genet. 44, S441-442 440-444 (2012).</li>
<li>Guo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+smooth+muscle+alpha-actin+%28ACTA2%29+lead+to+thoracic+aortic+aneurysms+and+dissections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in smooth muscle alpha-actin (ACTA2) lead to thoracic aortic aneurysms and dissections.</a> Nat Genet. 39, 1488-1493 (2007).</li>
<li>Sparrow, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+disease+caused+by+mutations+in+the+skeletal+muscle+alpha-actin+gene+%28ACTA1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Muscle disease caused by mutations in the skeletal muscle alpha-actin gene (ACTA1).</a> Neuromuscul Disord. 13, 519-531 (2003).</li>
<li>Kruth, K. A., Rubenstein, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+deafness-causing+%28DFNA20%2F26%29+actin+mutations+affect+Arp2%2F3-dependent+actin+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Two deafness-causing (DFNA20/26) actin mutations affect Arp2/3-dependent actin regulation.</a> J Biol Chem. 287, 27217-27226 (2012).</li>
<li>Amberg, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+yeast+actin+cytoskeleton+through+the+budding+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the yeast actin cytoskeleton through the budding cell cycle.</a> Mol Biol Cell. 9, 3259-3262 (1998).</li>
<li>Pelham, R. J., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+actin+polymerization+and+actin+cables+in+actin-patch+movement+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Cell Biol. 3, 235-244 (2001).</li>
<li>Vavylonis, D., Wu, J. Q., Hao, S., O'Shaughnessy, B., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+mechanism+of+the+contractile+ring+for+cytokinesis+by+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Assembly mechanism of the contractile ring for cytokinesis by fission yeast.</a> Science. 319, 97-100 (2008).</li>
<li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+ultrastructure+of+the+septin+filament+network+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional ultrastructure of the septin filament network in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 23, 423-432 (2012).</li>
<li>Senning, E. N., Marcus, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+driven+mitochondrial+transport+in+mating+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization driven mitochondrial transport in mating S. cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 107, 721-725 (2010).</li>
<li>Breitsprecher, D., Kiesewetter, A. K., Linkner, J., Faix, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+actin+assembly+by+in+vitro+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of actin assembly by in vitro TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 571, 401-415 (2009).</li>
<li>Popp, D., Narita, A., Iwasa, M., Maeda, Y., Robinson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+bundle+formation+by+the+bacterial+actin+ParM%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of bundle formation by the bacterial actin ParM.</a> Biochem Biophys Res Commun. 391, 1598-1603 (2010).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+response+to+mechanical+stimulation+studied+by+integrated+optical+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy.</a> J Vis Exp. (44), (2010).</li>
<li>Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Muller, N., Wedlich-Soldner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortex+organization+and+dynamics+in+microorganisms%2C+using+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortex organization and dynamics in microorganisms, using total internal reflection fluorescence microscopy.</a> J Vis Exp. (63), e3982(2012).</li>
<li>Manneville, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TIRF+microscopy+to+visualize+actin+and+microtubules+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of TIRF microscopy to visualize actin and microtubules in migrating cells.</a> Methods Enzymol. 406, 520-532 (2006).</li>
<li>Cook, R. K., Sheff, D. R., Rubenstein, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unusual+metabolism+of+the+yeast+actin+amino+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Unusual metabolism of the yeast actin amino terminus.</a> J Biol Chem. 266, 16825-16833 (1991).</li>
<li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probing+of+yeast+actin+subdomain+3%2F4+hydrophobic+loop+262-274.+Actin-actin+and+actin-myosin+interactions+in+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probing of yeast actin subdomain 3/4 hydrophobic loop 262-274. Actin-actin and actin-myosin interactions in actin filaments.</a> J Biol Chem. 272, 16829-16837 (1997).</li>
<li>Lin, M. C., Galletta, B. J., Sept, D., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+and+distinct+functions+for+cofilin%2C+coronin+and+Aip1+in+actin+dynamics+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Overlapping and distinct functions for cofilin, coronin and Aip1 in actin dynamics in vivo.</a> J Cell Sci. 123, 1329-1342 (2010).</li>
<li>Malloy, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thoracic+Aortic+Aneurysm+%28TAAD%29-causing+Mutation+in+Actin+Affects+Formin+Regulation+of+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Thoracic Aortic Aneurysm (TAAD)-causing Mutation in Actin Affects Formin Regulation of Polymerization.</a> J Biol Chem. 287, 28398-28408 (2012).</li>
<li>Smyth, J. W., Shaw, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+ion+channel+dynamics+at+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Visualizing ion channel dynamics at the plasma membrane.</a> Heart Rhythm. 5, S7-S11 (2008).</li>
<li>Bhattacharya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+vimentin+to+the+cell+surface+by+beta3+integrin+and+plectin+mediates+adhesion+strength%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Recruitment of vimentin to the cell surface by beta3 integrin and plectin mediates adhesion strength.</a> J Cell Sci. 122, 1390-1400 (2009).</li>
<li>Hetheridge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+FMNL3+is+a+cytoskeletal+regulator+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The formin FMNL3 is a cytoskeletal regulator of angiogenesis.</a> J Cell Sci. 125, 1420-1428 (2012).</li>
<li>Bergeron, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+effects+of+thoracic+aortic+aneurysm+and+dissection+alpha-smooth+muscle+actin+mutations+on+actin+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Allele-specific effects of thoracic aortic aneurysm and dissection alpha-smooth muscle actin mutations on actin function.</a> J Biol Chem. 286, 11356-11369 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisano tutaj skuteczną strategię wizualizacji dynamiki cytoszkieletu i jej użyteczność w badaniach nad mutacjami patogennymi. Zaawansowane metody obrazowania stworzyły nowe możliwości zrozumienia wewnątrzkomórkowego ruchu białek w pobliżu błony komórkowej. Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) jest czułą techniką do badań funkcjonalnych w żywych komórkach. TIRF wykorzystuje kątowy laser wzbudzający, który wytwarza ulotne pole z powodu różnicy współczynników załamania światła szkiełka nakry...

Aktyna jest dominującym białkiem tworzącym cytoszkielet i uczestniczy w krytycznych procesach komórkowych, takich jak podział komórek, ruch organelli, ruchliwość komórek, skurcze i sygnalizacja. W ciągu ostatniej dekady odkryto chorobotwórcze mutacje aktyny w każdej z sześciu ludzkich izoform aktyny, prowadzące do szeregu zaburzeń, od miopatii po chorobę wieńcową1-7. Procesy, w których mutacje aktyny prowadzą do choroby, są nadal wyjaśniane. Model drożdży pozostaje złotym standardem w badaniu biochemicznego wpływu mutacji na funkcję aktyny ze względu na zalety pojedynczej niezbędnej izoformy aktyny, wykonalność genetyczną oraz wysoką zachowanie sekwencji i funkcji aktyny. Badania pokazują, że poszczególne mutacje aktyny prowadzą do dysfunkcji specyficznych molekularnie z dominującymi negatywnymi skutkami8. Na przykład mutacje powodujące głuchotę w aktynie γ-niemięśniowej, które wpływają na resztę Lys-118, zmieniają regulację przez białko wiążące aktynę Arp2/39. W badaniach często stosuje się analizy in vitro interakcji białko-białko. Badania nad wpływem mutacji aktyny na biologię komórki, a w szczególności na lokalizację białka wiążącego aktynę w komórce, są ograniczone.
Badania cytoszkieletu drożdży in vivo tradycyjnie opierają się na obrazach utrwalonych komórek z odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego10. Eksperymenty te dostarczyły podstawowych danych na temat morfologii cytoszkieletu aktynowego. Od tego czasu badania objęły trójwymiarowe obrazowanie konfokalne w celu wizualizacji złożonej sieci cytoszkieletu11,12. Obrazowanie to pozwala na ilościowe określenie obfitości i względnej lokalizacji plam i włókien aktynowych. Tomografia elektronowa cienkowarstwowa została wykorzystana do zobrazowania morfologii gęstych sieci nitkowatych w stosunku do zachowanych struktur subkomórkowych13. Za pomocą tej techniki można szczegółowo zbadać zatłoczone przestrzenie komórkowe o małym przekroju. Badania obrazowe zostały rozszerzone na żywe komórki za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Gdy wybielanie zdjęć i fluorescencja tła mogą być moderowane, obrazowanie poklatkowe umożliwia badania dynamiki białek cytoszkieletu i odpowiedzi na warunki środowiskowe11,14. Niezależnie od tego, wizualizacja dynamiki filamentów aktynowych in vitro została pogłębiona dzięki wprowadzeniu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). W porównaniu z mikroskopią szerokokątną, TIRF ma tę zaletę, że zmniejsza fluorescencję tła i zwiększa kontrast do monitorowania pojedynczych włókien15,16. Dzięki tym cechom mikroskopia TIRF została zaadaptowana przez biologów komórkowych do monitorowania struktur komórkowych na błonie komórkowej17,18. Zdarzenia komórkowe, w tym zmiany w cytoszkielecie, mogą być wizualizowane w czasie rzeczywistym przy niskiej fototoksyczności, maksymalnym kontraście i minimalnym fluorescencji tła19.
Aby lepiej zrozumieć wpływ mutacji aktyny na ruch, lokalizację i obrót białek cytoszkieletu w komórce, użyto mikroskopii TIRF i znakowania białek. W niniejszym artykule opisano metody badania wpływu klinicznie istotnej mutacji aktyny na dynamikę cytoszkieletu u Saccharomyces cerevisiae. W szczególności lokalizacja i ruch białka wiążącego aktynę, Aip1p, zostały uwidocznione i określone ilościowo w komórkach wykazujących ekspresję mutacji R256H w aktynie. Techniki te uzupełniają badania biochemiczne in vitro i pozwalają na lepsze zrozumienie interakcji i funkcji białek.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>rpi</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Amresco</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Change-IT Zestaw mutagenezy skierowanej w miejsce wielu mutacji</td><td>USB Corporation</td><td>4166059</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart Buffer</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>DNA, jednoniciowe z jąder łososia</td><td>Sigma</td><td>9007-49-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA pH 7,4</td><td>Sigma</td><td>93302</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td>Ostrzeżenie! Szkodliwe działanie drażniące</td></tr><tr><td>Zestaw DNA grzybów/bakterii</td><td>Symo Research</td><td>D6005</td><td></td></tr><tr><td>HpaI</td><td>NEB</td><td>R0105S</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu</td><td>AlfaAesar</td><td>6108-17-4</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka o niskiej masie DNA</td><td>Invitrogen</td><td>10068-013</td><td></td></tr><tr><td>Bufor NE #4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Platinum PCR SuperMix High Fidelity</td><td>Invitrogen</td><td>12532-016</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Każdy zestaw będzie działał</td></tr><tr><td>Zestaw do szybkiego podwiązywania</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>Amresco</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Ultrapure</td><td>rpi</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td> 1<td>/6/2015</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>XmaI</td><td>NEB</td><td>R0180S</td><td></td></tr><tr><td>YPD</td><td>media LabExpress</td><td>3011-URA</td><td></td></tr> <tr><td>Media</td><td>LabExpress</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>PCR Machine</td><td>Invitrogen</td><td>4359659</td><td>Każda maszyna do PCR będzie działać</td></tr><tr><td>Mikroskop TIRF</td><td>Olympus IX81</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA-R kamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dynamika aip1p jest zmieniona przez mutację r256h w aktynie

Aip1p Dynamics Are Altered by the R256H Mutation in Actin

Mutacje w aktynie powodują szereg chorób u ludzi z powodu specyficznych zmian molekularnych, które często zmieniają funkcję cytoszkieletu. W tym badaniu obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu mikroskopii całkowitej fluorescencji wewnętrznej (TIRF) służy do wizualizacji i ilościowego określenia zmian w dynamice cytoszkieletu. Mikroskopia TIRF i zastosowanie znaczników fluorescencyjnych pozwala również na ilościowe określenie zmian w dynamice cytoszkieletu spowodowanych mutacjami aktyny. Wykorzystując tę technikę, kwantyfikacja funkcji cytoszkieletu w żywych komórkach cennie uzupełnia badania in vitro funkcji białek. Na przykład mutacje typu missense wpływające na resztę aktyny R256 zostały zidentyfikowane w trzech ludzkich izoformach aktyny, co sugeruje, że aminokwas ten odgrywa ważną rolę w interakcjach regulacyjnych. Wpływ mutacji aktynowej R256H na ruchy cytoszkieletu badano przy użyciu modelu drożdży. Białko Aip1, o którym wiadomo, że pomaga kofilinie w depolimeryzacji aktyny, zostało oznaczone zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) na N-końcu i śledzone in vivo za pomocą mikroskopii TIRF. Określono ilościowo szybkość ruchu Aip1p zarówno w szczepach dzikich, jak i zmutowanych. W komórkach eksprymujących zmutowaną aktynę R256H ruch Aip1p jest ograniczony, a szybkość ruchu jest prawie o połowę mniejsza niż prędkość mierzona w komórkach typu dzikiego (0,88 ± 0,30 μm / s w komórkach R256H w porównaniu do 1,60 ± 0,42 μm / s w komórkach typu dzikiego, p < 0,005).

Przedstawiono metodę obrazowania dynamiki białek cytoszkieletu w komórce. Białko wiążące aktynę, Aip1p, znakowano białkiem GFP. Schemat plazmidu kodującego znakowany produkt przedstawiono na Ryc. 1. Plazmid został następnie wprowadzony do komórek drożdży poprzez transformację. Ekspresja znakowanego fluorescencyjnie białka Aip1p umożliwiła wizualizację zachowania tego białka w komórce. Aip1p zazwyczaj lokalizuje się w plamkach aktynowych w miejscach endocytozy22. Aby ilościowo określić ruch Aip...

Chorobotwórcze mutacje w aktynie mogą zmienić funkcję cytoszkieletu. Dynamikę cytoszkieletu określa się ilościowo poprzez obrazowanie białek znakowanych fluorescencyjnie przy użyciu całkowitej wewnętrznej mikroskopii fluorescencyjnej. Na przykład białko cytoszkieletu, Aip1p, ma zmienioną lokalizację i ruch w komórkach wyrażających zmutowaną izoformę aktyny, R256H.

Dynamika Aip1p jest zmieniona przez mutację R256H w aktynie

Mutations in actin cause a range of human diseases due to specific molecular changes that often alter cytoskeletal function. In this study, imaging of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja ruchu białka wiążącego aktynę w drożdżach wykazujących ekspresję mutantycznej izoformy aktyny. Osiąga się to najpierw poprzez stworzenie plazmidu i oznakowanie białka oddziałującego z aktyną lub genu IP one P za pomocą trzech cząsteczek zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Drugim krokiem jest wygenerowanie szczepu drożdży wykazującego ekspresję wyłącznie aktyny typu dzikiego lub mutantycznej.Następnie plazmid A IP one P z tagiem GFP jest transformowany do szczepu drożdży typu dzikiego lub zmutowanego. Ostatnim krokiem jest obrazowanie i analiza ruchu tagowanego A IP one P w komórkach drożdży typu dzikiego oraz zmutowanych. Ostatecznie wykorzystuje się całkowite wewnętrzne odbicie.Mikroskopia fluorescencyjna lub TURF jest wykorzystywana do wykazania, że białko AIP1 porusza się wolniej w drożdżach wykazujących mutant aktyny R256H niż w drożdżach z aktyną typu dzikiego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie cytoszkieletu, takie jak względna dynamika czasowa ruchów partnerów wiążących. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się po raz pierwszy, gdy odkryłem, że w przeciwieństwie do szczepu

aip1p-dynamics-are-altered-by-the-r256h-mutation-in-actin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dynamika Aip1p ulega zmianie w wyniku mutacji R256H w aktynie

Białka wiążą się z aktyną filamentową (F-aktyną) poprzez odrębne moduły wiążące aktynę. W tym filmie prezentujemy procedurę współsedymentacji aktyny, która jest testem in vitro rutynowo stosowanym do analizy białek lub specyficznych domen wiążących F-aktynę.

Test współwytrącania aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną

Opisano metodę czasowo-przestrzennej kontroli aktywności małych GTPaz za pomocą światła. Metoda ta opiera się na indukowanej rapamycyną heterodimeryzacji FKBP-FRB oraz systemach fotoklatkowania. Optymalizacja naświetlania umożliwia czasowo-przestrzenną kontrolę aktywacji małych GTPaz na poziomie subkomórkowym.

Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Nitkowata aktyna (F-aktyna) odgrywa ważną rolę w spinogenezie, plastyczności synaptycznej i stabilności synaptycznej. Kwantyfikacja F-aktyny puncta jest zatem użytecznym narzędziem do badania integralności struktur synaptycznych. Protokół ten opisuje procedury ilościowego oznaczania F-aktyny puncta znakowanej falloidyną w pierwotnych kulturach neuronów korowych o niskiej gęstości.

Kwantyfikacja punkcji aktyny nitkowatej (F-aktyny) w neuronach korowych szczurów

Przedstawiamy prosty, efektywny czasowo i wysokoprzepustowy test oparty na spektroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania włókien aktynowych w próbkach biologicznych ex vivo z tkanek mózgowych gryzoni i ludzi.

Efektywny czasowo test oparty na spektroskopii fluorescencji do oceny stanu polimeryzacji aktyny w tkankach mózgu gryzoni i ludzi

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Wybór, mikroiniekcja i obrazowanie znakowanej fluorescencyjnie F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamkowej (FSM).

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy dynamiki F-aktyny za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii plamistej (FSM)

Opisujemy in vivo protokół obrazowania fluorescencyjnego służący do monitorowania regeneracji mięśni za pomocą mioblastów znakowanych białkiem GFP po transplantacji do mięśni szkieletowych myszy zdrowych oraz dystroficznych. Protokół ten można zaadaptować do badania regeneracji mięśni poprzez transplantację innych typów komórek, a także w innych stanach chorobowych mięśni.

Śledzenie dynamiki wszczepiania mięśni u małych zwierząt za pomocą obrazowania fluorescencyjnego in vivo

Opisujemy metody fotowybielania, w tym Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) oraz Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP), służące do monitorowania dynamiki białek chromatyny w embrionalnych komórkach macierzystych (ES). Dynamika białek chromatyny, uznawana za jeden ze sposobów badania plastyczności chromatyny, jest zwiększona w komórkach pluripotencjalnych.

Analizy fotoblaknięcia (FRAP i FLIP) do pomiaru dynamiki białek chromatyny w żywych embrionalnych komórkach macierzystych

Poznaj dynamikę białka Aip1p w drożdżach z mutacją R256H w aktynie przy użyciu mikroskopii TIRF. Ta metoda pozwala wizualizować ruch białek wiążących aktynę i badać wpływ mutacji na dynamikę cytoszkieletu.

Dynamika Aip1p jest zmieniona przez mutację R256H w aktynie

Przeglądaj więcej filmów