Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Ogólnym celem poniższego protokołu jest zbadanie wpływu infekcji mikrobiologicznej na przewlekły stan zapalny in vivo przy użyciu fizjologicznie odpowiedniego modelu zwierzęcego. Osiąga się to poprzez doustne zakażenie myszy Porphyromonas gingivalis w celu wywołania miejscowego i ogólnoustrojowego przewlekłego stanu zapalnego. MRI można następnie wykorzystać do pomiaru postępu ogólnoustrojowego stanu zapalnego u żywych zwierząt, podczas gdy miejscowy zapalny ubytek kości ocenia się za pomocą mikrotomografii komputerowej, a blaszki miażdżycowe można uwidocznić za pomocą barwienia lipidów na twarzy po uśmierceniu.

Ostatecznie różnice w objętości kości wyrostka zębodołowego i akumulacji blaszek miażdżycowych między myszami zakażonymi P. gingivalis a niezakażonymi kontrolami można zmierzyć na podstawie analizy mikrotomografii komputerowej i barwienia lipidów twarzy. Główną zaletą naszego modelu zwierzęcego jest to, że pozwala on na zbadanie zarówno gospodarza, jak i mechanizmów patogennych zaangażowanych w przewlekły stan zapalny, a konkretnie w miejscach odległych od infekcji. Możesz więc przyjrzeć się miejscom ogólnoustrojowym, a także miejscowym miejscom infekcji za pomocą myszy transgenicznych i zdefiniowanych mutantów bakteryjnych.

Model ten może pomóc w identyfikacji kluczowych aspektów patogenezy, takich jak gospodarz i czynniki mikrobiologiczne przyczyniające się do choroby. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w specyficzne mechanizmy gospodarza i patogenu zaangażowane w zapalną utratę masy kostnej i miażdżycę, można ją również dostosować do innych mysich modeli chorób, w tym reumatoidalnego zapalenia stawów, cukrzycy i raka. Jest to główny ośrodek rezonansu magnetycznego wysokiego pola dla Uniwersytetu Bostońskiego, a mój kolega z tytułem doktora Ning zamierza zademonstrować aspekty obrazowania myszy Zacznij od smugowania zamrożonych łodyg brzoskwini gingivalis 3 81 na beztlenowych płytkach agaru z krwią i inkubuj płytki w komorze beztlenowej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po trzech do pięciu dniach użyj organizmów wyhodowanych na płytce, aby zaszczepić pięć mililitrowych płynnych kultur bulionu do infuzji mózgu serca lub BHI. Po nocnym wzroście przenieś kultury do 45 mililitrów BHI i inkubuj kultury beztlenowo przez dodatkowe 18 do 24 godzin. W połowie fazy logarytmicznej zebrać bakterie przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 7 000 GS i temperaturze pokojowej, a następnie dokładnie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS za pomocą pipety serologicznej po trzykrotnym umyciu osadu w 50 mililitrach PBS Resus, osad w PBS tak, aby rozcieńczenie kultury od 1 do 10 miało gęstość optyczną 1,0 przy 660 nanometrach.

Następnie usuń wystarczającą ilość karboksymetylocelulozy o średniej lepkości, aby uzyskać roztwór 2% wagowy do objętości i powoli dodawaj etylocelulozę karboksu do zawiesiny bakteryjnej podczas wirowania, aby uniknąć zbrylania. Aby zmierzyć postęp stanu zapalnego w C dwa. Najpierw umieść uchwyt na zwierzę z głową myszy w pozycji leżącej na plecach w pionowej sondzie o średnicy 30 milimetrów i w pionowym otworze skanera 11,7 TMRI.

Po procesach chybotania i podkładkowania użyj rzadkiej sekwencji, aby uzyskać obrazy zwiadowcze wzdłuż trzech ortogonalnych orientacji, aby utworzyć osiowe obrazy koronalne i strzałkowe. Następnie, po użyciu angiografii rezonansu magnetycznego o niskiej rozdzielczości w celu potwierdzenia, że uzyskane obrazy znajdują się w obszarze docelowym, wykonaj angiografię rezonansu magnetycznego o wysokiej rozdzielczości tętnicy nienazwanej z niewyodrębnioną sekwencją echa gradientowego 3D, stosując następujące parametry. Grubość płyty 1,5 centymetra, kąt odwrócenia 45 stopni, czas powtarzania 20 milisekund, czas echa 2,2 milisekundy, pole widzenia 1,5 na 1,5 na 1,5 centymetra, matryca 1 28 na 1 28 na 1 28 i liczba średnia cztery, co daje całkowity czas skanowania około 22 minut.

Następnie wybierz osiowy obraz tętnicy denominacyjnej 0,3 do 0,5 milimetra poniżej rozwidlenia podobojczykowego do analizy ROI Aby przypiąć aortę, utrzymując tkankę pokrytą PBS przez cały czas. Zacznij od ułożenia aorty w pozycji anatomicznej z opuszkami aorty po lewej stronie. Następnie umieść tymczasowe szpilki mnuchin kolejno w następujących pięciu miejscach, górna część aorty poniżej trzeciej gałęzi łuku, w połowie aorty zstępującej w pobliżu dolnego końca aorty zstępującej i powyżej gałęzi tętnicy udowej.

Następnie użyj bardzo cienkich nożyczek sprężynowych, aby przeciąć lewą stronę aorty, zaczynając od lewej gałęzi tętnicy udowej aż do dolnej gałęzi aorty wstępującej. Następnie, po przecięciu i przypięciu każdej gałęzi, aby odsłonić jej wewnętrzną powierzchnię, kontynuuj przypinanie tkanki. Cała wewnętrzna powierzchnia jest odsłonięta i dobrze widoczna od góry oraz wolna od zakłóceń wizualnych ze strony kołków.

Aby wybarwić lipidy i określić ilościowo zmiany, zacznij od pokrycia przypiętej aorty świeżo przygotowanym roztworem Sudan four lub czerwonym roztworem O. Po 50 minutach przemyj tkankę 70% izopropanolem przez jedną do pięciu minut, a następnie delikatnie przepłucz aortę wodą podwójnie destylowaną, aż woda spływająca z tkanki przestanie być czerwona. Następnie przykryj aortę PBS i umieść linijkę obok tkanki, aby pomóc w kalibracji obrazu.

Następnie uchwyć obrazy tkanki za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości podłączonej do mikroskopu preparacyjnego, zapisując obrazy jako pliki TIFF. Na koniec w oprogramowaniu do analizy obrazu ręcznie prześledź każdą powierzchnię błony wewnętrznej, aby określić jej powierzchnię. Następnie, aby obliczyć obszar zmiany chorobowej za pomocą automatycznego progowania kolorów, należy ustawić próg dla każdego obrazu, aby zdefiniować intensywność koloru, która odróżnia zmiany od normalnych obszarów.

Procent powierzchni wewnętrznej pokrytej zmianami miażdżycowymi można następnie obliczyć w tym reprezentatywnym doświadczeniu z myszami zakażonymi p gingivalis. Analiza wolumetryczna wykazała, że zakażone myszy wykazują znaczną utratę masy kostnej w porównaniu z niezakażonymi kontrolami. Oględziny zrekonstruowanej szczęki Hemi ilustrują wzrost odsłoniętej powierzchni korzeni trzonowych u zakażonych myszy w porównaniu z grupą kontrolną podatną na miażdżycę.

Myszy z niedoborem POE. P gingivalis wywołuje przewlekły stan zapalny, który powoduje utratę kości wyrostka zębodołowego i odkładanie się blaszki zapalnej w zatoce aortalnej i tętnicy nominatywnej już po 24 godzinach od ostatniej infekcji, co można monitorować u żywych myszy za pomocą seryjnego rezonansu magnetycznego in vivo in vivo w różnych punktach czasowych po zakażeniu, jak na tych reprezentatywnych obrazach. Dalsze pomiary powierzchni Sudanu z czterema barwnikami aorty pokazują, że zakażenie p gingivalis znacznie zwiększa odkładanie się lipidów i obszary chorobowe na powierzchni błony wewnętrznej.

Dodatkowo analiza immunohistochemiczna zmian w zatokach aortalnych ujawnia zwiększoną infiltrację mikrofagów i podwyższoną ekspresję wrodzonego receptora immunologicznego toll-like receptora u dwóch myszy zakażonych IV. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że eksperymentalne punkty czasowe, w których oceniany jest stan zapalny, powinny być odpowiednio dostosowane do postępu choroby. Po obrazowaniu MR innych osób można wykonać inne metody, takie jak stanie twarzą w twarz lub chemia immunologiczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak globalne obciążenie miażdżycowe lub składniki komórkowe zmiany.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć model myszy in vivo, który pozwala zbadać zarówno gospodarza, jak i czynniki chorobotwórcze zaangażowane w przewlekły stan zapalny. Nie zapominaj, że praca z patogenami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak prawidłowe stosowanie środków ochrony osobistej.