Płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie interakcji między gospodarzem a patogenem w bydlęcym modelu infekcji dróg oddechowych. Cel ten osiąga się poprzez indukowanie infekcji dróg oddechowych u cieląt poprzez wewnątrzbronchialną inokulację odpowiednim patogenem w trakcie przebiegu choroby. Próbki z organizmu zwierzęcia są pobierane wielokrotnie za pomocą płukania przedsionka i oskrzeli (BAL).

Następnie pobiera się wymazy z oskrzeli oraz biopsje płuc drogą transbronchialną w celu uzyskania odpowiednio komórek nabłonkowych oraz próbek tkanki pęcherzykowej lub płucnej. Ostatecznie można potwierdzić obecność patogenowo swoistej choroby układu oddechowego, na przykład poprzez zmiany zapalne w płukaninach, badanie cytologiczne oraz immunohistochemiczną detekcję patogenu. W przypadku biopsji płuc drogą transbronchialną główną zaletą tego modelu na dużych zwierzętach w porównaniu z innymi istniejącymi modelami zwierzęcymi i gryzoniami jest możliwość badania przebiegu choroby w tym samym osobniku przez długi okres czasu dzięki wielokrotnemu pobieraniu próbek.

Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w interakcje między patogenem a gospodarzem in vivo, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak alternatywne patogeny lub gatunki gospodarzy. Utrzymanie znieczulenia i pomoc przy pobieraniu próbek zaprezentuje fisher, lekarz weterynarii z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury należy napełnić trzy strzykawki odpowiednio jednym, dwoma i pięcioma mililitrami inokulum.

Następnie, po potwierdzeniu działania znieczulenia, wyciągnij język zwierzęcia i rozciągnij szyję. Następnie, wykonując lekkie ruchy obrotowe, wprowadź metalowe rozwieracz do pyska zwierzęcia. Przesuń rozwieracz do przodu, kontrolując miejsce wprowadzenia i używając latarki, aby określić moment, w którym krtań stanie się widoczna.

Następnie wprowadź rurkę teflonową do kanału roboczego endoskopu. Rurka nie powinna wystawać poza końcówkę endoskopu. Wprowadź endoskop przez rozwierak.

Może być konieczne wykonanie niewielkich korekt ustawienia wziernika, aby umożliwić wprowadzenie endoskopu. Aby przejść przez krtanią, należy wykorzystać tchawicę, która odgałęzia się w prawą stronę płuca, co pomoże w wyrównaniu obrazu na monitorze. Następnie do końca rurki teflonowej należy przymocować strzykawkę zawierającą 5 mL inokulum.

Wprowadź rurkę do rozgałęzień, w których zostanie zdeponowany inokulum, a następnie podaj odpowiednią ilość inokulum. Następnie do rurki podłącz strzykawkę zawierającą 1 ml inokulum. Przesuń się do oskrzeli i zdeponuj inokulum w gałęzi bocznej.

Wyjmij endoskop i wziernik. Następnie przymocuj ostatnią strzykawki do aktywatora i wtryśnij jeden mililitr inokulum do każdej nozdrza. Umieść zwierzę z powrotem w klatce w pozycji brzusznej do wybudzenia.

Boks pooperacyjny powinien być klimatyzowany, ponieważ podczas znieczulenia ogólnego zdolność zwierzęcia do termoregulacji jest ograniczona. Aby pobrać próbki z zastawki w wyznaczonym czasie, ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 38°C pięć strzykawek zawierających każda po 20 ml sterylnej soli fizjologicznej. Następnie wprowadzić cewnik do płukania do kanału roboczego endoskopu, a endoskop wprowadzić do metalowego wziernika.

Następnie należy przesunąć endoskop w głąb głównego oskrzela lewego płuca, aż do osiągnięcia pozycji klinowej i momentu, w którym dalsze posuwanie endoskopu nie będzie możliwe. Potem kolejno podłączaj strzykawki z ciepłym roztworem chlorku sodu do cewnika do płukania w celu wprowadzania i bezpośredniego odsysania płynu.

Przechowywać płyn z prania oskrzelowo-pęcherzykowego w butelkach szklanych silikonizowanych na lodzie natychmiast po odzyskaniu, aby zapobiec przywieraniu makrofagów pęcherzykowych do powierzchni szkła. Odnotować zarówno ilość podanej soli fizjologicznej, jak i ilość odzyskanego płynu. Następnie wyjąć cewnik do prania z kanału roboczego w celu pobrania komórek nabłonkowych.

Następnie wprowadź endoskop do pożądanego miejsca pobrania próbek. Na przykład w tym doświadczeniu do rozwidlenia tchawki. Gdy endoskop znajdzie się na miejscu, osłoń szczoteczkę oskrzelową rurką i wprowadź ją do kanału roboczego endoskopu, aż końcówka szczoteczki pojawi się na monitorze. Przesuń szczoteczkę wraz z plastikową rurką do przodu o około pięć centymetrów.

Następnie pchnij uchwyt szczoteczki, aby wysunąć ją z plastikowej rurki. Gdy szczoteczka znajdzie się w odpowiedniej pozycji, skieruj ją w miejsce, które ma zostać oczyszczone. Następnie delikatnie przesuwaj szczoteczkę przód i tył, jednocześnie manewrując endoskopem.

Należy zapewnić kontakt szczoteczki ze ścianą oskrzeli, aby zetrzeć komórki nabłonka. Przecieranie należy przerwać w momencie wystąpienia krwawienia. Następnie szczoteczkę należy przykryć probówką i wyciągnąć ją z kanału roboczego.

Ostrożnie przetocz szczeczkę pokrytą komórkami nabłonkowymi po maksymalnie pięciu szkiełkach przedmiotowych i utrwal rozmazy w zimnym metanolu przez 10 minut. Następnie po wysuszeniu szkiełek na powietrzu, przechowuj je w temperaturze -20 °C w celu wykonania transbronchialnej biopsji płuc. W dalszej kolejności wprowadź endoskop do pożądanego miejsca pobrania próbek.

Na przykład, w przypadku LOAs crans w tym eksperymencie, przed wprowadzeniem kleszczy biopsyjnych do kanału roboczego, należy kilka razy je otworzyć i zamknąć, aby upewnić się, że działają prawidłowo, a następnie przesunąć kleszczyki do bocznej gałęzi tchawki oskrzelowej, aż poczujemy lekki opór. Następnie należy wycofać kleszczyki o dwa do trzech centymetrów i je otworzyć. Ponownie przesunąć kleszczyki do przodu o około dwa centymetry, a następnie je zamknąć.

Wycofać i wyjąć kleszczyki z kanału roboczego. Za pomocą igły ostrożnie usunąć tkankę z kleszczyków do biopsji i umieścić ją w odpowiednim medium utrwalającym, aby zapobiec procesom autolitycznym. Na koniec, po umożliwieniu cielęciu regeneracji w boksie, ponownie monitorować zwierzę pod kątem odmy opłucnej przez kolejne 24 godziny, zapewniając paszę i świeżą wodę.

Po odzyskaniu przez zwierzę pełnej przytomności można przeprowadzić barwienie immunohistochemiczne mrożonych sekcji biopsji płuca pobranych drogą przezbronchialną. Aby zwizualizować wprowadzony patogen, należy zwrócić uwagę na brązowe inkluzje chlamydii w płucach tego zwierzęcia, które zostało zaszczepione chlamydią C na cztery dni przed pobraniem próbek. Barwienie immunohistochemiczne komórek z płukania pozwala na wizualizację patogenów wewnątrzkomórkowych.

Na przykład na tym obrazie widoczne są inkluzje chlamydialne obecne w makrofagach pęcherzykowych pobranych od cielęcia. CTAC można zaobserwować dziewięć dni po wewnątrzbronchialnym zaszczepieniu chlamydiami. Komórki z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego można zróżnicować za pomocą barwienia cytologicznego.

Makrofagi pęcherzykowe są dominującym typem komórek w płycinie z płukania. Jednak liczba granulocytów neutrofilnych wzrasta w obecności procesów zapalnych. Po opanowaniu techniki, inokulacja może zostać przeprowadzona w ciągu 10 do 15 minut, a pobieranie próbek w ciągu 20 do 30 minut, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzać inokulację wewnątrzoskrzelną u cieląt oraz jak pobierać płyn z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego, wymazy ze oskrzeli oraz biopsje płuc transbronchialne u znieczulonego zwierzęcia.