Name: Płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj techniki bronchoskopowe w płucach bydlęcych do badania interakcji patogen-gospodarz. Metoda obejmuje inokulację dooskrzelową, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i biopsję płucną u cieląt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy są bardzo wdzięczni Federalnemu Ministerstwu Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) Niemiec za finansowanie ich pracy. Autorzy dziękują również Ines Lemser, Sylke Stahlberg, Ingolfowi Rücknagelowi i wszystkim innym kolegom pracującym w zespole animal house (FLI, Niemcy) za ich pomoc techniczną przy bronchoskopii. Są bardzo wdzięczni Marii-Christinie Haase (FLI, Niemcy) za pomoc w dostarczaniu literatury. Ponadto autorzy pragną wyrazić wdzięczność dr Angeli Berndt (FLI, Niemcy) i Nicolette Bestul (University of Wisconsin-River Falls) za krytyczną lekturę manuskryptu.

Oświadczenie etyczne 
Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z europejskimi i krajowymi przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach i Ochrony Zwierząt w kraju związkowym Turyngia w Niemczech (numer zezwolenia: 04-004/11). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone pod nadzorem upoważnionego instytucjonalnego Agenta Ochrony Zwierząt. Bronchoskopia była wykonywana wyłącznie w znieczuleniu ogólnym. W trakcie badania dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować dyskomfort czy cierpienie.
Uwagi ogólne 
Opisane techniki zostały opracowane dla cieląt w wieku około 6-8 tygodni o wadze około 60-80 kg. W przypadku stosowania u innych dużych gatunków zwierząt lub cieląt różniących się wiekiem i masą ciała, techniki te muszą być dostosowane do wielkości i masy ciała oraz uwzględniać anatomię płuc poszczególnych gatunków zwierząt. Cały używany sprzęt musi być sterylny. Chlamydia psittaci jest bakterią odzwierzęcą, która może powodować choroby układu oddechowego i ogólne u ludzi. Nieptasi szczep C. psittaci DC15 stosowany w niniejszym protokole musi być traktowany zgodnie z poziomem bezpieczeństwa biologicznego 2. Wszystkie prace z patogenem i zakażonymi zwierzętami należy wykonywać przy użyciu środków ochrony osobistej, takich jak respirator, kombinezon przeciwbryzgłowy, gumowe buty i rękawice. Noszenie odpowiedniej respiratora ma ogromne znaczenie, ponieważ naturalną drogą zakażenia C. psittaci jest choroba układu oddechowego. Opakowanie i etykietowanie próbek musi być zabezpieczone przed środkami dezynfekującymi, ponieważ przed opuszczeniem pomieszczenia dla zwierząt wszystkie rzeczy muszą być poddane działaniu środka dezynfekującego skutecznego przeciwko chlamydiom zgodnie z instrukcjami producenta.
1. Przygotowanie zwierzęcia do bronchoskopii
<ol>
	<li>Określ wagę cielęcia do dawkowania środków znieczulających.</li>
	<li>Umieścić dostęp dożylny (IV) w lewej żyle szyjnej.</li>
	<li>Najpierw powoli wstrzyknąć ksylazynę (0,2 mg/kg masy ciała) przez około 30 sekund, a następnie, po wystąpieniu sedacji, wstrzyknąć ketaminę (2,0 mg/kg masy ciała). </li>
	<li>Podnieś zwierzę na stół i umieść je w prawej bocznej pozycji leżącej. Gdy zwierzę zostanie odpowiednio umieszczone na stole, sprawdź, czy dostęp do kroplówki jest nadal na swoim miejscu i w razie potrzeby wyreguluj go. Podczas znieczulenia regularnie sprawdzaj odruch powiekowy, aby określić głębokość znieczulenia.</li>
	<li>Gdy zwierzę zacznie oddychać miarowo, poproś kogoś, aby wyciągnął język i rozciągnął szyję. Umieść wziernik z metalową rurką w pysku zwierzęcia, wykonując lekkie ruchy obrotowe. Popchnij wziernik do przodu pod kontrolą wzroku, używając latarki, aż krtań będzie widoczna.</li>
	<li>Utrzymuj znieczulenie przez cały czas trwania procedury endoskopowej, wstrzykując bolus składający się z 7 mg ksylazyny i 70 mg ketaminy w razie potrzeby.</li>
</ol>
2. Inokulacja (Miejsca Inokulacji: Rysunek 1)
<ol>
	<li>Przygotować 3 strzykawki z inokulum, zawierające 1, 2 i 5 ml inokulum.</li>
	<li>Włóż rurkę teflonową do kanału roboczego endoskopu. Rurka nie powinna wystawać z końcówki endoskopu.</li>
	<li>Przełóż endoskop przez metalowy wziernik. Nieznaczne korekty wziernika mogą być konieczne, aby umożliwić przejście krtani. Oskrzela tchawicy, które rozgałęzia się na prawą stronę, pomaga wyrównać obraz na monitorze.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę z 5 ml inokulum do końca probówki teflonowej. Skieruj probówkę do gałęzi, w których ma zostać zdeponowane inokulum i nałóż żądaną ilość (Prawe płuco: Lobus medius: 0,5 ml, Lobus accessorius: 0,5 ml, Lobus caudalis: 0,5 ml i 1,0 ml; Lewe płuco: Lobus cranialis, Pars cranialis: 0,5 ml, Pars caudalis: 0,5 ml, Lobus caudalis: 1,5 ml). Podłączyć strzykawkę z 1 ml inokulum do probówki, a następnie przejść do oskrzela tchawicy i umieścić inokulum (Lobus cranialis, Pars caudalis: 1,0 ml). Pomocne jest, aby zawsze podchodzić do lokalizacji w tej samej kolejności.</li>
	<li>Usuń endoskop i wziernik.</li>
	<li>Rozpylić 1 ml inokulum do każdego nozdrza za pomocą aktywatora.</li>
	<li>Przynieś zwierzę z powrotem do stajni i ułóż je w pozycji leżącej, aby się obudziło. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki lub w towarzystwie innych zwierząt, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Stajnia rekonwalescencji powinna być klimatyzowana, ponieważ zdolność zwierzęcia do termoregulacji jest zmniejszona w znieczuleniu ogólnym. 
	UWAGA: Pierwsze objawy kliniczne powinny wystąpić około 24-36 godzin po inokulacji, w zależności od zastosowanego patogenu.</li>
</ol>
3. Procedury pobierania próbek (miejsca pobierania próbek: Rysunek 2)
<ol>
	<li>Przygotuj zwierzę zgodnie z opisem w krokach 1.1-1.6.</li>
	<li>Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe
	<ol>
		<li>Umieścić 5 strzykawek zawierających 20 ml sterylnego izotonicznego roztworu soli fizjologicznej w łaźni wodnej i pozostawić do ogrzania do temperatury około 38 °C.</li>
		<li>Wprowadzić cewnik do płukania do kanału roboczego endoskopu, a następnie włożyć endoskop do metalowego wziernika i poruszać się do przodu do głównego oskrzela lewego płuca, aż zostanie osiągnięta "pozycja klinowa", w której endoskop nie może być dalej wysunięty do przodu.</li>
		<li>Jedna po drugiej podłącz strzykawki z ciepłym roztworem NaCl do cewnika do płukania, wkraplaj płyn i odsysaj go bezpośrednio. Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego musi być przechowywany w silikonowanych szklanych butelkach i umieszczony na lodzie natychmiast po wyzdrowieniu, aby zapobiec przyczepianiu się makrofagów pęcherzykowych do powierzchni szkła. Zwróć uwagę zarówno na ilość wkroplonej soli fizjologicznej, jak i ilość odzyskanego płynu.</li>
		<li>Usunąć cewnik do płukania z kanału roboczego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szczotkowanie oskrzeli
	<ol>
		<li>Skieruj endoskop do żądanego miejsca pobierania próbek, w opisanym protokole jest to Bifurcatio tchawica.</li>
		<li>Przykryj szczoteczkę rurką przed włożeniem jej do kanału roboczego endoskopu, aż końcówka szczoteczki pojawi się na monitorze.</li>
		<li>Popchnij szczotkę z plastikową rurką do przodu o około 5 cm i odsłoń ją z plastikowej rurki, popychając uchwyt, a następnie skieruj ją w miejsce, które ma być szczotkowane.</li>
		<li>Zetrzyj wezwania nabłonkowe, delikatnie popychając i ciągnąc szczoteczkę do przodu iz powrotem podczas poruszania się po endoskopie, aby zapewnić kontakt między szczoteczką a ścianą oskrzela. Przestań pocierać, gdy wystąpi krwawienie. Przykryj szczotkę rurką przed wyciągnięciem jej z kanału roboczego.</li>
		<li>Przygotuj do pięciu rozmazów na szkiełkach mikroskopowych, delikatnie przesuwając szczoteczkę po szkiełku. Utrwalić rozmazy w zimnym metanolu na 10 minut, wysuszyć na powietrzu i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Szczotka może być płukana w różnych mediach, w zależności od przeznaczenia pobieranych komórek. Jeśli wykonujesz wiele szczotkowań tą samą szczoteczką, pamiętaj, aby płukać ją tylko w mediach, które nie podrażniają błony śluzowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Biopsja przezoskrzelowa płuca
	<ol>
		<li>Skieruj endoskop do żądanego miejsca pobierania próbek, w opisanym protokole jest to Pars caudalis Lobus cranialis. Przed włożeniem kleszczyków do biopsji do kanału roboczego otwórz go i zamknij kilka razy, aby upewnić się, że działa płynnie.</li>
		<li>Wciśnij kleszcze do biopsji w gałąź ogonową oskrzela tchawicy, aż pojawi się lekki opór. Cofnij się o 2-3 cm, otwórz kleszcze, popchnij do przodu o około 2 cm, zamknij kleszcze, odciągnij i wyjmij kleszcze z kanału roboczego. Wymaga to pewnej wprawy.</li>
		<li>Ostrożnie usuń tkankę z kleszczy biopsyjnych za pomocą igły lub małych kleszczy. W zależności od dalszego wykorzystania tkanki należy ją przechowywać w ciekłym azocie lub odpowiednim podłożu utrwalającym. Powinno to nastąpić zaraz po usunięciu, aby zapobiec procesom autolitycznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie pozabiegowe
	<ol>
		<li>Przynieś zwierzę z powrotem do stajni i ułóż je w pozycji leżącej, aby się obudziło. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki lub w towarzystwie innych zwierząt, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Stajnia rekonwalescencji powinna być klimatyzowana, ponieważ zdolność zwierzęcia do termoregulacji jest zmniejszona w znieczuleniu ogólnym.</li>
		<li>Uważnie obserwuj zwierzę pod kątem oznak odmy opłucnowej przez następne 24 godziny. Zapewnij mu paszę i świeżą wodę, gdy zwierzę odzyska pełną świadomość.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowano bronchoskopową metodę inokulacji i dostosowano różne bronchoskopowe metody pobierania próbek do stosowania u dużych zwierząt w warunkach doświadczalnych. Opisane techniki są łatwe do nauczenia, nawet dla egzaminatorów z niewielkim doświadczeniem w endoskopii. Proces bronchoskopii jest minimalnie inwazyjny i u żadnego ze zwierząt nigdy nie zaobserwowano żadnych działań niepożądanych związanych z metodami inokulacji, a także opisanymi metodami pobierania próbek (BAL, przezoskrzelowa biopsja płuc, szczotkowanie oskrzeli). Powikłania związane z przezoskrzelową biopsją płuc u ludzi to krwawienie i odma opłucnowa48, żadnego z nich nie zaobserwowano u cieląt, które przeszły tę procedurę. Biopsja przezoskrzelowa płuca jest bardziej czasochłonna i wymaga większej ilości sprzętu niż metoda przezskórna, ale jest mniej inwazyjna i nie niesie ze sobą ryzyka zakażenia rany.
Kontrolowana wizualnie, endoskopowa metoda inokulacji pozwala na osadzenie określonej ilości patogenu w określonych miejscach płuc. W ten sposób prowadzi to do bardzo spójnych objawów klinicznych i patologicznych u wszystkich zaszczepionych zwierząt32-34. Nie przypomina jednak wszystkich cech naturalnej infekcji u cieląt. W modelu zakażenia C. psittaci układu oddechowego opisana technika inokulacji doprowadziła do zmian w płucach związanych z miejscami rozmieszczenia patogenu34, podczas gdy w zakażeniach nabytych naturalnie u cieląt zwykle rozwija się zapalenie płuc płatów wierzchołkowych. Fakt ten należy wziąć pod uwagę przy interpretacji znaczenia wyników doświadczeń doświadczalnych w kontekście naturalnie nabytych zakażeń płuc u bydła.
Wideoendoskopowy BAL umożliwia pobranie próbki z określonego obszaru płuc. Do celów eksperymentalnych jest to zaleta w porównaniu z użyciem cewnika do nosa w warunkach ślepoty. Ze względu na anatomię płuca bydlęcego, ślepo wprowadzony cewnik byłby w większości przypadków wepchnięty do prawego płata przepony53,54 i badający nie ma wpływu na obszar płuca, który jest płukany. Kolejną zaletą endoskopowego BAL u znieczulonych cieląt w pozycji leżącej bocznej jest wysoki średni wskaźnik odzysku wkroplonego płynu wynoszący ponad 80%. Porównanie z innymi badaniami pokazuje, że u cieląt w pozycji stojącej, poddanej sedacji, odnotowano powrót do zdrowia 133,3 ± 1,6 ml 46 i 127,13 ± 3,53 ml 45 po wkropleniu 240 ml płynu do płata ogonowego. U cieląt w pozycji leżącej mostka można było odzyskać 51% wkroplonego płynu z płata czaszki i 62% z płata ogonowego43. Oznacza to, że około połowa wkroplonego płynu może zostać odzyskana w pionowej pozycji łydki. W zależności od ilości BALF potrzebnej do dalszego przygotowania próbki, może to nie pozostawić wystarczającej ilości materiału do przeprowadzenia wszystkich pożądanych eksperymentów. BAL u bydła był stosowany przez wiele grup badawczych i badano wiele różnych parametrów w różnych warunkach. Większość autorów wykonywała płukanie płatów podstawy43,45,46, ale ilość płynu użytego do płukania różni się w zależności od grupy badawczej. Prowadzi to do niespójności w rozcieńczaniu odzyskanych komórek, białek i innych substancji, co utrudnia porównywanie wyników z różnych publikacji. Dlatego do stosowania u bydła zaleca się płukanie pięcioma frakcjami po 20 ml (tj. łącznie 100 ml) izotonicznego roztworu soli fizjologicznej o pojemności 20 ml (tj. łącznie 100 ml), które są odzyskiwane natychmiast po wkropleniu. W przypadku stosowania cewnika do płukania o dużej średnicy (tj. >2 mm) objętość każdej frakcji należy nieznacznie zwiększyć, w zależności od ilości płynu, który pozostanie w cewniku.
Wysoce segmentowa anatomia płuca bydła prowadzi do metodycznego ograniczenia; Wyniki uzyskane z jednej części płuca mogą nie być prawdziwe dla pozostałej części płuca. Ponieważ nie ma kontroli wzroku całego obszaru płuc badanego za pomocą biopsji przezoskrzelowej i płukania, egzaminator nie może stwierdzić, czy pobrane obszary były zdrowe, czy chore. Dlatego bardzo ważne jest pobieranie próbek z miejsc, w których patogen był wcześniej inokulowany, aby uzyskać wyższy wskaźnik wyzdrowienia patogenu i mieć większą możliwość pobrania próbek z chorych obszarów płuc. Kolejnym ograniczeniem jest zwiększone ryzyko znieczulenia u zwierząt o złym stanie klinicznym. Opisane metody powinny być stosowane wyłącznie w modelach łagodnej do umiarkowanej choroby, aby utrzymać obciążenie zwierząt na jak najniższym poziomie. Znieczulenie ogólne u przeżuwaczy powinno być zawsze jak najkrótsze, ponieważ wytwarzanie się gazów w żwaczu zwiększa ryzyko znieczulenia u tych gatunków. Zwierzęta muszą być umieszczone w pozycji leżącej natychmiast po bronchoskopii, aby umożliwić wypływ wytworzonego gazu i muszą być ściśle monitorowane aż do całkowitego wyzdrowienia po znieczuleniu. Opisane techniki nie są również odpowiednie dla interwałów pobierania próbek krótszych niż 24 godziny.
Opisany protokół może być dostosowany do innych czynników zakaźnych. Opisano endoskopowe inokulacje różnych patogenów, takich jak C. psittaci32-34, Pasteurella haemolytica38-40,42, Haemophilus somni55 i wirus wirusowej biegunki bydła44. Również miejsca odkładania się patogenów w płucach można dostosować do pożądanego modelu. Przy wyborze miejsc pobierania próbek należy wziąć pod uwagę kilka ważnych faktów: (i) Miejsca pobierania próbek powinny być wybierane na podstawie miejsc inokulacji i spodziewanych zmian patologicznych. (ii) Gdy ma zostać przeprowadzona sekcja zwłok, należy dołożyć starań, aby pozostawić wystarczającą ilość niepobranych próbek do pobrania próbek ex vivo . (iii) Miejsca pobierania próbek muszą być wybrane w taki sposób, aby można było do nich dotrzeć ze sprzętem. Szczególnie w przypadku przezoskrzelowej biopsji płuc istnieją ograniczenia ze względu na długość kleszczy biopsyjnych. (iv) Kolejność pobierania próbek jest ważna, szczotkowanie oskrzeli i przezoskrzelowa biopsja płuc mogą prowadzić do niewielkiego krwawienia, które mogłoby zanieczyścić BALF. Dlatego BALF musi być zawsze najpierw uzyskany. W przypadku stosowania protokołu u innych gatunków należy wziąć pod uwagę anatomię płuc specyficzną dla danego gatunku.

Wartości dużych modeli zwierzęcych w badaniach biomedycznych
W nowoczesnych interdyscyplinarnych badaniach biomedycznych, modele zwierzęce są nadal niezbędne do wyjaśnienia złożonych interakcji - związanych ze zdrowiem lub statusem choroby - w organizmach ssaków. Pomimo 17 nagród Nobla przyznanych naukowcom, którzy badali bydło, konie, owce lub drób jako modele do badań biomedycznych1, obecnie zdecydowana większość eksperymentów na zwierzętach jest przeprowadzana na gryzoniach, podczas gdy mniej niż 1% badań dotyczy zwierząt domowych lub gospodarskich.
Małe zwierzęta oferują wiele praktycznych zalet (np. niskie koszty, plastyczność genetyczna, wysoka przepustowość, dostępność licznych genetycznych i immunologicznych narzędzi i zestawów), a genetycznie modyfikowane modele myszy są ogólnie akceptowane do przeprowadzania badań mechanistycznych odkrywających szczególne szlaki molekularne. W badaniach biomedycznych nad złożonymi systemami biologiczne znaczenie i przydatność kliniczna modeli mysich staje się coraz bardziej wątpliwa. Mogą one wprowadzać w błąd i wiązać się z ryzykiem nadmiernego uproszczenia złożoności biologicznej2-9.
Ze względu na międzygatunkowe specyfiki, żaden pojedynczy gatunek zwierząt nie będzie całkowicie odzwierciedlał sytuacji ludzkiej, a użycie więcej niż jednego modelu wydaje się być korzystne w interdyscyplinarnym podejściu do badań biomedycznych. W kontekście medycyny translacyjnej duże zwierzęta mogą służyć jako modele porównawcze, dostarczając wyników o wysokim znaczeniu biologicznym podwójnego zastosowania zarówno dla zdrowia ludzi, jak i zwierząt1. Co ciekawe, ludzki genom jest bardziej podobny do genomu bydła niż do genomu gryzoni laboratoryjnych. Niedawno potwierdzono również, że w porównaniu z innymi taksonami, genom myszy jest znacznie bardziej przegrupowany10-12.
W złożonym projekcie badawczym, wykorzystanie zwierząt gospodarskich oferuje unikalną możliwość wewnątrzindywidualnych, długoterminowych badań poprzez wielokrotne pobieranie różnych próbek in vivo od jednej i tej samej jednostki bez poświęcania zwierzęcia. W związku z tym zmiany czynnościowe, zapalne i morfologiczne mogą być monitorowane u tego samego podmiotu przez pewien okres czasu13.
Płuco bydlęce jako odpowiedni model oddechowy
Ze względu na dużą liczbę istotnych różnic w anatomii płuc, fizjologii układu oddechowego i immunologii płuc, myszy nie odtwarzają wielu ważnych patofizjologicznych aspektów ludzkiej choroby płuc. Należy to wziąć pod uwagę przy stosowaniu ich jako zwierzęcych modeli chorób układu oddechowego2,9,14-16. Chociaż istnieją osobliwości anatomiczne i strukturalne dla każdego płuca ssaka, cechy funkcjonalne (tj. objętość płuc, przepływ powietrza i mechanika oddechowa) są lepiej porównywalne między dorosłymi ludźmi a cielętami ze względu na podobną masę ciała (50-100 kg).
Specyficzne dla gatunku cechy płuca bydlęcego są podsumowane w następujący sposób: lewe płuco składa się z dwóch płatów (lobus cranialis, który jest podzielony na dwa segmenty, i lobus caudalis), podczas gdy prawe płuco składa się z czterech płatów (lobus cranialis, lobus medius, lobus caudalis, i lobus accessorius). W przeciwieństwie do anatomii płuc większości innych ssaków, oskrzela prawego płata czaszki rozgałęziają się bezpośrednio z prawej bocznej strony tchawicy. Jeśli chodzi o anatomię podbrzuszną, płuca bydła charakteryzują się wysokim stopniem zrazikowania i wysokim odsetkiem tkanki śródmiąższowej17,18, co prowadzi do stosunkowo niskiej swoistej podatności płuc i wyższej odporności tkanki płucnej19. W związku z tym wymagana aktywność oddechowa jest dość wysoka w porównaniu z innymi gatunkami20,21. Wysoki stopień zrazienia prowadzi do silnej niezależności segmentów. W ten sposób procesy zapalne są ograniczone przez przegrody tkanki łącznej, a chore i zdrowe segmenty często leżą w tym samym płacie. Ze względu na brak pobocznych dróg oddechowych, płuco bydlęce jest szczególnie odpowiednie do odzwierciedlania obturacyjnych dysfunkcji płuc13. Jeśli chodzi o unaczynienie w płucach bydła, małe tętnice płucne wykazują bardzo wyraźne warstwy mięśni gładkich. Dlatego cielę może również służyć jako dobrze ugruntowany zwierzęcy model nadciśnienia płucnego lub przebudowy naczyń22-24.
Jeśli chodzi o infekcje dróg oddechowych, naturalnie występujące choroby występują u zwierząt gospodarskich, które mają wiele podobieństw do porównywalnej choroby u człowieka. Typowymi przykładami są gruźlica bydła25, infekcje syncytialnym wirusem oddechowym (RSV) u cieląt26-28 lub naturalnie nabyte infekcje Chlamydia 29. Tak więc duże modele zwierzęce bardzo przypominają sytuację u naturalnego gospodarza. Dlatego są one najbardziej przydatne do badania interakcji gospodarz-patogen i złożonej patofizjologii odpowiadającej im choroby u ludzi30,31.
Jako biologicznie istotny model zakażenia Chlamydia psittaci, wybrano cielęta, ponieważ bydło stanowi naturalnych gospodarzy dla tego patogenu32-35. Informacje uzyskane z tego modelu, w odniesieniu do patogenezy choroby lub możliwych dróg przenoszenia się między zwierzętami a ludźmi, pomogą poszerzyć naszą wiedzę, która będzie miała wpływ zarówno na bydło, jak i człowieka. Model może również pomóc w weryfikacji ogólnie przyjętych i alternatywnych opcji terapeutycznych w zakresie eliminacji zakażeń płucnych C. psittaki, co jest ponownie interesujące zarówno w medycynie weterynaryjnej, jak i ludzkiej.
Techniki stosowane i próbki uzyskiwane z układu oddechowego bydła
Ten artykuł opisuje i ilustruje techniki i metody diagnostyczne stosowane do płuc bydlęcych i używane w naszym modelu do oceny zarówno wpływu patogenu na płuca ssaków, jak i skuteczności interwencji terapeutycznej.
Bronchoskopia jest wykonywana w medycynie ludzkiej od lat 60. i jest uważana za bezpieczną procedurę36. U cieląt eksperymentalną bronchoskopię opisano po raz pierwszy w 1968 roku37. Dooskrzelowe stosowanie patogenów zostało zasugerowane przez Potgietera i wsp. jako niezawodna metoda wywoływania chorób dolnych dróg oddechowych u cieląt38 i jest obecnie szeroko rozpowszechnioną metodą w badaniach bydła34,39,40. Inokulacja dooskrzelowa określonej ilości patogenu pod kontrolą wideoendoskopową pozwala na selektywne umieszczenie czynnika zakaźnego w płucach. Prowadzi to do spójnych wyników klinicznych i patologicznych u wszystkich zwierząt34 i umożliwia ukierunkowane pobieranie próbek z regionów płuc, które prawdopodobnie ulegną zmianie w wyniku narażenia na patogen.
Płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) jest dobrze opisanym wskaźnikiem obecności i nasilenia zapalenia płuc. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) jest standardową procedurą w medycynie ludzkiej w diagnostyce różnych chorób układu oddechowego41. U żywego bydła BAL został wprowadzony przez Wilkie i Markhama pod koniec lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku42. Uznano ją za bezpieczną i powtarzalną technikę badania dolnych dróg oddechowych bydła. Ze względu na brak wystarczających danych na temat parametrów BALF u zdrowych zwierząt, w 1988 roku Pringle i wsp. wykonali BAL na zdrowych cielętach za pomocą elastycznego bronchoskopu światłowodowego. Autorzy zwrócili również uwagę na potrzebę standaryzacji protokołów BAL w warunkach eksperymentalnych w celu uzyskania porównywalnych wyników43. BAL jest nadal stosowany jako metoda pobierania próbek in vivo u cielątw wieku 44-46 lat.
Szczotkowanie oskrzeli jest powszechnie używane w medycynie ludzkiej jako narzędzie diagnostyczne do pobierania próbek zmian nowotworowych lub do analizy mikrobiologicznej36. Do celów badawczych można uzyskać pierwotne hodowle komórkowe komórek nabłonka pobranych metodą szczotkowania cytologicznego47. U bydła opisano stosowanie szczotek oskrzelowych do analizy mikrobiologicznej w celu scharakteryzowania środowiska mikrobiologicznego płuc43.
Przezoskrzelowa biopsja płuc dostarcza próbek tkanki płucnej i jest cennym narzędziem diagnostycznym dla rozlanych chorób płuc u ludzi. Jatrogenna odma opłucnowa i krwotok związany z zabiegiem to powikłania związane z tą techniką. Ich częstość występowania wynosi mniej niż jeden procent u ludzi48. Przezoskrzelowa biopsja płuc nie jest powszechną metodą stosowaną u bydła ze względu na wysoki koszt wymaganego sprzętu i czas potrzebny do uzyskania biopsji. Zamiast tego przezskórne biopsje płuc są wygodniejsze w warunkach polowych49-51.

<table><tbody><tr><td>Weterynaryjny wideoendoskop</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Niemcy</td><td>PV-SG 22&ndash; 140</td><td>średnica: 9 mm, kanał roboczy: 2,2 mm, długość robocza 140 cm</td></tr><tr><td>Cewnik do mycia</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Niemcy</td><td></td><td>średnica: 2 mm; długość: 180 cm, Adapter Luer-lock</td></tr><tr><td>Siłownik</td><td>WEPA Apothekenbedarf GmbH & Co KG, Hillscheid, Niemcy</td><td>32660</td><td>długość: 60 mm</td></tr><tr><td>Kleszczyki do biopsji</td><td>Karl Storz GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Niemcy</td><td>REF 60180LT</td><td>1,8 mm, ząbkowane, owalne</td></tr><tr><td>Omnifix 20 ml, Luer-Lock</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td>4617207V</td><td></td></tr><tr><td>Szczoteczka do cytologii</td><td>mtp GmbH, Neuhausen ob Eck, Niemcy</td><td>110240-10</td><td>długość robocza 180 cm, długość szczotki: 15 mm, średnica 1,8 mm</td></tr><tr><td>iv acess</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Niemcy</td><td>370-211</td><td>średnica: 1,2 mm; długość: 43 mm</td></tr><tr><td>Rompun 2% (xylazin)</td><td>Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Niemcy</td><td></td><td>0,2 mg/kg masy ciała</td></tr><tr><td>Ketamin 10% (ketamina)</td><td>bela-pharm GmbH & Co. KG, Vechta, Niemcy</td><td></td><td>2,0 mg/kg masy ciała</td></tr><tr><td>Izotoniczny roztwór soli</td> fizjologicznej <td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td></td><td></td>3200950</tr><tr><td>SUB 6 kąpiel wodna</td><td>CLF analytische Laborger&auml; te GmbH, Emersacker, Niemcy</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wziernik z metalowej rurki</td><td>n/a</td> nie <td>dotyczy</td><td>średnica: 3,5 cm; długość: 35 cm</td></tr><tr><td>Latarka</td><td>n/a</td> n<td>/d</td><td></td></tr><tr><td>Butelki ze szkła silikonowanego</td><td>nie</td><td>dotyczy</td><td>silikonu z Sigmacote (Sigma-Aldrich Co. LLC)</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>Omnifix Luer 5 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td>4616057V</td><td></td></tr><tr><td>Zatyczki uszczelniające</td><td>Henry Schein Vet GmbH, Hamburg, Niemcy</td><td>900-3057</td><td></td></tr><tr><td>Inokulum</td><td></td><td>n/a</td><td>rozcieńczony patogen w 8 ml buforze</td></tr></tbody></table>

płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo

The Bovine Lung in Biomedical Research: Visually Guided Bronchoscopy, Intrabronchial Inoculation and In Vivo Sampling Techniques

Trwają poszukiwania alternatywnych modeli zwierzęcych w badaniach nad medycyną układu oddechowego. W zależności od celu badań, duże zwierzęta jako modele chorób płuc często znacznie lepiej przypominają sytuację ludzkiego płuca niż myszy. Praca z dużymi zwierzętami daje również możliwość wielokrotnego pobierania próbek od tego samego zwierzęcia w określonym czasie, co pozwala na długoterminowe badania bez poświęcania zwierząt.
Celem było ustalenie metod pobierania próbek in vivo do wykorzystania w bydlęcym modelu infekcji oddechowej Chlamydia psittaci. Pobieranie próbek powinno być wykonywane w różnych punktach czasowych u każdego zwierzęcia podczas badania, a próbki powinny być odpowiednie do badania reakcji gospodarza, a także patogenu w warunkach doświadczalnych.
Bronchoskopia jest cennym narzędziem diagnostycznym w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej. Jest to zabieg bezpieczny i mało inwazyjny. W artykule opisano inokulację wewnątrzoskrzelową cieląt, a także metody pobierania próbek z dolnych dróg oddechowych. Wideoendoskopowa inokulacja dooskrzelowa prowadzi do bardzo spójnych wyników klinicznych i patologicznych u wszystkich zaszczepionych zwierząt i dlatego dobrze nadaje się do stosowania w modelach zakaźnej choroby płuc. Opisane metody pobierania próbek to płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, szczotkowanie oskrzeli i przezoskrzelowa biopsja płuc. Wszystkie te narzędzia są cennymi narzędziami diagnostycznymi w medycynie ludzkiej i mogą być dostosowane do celów eksperymentalnych u cieląt w wieku 6-8 tygodni. Uzyskane próbki nadawały się zarówno do wykrywania patogenów, jak i charakterystyki nasilenia zapalenia płuc u gospodarza.

Przebieg choroby
Wpływ patogenu na stan zdrowia zwierząt można ocenić za pomocą badania klinicznego. W naszych modelach infekcji dróg oddechowych zwierzęta były badane dwa razy dziennie, a obserwacje kliniczne zapisywano przy użyciu systemu punktowego. Dodatkowe informacje pozyskiwano, stosując inne metody pobierania próbek in vivo, np. pobieranie krwi i wymazów lub pomiar funkcji płuc. Badania patomorfologiczne przeprowadzano w różnych punktach czasowych po inokulacji, aby opisać postępy infekcji32-34.
Wskaźnik odzyskania BALF
Wskaźnik odzysku wprowadzonego płynu wyniósł 83,05 ± 4,58% (średnia ± SD).
Wykrywanie patogenów
Rekultywację patogenu można przeprowadzić z materiału pobranego za pomocą szczoteczki oskrzelowej. Możliwe jest również badanie przesiewowe PCR różnych próbek w celu wykrycia patogenu, np. biopsji tkankowej, wymazu cytologicznego, komórek płynu z przemycia bronchoalveolarnego (BALF)52 lub wymazu z gardła. Wizualizacja patogenu jest możliwa poprzez wykonanie immunohistochemii mrożonych przekrojów biopsji płuc oraz preparatów osadowych z komórek BALF (Rysunek 3). W poprzednich eksperymentach wykonano PCR próbek krwi oraz wymazów (z spojówek, kału, nosa), aby scharakteryzować rozprzestrzenianie się i wydalanie patogenu32.
Markery miejscowego stanu zapalnego tkanki płucnej
W płynie z przemywania oskrzeli i pęcherzyków płucnych (BALF) można badać różne parametry stanu zapalnego płuc. Całkowita liczba komórek oraz proporcja neutrofili zazwyczaj wzrastają w przypadku wystąpienia stanu zapalnego płuc. W celu różnicowania komórek preparaty osadowe komórek BALF można barwić metodą Giemsy i różnicować przy użyciu imersji olejowej (Rysunek 4). Frakcję komórkową i ciekłą BALF rozdziela się poprzez wirowanie (300 x g; 20 min). Nadfiltr BALF zawiera różne markery, które zmieniają się podczas procesów zapalnych w płucach i mogą być badane w warunkach eksperymentalnych. Przykładami są całkowite białko oraz eikozanoidy29,34.
Schematyczny przegląd potencjalnych dalszych zastosowań opisanych próbek przedstawiono na Rysunku 5.
<img alt="&lt;b&gt;Schemat anatomii płuc; opisane oskrzela i płaty do celów edukacyjnych.&lt;/b&gt;" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat płuca bydlęcego z zaznaczonymi miejscami inokulacji (kolor żółty). Numery wskazują kolejność podawania inokulum do poszczególnych oskrzeli. R: prawy; L: lewy. Płuco prawe: 1 Lobus medius: 0.5 ml, 2 Lobus accessorius: 0.5 ml, 3 Lobus caudalis: 0.5 ml oraz 4 1.0 ml; Płuco lewe: Lobus cranialis, 5 Pars cranialis: 0.5 ml, 6 Pars caudalis: 0.5 ml, 7 Lobus caudalis: 1.5 ml, 8 Lobus cranialis, Pars caudalis: 1.0 ml.
<img alt="Schemat drenażu limfatycznego płuc z zaznaczonymi drogami węzłów do badań edukacyjnych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat płuca bydła z miejscami inokulacji (żółte) i miejscami pobierania próbek: płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (niebieskie), szczotkowania oskrzeli (zielone) oraz biopsji płuc (pomarańczowe). Należy zwrócić uwagę, że wszystkie próbki pobrano z obszarów, w których wcześniej naniesiono patogen. R: prawy, L: lewy.
<img alt="Barwione przekroje histologiczne; a) struktura tkanki, b) liczba komórek; obraz mikroskopowy, skala 100 μm." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. a) Biopsja płuca cielęcia zaszczepionego Chlamydia psittaci 4 dni po szczepieniu (dpi), b) osad komórkowy BALF z cielęcia zaszczepionego C. psittaci 9 dpi. Barwienie immunohistochemiczne przeciwko chlamydiom. Wtrącenia chlamydialne (strzałki) obecne są w płucu (a) oraz w makrofagach pęcherzykowych (b). Kontrastowanie hematoksyliną.
<img alt="Obraz mikroskopowy barwionych ludzkich komórek; skala 20μm; obserwacja struktury komórkowej." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Osad komórkowy BALF z cielęcia inokulowanego C. psittaci w 9 dpi. Makrofagi pęcherzykowe (#) są dominującym typem komórek w BALF. Liczba granulocytów neutrofilowych (*) wzrasta w obecności procesów zapalnych. Modyfikowane barwienie Pappenheima.
<img alt="Schemat pobierania próbek z oskrzeli: diagram płukania, szczotkowania i biopsji; obejmuje etapy PCR i mikroskopii." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51557/51557fig5highres.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Możliwe metody przygotowania próbek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51557/51557fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje techniki bronchoskopowe w płucach bydlęcych w warunkach eksperymentalnych, tj. inokulację pod kontrolą bronchoskopową, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, szczotkowanie oskrzeli i przezoskrzelową biopsję płuc.

Płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo

There is an ongoing search for alternative animal models in research of respiratory medicine. Depending on the goal of the research, large animals as ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie interakcji między gospodarzem a patogenem w bydlęcym modelu infekcji dróg oddechowych. Cel ten osiąga się poprzez indukowanie infekcji dróg oddechowych u cieląt poprzez wewnątrzbronchialną inokulację odpowiednim patogenem w trakcie przebiegu choroby. Próbki z organizmu zwierzęcia są pobierane wielokrotnie za pomocą płukania przedsionka i oskrzeli (BAL).Następnie pobiera się wymazy z oskrzeli oraz biopsje płuc drogą transbronchialną w celu uzyskania odpowiednio komórek nabłonkowych oraz próbek tkanki pęcherzykowej lub płucnej. Ostatecznie można potwierdzić obecność patogenowo swoistej choroby układu oddechowego, na przykład poprzez zmiany zapalne w płukaninach, badanie cytologiczne oraz immunohistochemiczną detekcję patogenu. W przypadku biopsji płuc drogą transbronchialną główną zaletą tego modelu na dużych zwierzętach w porównaniu z innymi istniejącymi modelami zwierzęcymi i gryzoniami jest możliwość badania przebiegu choroby w tym samym osobniku przez długi okres czasu dzięki wielokrotnemu pobieraniu próbek.Choć metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w interakcje między patogenem a gospodarzem in vivo, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak alternatywne patogeny lub gatunki gospodarzy. Utrzymanie znieczulenia i pomoc przy pobieraniu próbek zaprezentuje fisher, lekarz weterynarii z naszego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury należy napełnić trzy strzykawki odpowiednio jednym, dwoma i pięcioma mililitrami inokulum.Następnie, po potwierdzeniu działania znieczulenia, wyciągnij język zwierzęcia i rozciągnij szyję. Następnie, wykonując lekkie ruchy obrotowe, wprowadź metalowe rozwieracz do pyska zwierzęcia. Przesuń rozwieracz do przodu, kontrolując miejsce wprowadzenia i używając latarki, aby określić moment, w którym krtań stanie się widoczna.Następnie wprowadź rurkę teflonową do kanału roboczego endoskopu. Rurka nie powinna wystawać poza końcówkę endoskopu. Wprowadź endoskop przez rozwierak.Może być konieczne wykonanie niewielkich korekt ustawienia wziernika, aby umożliwić wprowadzenie endoskopu. Aby przejść przez krtanią, należy wykorzystać tchawicę, która odgałęzia się w prawą stronę płuca, co pomoże w wyrównaniu obrazu na monitorze. Następnie do końca rurki teflonowej należy przymocować strzykawkę zawierającą 5 mL inokulum.Wprowadź rurkę do rozgałęzień, w których zostanie zdeponowany inokulum, a następnie podaj odpowiednią ilość inokulum. Następnie do rurki podłącz strzykawkę zawierającą 1 ml inokulum. Przesuń się do oskrzeli i zdeponuj inokulum w gałęzi bocznej.Wyjmij endoskop i wziernik. Następnie przymocuj ostatnią strzykawki do aktywatora i wtryśnij jeden mililitr inokulum do każdej nozdrza. Umieść zwierzę z powrotem w klatce w pozycji brzusznej do wybudzenia.Boks pooperacyjny powinien być klimatyzowany, ponieważ podczas znieczulenia ogólnego zdolność zwierzęcia do termoregulacji jest ograniczona. Aby pobrać próbki z zastawki w wyznaczonym czasie, ogrzać w kąpieli wodnej o temperaturze 38°C pięć strzykawek zawierających każda po 20 ml sterylnej soli fizjologicznej. Następnie wprowadzić cewnik do płukania do kanału roboczego endoskopu, a endoskop wprowadzić do metalowego wziernika.Następnie należy przesunąć endoskop w głąb głównego oskrzela lewego płuca, aż do osiągnięcia pozycji klinowej i momentu, w którym dalsze posuwanie endoskopu nie będzie możliwe. Potem kolejno podłączaj strzykawki z ciepłym roztworem chlorku sodu do cewnika do płukania w celu wprowadzania i bezpośredniego odsysania płynu.Przechowywać płyn z prania oskrzelowo-pęcherzykowego w butelkach szklanych silikonizowanych na lodzie natychmiast po odzyskaniu, aby zapobiec przywieraniu makrofagów pęcherzykowych do powierzchni szkła. Odnotować zarówno ilość podanej soli fizjologicznej, jak i ilość odzyskanego płynu. Następnie wyjąć cewnik do prania z kanału roboczego w celu pobrania komórek nabłonkowych.Następnie wprowadź endoskop do pożądanego miejsca pobrania próbek. Na przykład w tym doświadczeniu do rozwidlenia tchawki. Gdy endoskop znajdzie się na miejscu, osłoń szczoteczkę oskrzelową rurką i wprowadź ją do kanału roboczego endoskopu, aż końcówka szczoteczki pojawi się na monitorze. Przesuń szczoteczkę wraz z plastikową rurką do przodu o około pięć centymetrów.Następnie pchnij uchwyt szczoteczki, aby wysunąć ją z plastikowej rurki. Gdy szczoteczka znajdzie się w odpowiedniej pozycji, skieruj ją w miejsce, które ma zostać oczyszczone. Następnie delikatnie przesuwaj szczoteczkę przód i tył, jednocześnie manewrując endoskopem.Należy zapewnić kontakt szczoteczki ze ścianą oskrzeli, aby zetrzeć komórki nabłonka. Przecieranie należy przerwać w momencie wystąpienia krwawienia. Następnie szczoteczkę należy przykryć probówką i wyciągnąć ją z kanału roboczego.Ostrożnie przetocz szczeczkę pokrytą komórkami nabłonkowymi po maksymalnie pięciu szkiełkach przedmiotowych i utrwal rozmazy w zimnym metanolu przez 10 minut. Następnie po wysuszeniu szkiełek na powietrzu, przechowuj je w temperaturze -20 °C w celu wykonania transbronchialnej biopsji płuc. W dalszej kolejności wprowadź endoskop do pożądanego miejsca pobrania próbek.Na przykład, w przypadku LOAs crans w tym eksperymencie, przed wprowadzeniem kleszczy biopsyjnych do kanału roboczego, należy kilka razy je otworzyć i zamknąć, aby upewnić się, że działają prawidłowo, a następnie przesunąć kleszczyki do bocznej gałęzi tchawki oskrzelowej, aż poczujemy lekki opór. Następnie należy wycofać kleszczyki o dwa do trzech centymetrów i je otworzyć. Ponownie przesunąć kleszczyki do przodu o około dwa centymetry, a następnie je zamknąć.Wycofać i wyjąć kleszczyki z kanału roboczego. Za pomocą igły ostrożnie usunąć tkankę z kleszczyków do biopsji i umieścić ją w odpowiednim medium utrwalającym, aby zapobiec procesom autolitycznym. Na koniec, po umożliwieniu cielęciu regeneracji w boksie, ponownie monitorować zwierzę pod kątem odmy opłucnej przez kolejne 24 godziny, zapewniając paszę i świeżą wodę.Po odzyskaniu przez zwierzę pełnej przytomności można przeprowadzić barwienie immunohistochemiczne mrożonych sekcji biopsji płuca pobranych drogą przezbronchialną. Aby zwizualizować wprowadzony patogen, należy zwrócić uwagę na brązowe inkluzje chlamydii w płucach tego zwierzęcia, które zostało zaszczepione chlamydią C na cztery dni przed pobraniem próbek. Barwienie immunohistochemiczne komórek z płukania pozwala na wizualizację patogenów wewnątrzkomórkowych.Na przykład na tym obrazie widoczne są inkluzje chlamydialne obecne w makrofagach pęcherzykowych pobranych od cielęcia. CTAC można zaobserwować dziewięć dni po wewnątrzbronchialnym zaszczepieniu chlamydiami. Komórki z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego można zróżnicować za pomocą barwienia cytologicznego.Makrofagi pęcherzykowe są dominującym typem komórek w płycinie z płukania. Jednak liczba granulocytów neutrofilnych wzrasta w obecności procesów zapalnych. Po opanowaniu techniki, inokulacja może zostać przeprowadzona w ciągu 10 do 15 minut, a pobieranie próbek w ciągu 20 do 30 minut, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzać inokulację wewnątrzoskrzelną u cieląt oraz jak pobierać płyn z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego, wymazy ze oskrzeli oraz biopsje płuc transbronchialne u znieczulonego zwierzęcia.

the-bovine-lung-biomedical-research-visually-guided-bronchoscopy

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Płuca bydła w badaniach biomedycznych: Wizualnie sterowana bronchoskopia, wewnątrzoponowa inokulacja i techniki pobierania próbek in vivo

Opisujemy technikę badawczą bronchoskopii światłowodowej i płukania oskrzelowo-pęcherzykowego za pomocą odsysania niskociśnieniowego. Technika ta służy do pobierania komórek odpornościowych z powierzchni oskrzelowo-pęcherzykowych płuc. Stosuje się znieczulenie miejscowe i łagodną świadomą sedację (midazolam). Badani dobrze tolerują zabieg i odczuwają minimalne skutki uboczne.

płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) do badań; Uzyskanie odpowiedniej wydajności próbki

Ten film opisuje podejście dooskrzelowe polegające na selektywnym podawaniu eksperymentalnego środka do dystalnego prawego i lewego płuca. W przedstawionym protokole będziemy podawać bleomycynę dooskrzelowo myszy, aby uzyskać lepszy model zwłóknienia płuc.

Podawanie dooskrzelowe: technika selektywnego podawania eksperymentalnego środka do płuc myszy

W tym filmie opisujemy zabieg chirurgiczny polegający na ekstrakcji tkanek oskrzelików z pobranego płuca świni. Tkanka oskrzelików ex vivo może zostać wykorzystana do opracowania modeli infekcji do badania przewlekłych infekcji płuc.

Ekstrakcja tkanki oskrzelowej świni: procedura polegająca na wypreparowaniu skrawków tkanki oskrzelikowej z płuc świń

Ten film pokazuje proces powstawania infekcji płuc u immunokompetentnego modelu gryzoni poprzez intubację i instalację zawiesin bakteryjnych w płatach płuc. Model ten umożliwia badania skuteczności przeciwbakteryjnej u zwierząt immunokompetentnych.

Wkraplanie dooskrzelowe Streptococcus pneumoniae w immunokompetentnych modelach gryzoni

Użycie modelu, który naśladuje stan chorób płuc u ludzi, jest kluczowe dla badania patofizjologii i/lub etiologii danej choroby oraz dla opracowania interwencji terapeutycznej. W artykule przedstawiono nieinwazyjną metodę intubacji dotchawiczej, która może bezpośrednio dostarczać materiały egzogenne do płuc myszy.

Nieinwazyjna intubacja dotchawicza w celu zbadania patologii i fizjologii płuc myszy

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Dotchawicze (IT) podawanie eksperymentalnych środków myszom często powoduje asymetryczne dostarczanie do dystalnych płuc. W tym raporcie opisujemy bezpośrednie podejście dooskrzelowe (IB) do kanniulacji każdego płuca u żywych myszy bez operacji. To podejście może być stosowane do selektywnego podawania środków do jednego płuca lub może być dostosowane do poprawy symetrycznego dostarczania środka do obu płuc.

Bezpośrednie podanie dooskrzelowe w celu poprawy selektywnego odkładania się czynnika w płucach myszy

Przedstawiamy tutaj protokół dotyczący obrazowania intravitalnego zmniejszonej, zatwierdzonej na poziomie BSL-2 Mycobacterium tuberculosis. szczepu w płucach mysich przy użyciu stałego okna płucnego. Takie podejście umożliwia długotrwałą analizę z rozdzielczością pojedynczych komórek wczesnych interakcji gospodarz-patogen, w tym lokalizacji pałeczek, dynamiki naczyń i fagocytozy przez makrofagi w tym samym mikrośrodowisku płuc.

Obrazowanie in vivo zmniejszonego wzrostu Mycobacterium tuberculosis w płucach mysich podczas wczesnej infekcji dokrewnej

Opisano zestaw testowy (IMAP) służący do pogłębionej oceny zdolności słuchowych i poznawczych wpływających na umiejętności słuchania. Jest on szybki w przeprowadzeniu, przyjazny dla dzieci i wolny od zakłóceń językowych. Generowanie bodźców oraz zarządzanie protokołem są kontrolowane za pomocą platformy programowej (IHR-STAR), co zapewnia powtarzalność procedur.

Zrozumienie procesu słuchania: zestaw testów IMAP

Perfuzja płuc Ex-Vivo (EVLP) umożliwiła przeszczep płuc u ludzi dzięki umożliwieniu oceny narządów i rozszerzeniu puli dawców. W tym miejscu opisujemy rozwój programu EVLP dla szczurów i udoskonalenia, które pozwalają na stworzenie powtarzalnego modelu do przyszłej rozbudowy.

Metoda izolowanej perfuzji płuc ex vivo w modelu szczurzym: wnioski wyciągnięte z opracowania programu EVLP dla szczurów

Poznaj techniki bronchoskopowe w płucach bydlęcych do badania interakcji patogen-gospodarz. Metoda obejmuje inokulację dooskrzelową, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe i biopsję płucną u cieląt.

Płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Płuca bydlęce w badaniach biomedycznych: bronchoskopia sterowana wizualnie, inokulacja dooskrzelowa i techniki pobierania próbek in vivo

Przeglądaj więcej filmów