Name: Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj metodę indukcji ostrego urazu mózgu u myszy z podłużnym obrazowaniem dwufotonowym. Technika ta umożliwia badanie zachowania komórek mózgowych w warunkach pourazowych oraz rozwój strategii terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy głęboko wdzięczni Dr. Frankowi Kirchhoffowi za dostarczenie szczepów myszy GFAP-EGFP i CX3CR1-EGFP. Prace były wspierane przez granty z Centrum Mobilności Międzynarodowej Finlandii, Tekes, Fińskiej Wyższej Szkoły Neuronauki (FGSN) oraz Akademii Fińskiej.

Wszystkie przedstawione tutaj procedury zostały wykonane zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami (Fińska ustawa o doświadczeniach na zwierzętach 62/2006). Licencja na zwierzę (ESAVI/2857/04.10.03/2012) została uzyskana od władz lokalnych (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Dorosłe myszy w wieku 1-3 miesięcy, o wadze 24-38 g, trzymano w indywidualnych klatkach w certyfikowanym obiekcie dla zwierząt Uniwersytetu i zaopatrywano w pokarm i wodę ad libitum.
1. Obrazowanie uszkodzeń mózgu przez okno czaszkowe
<ol>
	<li>Znieczulanie zwierząt i przygotowanie pola operacyjnego
	<ol>
		<li>Znieczulenie myszy przez wstrzyknięcie otrzewnowe mieszaniny ketaminy (Ketalar, 80 mg/kg) i ksylazyny (Rompun, 10 mg/kg) rozpuszczonej w soli fizjologicznej z wysterylizowanym przez filtr bufor fosforanowy (PBS), pH 7,4. Regularnie sprawdzaj odruchy myszy (sonda szczypania ogona i palców), aby zweryfikować głębokość znieczulenia. W razie potrzeby należy zwiększyć dawkę, aby utrzymać prawidłowe znieczulenie, ale uniknąć przedawkowania.</li>
		<li>Utrzymuj zwierzę w temperaturze 37,0 °C za pomocą poduszki grzewczej podczas operacji chirurgicznej, sesji obrazowania i pierwszej godziny po wyzdrowieniu ze znieczulenia.</li>
		<li>Aby chronić oczy myszy przed wysuszeniem, nałóż lubrykant do oczu.</li>
		<li>Deksametazon (Rapidexon vet, 2 mg/kg) należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym w celu zmniejszenia stanu zapalnego i obrzęku mózgu.</li>
		<li>Lek przeciwbólowy (na przykład Ketoprophen należy podawać dootrzewnowo) do 30 minut przed lub bezpośrednio po zabiegu. Jeśli zwierzę wykazuje jakiekolwiek objawy bólowe, takie jak niechęć do poruszania się, jedzenia lub picia, utrata masy ciała, ślinotok, piloerekcja lub nieprawidłowe dźwięki oddechowe po operacji, powtórz wstrzyknięcie leku przeciwbólowego.</li>
		<li>Ogol głowę myszy za pomocą maszynki do golenia (patrz Materiały i sprzęt). Unikaj uszkadzania wąsów.</li>
		<li>Potraktuj skórę na głowie myszy 70% roztworem etanolu, aby oczyścić ogolony obszar.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych (patrz Materiały i sprzęt) oraz kleszczy (patrz Materiały i sprzęt) przeciąć skórę od środkowej linii między uszami do czoła.</li>
		<li>Delikatnie zeskrob tkankę łączną przyczepioną do czaszki ostrzem mikrochirurgicznym.</li>
		<li>Przesuń krawędzie skóry na boki i lekko wciągnij nauszniki w otwory słuchowe czaszki w celu ustabilizowania głowy i skóry.</li>
		<li>Oczyść czaszkę sterylnym PBS i potraktuj miejsce operacji na głowie myszy 0,5% diglukonianem chlorheksydyny, a następnie osusz powierzchnię czaszki za pomocą kombinacji sterylnych wacików bawełnianych i sprężonego powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zadawanie urazu kłutego
	<ol>
		<li>Umieść instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt z uchwytem na zwierzę (patrz Materiały i wyposażenie).</li>
		<li>Dostosuj położenie mikroskopu dwuokularowego obok instrumentu stereotaktycznego, aby ustawić ostrość na powierzchni czaszki zwierzęcia.</li>
		<li>Za pomocą mikroskopu dwuokularowego zlokalizuj punkt bregma na czaszce.</li>
		<li>Zidentyfikuj obszar zainteresowania za pomocą współrzędnych stereotaktycznych. 
		UWAGA: Unikaj tych obszarów zainteresowania, które znajdują się bezpośrednio nad powierzchownymi naczyniami korowymi. Ich zniszczenie może silnie wpłynąć na postęp traumy.</li>
		<li>Umieść igłę 30 G nad wybranym obszarem i zaznacz miejsce docelowe, drapiąc powierzchnię czaszki.</li>
		<li>Przewiercić czaszkę z zachowaniem wszelkich możliwych środków ostrożności, aby uniknąć niepotrzebnego poszerzenia dotkniętego obszaru kości. Użyj szybkoobrotowej wiertarki chirurgicznej (patrz Materiały i sprzęt) pod mikroskopem. Przerwij wiercenie, jeśli w wierconym obszarze pojawi się ciecz.</li>
		<li>Dotknij igłą dna wywierconej studni.</li>
		<li>Zanurz igłę gładko w mózgu (szybkość wprowadzania 5-10 mm/min), na głębokość 0,5-2,0 mm zgodnie ze współrzędnymi miejsca nakłucia.</li>
		<li>Wyjąć igłę natychmiast po osiągnięciu pożądanej głębokości (szybkość cofania 5-10 mm/min) i przetrzeć krew powstałą po ukłuciu małym tamponem (patrz Materiały i sprzęt).</li>
		<li>Wykonać mikroiniekcję 100 μM sulforodaminy 101 lub innego związku będącego przedmiotem zainteresowania w miejsce zmiany za pomocą pompy mikrostrzykawkowej (WPI) i 10 μl strzykawki Hamiltona ze szklaną pipetą. 
		UWAGA: Podczas przygotowywania szklanej pipety z kapilary ze szkła borokrzemianowego należy naostrzyć końcówkę do średnicy 10-20 μm.</li>
		<li>Wlać w infuzji 250-1 500 nl roztworu do wstrzykiwań z szybkością 2-5 nl/sek. 
		UWAGA: Pozostaw pipetę po zakończeniu infuzji na co najmniej 5 minut w miąższu mózgu, a następnie wyjmij ją powoli i delikatnie, aby zapobiec wyciekowi roztworu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kraniotomia z powodu przewlekłego okna czaszkowego
	<ol>
		<li>Delikatnie i ostrożnie nawiercić czaszkę, aby zrobić okrągłe okienko wokół miejsca urazu. Użyj średnicy okienka 3-3,5 mm.</li>
		<li>Nałóż kroplę buforu kory mózgowej (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 i 2 mMMgSO4 w destylowanymH2O), aby zakryć okno.</li>
		<li>Umieść okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (grubość #1.5) na oknie czaszki.</li>
		<li>Usunąć nadmiar buforu kory wokół szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Uszczelnić krawędzie szkiełka nakrywkowego klejem poliakrylowym (patrz Materiały i wyposażenie). 
		UWAGA: Upewnij się, że klej nie jest nałożony na górną powierzchnię szkiełka nakrywkowego. Jeśli szkło nakrywkowe jest zanieczyszczone klejem, poczekaj, aż szkło zostanie stabilnie przyklejone do czaszki, a klej na powierzchni szkła wyschnie, a następnie ostrożnie usuń zanieczyszczający klej za pomocą mikroostrza.</li>
		<li>Odczekaj 5 minut, aby klej wysechł.</li>
		<li>Za pomocą wysokości belki dousznej wyreguluj pozycję głowicy tak, aby można było umieścić metalowy uchwyt.</li>
		<li>Nałóż niewielką ilość kleju poliakrylowego na pierścień stalowego uchwytu (patrz Materiały i wyposażenie).</li>
		<li>Przyklej pierścień stalowego uchwytu do szklanego szkiełka nakrywkowego z metalowym uchwytem uchwytu skierowanym do tyłu.</li>
		<li>Odczekaj 5 minut, aby klej wysechł.</li>
		<li>Wymieszaj cement dentystyczny (patrz Materiały i sprzęt) z klejem poliakrylowym na 3,5 cm szalce Petriego (lub analogu), aby uzyskać lepkie warunki.</li>
		<li>Uszczelnij granice okna czaszki mieszanką cementu + kleju i przykryj odsłoniętą powierzchnię czaszki tą samą mieszaniną aż do granicy skóry.</li>
		<li>Odczekaj 15 minut, aby mieszanina cementu i kleju wyschła, a następnie usuń nauszniki.</li>
		<li>Wykonać obrazowanie mikroskopowe wzbudzenia dwufotonowego (TPEM) dla obszaru zainteresowania i obszaru kontrolnego, jak opisano w Protokole 3.</li>
		<li>Po wykonaniu zdjęć pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na poduszce grzewczej i trzymaj je w indywidualnej klatce pod obserwacją aż do pełnego wyzdrowienia. Można podawać mokrą karmę, aby ułatwić żucie i nawodnienie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie uszkodzeń mózgu przez przerzedzoną czaszkę
<ol>
	<li>Znieczulanie zwierząt i przygotowanie pola operacyjnego
	<ol>
		<li>Znieczulij mysz i przygotuj ją do indukcji urazu zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przerzedzenie czaszki i zadawanie ukłucia
	<ol>
		<li>Umieść przyrząd stereotaktyczny dla małych zwierząt z uchwytem na zwierzę (patrz Materiały i wyposażenie).</li>
		<li>Dostosuj położenie mikroskopu dwuokularowego obok instrumentu stereotaktycznego, aby ustawić ostrość na powierzchni czaszki zwierzęcia.</li>
		<li>Zlokalizuj punkt bregma na czaszce za pomocą mikroskopu dwuokularowego, zidentyfikuj obszar mózgu do zobrazowania na podstawie współrzędnych stereotaktycznych i zaznacz go przez drapanie. 
		UWAGA: Pozycja ścieńczenia czaszki nie powinna znajdować się nad szwami czaszkowymi ani w ich pobliżu, ponieważ stabilność czaszki w tych obszarach jest zagrożona. Ponadto duże naczynia korowe lub oponowe oraz opony mózgowe znajdujące się poniżej szwów czaszki mogą powodować artefakty obrazowania.</li>
		<li>Umieść metalowy uchwyt pokryty klejem na obszarze zainteresowania na czaszce zwierzęcia, lekko dociśnij i odczekaj 5 minut, aż metalowy uchwyt zostanie mocno przyklejony do czaszki.</li>
		<li>Wymieszaj cement dentystyczny (patrz Materiały i sprzęt) z klejem poliakrylowym na 3,5 cm szalce Petriego (lub analogu), aby uzyskać lepkie warunki.</li>
		<li>Uszczelnij krawędzie metalowego uchwytu mieszanką cementu + kleju i przykryj odsłoniętą powierzchnię czaszki tą samą mieszanką aż do granicy skóry.</li>
		<li>Odczekaj 15 minut, aby mieszanina cementu i kleju wyschła.</li>
		<li>Przepłukać kilkakrotnie rozrzedzony obszar czaszki i otaczające go części metalowego uchwytu PBS, aby resztki niespolimeryzowanego kleju zostały zmyte. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest zapewnienie stabilnego mocowania czaszki do uchwytu. Umożliwia to stabilność preparatu podczas obrazowania.</li>
		<li>Korzystając z trybu dużego powiększenia mikroskopu dwuokularowego, usuń górne warstwy kości czaszki za pomocą szybkoobrotowego mikrowiertła, aby uzyskać cieńszy obszar czaszki o średnicy ~0,5–1,5 mm. Podczas wiercenia użyj sprężonego powietrza, aby usunąć resztki kości. Podczas procedury przerzedzania należy wiercić z przerwami, aby uniknąć przegrzania spowodowanego tarciem. Schłodzić wiertło roztworem o temperaturze pokojowej i okresowo nakładać bufor na rozcieńczony obszar, aby pochłonąć ciepło. 
		UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia kory mózgowej, nie należy wiercić w dużych obszarach (>1,5 mm) aż do cienkiej warstwy (<50 μm). 
		UWAGA: Struktura kości czaszki gryzonia składa się z dwóch cienkich warstw zwartej kości oddzielonych grubą warstwą gąbczastej kości. Drobne ubytki kości gąbczastej tworzą koncentryczne kręgi i kanaliki, w których znajdują się naczynia krwionośne. Użyj mikrowiertła, aby usunąć zarówno zewnętrzną, zwartą warstwę kości, jak i większość warstwy gąbczastej. Przerwanie naczyń krwionośnych w kości gąbczastej może spowodować krwawienie. Użyj gąbki kolagenowej do hemostazy, aby zatrzymać to krwawienie.</li>
		<li>Użyj obrazowania generacji drugiej harmonicznej (SHG), aby sprawdzić, czy większość kości gąbczastej została usunięta. Należy uważać, aby nie dopuścić do nadmiernego rozrzedzenia, należy upewnić się, że pozostała kość jest grubsza niż 50 μm na tym etapie przygotowania.</li>
		<li>Umieść kroplę ciepłego buforu (35-37 °C) na wierzchu rozcieńczonego obszaru. Użyj ostrza mikrochirurgicznego lub wiertła do mikrowykańczania, aby dodatkowo usunąć warstwy kości i uformować gładki obszar o średnicy ~700 μm i grubości kości ~20 μm. Na tym etapie pomocne jest wykonywanie powtarzających się obrazowań SHG i regularne mierzenie grubości kości.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie TPEM dla obszaru zainteresowania i obszaru kontrolnego.</li>
		<li>Wyreguluj pozycję głowy za pomocą wysokości nausznika w taki sposób, aby przerzedzony obszar był ustawiony ściśle poziomo. Umieść igłę nad przerzedzonym obszarem i upewnij się, że pod docelowym miejscem nie ma dużych naczyń.</li>
		<li>Zmianę należy wykonać, zanurzając igłę w mózgu, na głębokość 0,5-2,0 mm od rozrzedzonej powierzchni czaszki i zgodnie ze współrzędnymi miejsca nakłucia.</li>
		<li>Usunąć igłę i zatamować krwotok powstały po ostrym uszkodzeniu mózgu za pomocą tamponu hemostatycznego (patrz Materiały i sprzęt). Poczekaj, aż utworzą się skrzepy krwi i ustanie pulsacja naczyń w miejscu urazu. </li>
		<li>Wykonać mikroiniekcję 100 μM sulforodaminy 101 lub innego związku będącego przedmiotem zainteresowania w miejsce zmiany chorobowej, jak opisano powyżej w sekcji 1.2.10.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie TPEM, aby monitorować postęp urazu i powrót do zdrowia, jak opisano w Protokole 3.</li>
		<li>Po wykonaniu zdjęć pozwól zwierzęciu odzyskać przytomność po znieczuleniu na poduszce grzewczej. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki i odłóż je do klatki domowej dopiero po pełnym powrocie do zdrowia fizycznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie
<ol>
	<li>Umieść zwierzę pod mikroskopem, mocując metalowy uchwyt do specjalnie zbudowanej ramy.</li>
	<li>Do obrazowania należy użyć np. mikroskopu dwufotonowego FV1000MPE wyposażonego w laser Mai Tai DeepSee i obiektyw zanurzeniowy XLPLN 25X 1,05 NA zoptymalizowany do obrazowania dwufotonowego in vivo.</li>
	<li>Zidentyfikuj miejsce zmiany pod mikroskopem w trybie fluorescencji szerokokątnej. Użyj filtrów długoprzepustowych, aby zobrazować unaczynienie mózgu i wybrać obszar kontrolny zgodnie z obserwowanym wzorcem naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Aby zobrazować sygnał drugiej generacji harmonicznej (SHG), należy dostroić laser femtosekundowy do długości fali 800 nm i zebrać emitowane światło za pomocą filtra obejściowego 380-410 nm. Do obrazowania fluorescencyjnego należy użyć filtra pasmowoprzepustowego (515-560 nm) do zbierania emitowanego światła, a do wzbudzenia fluorescencji stosuje się następujące długości fal: GFP-860 nm, YFP-950 nm.</li>
	<li>Użyj oprogramowania Fluoview do akwizycji obrazu.</li>
	<li>Przechowuj współrzędne każdego zwrotu z inwestycji dla późniejszego, powtarzalnego obrazowania. Uzyskuj te same zwroty z inwestycji w czasie i za każdym razem dostosowuj współrzędne, aby zmaksymalizować nakładanie się obrazu.</li>
	<li>Analizuj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. ImageJ). Prezentowane tu rekonstrukcje zostały wykonane przy użyciu oprogramowania Imaris.</li>
</ol>

<ol><li>Lighthall, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+cortical+impact%3A+A+new+experimental+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model.</a> J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).</li>
<li>Lindgren, S., Rinder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+in+head+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysik%22%5BJournal%5D)">Experimental studies in head injury.</a> Biophysik. 2 (5), 320-329 (1965).</li>
<li>Shreiber, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+investigation+of+cerebral+contusion%3A+histopathological+and+immunohistochemical+evaluation+of+dynamic+cortical+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).</li>
<li>Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+cortical+injury%3A+I.+Methodology+and+local+effects+of+contusions+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat.</a> Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).</li>
<li>Bardehle, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+astrocyte+responses+to+acute+injury+reveals+selective+juxtavascular+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation.</a> Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).</li>
<li>Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+neuronal+and+astroglial+disruption+in+the+peri-contusional+cortex+of+mice+revealed+by+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging.</a> Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Nolte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+promoter-controlled+EGFP-expressing+transgenic+mice%3A+a+tool+to+visualize+astrocytes+and+astrogliosis+in+living+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue.</a> Glia. 33 (1), 72-86 (2001).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulforhodamine+101+as+a+specific+marker+of+astroglia+in+the+neocortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo.</a> Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).</li>
<li>Carré, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+an+impact+acceleration+traumatic+brain+injury+rat+model+with+potential+suitability+for+both+microdialysis+and+PtiO2+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring.</a> J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).</li>
<li>Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-evoked+calcium+transients+in+somatosensory+cortex+are+temporarily+inhibited+by+a+nearby+microhemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage.</a> PloS one. 8 (5), (2013).</li>
<li>Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polished+and+reinforced+thinned-skull+window+for+long-term+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain.</a> J. Vis. Exp. 61, (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Uraz mózgu jest nagłym, nieprzewidywalnym zdarzeniem. W tym miejscu opisujemy model zwierzęcy, który odtwarza spektrum zmian patologicznych obserwowanych u ludzi po urazie mózgu, takich jak neurodegeneracja, eliminacja dendrytów, obrzęk mózgu, blizna glejowa, krwotoki w korze mózgowej w połączeniu z ogniskowym krwotokiem podpajęczynówkowym i zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. Aby zbadać patogenezę pierwotną i wtórną, a także powrót do zdrowia po urazie, ten model urazu połączono z podłużną wizualizacją ...

Ostre uszkodzenie mózgu jest poważnym problemem zdrowia publicznego, z dużą częstością występowania urazów w wypadkach samochodowych, upadkach lub napaściach, oraz wysokim rozpowszechnieniem późniejszej przewlekłej niepełnosprawności. Podejścia terapeutyczne do leczenia urazów mózgu pozostają całkowicie objawowe, ograniczając w ten sposób skuteczność opieki przedszpitalnej, chirurgicznej i intensywnej terapii. To sprawia, że społeczne i ekonomiczne skutki uszkodzenia mózgu są szczególnie poważne. Z różnych powodów większość badań klinicznych nie wykazała poprawy w zakresie powrotu do zdrowia po urazie mózgu przy użyciu nowatorskich podejść terapeutycznych.
Modele zwierzęce są kluczowe dla rozwoju nowych strategii terapeutycznych w kierunku etapu, w którym skuteczność leku może być przewidziana u pacjentów z urazami mózgu. Obecnie istnieje kilka dobrze ugruntowanych zwierzęcych modeli urazów głowy, w tym kontrolowane uderzenie korowe1, płynne uszkodzenie udarowe2, dynamiczna deformacja kory mózgowej3, spadek ciężaru ciała4 i uraz fotograficzny5. Do zbadania pewnych morfologicznych, molekularnych i behawioralnych aspektów patologii związanej z urazami głowy wykorzystano szereg modeli eksperymentalnych. Jednak żaden pojedynczy model zwierzęcy nie jest w pełni skuteczny w walidacji nowych strategii terapeutycznych. Opracowanie wiarygodnych, powtarzalnych i kontrolowanych modeli zwierzęcych uszkodzeń mózgu jest niezbędne do oceny złożonych procesów patologicznych.
Nowatorskie połączenie najnowszych technologii obrazowania mikroskopowego i genetycznie kodowanych fluorescencyjnych reporterów oferuje bezprecedensową możliwość zbadania wszystkich faz uszkodzenia mózgu, które obejmują uraz pierwotny, rozprzestrzenianie się pierwotnego urazu, wtórny uraz i regenerację. W szczególności mikroskopia dwufotonowa in vivo jest unikalną nieliniową technologią optyczną, która umożliwia wizualizację w czasie rzeczywistym struktur komórkowych, a nawet subkomórkowych w głębokich warstwach korowych mózgu gryzoni. Kilka typów komórek i organelli może być obrazowanych jednocześnie, łącząc różne markery fluorescencyjne. Za pomocą tego potężnego narzędzia możemy wizualizować dynamiczne zmiany morfologiczne i funkcjonalne w żywym mózgu w warunkach pourazowych. Zalety mikroskopii dwufotonowej in vivo w badaniu uszkodzeń mózgu zostały niedawno zademonstrowane przez Kirova i współpracowników6. Korzystając z łagodnego modelu ogniskowego stłuczenia kory mózgowej, autorzy ci wykazali, że ostre uszkodzenie dendrytyczne w korze okołokontuzjowej jest bramkowane przez spadek lokalnego przepływu krwi. Co więcej, wykazali, że metabolicznie upośledzona kora wokół miejsca stłuczenia jest dodatkowo uszkadzana przez rozprzestrzeniającą się depolaryzację. To wtórne uszkodzenie wpływa na obwody synaptyczne, co sprawia, że konsekwencje urazowego uszkodzenia mózgu są bardziej poważne.
Tutaj proponujemy metodę stereotaktycznego nakłuwania za pomocą igły strzykawki, która może być połączona z jednoczesnym miejscowym stosowaniem leków, jako zaawansowany model miejscowego uszkodzenia mózgu i jako narzędzie do badania patofizjologicznych konsekwencji ostrego urazu w mózgu ssaków in vivo.

<table><tbody><tr><td>Pęseta 2A-sa, 115 mm</td><td>XYtronic</td><td>XY-2A-SA</td><td></td></tr><tr><td>30 G & frac12; w igle</td><td>BD</td><td>REF 304000</td><td></td></tr><tr><td>Trymer do zwierząt, maszynka do golenia</td><td>Aesculap</td><td>Isis GT420</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop lornetkowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Biologiczny regulator temperatury z poduszką grzewczą ze stali nierdzewnej</td><td>Supertech</td><td>TMP-5b</td><td></td></tr><tr><td>ostrze mikrochirurgiczne</td><td>BD</td><td>REF 374769</td><td></td></tr><tr><td>Rurka borokrzemianowa z żarnikiem</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td>Do produkcji pipet szklanych</td></tr><tr><td>Karprofen</td><td>Pfizer</td><td>Rimadyl vet</td><td></td></tr><tr><td>Diglukonian chlorheksydyny</td><td>Sigma</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>DrguDent, Dentsply</td><td>REF 640 200 271</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>FaunaPharma</td><td>Rapidexon weterynarz</td><td></td></tr><tr><td>Wiertła jednorazowe</td><td>Meisinger</td><td>HP 310 104 001 001 008</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco' s PBS 10x</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 kleszcze, 110 mm</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz mikroelektrod</td><td>Ealing Ealing</td><td>50-2013</td><td>Ściągacz pionowy do produkcji pipet szklanych</td></tr><tr><td>Maść do oczu</td><td>Novartis</td><td>Viscotears</td><td></td></tr><tr><td>Sterowanie wiertarką Foredom</td><td></td><td>FM3545</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść</td> <td>mikrosilnika ForedomForedom</td><td>MH-145</td><td></td></tr><tr><td>Platforma do znieczulenia gazowego dla myszy</td><td>Stoelting</td><td>50264</td><td>Zmontowana na instrumencie stereotaktycznym</td></tr><tr><td>Gąbka kolagenowa Hemostaza</td><td>Avitene, Ultrafoam BARD</td><td>Ref 1050050</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Intervet</td><td>Ketaminol vet</td><td></td></tr><tr><td>Mai Tai DeepSee laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metalowy uchwyt</td><td>Kleszczyki</td> do mikroopatrunków Neurotar<td></td><td></td></tr><tr><td>, 105 mm</td><td>Aesculap</td><td>BD302R</td><td></td></tr><tr><td>Microfil</td><td>WPI</td><td>MF34G-5</td><td>Mikrostrzykawka do napełniania kapilar</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Olympus</td><td>FV1000MPE</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil Strzykawka 10 &mu; l</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td>Strzykawka Hamilton</td></tr><tr><td>Waciki włókninowe 5 x 5</td><td>Molnlycke Health Care</td><td>Mesoft</td><td>Tampony chirurgiczne</td></tr><tr><td>Klej poliakrylowy</td><td>Henkel</td><td>Loctite 401</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe okrągłe&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td></td><td></td>Nauki</tr><tr><td>o grubości 1,5 grubości&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrument stereotaktyczny dla małych zwierząt</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900</td><td></td></tr><tr><td>Adapter dla myszy i noworodków</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td>Zmontowany na instrumencie stereotaktycznym.</td></tr><tr><td>Nożyczki studenckie do irysów, proste 11,5 cm</td><td>FST</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>Sulforodamine 101</td> Pompa mikrostrzykawkowa <td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>UMP3 i sterownik pompy mikrostrzykawkowej Micro 4</td><td>WPI</td><td>UMP3-1</td><td>Mikrowtryskiwacz i kontroler</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Health Care</td><td>Rompun weterynarz</td><td></td></tr></tbody></table>

ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Chociaż ostry uraz mózgu często wynika z uszkodzenia głowy w różnych wypadkach i dotyka znaczną część populacji, nie ma jeszcze skutecznego leczenia. Ograniczenia współcześnie stosowanych modeli zwierzęcych utrudniają zrozumienie mechanizmu patologii. Mikroskopia wielofotonowa umożliwia badanie komórek i tkanek w nienaruszonych mózgach zwierząt podłużnie w warunkach fizjologicznych i patologicznych. W tym artykule opisano dwa modele ostrego uszkodzenia mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania zachowania komórek mózgowych w warunkach pourazowych. Wybrany obszar mózgu jest uszkadzany ostrą igłą w celu wytworzenia urazu o kontrolowanej szerokości i głębokości w miąższu mózgu. Nasza metoda polega na stereotaktycznym nakłuciu za pomocą igły strzykawki, które można połączyć z jednoczesnym zastosowaniem leku. Proponujemy, aby metoda ta mogła być wykorzystana jako zaawansowane narzędzie do badania komórkowych mechanizmów patofizjologicznych konsekwencji ostrego urazu w mózgu ssaków in vivo. W tym filmie łączymy ostre uszkodzenie mózgu z dwoma preparatami: oknem czaszkowym i ścieńczeniem czaszki. Omówiono również zalety i ograniczenia obu preparatów do wielosesyjnego obrazowania regeneracji mózgu po urazie.

Zoptymalizowaliśmy dwie procedury operacyjne: 1) chroniczne okno czaszkowe oraz 2) ścieńczanie czaszki, przeznaczone do obrazowania postraumatycznego mózgu u myszy transgenicznych. Schematyczny widok przygotowań eksperymentalnych przedstawiono na Rysunku 1. Traumatyczne nakłucie stalową igłą o średnicy zewnętrznej 0,3 mm (30 G) wykonuje się w wywierconym otworze (Rysunek 1A). Prawidłowe przygotowanie okna czaszkowego umożliwia obrazowanie na głębokościach do 650 μm poniżej powierzchni pi...

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Witam, nazywam się Michel iv i jestem badaczem postdoktoralnym w Centrum Neuronauki Uniwersytetu w Helsinkach. Witam, nazywam się Hel Stein i jestem studentem studiów podyplomowych na Uniwersytecie w Helsinkach. W tym filmie opiszemy metodę wywołania miejscowego ostrego urazu mózgu myszy w celu późniejszego obrazowania zachowania komórek mózgowych i stanu potraumatycznego.Ostre uszkodzenie mózgu jest poważną patologią dotykającą znaczną część populacji w krajach rozwiniętych. Mikroskopia wielofotonowa umożliwia badanie komórek w kontekście tkankowym w żywym mózgu gryzonia w warunkach fizjologicznych i patologicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę wywołania ostrego uszkodzenia mózgu poprzez stereotaktyczne nakłucie igłą strzykawki, a następnie obrazowanie dwufotonowe zachowania komórek mózgowych oraz warunków potraumatycznych.Metoda stereotaktycznego wywołania miejscowego urazu mózgu jest narzędziem służącym do badania patofizjologicznych następstw ostrej traumy. W mózgu ssaków można precyzyjnie celować w konkretny obszar i uszkodzić go za pomocą ostrej igły, aby wywołać uraz o pożądanej szerokości i głębokości w parenchymie mózgu. W tym filmie zastosujemy ostry uraz mózgu w p

acute-brain-trauma-in-mice-followed-by-longitudinal-two-photon-imaging

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ostre urazy mózgu u myszy obserwowane w badaniach przekrojowych z zastosowaniem obrazowania dwufotonowego

W tym filmie i materiałach uzupełniających przedstawiamy protokół przewlekłego obrazowania in vivo nienaruszonego mózgu z wykorzystaniem preparacji z cienkiej czaszki.

Przewlekłe obrazowanie kory wzrokowej myszy z wykorzystaniem preparatu z pocienioną czaszką

Ten film pokazuje przebieg urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) u myszy. Po odsłonięciu czaszki zaznacza się miejsce TBI. Mysz jest następnie umieszczana pod urządzeniem TBI. Uderzenie odbywa się poprzez podniesienie metalowego pręta i umożliwienie mu swobodnego opadnięcia na impaktor, który styka się z czaszką.

Dostarczenie urazowego uszkodzenia mózgu do mózgu myszy

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Sportowcy każdego roku doświadczają kilkuset łagodnych urazowych urazów mózgu (mTBI)/wstrząśnień mózgu; jednak ich konsekwencje dla mózgu są słabo poznane. W związku z tym zwierzęcy model pojedynczego i powtarzalnego mTBI, który konsekwentnie replikuje klinicznie istotne objawy, zapewnia środki do postępu w badaniach nad mTBI i wstrząsem mózgu.

Mysi model pojedynczego i powtarzalnego łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

To badanie demonstruje dostarczanie powtarzających się urazowych uszkodzeń mózgu myszom i jednoczesne wszczepienie okna czaszkowego do późniejszego przyżyciowego obrazowania EGFP wyrażonego przez neuron za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Przyżyciowe obrazowanie ekspresji białek fluorescencyjnych u myszy z urazowym uszkodzeniem mózgu i okienkiem czaszkowym przy użyciu mikroskopu dwufotonowego

Ten protokół przedstawia zmodyfikowany mysi model powtarzalnego łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (rmTBI) wywołanego metodą zamkniętego urazu głowy (CHI). Podejście to obejmuje cieńsze okienko czaszki i płynną stymulację w celu zmniejszenia stanu zapalnego często spowodowanego ekspozycją opon mózgowych, a także lepszą odtwarzalność i dokładność w modelowaniu rmTBI u gryzoni.

Zmodyfikowany mysi model powtarzającego się łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu z przerzedzonym okienkiem czaszki i płynną stymulacją

Pseudozłamanie, odtwarzalny mysi model sterylnego urazu układu mięśniowo-szkieletowego, umożliwia ocenę późnych odpowiedzi immunologicznych po urazie. Niniejszy artykuł opisuje krok po kroku wykonanie procedury tego modelu, w tym możliwość łączenia modeli eksperymentalnych w celu badania urazów wielonarządowych.

Pseudozłamanie: model ostrego urazu tkanek obwodowych

Poznaj metodę indukcji ostrego urazu mózgu u myszy z podłużnym obrazowaniem dwufotonowym. Technika ta umożliwia badanie zachowania komórek mózgowych w warunkach pourazowych oraz rozwój strategii terapeutycznych.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Przeglądaj więcej filmów