Name: Automatyczna analiza dynamicznych sygnałów Ca2+ w sekwencjach obrazów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną analizę ROI aktywności wapniowej w świniaczych tętnicach wieńcowych. Ta metoda zwiększa dokładność pomiarów fizjologicznych Ca²⁺ i redukuje błąd użytkownika w badaniach układu sercowo-naczyniowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health Grants HL-085887, HL-092992, S10RR027535 i MOP-93676.

1. Sekcja naczyń i obrazowanie
<ol>
	<li>Pobieranie tkanek od domowych młodych świń zgodnie z opisem w Martens i wsp. 27. Umieścić prawe komory odłowionej świni w dolnym naczyniu preparacyjnym z polidimetylosiloksanu (PDMS) zawierającym buforowany roztwór soli fizjologicznej (PSS) HEPES.
	<ol>
		<li>Za pomocą stereomikroskopu wypreparuj i usuń odcinek lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (~8 mm długości, 0,5 mm średnicy) z otaczającej tkanki za pomocą kleszczy i nożyczek sprężynowych, usuwając segment naczynia z otaczających warstw tkanki serca. UWAGA: Uważaj, aby nie przebić ścianki naczynia.</li>
		<li>Umieść blok PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) w naczyniu preparacyjnym i użyj igły, aby przypiąć go do dna. Pokrój drut wolframowy o średnicy około 40 μm na dwanaście segmentów o długości ~0,3 cm, tworząc mikroszpilki i umieść je w naczyniu. Za pomocą kleszczy przymocuj jeden koniec segmentu naczynia do bloku za pomocą mikroszpilki.</li>
		<li>Ostrożnie włóż małe nożyczki sprężynowe do światła naczynia i przetnij wzdłużnie po jednej stronie naczynia, aby całkowicie je otworzyć. Zorientuj otwarty segment naczynia śródbłonkiem do góry.</li>
		<li>Użyj pozostałych mikroszpilek, aby zabezpieczyć krawędzie otwartego segmentu naczynia, aby zablokować je tak, aby naczynie utworzyło płaski prostokąt. UWAGA: Wierzchołki Micropin należy wygiąć pod kątem 90° i włożyć, aż zrównają się z powierzchnią bloku. Należy zadbać o to, aby rozciągnąć preparat naczyniowy bez nadmiernego rozciągania; Końcowa szerokość powinna wynosić ~1,5x początkowa szerokość nierozciągnięta.</li>
		<li>Przygotować małą objętość (~1 ml) roztworu nasycającego Fluo-4 AM, mieszając Fluo-4 AM (10 μM) rozpuszczony w DMSO z pluronem (0,03 %) w buforowanym przez HEPES PSS (zawierającym w mM: 134 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl, 10 HEPES, 10 glukozy) i włożyć cały blok do roztworu ładującego na około 40 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Po załadowaniu myj blok w buforowanym przez HEPES PSS przez 5-10 min.</li>
		<li>Zamontuj blok na podkładkach dystansowych o grubości 50-100 μm w dolnej komorze ze szkła nakrywkowego zawierającej buforowany przez HEPES PSS. UWAGA: Metalowe kołki mogą być używane jako przekładki i zapewniają, że segment naczynia jest skierowany w dół i nie dotyka przekładek.</li>
		<li>Umieść komorę na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w obrazowanie konfokalne i skup się na warstwie komórek śródbłonka.</li>
		<li>Uchwyć sekwencje obrazów poklatkowych o podstawowej fluorescencji względnej przez ~3 minuty przy 20-krotnym powiększeniu i liczbie klatek na sekundę ~8 klatek na sekundę za pomocą oprogramowania do akwizycji sekwencji obrazów konfokalnych.</li>
		<li>Po ~ 3 minutach od zarejestrowania fluorescencji podstawowej, zastąpić buforowany roztwór PSS HEPES tą samą objętością (~1 ml) substancji P (100 pM) rozpuszczoną w buforowanym PSS HEPES i rejestrować przez dodatkowe 3 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Zautomatyzowana analiza
<ol>
	<li>Renderuj sekwencje obrazów fluorescencyjnej aktywności wapnia z oprogramowania do akwizycji konfokalnej jako 8-bitowe pliki w formacie ".tif" w skali szarości bez informacji o skali.</li>
	<li>Otwórz ImageJ, kliknij "otwórz" w menu plików i wybierz odpowiednią sekwencję obrazów w oknie eksploratora, aby wyświetlić sekwencje obrazów w ImageJ.</li>
	<li>Określ odpowiednią średnicę ROI za pomocą prostokątnego narzędzia ROI w celu oszacowania górnej i dolnej granicy przestrzennego rozkładu aktywności w sekwencji obrazów. UWAGA: Średnia średnica prostokątna jest odpowiednim wyborem dla średnicy ROI.</li>
	<li>Utwórz nowy folder na dysku twardym komputera i dodaj sekwencje obrazów do katalogu folderów.</li>
	<li>W ImageJ kliknij okno "wtyczki", a następnie kliknij "LC_Pro", aby rozpocząć analizę.</li>
	<li>Wprowadź wartość średnicy ROI i wybierz wartość progową filtra (0,05 lub 0,01).</li>
	<li>Kliknij pole wyboru "leczenie farmakologiczne" i wprowadź wartości punktów czasowych bezpośrednio przed i po dodaniu leku (w sekundach).</li>
	<li>Kliknij "ok" i wprowadź katalog sekwencji obrazów do okna eksploratora plików.</li>
</ol>
3. Wyjście graficzne
<ol>
	<li>Pobierz wersję R 3.0.2 z <a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a>.</li>
	<li>Otwórz 32-bitową wersję języka R.</li>
	<li>Kliknij "plik", a następnie "otwórz skrypt" i wybierz "traceplot". Skrypt R' R do generowania graficznych raportów eksperymentalnych.</li>
	<li>Zainstaluj pakiety kalibrowania i gplots, wybierając opcję "pakiety", "pakiety instalacyjne" i wybierając odpowiednie pakiety.</li>
	<li>Kliknij "plik", a następnie polecenie "zmień katalog" i użyj okna eksploratora, aby wybrać katalog odpowiadający wynikowi analizy LC_Pro.</li>
	<li>Kliknij okno skryptu, a następnie polecenie "uruchom wszystko", aby uruchomić skrypt.</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361 (6410), 315-325 (1993).</li>
<li>Berridge, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Delisle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+four+dimensions+of+calcium+signalling+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The four dimensions of calcium signalling in Xenopus oocytes.</a> Cell Calcium. 12 (2-3), 217-227 (1991).</li>
<li>Dupont, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics%3A+spatio-temporal+organization+from+the+subcellular+to+the+organ+level%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics: spatio-temporal organization from the subcellular to the organ level.</a> Int Rev Cytol. 261, 193-245 (2007).</li>
<li>Hayashi, H., Miyata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of intracellular Ca2.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 31 (1), 1-10 (1994).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. 23, (2009).</li>
<li>Hong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+spikes+in+rat+suprachiasmatic+nucleus+neurons+induced+by+BAPTA-based+calcium+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium spikes in rat suprachiasmatic nucleus neurons induced by BAPTA-based calcium dyes.</a> PloS One. 5 (3), (2010).</li>
<li>Kuga, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+calcium+waves+traveling+through+astrocytic+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-scale calcium waves traveling through astrocytic networks in vivo.</a> J Neurosci. 31 (7), 2607-2614 (2011).</li>
<li>Mumtaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+agonist+induced+Ca2%2B+signalling+in+intact+endothelial+cells+studied+confocally+in+in+situ+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The mechanism of agonist induced Ca2+ signalling in intact endothelial cells studied confocally in in situ arteries.</a> Cell Calcium. 49 (1), 66-77 (2011).</li>
<li>Paredes, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Silei, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium+levels+by+the+fluorescent+Ca2%2B+indicator+Calcium-Green%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium levels by the fluorescent Ca2+ indicator Calcium-Green.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 5 (2), 132-134 (2000).</li>
<li>Simpson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+measurement+of+%5BCa2%2B%5Dc%3A+basic+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent measurement of [Ca2+]c: basic practical considerations.</a> Methods Mol Biol. 937, 3-36 (2006).</li>
<li>Gaspers, L. D., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in liver.</a> Cell Calcium. (3-4), 329-342 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Ca2%2B+oscillations+in+pancreatic+%C3%9F-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Ca2+ oscillations in pancreatic ß-cells.</a> Biochem Biophys Acta. 1113 (3-4), 295-305 (1992).</li>
<li>Kansui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+spontaneous+Ca2%2B+events+in+endothelial+cells+reflect+signalling+through+myoendothelial+gap+junctions+in+pressurized+mesenteric+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Enhanced spontaneous Ca2+ events in endothelial cells reflect signalling through myoendothelial gap junctions in pressurized mesenteric arteries.</a> Cell Calcium. 44 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Tatsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+intracellular+calcium+concentration+in+guinea-pig+myenteric+neurons+by+using+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+res%22%5BJournal%5D)">Measurement of the intracellular calcium concentration in guinea-pig myenteric neurons by using fura-2.</a> Brain res. 451 (1-2), 371-375 (1988).</li>
<li>Lorenz, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pixel-based+criteria-oriented+analysis+of+time-lapse+Ca2%2B-fluorescence+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Pixel-based criteria-oriented analysis of time-lapse Ca2+-fluorescence images.</a> J Neurosci Meth. 127 (2), 157-166 (2003).</li>
<li>Mukamel, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Reidl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+component+analysis+of+high-resolution+imaging+data+identifies+distinct+functional+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Independent component analysis of high-resolution imaging data identifies distinct functional domains.</a> Neuroimage. 34 (1), 94-108 (2007).</li>
<li>Wegner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+of+elementary+calcium+release+events+using+the+%C3%A1+trous+wavelet+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Automated detection of elementary calcium release events using the á trous wavelet transform.</a> Biophys J. 90 (6), 2151-2163 (2006).</li>
<li>Cheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplitude+distribution+of+calcium+sparks+in+confocal+images%3A+theory+and+studies+with+an+automatic+detection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Amplitude distribution of calcium sparks in confocal images: theory and studies with an automatic detection method.</a> Biophys J. 76 (2), 606-617 (1999).</li>
<li>Picht, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SparkMaster%3A+automated+calcium+spark+analysis+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (3), (2007).</li>
<li>Abramoff, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton+Int%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophoton Int. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Francis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+region+of+interest+analysis+of+dynamic+Ca2%2B+signals+in+image+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated region of interest analysis of dynamic Ca2+ signals in image sequences.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303 (3), (2012).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+dynamic+endothelial+Ca2%2B+signals+by+the+TRPA1+channel+activator+AITC+in+rat+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Recruitment of dynamic endothelial Ca2+ signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries.</a> Microcirculation. 20 (2), 138-148 (2013).</li>
<li>Taylor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Ca2%2B+signal+modalities+in+the+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Dynamic Ca2+ signal modalities in the vascular endothelium.</a> Microcirculation. 19 (5), 423-429 (2012).</li>
<li>Martens, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucous+solids+and+liquid+secretion+by+airways%3A+studies+with+normal+pig%2C+cystic+fibrosis+human%2C+and+non-cystic+fibrosis+human+bronchi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mucous solids and liquid secretion by airways: studies with normal pig, cystic fibrosis human, and non-cystic fibrosis human bronchi.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 301 (2), (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dekodowanie złożonych sygnałów Ca2 + na poziomie komórkowym i wielokomórkowym będzie wymagało rygorystycznych podejść eksperymentalnych i analitycznych. W tym miejscu opisano podejście, w którym rozdzielcze w czasie konfokalne sekwencje obrazów fluorescencji zależnej od Ca2 + są poddawane automatycznej analizie, która identyfikuje i określa ilościowo statystycznie istotne sygnały Ca2 + w nienaruszonych polach komórkowych W przedstawionym konkretnym przypadku odcinek tętnicy został wyizolo...

Ca2+ jest wszechobecną cząsteczką sygnalizacyjną drugiego posłańca, a poziomy cytozolowego Ca2+ są wysoce regulowane. Wewnątrzkomórkowe sygnały Ca2 + są złożone i obejmują izolowane stany nieustalone, oscylacje i rozchodzące się fale1-4. Uważa się, że przestrzenna i czasowa kontrola Ca2 + leży u podstaw fizjologicznej specyficzności sygnału, a zatem analiza wzorców sygnałów Ca2 + jest bardzo interesująca dla badaczy w wielu dziedzinach5.
Ca2+ barwniki wskaźnikowe, takie jak Fluo-4 i Fura-2, są powszechnie stosowane do pomiaru wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej5-12. Zazwyczaj czasowe sygnały Ca2 + są oceniane jako zależne od czasu zmiany średniej fluorescencji w zdefiniowanym przez użytkownika obszarze lub regionie zainteresowania (ROI)5,6,13-16. Obecnie ręczna analiza ROI jest zarówno czasochłonna, jak i pracochłonna, ponieważ wymaga od użytkowników identyfikowania wielu ROI i wykonywania powtarzalnych obliczeń17-19. Techniki te mogą być również obarczone znacznym błędem użytkownika, w tym wprowadzeniem sztucznych modów sygnału i wykluczeniem sygnałów o niskiej amplitudzie lub sygnałów rozproszonych18,20.
Algorytmy automatycznego wykrywania ROI były wcześniej implementowane przy użyciu różnych podejść statystycznych do określania optymalnego rozmieszczenia ROI, ale generalnie ograniczały się do analizy obrazów skanowania linii lub pseudolinii, co ogranicza analizę do jednego wymiaru przestrzennego w czasie17,19-22. Ponadto wiele istniejących algorytmów nie jest wystarczających do uwzględnienia różnorodności zdarzeń uwalniania Ca2+, które wahają się od okresowych, zlokalizowanych stanów nieustalonych do rozchodzących się fal23,24. Kompleksowa ocena fizjologicznych sygnałów Ca2+ jest często dodatkowo skomplikowana ze względu na obecność znaczącego artefaktu obrazu, który zakłóca dyskryminację sygnału z szumem w wielu systemach eksperymentalnych.
Poprzednio, zautomatyzowany algorytm wykrywania ROI do wykrywania stanów przejściowych sygnału Ca2+, zaimplementowany jako wtyczka do oprogramowania NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), został opracowany i zatwierdzony25,26. Algorytm ten, nazwany LC_Pro, został zaprojektowany do identyfikacji i analizy ROI obejmujących stany przejściowe sygnału Ca2+ w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów poklatkowych. W tym miejscu przedstawiono praktyczny protokół eksperymentalny i reprezentatywną demonstrację zastosowania algorytmu w śródbłonku tętnic wieńcowych świń, z dodatkowym przetwarzaniem końcowym przy użyciu oprogramowania do przetwarzania statystycznego R o otwartym kodzie źródłowym w celu wygenerowania użytecznych wyników graficznych.

<table><tbody><tr><td>Naczynie preparacyjne</td><td>Fisher Sci</td><td>#08-772-70</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Zestaw elastomerów</td> <td>Fisher Sci</td><td>#NC9644388</td> należy formować w naczynia</tr> Mikroskop stereoskopowy <tr><td>z buforem</td> HEPES PSS <td>Sigma</td><td>#H3375-250G</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Inst.</td><td></td><td></td>#MNA42000</tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy</td><td>Scientific Inst Svcs</td><td>#406</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Tech.</td><td>#F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Pluroniczny F-127</td><td>Life Tech.</td><td></td><td></td>#P3000MP</tr><tr><td>Metalowe kołki</td><td>Fine Science Tools</td><td>#26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Dolna komora</td><td></td><td></td> ze szkła nakrywkowego <td>Specjalnie zaprojektowany</td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem</td><td>Perkin Elmer</td><td>RS-3</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ oprogramowanie</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html">do pobrania pod adresem: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td></tr><tr><td>LC_Pro wtyczka do imageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html">do pobrania na: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html</a></td></tr><tr><td>R software</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.r-project.org/">do pobrania na: http://www.r-project.org/</a></td></tr><tr>R <td></td><td></td><td>skrypt traceplot</td><td><a href="https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing">do pobrania na: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing</a></td></tr></tbody></table>

automatyczna analiza dynamicznych sygnałów ca2+ w sekwencjach obrazów

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Wewnątrzkomórkowe sygnały Ca2+ są powszechnie badane za pomocą fluorescencyjnych barwników wskaźnikowych Ca2+ i technik mikroskopowych. Jednak analiza ilościowa danych obrazowania Ca2+ jest czasochłonna i podatna na błędy. Zautomatyzowane algorytmy analizy sygnału oparte na wykrywaniu obszaru zainteresowania (ROI) zostały zaimplementowane do jednowymiarowych pomiarów skanowania linii, ale obecnie nie ma algorytmu, który integrowałby zoptymalizowaną identyfikację i analizę ROI w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów. W tym miejscu opisano algorytm szybkiego pozyskiwania i analizy ROI w sekwencjach obrazów. Wykorzystuje elipsy dopasowane do sygnałów filtrowanych szumami w celu określenia optymalnego rozmieszczenia ROI i oblicza parametry sygnału Ca2+ dotyczące amplitudy, czasu trwania i rozpiętości przestrzennej. Algorytm ten został zaimplementowany jako ogólnodostępna wtyczka do oprogramowania ImageJ (NIH). Wraz ze skryptami analitycznymi napisanymi dla oprogramowania do przetwarzania statystycznego typu open source R, podejście to zapewnia potok o dużej pojemności do wykonywania szybkiej analizy statystycznej wyników eksperymentu. Autorzy sugerują, że zastosowanie tego protokołu analizy doprowadzi do bardziej kompletnej i bezstronnej charakterystyki fizjologicznej sygnalizacji Ca2 +.

W celu przeprowadzenia zautomatyzowanej analizy dynamiki Ca2+ w sekwencjach obrazów konfokalnych opracowano i wdrożono autorski algorytm LC_Pro. Jak przedstawiono na Rysunku 1, algorytm wykorzystuje sekwencyjne moduły przetwarzania, które A) wykrywają i śledzą miejsca dynamicznych zmian Ca2+ powyżej szumu statystycznego (p &lt; 0,01), B) automatycznie definiują obszary zainteresowania (ROI) w centrach aktywnych miejsc oraz C) obliczają średnią intensywność fluorescencji w obszarach ...

Tutaj zademonstrowany jest nowatorski protokół analizy interesujących regionów, oparty na sortowaniu najlepiej dopasowanych elips przypisanych do regionów pozytywnego sygnału w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów poklatkowych. Algorytm ten może umożliwić badaczom kompleksową analizę fizjologicznych sygnałów Ca2 + przy minimalnym wkładzie użytkownika i stronniczości.

Automatyczna analiza dynamicznych sygnałów Ca2+ w sekwencjach obrazów

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest analiza aktywności wapniowej śródbłonka w tętnicach wieńcowych świni z wykorzystaniem zautomatyzowanej analizy ROI. W drugim etapie osiąga się to poprzez wycięcie i otwarcie tętnic wieńcowych świni w celu pomiaru aktywności wapniowej śródbłonka. Zautomatyzowana analiza ROI jest przeprowadzana na uzyskanych pomiarach wapnia, co daje w wyniku podsumowany wynik aktywności wapniowej.Następnie na uzyskanych danych uruchamiane są skrypty programistyczne w celu przeprowadzenia analizy statystycznej i graficznego przedstawienia wyników analizy aktywności wapnia, co pozwala uzyskać parametry przejściowe sygnału wapniowego na podstawie zautomatyzowanej analizy ROI oraz przetwarzania statystycznego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczna analiza ROI, jest to, że analiza zautomatyzowana jest szybsza, bardziej kompleksowa i mniej podatna na błędy użytkownika. W ramach tej procedury pobrane prawe komory serca świni należy umieścić w dolnej szalce sekcyjnej A-P-D-M-S zawierającej roztwór soli fizjologicznej HEPES.Pod mikroskopem stereoskopowym wyciąć fragment lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej, oddzielając ją od otaczających warstw tkanki serca. Należy uważać, aby nie przebić ściany naczynia. Następnie umieścić blok PDMS w naczyniu do sekcji i za pomocą igły przymocować go do dna.Dodać bufor do szalki. Następnie przeciąć drut wolframowy o średnicy około 40 micron do 12 odcinków o długości 0.3 centymetr każdy, tworząc mikroigły, i umieścić je w szalce. Używając pęsety, przymocować jeden koniec fragmentu naczynia do bloku za pomocą mikroigły.Ostrożnie wprowadź małe nożyczki sprężynowe do światła naczynia i wykonaj cięcie wzdłuż jednej z jego ścian, aby całkowicie je otworzyć. Następnie ułóż otwarty segment naczynia śródbłonkiem do góry. Pozostałe piny mikrochirurgiczne wykorzystaj do przymocowania brzegów otwartego segmentu naczynia do bloku w taki sposób, aby naczynie tworzyło płaski prostokąt.Następnie przygotuj jeden mililitr roztworu ładującego flu oh 4:00 AM. Umieść cały blok w roztworze ładującym na około 40 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a po ładowaniu przemyj blok w buforze HEPES PSS przez 5 do 10 minut. Następnie zamocuj blok na dystansach o grubości od 50 do 100 mikronów w komorze z podstawką ze szkła okrywek zawierającej bufor HEPES PSS.Umieść komorę na stoliku mikroskopu odwróconego przystosowanego do obrazowania konfokalnego i ustaw ostrość na warstwę komórek śródbłonka. Używając oprogramowania do sekwencyjnego pozyskiwania obrazów konfokalnych, zarejestruj sekwencje obrazów time-lapse dla bazowej fluorescencji względnej przez trzy minuty przy powiększeniu 20 x i częstotliwości ośmiu klatek na sekundę. Po trzech minutach rejestracji fluorescencji bazowej zastąp buforowany HEPES roztwór PSS taką samą objętością 100 pM substancji P rozpuszczonej w buforowanym HEPES PSS i rejestruj obraz przez kolejne trzy minuty. W tej procedurze wyeksportuj sekwencję obrazów aktywności wapnia w fluorescencji z oprogramowania do akwizycji konfokalnej jako plik w 8-bitowym formacie TIFF w skali szarości, bez informacji o skali.Następnie otwórz program ImageJ. Kliknij „Open” w menu „File” i wybierz odpowiednią sekwencję obrazów w oknie eksploratora. Aby wyświetlić sekwencję obrazów w programie ImageJ, określ odpowiedni obszar ROI, korzystając z prostokątnego narzędzia ROI, aby oszacować górną i dolną granicę przestrzennego rozprzestrzenienia aktywności w sekwencji obrazów. Następnie utwórz nowy folder na dysku twardym komputera i dodaj sekwencję obrazów do katalogu tego folderu.W programie ImageJ kliknij okno wtyczek (plugins). Następnie kliknij lc pro. Aby rozpocząć analizę, wprowadź wartość średnicy ROI i wybierz wartość progu filtrowania po słowie.Zaznacz pole wyboru leczenia lekiem i wprowadź wartości punktów czasowych bezpośrednio przed i po dodaniu leku. Następnie kliknij OK i w oknie eksploratora plików wskaż katalog z sekwencją obrazów. Na tym etapie pobierz i zainstaluj program R w wersji 3.0 0.2.Następnie otwórz 32-bitową wersję programu R. Kliknij plik. Następnie otwórz skrypt i wybierz skrypt trace plot RR służący do generowania graficznych raportów eksperymentalnych. Zainstaluj pakiety calibrate oraz gpls, wybierając opcję pakietów.Zainstaluj pakiety, a następnie wybierz odpowiednie z nich. Kliknij plik, potem polecenie zmiany katalogu i użyj okna eksploratora, aby wybrać katalog odpowiadający wynikom analizy lc pro. Następnie kliknij okno skryptu, a potem polecenie uruchom wszystko, aby uruchomić tutaj skrypt.Obrazy time-lapse z sekwencji wejściowej obrazów dla bazowego interwału próbkowania, po którym nastąpił interwał próbkowania stymulowany substancją P, przedstawiono w skali szarości; sekwencje obrazów time-lapse najlepszych liz dla interwałów bazowego i stymulowanego zostały wygenerowane przez program lc Pro, a tutaj przedstawiono zależne od czasu skalowane krzywe intensywności z każdego automatycznie rozmieszczonego ROI. Przedstawiono histogramy amplitudy szczytowej, czasu trwania przy połowie maksimum oraz maksymalnego rozprzestrzenienia przestrzennego dla zdarzeń kontrolnych i stymulowanych substancją P z reprezentatywnego eksperymentu. Do graficznego przetwarzania wyników z programu lc Pro wykorzystano język R.Warto zauważyć, że stymulacja substancją P zwiększyła liczbę zdarzeń i spowodowała istotne przesunięcie w prawo mediany amplitudy oraz czasu trwania, co potwierdzono testem U Manna-Whitneya. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o minimalizacji artefaktów obrazu wynikających z przemieszczenia płaszczyzny ogniskowej lub nieprawidłowych ustawień kontrastu, ponieważ mogą one znacząco wpłynąć na wyniki analizy.

automated-analysis-of-dynamic-ca2-signals-in-image-sequences

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

W miocytach serca struktury błony kanalikowej tworzą sieci wewnątrzkomórkowe. Opisujemy zoptymalizowane protokoły i) izolacji miocytów z serca myszy, w tym kontroli jakości, ii) barwienia żywych komórek do najnowocześniejszej mikroskopii fluorescencyjnej oraz iii) bezpośredniej analizy obrazu w celu ilościowego określenia złożoności składników i plastyczności sieci błon wewnątrzkomórkowych.

Analiza sieci błon rurkowych w miocytach serca z przedsionków i komór

Tutaj prezentujemy techniki obrazowania lokalnych zdarzeń Ca2+ za pośrednictwem IP3 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w nienaruszonych komórkach ssaków załadowanych wskaźnikami Ca2+ wraz z algorytmem, który automatyzuje identyfikację i analizę tych zdarzeń.

Obrazowanie lokalnych sygnałów Ca2+ w hodowanych komórkach ssaków

Prezentujemy oprogramowanie do półautomatycznego śledzenia względnego stężenia białka na całej długości dynamicznych wypukłości komórkowych.

Graficzny interfejs użytkownika do wspomaganego programowo śledzenia stężenia białka w dynamicznych wypukłościach komórkowych

Przedstawiamy protokół do optycznego wykrywania pojedynczych, nieznakowanych białek w czasie rzeczywistym, gdy są wydzielane z żywych komórek. Opiera się to na mikroskopii rozpraszania interferometrycznego (iSCAT), która może być stosowana do wielu różnych systemów i konfiguracji biologicznych.

Bezznacznikowe obrazowanie pojedynczych białek wydzielanych z żywych komórek za pomocą mikroskopii iSCAT

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Ten protokół przedstawia kroki do pozyskiwania i analizy fluorescencyjnych obrazów wapnia z perycytów otaczających mózg oraz danych o przepływie krwi z pobliskich naczyń krwionośnych u znieczulonych myszy. Techniki te są przydatne do badań nad fizjologią komórek szkieletowych i mogą być dostosowane do badania stanów przejściowych wapnia w dowolnym typie komórki.

Obrazowanie wapnia i hemodynamiki perycytów mózgu u myszy transgenicznych in vivo

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) to wtyczka ImageJ o otwartym kodzie źródłowym do analizy obrazowania 3D wapnia, która bada ruch na osi z i identyfikuje maksymalną wartość każdego stosu z, aby reprezentować intensywność komórki w odpowiednim punkcie czasowym. Może rozdzielać neurony nakładające się na siebie w kierunku bocznym (x/y), ale na różnych płaszczyznach z.

TACI: Wtyczka ImageJ do analizy obrazowania 3D wapnia

W tym protokole prezentujemy nowatorską technikę rejestrowania i analizowania sygnałów Ca2+ w żyłach wewnątrzpłucnych (małe żyły płucne lub PV) przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym. Technika ta obejmuje izolację małych PV, inkubację ich za pomocą wskaźnika Ca2+, kaniulowanie i zwiększanie ciśnienia, obrazowanie konfokalne sygnałów Ca2+ oraz analizę danych.

Obrazowanie sygnałówCa2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym

W niniejszym raporcie proponujemy nowe zastosowanie światłoutwardzalnych żywic stomatologicznych do mocowania podstawy elektrod lub sond do mikrodializy w eksperymentach chronicznych. Materiał ten umożliwia bezpośrednie wiązanie z czaszką.

Zastosowanie światlutowalnej żywicy do wiązania stomatologicznego do mocowania elektrod lub sond mikrodializacyjnych w eksperymentach przewlekłych

Poznaj zautomatyzowaną analizę ROI aktywności wapniowej w świniaczych tętnicach wieńcowych. Ta metoda zwiększa dokładność pomiarów fizjologicznych Ca²⁺ i redukuje błąd użytkownika w badaniach układu sercowo-naczyniowego.

Automatyczna analiza dynamicznych sygnałów Ca²⁺ w sekwencjach obrazów

Przeglądaj więcej filmów