Name: qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metodę qPCR do wykrywania DNA wirusa cytomegalii w bioptatach przewodu pokarmowego utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Ta technika zwiększa czułość diagnostyczną w porównaniu do konwencjonalnych metod barwienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Amy Thomasson za pomoc w przygotowaniu tego rękopisu, oraz Fredrikowi Skarstedtowi i Ryanowi Christy'emu za ich wysiłki w przygotowaniu rysunków.

Za zgodą Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej, przeprowadzono przeszukiwanie elektronicznej bazy danych laboratorium w celu zidentyfikowania bloków utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) reprezentujących przypadki zakażenia wirusem cytomegalii (CMV) w biopsjach przewodu pokarmowego (GI) rozpoznanych przez histopatologię (hematoksylina i eozyna (H&E) i/lub immunohistochemia (IHC)).
1. Przetwarzanie tkanek z tkanek biopsyjnych FFPE GI
<ol>
	<li>Pobrać bloki tkanek z biopsji przewodu pokarmowego FFPE pod kątem ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) wirusa cytomegalii (CMV). Bloki te są przechowywane w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wstępnie oznacz probówki do mikrofuge o pojemności 1,7 ml unikalnym numerem identyfikacyjnym bloku.</li>
	<li>Zablokuj pokrętło mikrotomu.</li>
	<li>Umieść blok tkanki w kasecie clamp.</li>
	<li>Używając świeżego, nieużywanego ostrza, dopasuj blok do kąta noża na mikrotomie.</li>
	<li>Dostosuj mikrotom, aby ciąć odcinki o grubości 10 μm.</li>
	<li>Odblokuj pokrętło i przesuń klocek w kierunku ostrza.</li>
	<li>Wytnij 5 odcinków bloku w odstępach o grubości 10 μm, pozwalając każdemu cięciu zwinąć się w zwój tkanki. Upewnij się, że każdy zwój zawiera odpowiednią reprezentację pożądanych tkanek z biopsji.</li>
	<li>Zablokuj pokrętło mikrotomu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy umieść wszystkie 5 zwojów tkanki we wstępnie oznakowanej probówce wirówkowej, uważając, aby manipulować zwojem tylko za pomocą parafiny, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Zatrzaśnij nakrętkę na tubie i umieść ją z powrotem na stojaku.</li>
	<li>Usuń blok tkankowy z mikrotomu.</li>
	<li>Wyjmij i wyrzuć ostrze.</li>
	<li>Odkazić wszelkie powierzchnie lub narzędzia, które mogły mieć kontakt z poprzednią tkanką.</li>
	<li>Umieść świeże, nieużywane ostrze w uchwycie noża.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.4-1.14 dla każdego dodatkowego bloku, który ma zostać przetworzony. Probówki do mikrofuge zawierające zwoje tkankowe mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej do czasu ekstrakcji DNA.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA ze zwojów tkanki biopsji przewodu pokarmowego FFPE
UWAGA: Ten protokół jest zaadaptowany z ulotki dołączonej do zestawu do ekstrakcji DNA tkanek FFPE (UWAGA: patrz Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS)).
<ol>
	<li>Dodaj 1 ml ksylenu (UWAGA: patrz karta charakterystyki) do każdej probówki do mikrofuge próbki. Zamknij pokrywkę i energicznie wiruj przez 10 sekund.</li>
	<li>Kontynuuj ekstrakcję DNA zgodnie z opisem w ulotce produktu producenta, z następującymi modyfikacjami.</li>
	<li>Najpierw dodaj 6 μl kontroli wewnętrznej (IC) do każdej probówki do mikrofuge.
	<ol>
		<li>Po inkubacji ATL/proteinazy K w temperaturze 56 °C przez 1 godzinę, inkubować w temperaturze 99 °C przez 30 minut, a nie w temperaturze 90 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Podczas ostatniego etapu elucji DNA ostrożnie otwórz pokrywę kolumny oczyszczającej DNA i nałóż 50 μl destylowanej wody wolnej od DNAzy/RNAzy na środek błony, zamiast buforować ATE. 
		UWAGA: Zapoznaj się z ulotką dołączoną do opakowania, aby uzyskać informacje na temat prawidłowego przechowywania i przygotowania odczynników. DNA powinno zostać wyekstrahowane ze wszystkich 5 zwojów FFPE. Wszystkie etapy wirowania należy wykonać w temperaturze pokojowej (15-25 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. qPCR dla CMV
<ol>
	<li>Procedura reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)
	<ol>
		<li>Wygeneruj arkusz PCR programu Excel dla przebiegu testu CMV. Ten arkusz programu Excel oblicza całkowitą ilość każdego odczynnika potrzebnego do przygotowania mieszanki głównej z Mg. Mnoży ilość każdego odczynnika potrzebnego na próbkę (wymienioną poniżej) razy liczbę próbek i próbek kontrolnych plus jeden (w celu skompensowania strat spowodowanych pipetowaniem).
		<ol>
			<li>Włączyć następujące odczynniki do każdej reakcji PCR we wskazanej ilości: 
			Ilość odczynnika na próbkę 
			CMV LC master mix fiolka 12,5 μl 
			Mg Roztwór żółty fiolka 2,5 μl 
			Objętość całkowita: 15,0 μl</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W każdym teście należy przeprowadzić kontrolę wody lub brak celu (NTC), kontrolę ujemną, niską kontrolę pozytywną, wysoką kontrolę pozytywną oraz QS3 lub QS4 oraz wszystkie próbki pacjentów. Kapilary należy ustawić w tej kolejności.</li>
		<li>Zaopatrzyć się w blok chłodzący specyficzny dla przyrządu do PCR w czasie rzeczywistym, który jest przechowywany w temperaturze 4 °C. Umieścić odpowiednie rurki kapilarne w bloku chłodzącym. Nie dotykaj powierzchni rurek kapilarnych. Podczas pracy z naczyniami włosowatymi należy zawsze używać rękawiczek.</li>
		<li>Ustaw wszystkie reakcje łańcuchowe polimerazy w czystym okapie, niezanieczyszczonym produktami wzmacniającymi.
		<ol>
			<li>Wyjmij odpowiednią liczbę fiolek głównych z zestawu do PCR, aby przetestować wszystkie próbki pacjenta oraz 5 próbek kontrolnych. Pozwól, aby fiolki główne, roztwór Mg i woda klasy PCR rozmroziły się w bloku chłodzącym. Każda fiolka wzorcowa zawiera wystarczającą ilość odczynników do przeprowadzenia 12 testów.</li>
			<li>Delikatnie zwiruj fiolki główne i szybko odwiruj je w wirówce z maksymalną prędkością.</li>
			<li>Połączyć zawartość każdej fiolki wzorcowej w jedną fiolkę i ponownie delikatnie wprowadzić wir.</li>
			<li>Połącz mieszaninę wzorcową i roztwór Mg w ilościach wskazanych w arkuszu PCR w jednej sterylnej probówce do mikrofuge.</li>
			<li>Delikatnie wymieszać i podatkować 15 μl mieszanki wzorcowej z Mg do każdej rurki kapilarnej, z wyjątkiem kapilary w pozycji 5, która jest przeznaczona dla wzorca oznaczalności (QS).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przenieść blok chłodzący zawierający rurki kapilarne i mieszanie główne z Mg z czystego okapu do okapu technologicznego.</li>
		<li>Dodać 2 μl kontroli wewnętrznej (IC) do pozostałych 30 μl mieszanki wzorcowej z Mg. Delikatnie wymieszać i podsycić 15 μl do kapilary w pozycji 5 (pozycja dla QS).</li>
		<li>Pobrać pipetą 10 μl wody, kontrolnego DNA lub próbki DNA do odpowiedniej rurki kapilarnej. Zakryj rurki kapilarne za pomocą narzędzia do zamykania.</li>
		<li>Przenieś blok chłodzący/próbki do urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaprogramuj instrument do PCR w czasie rzeczywistym (patrz Tabela 1)</li>
	<li>Amplifikacja i detekcja wykonywane na urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym
	<ol>
		<li>Zaloguj się do komputera</li>
		<li>Kliknij dwukrotnie ikonę instrumentu i zaloguj się do oprogramowania.</li>
		<li>Włącz instrument do PCR w czasie rzeczywistym</li>
		<li>Kliknij "CMV/EBV" na ekranie przednim.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami kreatora makr.</li>
		<li>Zaznacz to pole, aby uruchomić autotest po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie. Autotest należy wykonywać raz dziennie, gdy urządzenie jest w użyciu.</li>
		<li>Nazwij przebieg.</li>
		<li>Dostosuj liczbę próbek znajdującą się w lewym górnym rogu strony do sumy osób z grupy kontrolnej i pacjentów uwzględnionych w przebiegu i wprowadź numer identyfikacyjny każdej próbki pacjenta.</li>
		<li>Kliknij zakładkę "Abs Quant".</li>
		<li>W sekcji "Typ próbki" przypisz odpowiedni typ próbki dla normy.</li>
		<li>Wpisz oczekiwane stężenia dla wzorca oznaczalności (QS).</li>
		<li>Wyjmij rurki kapilarne z bloku chłodzącego i umieść je w odpowiedniej pozycji w karuzeli (próbka bloku chłodzącego #1 powinna być umieszczona w pozycji #1 na karuzeli itp.).</li>
		<li>Umieść karuzelę w wirówce urządzenia i naciśnij start.</li>
		<li>Otwórz wirówkę i wyjmij karuzelę.</li>
		<li>Umieść karuzelę w aparacie do PCR w czasie rzeczywistym. Zamknij pokrywę.</li>
		<li>Naciśnij "Rozpocznij bieg".</li>
		<li>Przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym sprawdzi każdą pozycję dla próbki. Nie odchodź od instrumentu, dopóki ta kontrola nie zostanie zakończona, zwłaszcza jeśli jedna z naczyń włosowatych nie znajduje się w karuzeli. Przyrząd odnotuje to i zapyta, czy bieg ma być kontynuowany. Odpowiedz tak przed wyjazdem.</li>
		<li>Po zakończeniu przebiegu zamknij wygenerowany raport.</li>
		<li>Kliknij "Bezwzględna ocena ilościowa".</li>
		<li>Kliknij strzałkę obok opcji Kompensacja kolorów.</li>
		<li>Kliknij "Wybierz kompensację kolorów" z listy rozwijanej.</li>
		<li>Wybierz najbardziej aktualny plik kompensacji kolorów, który ma zostać zastosowany do przebiegu.</li>
		<li>Kliknij OK, gdy pojawi się okno.</li>
		<li>Kliknij strzałkę obok opcji Krzywa standardowa.</li>
		<li>Wybierz "użyj zewnętrznego" z menu rozwijanego.</li>
		<li>Wybierz bieżący plik zewnętrznej krzywej standardowej, a następnie kliknij przycisk OK.</li>
		<li>Przyjrzyj się każdej krzywej w menu Kwantyfikacja bezwzględna, aby upewnić się, że obecne są krzywe, a nie płaska linia, jeśli przypisano stężenie. Kwantyfikacja bezwzględna dla modelu 705/Back 530 jest analizowana automatycznie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontrola jakości
	<ol>
		<li>Generuj nową krzywą wzorcową za każdym razem, gdy otrzymany zostanie nowy numer partii odczynników lub co sześć miesięcy, w zależności od tego, co dzieje się częściej.</li>
		<li>Dodać 10 μl każdego wzorca do mieszanki wzorcowej z Mg. Wzorce dołączone do zestawu należy traktować jako uprzednio wyekstrahowane DNA.</li>
		<li>Dodać 1 μl kontroli wewnętrznej dla każdego wzorca do mieszanki wzorcowej z Mg użytej do wygenerowania krzywej wzorcowej w celu zapewnienia dokładnej oceny ilościowej. Nie dodawaj IC do mieszanki głównej z Mg dla kontroli bez matrycy (NTC).</li>
		<li>Przygotować NTC i trzy powtórzenia wzorców ilościowych QS 4, 3, 2, 1 oraz rozcieńczenie QS4 w stosunku 1:10 dla serii w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, sumując się w 16 punktach danych.</li>
		<li>Wybierz "replikuj" z menu rozwijanego, aby uzyskać powtarzające się standardy</li>
		<li>Wybierz kanał 530/back none i włącz kompensację kolorów podczas analizy przebiegu,</li>
		<li>W sekcji "Krzywa standardowa (w biegu)" wybierz "zapisz jako zewnętrzną" i nazwij krzywą. Wprowadź komentarz "zastosowana jako krzywa standardowa" podczas zapisywania.</li>
		<li>Przedstaw wyniki na wykresie. Wynikowy współczynnik liniowości musi wynosić ≥0,81.</li>
		<li>W przypadku codziennych przebiegów dołącz jedną kopię QS3 lub QS4 jako kontrolkę w przebiegu. Bieżąca zewnętrzna krzywa standardowa może zostać zaimportowana do przebiegu w fazie analizy.</li>
		<li>Uruchom kontrole: brak kontroli DNA, kontrola negatywna, niskie i wysokie kontrole pozytywne. Oczekiwana wiremia jest określana i dostosowywana dla każdego dostawcy i numeru partii.</li>
		<li>Dodaj IC do każdej próbki i kontroluj podczas ekstrakcji DNA.</li>
		<li>Jeśli którakolwiek z kontroli znajdzie się poza zakresem, zapisz niedopuszczalne wyniki i skieruj test do rozwiązania problemu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Częstotliwość kontroli
	<ol>
		<li>Uwzględnij w każdym przebiegu: NTC, kontrolkę ujemną, nisko dodatnią, wysoką dodatnią i standardową.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
UWAGA: Dopuszczalne limity dla kontroli. Nie należy obserwować pików w przypadku braku matrycy (NTC) i kontroli ujemnych. Piki powinny być obecne w kanale 530, a oczekiwane miano wirusa jest określane i dostosowywane dla każdego dostawcy i numeru partii dla niskich i wysokich kontroli dodatnich.

<ol><li>Hodinka, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHodinka%2C+RL+%22Manual+of+Clnical+Microbiology%22">Manual of Clnical Microbiology</a>. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).</li>
<li>Lasry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstrain+variations+in+the+cytomegalovirus+%28CMV%29+glycoprotein+B+gene+sequence+among+CMV-infected+children+attending+six+day+care+centers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day care centers.</a> The Journal of infectious diseases. 174, 606-609 (1996).</li>
<li>Murph, J. R., Baron, J. C., Brown, C. K., Ebelhack, C. L., Bale Jr, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occupational+risk+of+cytomegalovirus+infection+among+day-care+providers%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+%3A+the+journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The occupational risk of cytomegalovirus infection among day-care providers.</a> JAMA : the journal of the American Medical Association. 265, 603-608 (1991).</li>
<li>Pass, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccine+prevention+of+maternal+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection.</a> The New England journal of medicine. 360, 1191-1199 (2009).</li>
<li>McCoy, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((qPCR+increases+sensitivity+to+detect+cytomegalovirus+in+paraffin-embedded%2C+formalin-fixed+tissue+of+gastrointestinal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">qPCR increases sensitivity to detect cytomegalovirus in paraffin-embedded, formalin-fixed tissue of gastrointestinal biopsies.</a> Human Pathology. 45, 48-53 (2014).</li>
<li>Mills, A. M., Guo, F. P., Copland, A. P., Pai, R. K., Pinsky, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+CMV+detection+in+gastrointestinal+mucosal+biopsies+using+immunohistochemistry+and+PCR+performed+on+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+surgical+pathology%22%5BJournal%5D)">A comparison of CMV detection in gastrointestinal mucosal biopsies using immunohistochemistry and PCR performed on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> The American journal of surgical pathology. 37, 995-1000 (2013).</li>
<li>Krech, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-fixing+antibodies+against+cytomegalovirus+in+different+parts+of+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Complement-fixing antibodies against cytomegalovirus in different parts of the world.</a> Bulletin of the World Health Organization. 49, 103-106 (1973).</li>
<li>Chou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newer+methods+for+diagnosis+of+cytomegalovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Newer methods for diagnosis of cytomegalovirus infection.</a> Reviews of infectious diseases. 12 Suppl 7, (1990).</li>
<li>Brytting, M., Xu, W., Wahren, B., Sundqvist, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomegalovirus+DNA+detection+in+sera+from+patients+with+active+cytomegalovirus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytomegalovirus DNA detection in sera from patients with active cytomegalovirus infections.</a> Journal of clinical microbiology. 30, 1937-1941 (1992).</li>
<li>Revello, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+in+blood+of+immunocompetent+persons+during+primary+infection%3A+prognostic+implications+for+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus in blood of immunocompetent persons during primary infection: prognostic implications for pregnancy.</a> The Journal of infectious diseases. 177, 1170-1175 (1998).</li>
<li>Shinkai, M., Bozzette, S. A., Powderly, W., Frame, P., Spector, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+urine+and+leukocyte+cultures+and+plasma+DNA+polymerase+chain+reaction+for+identification+of+AIDS+patients+at+risk+for+developing+human+cytomegalovirus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+infectious+diseases%22%5BJournal%5D)">Utility of urine and leukocyte cultures and plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing human cytomegalovirus disease.</a> The Journal of infectious diseases. 175, 302-308 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Dostępnych jest wiele metod laboratoryjnych do diagnozowania zakażenia wirusem cytomegalii (CMV), w tym serologia, hodowla wirusa, testy wiremii molekularnej, histologia materiału biopsyjnego oraz, jak ostatnio wykazano, testy molekularne tkanki biopsyjnej utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE)5,6. Serologia, niegdyś podstawa diagnostyki, jedynie wiarygodnie identyfikuje narażenie i nie koreluje dobrze z ostrym zakażeniem CMV7. Hodowla wirusa, zarówno konwencjonalna, jak i wczesna f...

Interpretacja zakażenia wirusem cytomegalii (CMV) w próbkach klinicznych jest niezwykle ważna. CMV należy do podrodziny herpesvirinae herpeswirusów. Podobnie jak inne herpeswirusy, CMV ma zdolność do tworzenia trwałej lub utajonej infekcji charakteryzującej się brakiem aktywnej replikacji wirusa1. Reaktywacja wirusa może nastąpić w okresach stresu lub innej immunosupresji, co prowadzi do aktywnej replikacji wirusa charakteryzującej się uwalnianiem wirionu, któremu mogą towarzyszyć objawy choroby2-4. Objawy choroby CMV w przewodzie pokarmowym (GI) często obejmują ból brzucha i/lub krwawe stolce1.
Rozpoznanie zapalenia żołądka i jelit CMV za pomocą histologii wykorzystuje hematoksylinę i eozynę (H&E) do identyfikacji inkluzji wirusa CMV. W przypadkach, gdy podejrzenie kliniczne jest wysokie, ale nie obserwuje się żadnych oczywistych inkluzji, immunohistochemia (IHC) jest często stosowana jako metoda badania uzupełniającego. Jednak IHC może być również utrudnione przez rzadkie, nieklasyczne wzorce barwienia komórkowego (niejednoznaczne), co utrudnia interpretację (ryc. 2)5. Starano się wykorzystać DNA wyekstrahowane z tkanki biopsji przewodu pokarmowego utrwalonego w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE) oraz ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) do wykrywania CMV w biopsjach przewodu pokarmowego. Wykazano, że technika ta jest cenna w wykrywaniu CMV w biopsjach przewodu pokarmowego i jest szczególnie pomocna w przypadkach niejednoznacznego barwienia IHC5,6. Wykazano również, że qPCR dobrze koreluje z dodatkowymi danymi klinicznymi z testów CMV, gdy są one dostępne6. Zastosowanie qPCR w wykrywaniu CMV może prowadzić do wcześniejszej diagnozy i leczenia w przypadkach, gdy kliniczne podejrzenie CMV jest wysokie, ale H&E i CMV IHC są ujemne.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml Probówki do mikrofug</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>Ząbkowane kleszcze</td><td>Usługi mikroskopii elektronowej</td><td>62086-1S</td><td>Mikrokleszcze MF-1</td></tr><tr><td>Wirówki stołowe (mikrofugi)</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: X3P</td><td>1 galon</td></tr> etanolu <tr><td></td><td>Fisher</td><td>Fisher Scientific: ET108</td><td>96-100% </td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA FFPE Zestaw tkanek</td><td>Qiagen</td><td>56404</td><td></td></tr><tr><td>artus CMV LightCycler PCR ASR</td><td>Qiagen</td><td>4500025</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw suplementów CMV LC PCR Wirówka</td><td>Qiagen</td><td>1031873</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler</td><td>Roche</td><td>75005087</td><td></td></tr><tr><td>Blok chłodzący LightCycler</td><td>Roche</td><td></td><td></td>10800058001</tr><tr><td>Narzędzie do zamykania LightCycler</td><td></td><td></td> Zestaw do kompensacji kolorów 3357317 <td></td></tr><tr><td></td><td>Roche</td><td>2158850</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 20 &mu; l Kapilary</td><td>Roche</td><td>1 909 339</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza</td><td>Sakura</td><td>Fisher Scientific: 4689</td><td>Accu-Edge low profile</td></tr></tbody></table>

qpcr jest czułą i szybką metodą wykrywania dna wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

Kluczowe jest zidentyfikowanie zakażenia wirusem cytomegalii (CMV) w przewodzie pokarmowym (GI) pacjentów z obniżoną odpornością, biorąc pod uwagę ich większe ryzyko rozwoju ciężkiej infekcji. Opracowano wiele metod laboratoryjnych do wykrywania zakażenia CMV, w tym serologię, hodowlę wirusa i metody molekularne. Często metody te odzwierciedlają ogólnoustrojowe zajęcie CMV i nie identyfikują jednoznacznie miejscowego zajęcia tkanki. W związku z tym wykrywanie zakażenia CMV w przewodzie pokarmowym jest często wykonywane za pomocą tradycyjnej histologii tkanki biopsyjnej. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w połączeniu z immunohistochemią (IHC) pozostało podstawą badania tych biopsji. H&E i IHC czasami skutkują nietypowymi (niejednoznacznymi) wzorami barwienia, co utrudnia interpretację. Wykazano, że ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR) w kierunku CMV może być z powodzeniem przeprowadzana na tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (FFPE) o bardzo wysokiej czułości i swoistości. Celem tego protokołu jest pokazanie, jak wykonywać testy qPCR w celu wykrycia CMV w tkance biopsji FFPE w klinicznych warunkach laboratoryjnych. Metoda ta może być bardzo korzystna dla pacjentów w przypadkach niejednoznacznego barwienia CMV w biopsjach przewodu pokarmowego.

Łącznie 228 bloków tkanek przebadano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), z czego 91 przypadków było pozytywnych pod kątem cytomegalowirusa (CMV) na podstawie histologii i pozytywnej immunohistochemii (IHC), 18 miało wątpliwy wynik IHC pod kątem CMV, a 79 stanowiły kontrole negatywne. Jak pokazano na Rysunku 2, przypadki CMV-dodatnie wykazywały typowe wtrącenia wirusowe CMV (A) i/lub pozytywne barwienie IHC (B). Przypadki wątpliwe wykazywały rzadki...

Ten protokół opisuje wykrywanie wirusa cytomegalii metodą qPCR w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie, co jest szybkie, czułe, specyficzne i przydatne do interpretacji niejednoznacznych wzorców barwienia hematoksyliną i eozyną lub immunohistochemicznych.

qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Ogólnym celem następującej procedury jest zwiększenie czułości wykrywania DNA cytomegalowirusa w biopsjach z przewodu pokarmowego, w szczególności w biopsjach, które dają niejednoznaczne wyniki w konwencjonalnych metodach barwienia. Osiąga się to poprzez wstępne wycięcie i zebranie zwojów tkanki z biopsji przewodu pokarmowego utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie. Następnie z zwojów tkanki ekstrahuje się DNA w celu jego amplifikacji.Specyficzne primery służą do selektywnej amplifikacji dowolnego DNA cytomegalowirusa. W przypadku gdy konwencjonalne metody stosowane w badaniu tkanek z biopsji przewodu pokarmowego dają niejednoznaczne wyniki, ta czuła metoda pozwala na wykrycie DNA cytomegalowirusa. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami stosowanymi w tej dziedzinie, takimi jak hematylina, indyna i immunohistochemia, jest to, że nie wymaga ona interpretacji nieklasycznych wzorców barwienia. Na slajdzie przedstawiającym preparowanie tkanek z biopsji przewodu pokarmowego pojawi się Zainab van Horn, histotechnik w laboratorium, która zademonstruje ekstrakcję kwasów nukleowych, a następnie zostanie przedstawione przygotowanie do RT-PCR w laboratorium.Rebecca Jocelyn. Do niniejszego protokołu należy przygotować bloki tkanek z biopsji przewodu pokarmowego utrwalone w FFPE, umieszczone na kruszonym lodzie. Następnie, przy mikrotomie, należy opisać probówki do wirówki mikrocentryfugalnej dla każdego bloku próbki, wpisując numer identyfikacyjny bloku tkanki.Upewnij się, że pokrętło jest zablokowane, a następnie umieść kasetkę z blokiem tkankowym w uchwycie. Aby zapobiec kontaminacji krzyżowej między próbkami, upewnij się, że używasz nowej ostrza. Niezwykle ważne jest zastosowanie nieużywanego ostrza do pierwszej próbki.Wymień ostrze między kolejnymi próbkami oraz zdekontaminuj mikrotom pomiędzy preparatami. Następnie ustaw blok zgodnie z kątem noża i dostosuj grubość przekroju do 10 microns. Teraz odblokuj pokrętło i przesuń blok w kierunku ostrza.Wyciąć pięć skrawków z bloku w odstępach 10 mikronów, pozwalając, aby każdy skrawek zwinął się w rulonik tkanki. Upewnić się, że każdy rulonik zawiera reprezentatywną ilość pożądanej tkanki z biopsji. Po wycięciu pięciu ruloników zablokować pokrętło ręczne.Podczas przenoszenia pięciu zwitków do oznakowanej probówki wirówkowej należy upewnić się, że pęseta dotyka wyłącznie parafiny, a nie tkanki, i zrobić to sprawnie. Zakręć probówkę, a następnie wyjmij blok z uchwytu kasety, aby pobrać zwitki z kolejnej próbki. Najpierw usuń i wyrzuć ostrze.Przed załadowaniem nowego, nieużywanego ostrza należy zdezynfekować wszystkie powierzchnie, które mogły mieć kontakt z poprzednią próbką. Do czasu dalszego przetwarzania próbki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej. Poniższy protokół został dostosowany z zestawu do ekstrakcji DNA z tkanek FFPE.Przed przystąpieniem do pracy należy zapoznać się z kartą charakterystyki materiałów. Rozpocznij od dodania 1 ml ksylenu do każdej probówki z próbką, a następnie intensywnie wymieszaj je w wstrząsacu wirówkowym przez 10 s. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, wprowadzając następujące modyfikacje.W pierwszej kolejności do każdej probówki należy dodać 6 µL kontroli wewnętrznej. Po drugie, po inkubacji lizy białkiem proteinaza K z zestawu A TL w temperaturze 56 °C przez jedną godzinę, próbki należy inkubować w temperaturze 99 °C przez 30 minut zamiast w 90 °C przez jedną godzinę.Po trzecie, podczas etapu elucji, zamiast buforu TE, ostrożnie nanieś 50 µL wody destylowanej wolnej od DNK i RNK na środek membrany kolumny elucyjnej. I na koniec, wszystkie etapy wirowania powinny być przeprowadzane w temperaturze pokojowej. Przygotuj reakcje w czystym wyciągu, który nie jest zanieczyszczony produktami amplifikacji z zestawu.Wyjąć odpowiednią liczbę fiolek matowych i roztworu magnezu dla próbek oraz pięciu kontroli. Każda fiolka matowa zawiera odczynnik wystarczający do przeprowadzenia 12 testów. Po rozmrożeniu wymieszać fiolki matowe w wirówce typu vortex i krótko odwirować z maksymalną prędkością.Następnie, zgodnie z arkuszem PCR, połączyć roztwór magnezu i master mix. Delikatnie wymieszać roztwory poprzez pipetowanie, umieszczając je w bloku chłodzącym. Dodać 15 µL mieszaniny do kapilar testowych w bloku chłodzącym, z wyjątkiem pozycji piątej.Kapilara ta jest przeznaczona dla standardu ilościowego. Przenieś blok chłodzący zawierający kapilary i master mix z magnezem z czystego wyciągu do oddzielnego wyciągu procesowego. Następnie dodaj 2 µL kontroli wewnętrznej do pozostałych 30 µL master mixu.Wymieszaj roztwór, pipetując go w górę i w dół, a następnie nanieś 15 µL tej mieszaniny do kapilary w pozycji piątej. Następnie dodaj 10 µL kontrolnego DNA w wodzie lub DNA z próbki do odpowiedniej kapilary. Po załadowaniu zamknij kapilary za pomocą narzędzia do zamykania w wirówce do kapilar.Przenieś kapilary z bloku chłodzącego do odpowiedniej pozycji w statywie karuzelowym. Następnie umieść karuzelę w wirówce i uruchom cykl wirowania. Przenieś karuzelę do urządzenia do real-time PCR i przeprowadź reakcję w późniejszym etapie analizy.Przeanalizuj dane za pomocą ilościowania absolutnego, aby upewnić się, że dostępna jest krzywa umożliwiająca wykonanie pomiarów ilościowych dla łącznie 228 próbek. Bloki tkankowe przebadano metodą QPCR. 91 bloków stanowiły przypadki CMV-dodatnie na podstawie badania histologicznego i dodatniej immunohistochemii.W 18 blokach uzyskano niejednoznaczny wynik C-M-V-I-H-C. Pozostałe 79 stanowiło kontrolę negatywną. Przedstawiono przypadki dodatnie pod kątem CMV.Typowe inkluzje wirusa CMV i dodatnie barwienie IHC lub przynajmniej jedno z tych dwóch kryteriów. W przypadkach niejednoznacznych zaobserwowano rzadkie, nietypowe wzorce barwienia, natomiast w kontrolach negatywnych nie stwierdzono podejrzanych zmian histologicznych ani barwienia IHC w 91 tkankach dodatnich pod kątem CMV 88. Z 71 kontroli negatywnych jedna uzyskała wynik dodatni w teście QPCR na obecność CMV.A. Omówienie biopsji z niejednoznacznym barwieniem C-M-V-I-H-C znajduje się w protokole tekstowym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania ekstrakcji DNA z utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie tkanek z biopsji przewodu pokarmowego, a następnie późniejszej detekcji DNA cytomegalowirusa za pomocą real-time PCR.

qpcr-is-sensitive-rapid-method-for-detection-cytomegaloviral-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

qPCR Jest wrażliwą i szybką metodą wykrywania DNA cytomegalowirusa w utkankach biopsji fiksowanych w formalinie i osadzonych w parafinie

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

W tym filmie, komórki zainfekowane wirionami MCPyV zostały poddane reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia specyficznych genomów MCPyV. Co więcej, technikę DNA-HCR połączono z FISH w celu wizualizacji DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry.

HCR-DNA FISH: Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania wirusowego DNA w zakażonych komórkach

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym w połączeniu z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest szeroko stosowana do pomiaru poziomu infekcji wirusem RNA. W tym miejscu przedstawiamy bezpośredni test RT-qPCR, który nie wymaga etapu oczyszczania RNA, opracowany do oznaczania ilościowego kilku wirusów RNA, w tym wirusa dengi.

Pomiar RNA wirusa dengi w supernatancie hodowli zakażonych komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw uszkodzeń mięśni jest kluczowa. Przedstawiamy tutaj technikę histologiczną przygotowywania skrawków z laniny oraz skrawków mrożonych mięśni klatki piersiowej Drosophila. Pozwala to na analizę morfologii mięśni oraz lokalizację białek i innych składników komórek mięśniowych.

Przekroje woskowe i mrożone mięśni dorosłych osobników Drosophila

Poznaj metodę qPCR do wykrywania DNA wirusa cytomegalii w bioptatach przewodu pokarmowego utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Ta technika zwiększa czułość diagnostyczną w porównaniu do konwencjonalnych metod barwienia.

qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie (Wideo) | JoVE Journal

qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie

Przeglądaj więcej filmów