Demonstracja proteolitycznej aktywacji nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) poprzez połączenie pomiarów prądu z detekcją fragmentów rozszczepienia

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie wpływu proteaz na heterologicznie wyrażony w oocytach żaby Xenopus laevis epiteliatny kanał sodowy (ENaC). Osiąga się to poprzez pomiar prądu całokomórkowego w oocycie, wrażliwego na amiloryd. Po regeneracji oocytu zostaje on poddany działaniu proteazy, a następnie ponownie mierzony jest prąd.

Następnie równolegle oocyty poddawane są biotynylacji i western blottingowi w celu monitorowania pojawienia się fragmentów cięcia gamma ENaC na powierzchni komórki; wyniki uzyskane dzięki połączeniu techniki twu-elektrodowej clampy napięciowej oraz metody z użyciem biotyny wykazują związek przyczynowy między cięciem kanału a jego aktywacją. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak pomiary nieplanowane, jest możliwość wystawienia oocytu na działanie proteazy lub innych czynników farmakologicznych pomiędzy dwoma pomiarami przez różny czas w małej objętości roztworu testowego. Dwa dni po izolacji oocytów Xenopus laevis i wstrzyknięciu cRNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć roztworu ND 96 do napełnienia jednej strzykawki grawitacyjnego systemu perfuzji oraz roztworu ND 96 zawierającego amid do napełnienia drugiej strzykawki.

Po zamontowaniu strzykawek 50 cm nad komorą kąpielową, należy włączyć 150 W halogenowe źródło zimnego światła i ustawić je 10 cm nad komorą kąpielową dla oocytów, aby zapewnić dobrą wizualizację pod mikroskopem binokularnym. Następnie należy włączyć odsysanie i umieścić rurkę ssącą naprzeciwko adaptera rurki do superfuzji w komorze kąpielowej oocytów. W kolejnym kroku, korzystając z urządzenia IV do kontroli przepływu grawitacyjnego, należy ustawić prędkość superfuzji każdego roztworu na 3 do 5 ml/min. Następnie, za pomocą adaptera, należy połączyć rurki do superfuzji z komorą kąpielową oocytów, używając szklanych kapilar wyciąganych mikropipetą, aby uzyskać średnicę końcówki mniejszą niż 1 µm.

Następnie należy wypełnić je w około jednej czwartej objętości trzymolowym roztworem chlorku potasu. Wprowadź kapilary do uchwytów elektrod prądowej i napięciowej, a następnie za pomocą mikromanipulatorów umieść je w ND 96 zawierającym dwumikromolowy roztwór amidu. Aby zmierzyć wrażliwe na amid prądy całokomórkowe, należy zacząć od ustawienia przycisku VM offset w celu zerowania potencjału elektrody napięciowej oraz przycisku VE offset w celu zerowania elektrody prądowej.

Umieść miejsce UO w komorze kąpielowej w bliskim sąsiedztwie elektrody pomiarowej napięcia. Następnie, używając obu mikroelektrod, delikatnie przebij miejsce UO, ustaw potencjał utrzymujący wzmacniacza na -60 mV i włącz rejestrator. Następnie włącz dopływ roztworu zawierającego amid.

Następnie rozpocznij rejestrację i w razie potrzeby dostosuj wzmocnienie. Po osiągnięciu stabilnego plateau mierzonego prądu, przełącz na roztwór wolny od amidu. Po osiągnięciu plateau prądowego przywróć perfuzję roztworem zawierającym amid. Gdy prąd w miejscu UO osiągnie początkowy prąd bazowy, wyłącz zacisk napięciowy (voltage clamp) i ostrożnie wycofaj elektrody, aby umożliwić ponowne zamknięcie błony plazmatycznej w miejscach wkłucia.

Umieść miejsce Uoc w jednym dołku płytki 96-dołkowej zawierającej od 100 do 150 µl roztworu ND 96 wolnego od proteaz na pięć minut, przed przeniesieniem miejsca UOC do roztworu zawierającego proteazę lub do roztworu kontrolnego bez proteazy. Przez 30 minut po inkubacji powtórz bieżący pomiar, odrzuć uszkodzone oocyty pod mikroskopem stereoskopowym i przygotuj anti 96 z odpowiednią proteazą oraz bez niej. Przygotuj pipety pastoralne, etykietując je i krótko opalając ich końcówki płomieniem, aby uniknąć uszkodzenia oocytów.

Napełnij każde wgłębienie płytki sześciodołkowej 2,5 ml medium ND 96 w temperaturze pokojowej lub medium ND 96 zawierającego proteazę. Następnie dodaj po 30 oocytów do każdego wgłębienia i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po napełnieniu wgłębień nowej płytki sześciodołkowej 2,5 ml medium ND 96, przenieś każdą grupę oocytów do wgłębienia wypełnionego medium ND 96.

Przenoś oocyty sekwencyjnie do dwóch kolejnych dołków z ND 96, aby wypłukać pozostałą proteazę, a następnie inkubuj je w ostatnim dołku przez pięć minut; przygotuj biotynę w buforze do elucji biotyny zgodnie z protokołem tekstowym. Po umieszczeniu każdej grupy oocytów w dołku zawierającym 2,5 milliliters buforu do elucji biotyny, inkubuj przez 15 minut przy delikatnym mieszaniu. Następnie, po umieszczeniu każdej grupy oocytów w dołku zawierającym 2,5 milliliters buforu gaszącego w celu zatrzymania reakcji biotyny, przenieś je do drugiego dołka z buforem gaszącym i inkubuj przez pięć minut.

Przy delikatnym mieszaniu przenieść każdą grupę oocytów do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i przy użyciu 1 ml buforu lizującego, uzupełnionego o inhibitory proteaz, przeprowadzić lizę komórek, przeciskając je przez igłę o rozmiarze 27 G. Odwirować lizaty przez 10 minut przy 1500 ×g. Przenieść nadsącz do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej TRITTON X 100 oraz MP 40 i inkubować probówki na lodzie przez 20 minut. Po wielokrotnym wstrząsaniu probówek w celu rozpuszczenia białek oraz po zrównoważeniu 100 µl kulek vagaro na grupę oocytów, dodać je do roztworów białek z detergentem i inkubować próbki w rotacji nadgłowicowej w temperaturze 4 °C przez noc.

Następnego dnia odwiruj próbki przez trzy minuty przy 1500 ×g. Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki, aby wykryć fragmenty cięcia act na powierzchni komórek. Przygotuj próbki do elektroforezy w żelu, przemywając kuleczki trzy razy buforem lizującym przed dodaniem dwukrotnego buforu do próbek SDS-PAGE. Po odwirowaniu próbek przez trzy minuty przy 20 000 ×g, przelej nadsącz do nowych probówek do wirówki mikrocentryfużowej.

Próbki należy poddać analizie metodą western blot zgodnie z protokołem tekstowym, aby zbadać, czy serynowa proteaza plazmina potrafi aktywować prądy pośredniczone przez ENaC. Wartość delta IE poszczególnych cytes wykazujących ekspresję ENaC określono przed i po 30-minutowej inkubacji cytes w roztworze wolnym od proteaz lub zawierającym plazminę. Z zastosowaniem techniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego (two electrode voltage clamp), przedstawionej w tym materiale, wykazano, że ekspozycja na plazminę zwiększyła delta IE w każdym zmierzonym cyte.

Z kolei inkubacja w roztworze wolnym od proteaz miała pomijalny wpływ. Rysunek ten porównuje wpływ chymotrypsyny na ENaC typu dzikiego oraz na ENaC z zmutowanymi miejscami cięcia prostazyny i plazminy. Jak widać, zmutowany kanał opóźnia i ogranicza aktywację prądu pośredniczonego przez ENaC wywołaną przez chymotrypsynę.

Ponadto generuje ono fragment cięcia z mniejszą częstotliwością w porównaniu do ENaC typu dzikiego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak kombinacja opisanych metod może zostać wykorzystana do skorelowania stymulującego wpływu proteaz na występowanie wewnętrzne z pojawieniem się produktów cięcia na powierzchni komórki. Może to być przydatne w szerokim zakresie zastosowań, na przykład w celu udzielenia odpowiedzi na podobne pytania dotyczące regulacji innych kanałów jonowych, transporterów lub receptorów transbłonowych.