Name: Demonstracja proteolitycznej aktywacji nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) poprzez połączenie pomiarów prądu z detekcją fragmentów rozszczepienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Poznaj metodę badania proteolitycznej aktywacji kanału ENaC w oocytach Xenopus laevis poprzez pomiary prądu i detekcję fragmentów rozszczepienia. Technika ta pozwala na precyzyjną kontrolę czasu ekspozycji na proteazy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Za fachową pomoc techniczną Céline Grüninger, Christinę Lang, Sonję Mayer i Ralfa Rinke dziękujemy. Dziękujemy dr Morag K. Mansley za uważne przeczytanie manuskryptu. Projekt ten został wsparty grantem Deutsche Forschungsgemeinschaft (grant SFB 423: Uszkodzenie nerek: patogeneza i mechanizmy regeneracyjne, dla C. Korbmachera), grantami Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (dla S. Haerteisa i M. Krappitza), programu ELAN (dla S. Haerteisa) Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg oraz Biblioteki Uniwersyteckiej w Erlangen-Norymberdze.

1. Izolacja oocytów Xenopus i mikroiniekcja cRNA
<ol>
	<li>Pozyskaj oocyty od dorosłej samicy Xenopus laevis. Znieczulić zwierzęta 0,2% MS222 i wyciąć płaty jajników przez małe nacięcie w jamie brzusznej.</li>
	<li>Wyizolować oocyty z płatów jajników przez trawienie enzymatyczne w temperaturze 19 °C przez 3-4 godziny z 600-700 U/ml kolagenazy typu 2 z Clostridium histolyticum rozpuszczonej w roztworze OR2 wolnym od wapnia (przepis w tabeli 1).</li>
	<li>W celu selekcji umieścić zdeflkulowane oocyty na szalce Petriego pod mikroskopem lornetkowym w roztworze o wysokiej zawartości sodu (ND96: przepis w Tabeli 1).</li>
	<li>Wybrać oocyty w stadium V-VI i umieścić je na innej szalce Petriego za pomocą pipety Pasteura. UWAGA: pipeta Pasteura przez płomienie, aby zapobiec uszkodzeniu oocytów.</li>
	<li>Wstrzyknąć oocytom cRNA (np. 0,2 ng na podjednostkę αβγENaC). Rozpuść cRNA w wodzie wolnej od RNaz. UWAGA: Całkowita objętość wstrzyknięta do każdego oocytu wynosi 46 nl.</li>
	<li>Przechowuj wstrzyknięte oocyty w temperaturze 19 °C w roztworze o niskiej zawartości sodu, aby zapobiec obciążeniu oocytów sodem (ND9: przepis w tabeli 1). Uzupełnij roztwór 100 j./ml penicyliny sodowej i 100 μg/ml siarczanu streptomycyny, aby zapobiec rozwojowi bakterii. Ostrożnie obchodź się z oocytami, aby ograniczyć ilość uszkodzonych lub martwych oocytów i utrzymuj je w pojedynczych małych grupach w 12-dołkowych studzienkach wypełnionych roztworem do kąpieli przez dwa dni po wstrzyknięciu cRNA.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >OR2</td>
			<td >82,5 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, dostosowane do pH 7,4 z NaOH</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ND96</td>
			<td >96 mM NaCl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, dostosowane do pH 7,4 za pomocą Tris</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ND9</td>
			<td >9 mM NaCl, 87 mM NMDG-Cl, 2 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES, dostosowane do pH 7,4 za pomocą Tris</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bufor biotynylacyjny</td>
			<td >10 mM trietanoloamina, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, dostosowany do pH 9,5 za pomocą HCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >bufor wygaszania</td>
			<td >192 mM glicyna, 25 mM Tris-Cl, dostosowana do pH 7,5 z HCl</td>
		</tr>
		<tr >
			<td bufor do >lizy</td>
			<td >500 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-Cl, dostosowane do pH 7,4 z HCl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Rozwiązania
2. Przeprowadzanie eksperymentów z dwuelektrodowymi zaciskami napięcia
<ol>
	<li>Zmierz oocyty dwa dni po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Napełnić jedną strzykawkę grawitacyjnego systemu perfuzyjnego roztworem ND96, a drugą strzykawkę roztworem ND96 zawierającym amiloryd (2 μM). Zamontuj strzykawki 50 cm nad komorą kąpieli oocytów. UWAGA: Stężenie amilorydu inhibitora ENaC zostało wybrane tak, aby było 20 razy wyższe niż jego IC50 (100 nM).</li>
	<li>Włącz halogenowe źródło zimnego światła o mocy 150 W i ustaw je na wysokości 10 cm nad komorą kąpieli oocytów, umożliwiając dobrą wizualizację za pomocą mikroskopu dwuokularowego. Następnie włącz ssanie i wyreguluj rurkę ssącą na końcu komory kąpieli oocytów. Umieść rurkę ssącą naprzeciwko adaptera rurek do zgrzewania wchodzącego do kąpieli oocytów. UWAGA: Moc ssania musi być wystarczająca, aby utrzymać ciągły przepływ roztworu powodującego fuzję oocytu.</li>
	<li>Dostosuj prędkość superfuzji każdego roztworu do 3-5 ml/min za pomocą urządzenia do kontroli przepływu dożylnego. Podłącz rurki do zgrzewania z adapterem do komory kąpieli oocytów.</li>
	<li>Pociągnij szklane kapilary za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać średnicę końcówki <1 μm. Następnie napełnij kapilary do ~1/4 3 M KCl. UWAGA: Upewnij się, że chlorowana część srebrnego drutu uchwytu elektrody jest zanurzona w roztworze KCl. Sprawdź, czy w końcówce kapilary nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza pogarszają pomiar poprzez zwiększenie pojemności błądzącej rezystancji.</li>
	<li>Włóż kapilary do uchwytów elektrod prądu i elektrody napięciowej i umieść je w roztworze ND96 zawierającym amiloryd (2 μM) za pomocą mikromanipulatorów.</li>
</ol>
3. Pomiar prądów całych komórek wrażliwych na amiloryd
<ol>
	<li>Wyzeruj potencjał elektrody napięciowej (Vm) i elektrody prądowej (Ve), regulującprzyciski przesunięcia Vm i Ve.UWAGA: Rezystancja powinna wynosić 1-2 MΩ dla elektrody do pomiaru Vm i 0,5-1 MΩ dla elektrody do wstrzykiwania prądu.</li>
	<li>Umieść oocyt w komorze kąpieli w bliskiej odległości od elektrody wykrywającej napięcie. UWAGA: Nie uszkadzaj oocytu podczas żadnego z tych etapów transferu. Użyj pipety Pasteura, aby przenieść oocyt. Aby uniknąć uszkodzenia oocytu, krawędzie pipety powinny być stępione przez płomieniowanie.</li>
	<li>Delikatnie przebij oocyty obiema mikroelektrodami.</li>
	<li>Ustaw potencjał podtrzymania na amplifier na -60 mV i włącz rejestrator wykresów. Włączyć roztwór zawierający amiloryd (2 μM). UWAGA: Prąd powinien wynosić około 0 ± 0,5 μA. Większe prądy upływowe wskazują na nieszczelne przebicie. Dlatego te oocyty należy odrzucić. Ponadto prądy upływowe mierzone w obecności amilorydu (2 μM) powinny być podobne w oocytach wykazujących ekspresję αβγ-WT do tych mierzonych w oocytach wykazujących ekspresję αβγ-mutanta ENaC. Oznacza to, że mutacje nie wpływają na wrażliwość kanału na amilorydy.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie. W razie potrzeby dostosuj wzmocnienie.</li>
	<li>Gdy mierzony prąd osiągnie stabilny plateau, zmień na roztwór wolny od amiloridów. UWAGA: Odchylenia prądu w dół w ścieżkach prądowych odpowiadają prądom wewnętrznym, czyli przemieszczaniu się ładunku dodatniego (Na+) od strony zewnątrzkomórkowej do ogniwa.</li>
	<li>Po osiągnięciu plateau prądu (po ~60 sekundach) przełącz superfuzję z powrotem na roztwór zawierający amilorydy. Gdy prąd oocytu osiągnie początkowy prąd podstawowy, wyłącz cęgi napięciowe i delikatnie wyjmij elektrody.</li>
	<li>Aby umożliwić ponowne uszczelnienie błony plazmatycznej w miejscach przebicia, umieść oocyt w jednym dołku 96-dołkowej płytki zawierającej 100-150 μl roztworu ND96 wolnego od proteazy.</li>
	<li>Po 5 minutach przenieść oocyt do roztworu zawierającego proteazę lub do roztworu kontrolnego bez proteazy na czas inkubacji 30 minut. UWAGA: Czas inkubacji zależy od proteazy i badanego kanału.</li>
	<li>Po etapie inkubacji powtórzyć bieżący pomiar (patrz 3.2 i następne). UWAGA: Możliwe jest zmierzenie >90% oocytów po inkubacji w roztworze proteazy.</li>
</ol>
4. Test biotynylacji
<ol>
	<li>Wybierz i odrzuć wadliwe oocyty pod mikroskopem dwuokularowym. UWAGA: Do bieżących pomiarów i eksperymentów z biotynylacją należy używać wstrzykniętych oocytów z tej samej partii.</li>
	<li>Trzymaj biotynę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut przed jej użyciem w eksperymencie.</li>
	<li>Przygotować roztwory: ND96 i ND96 zawierające odpowiednią proteazę. Przygotuj pipety Pasteura, oznaczając je etykietami i krótko podpalając ich końcówki, aby uniknąć uszkodzenia oocytów. UWAGA: W tym przypadku stosuje się proteazę chymotrypsynę 2 μg/ml w ND96. Każdą grupę należy traktować oddzielną pipetą, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego roztworów.</li>
	<li>Wypełnić każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 2,5 ml kontrolnego ND96 lub ND96 zawierającego proteazę w temperaturze pokojowej. Następnie umieść 30 oocytów w dołku i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: W przypadku kolejnych procedur ważne jest, aby próbki były zawsze trzymane na lodzie. Wszystkie etapy wirowania odbywają się w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Napełnij każdą studzienkę nowej płytki 6-dołkowej 2,5 ml ND96 (każda grupa potrzebuje 3 dołków na etapy mycia) i zważ biotynę. UWAGA: Wymagane jest 2,5 mg biotyny na studzienkę (1 mg / ml). Rozpuścić biotynę w buforze do biotynylacji (tj. 25 mg biotyny (dla 10 grup) w 25 ml buforu do biotynylacji (przepis w tabeli 1).</li>
	<li>Przenieś każdą grupę oocytów do studzienki wypełnionej 2,5 ml ND96. Przenieś oocyty sekwencyjnie do dwóch dodatkowych studzienek z ND96, aby zmyć pozostałą proteazę. Inkubować oocyty przez 5 minut w ND96.</li>
	<li>Przenieść oocyty do studzienki zawierającej 2,5 ml roztworu biotyny i inkubować je z delikatnym mieszaniem ("wytrząsaczem") przez 15 minut. UWAGA: Zminimalizuj przenoszony ND96 za pomocą pipety, aby uniknąć rozcieńczenia roztworu biotyny.</li>
	<li>Przenieść każdą grupę oocytów do studzienki zawierającej 2,5 ml buforu wygaszającego (przepis w Tabeli 1) w celu zatrzymania reakcji biotynylacji. Następnie przenieś każdą grupę oocytów do drugiego dołka, również zawierającego 2,5 ml buforu hartującego i inkubuj przez 5 minut z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Usuń uszkodzone lub martwe oocyty. UWAGA: Wybierz taką samą liczbę oocytów na grupę do poniższej procedury.</li>
	<li>Przenieś każdą grupę oocytów do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. UWAGA: Zminimalizuj ilość przenoszonego bufora wygaszającego.</li>
	<li>Następnie poddać lizie oocyty, przepuszczając je przez igłę 27 G w 1 ml buforu do lizy (przepis patrz tabela 1) uzupełnionego inhibitorami proteazy.</li>
	<li>Odwirowywać lizaty przez 10 minut przy 1 500 x g.</li>
	<li>Odessać supernatant i przenieść go do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 0,5% Triton-X-100 i 0,5% NP40. Wyrzuć pozostały granulek. UWAGA: Supernatant zawiera biotynylowane białka błony komórkowej i niebiotynylowane białka wewnątrzkomórkowe.</li>
	<li>Inkubować probówki do mikrowirówek przez 20 minut na lodzie. W tym okresie wielokrotnie wiruj probówki, aby całkowicie rozpuścić białka w NP40 i Triton-X-100.</li>
	<li>Odwirować 100 μl kulek agarozy na grupę oocytów przez 3 minuty przy 1 500 x g. Po odwirowaniu usunąć supernatant z roztworu kulek i przemyć trzykrotnie buforem do lizy w celu zrównoważenia kulek z buforem.</li>
	<li>Odpipetować 100 μl przemytych kulek do każdej probówki do mikrowirówki zawierającej roztwór białkowo-detergentowy przygotowany w 4.13, aby umożliwić związanie biotynylowanych białek z kulkami.</li>
	<li>Inkubować probówki do mikrowirówek z obrotem O/N nad głową w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować probówki do mikrowirówek przez 3 minuty przy 1 500 x g. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki. UWAGA: Białka wewnątrzkomórkowe nie są znakowane biotyną. Supernatant może być przechowywany w temperaturze -20 °C. Nie zasysaj koralików.</li>
</ol>
5. Wykrywanie fragmentów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki za pomocą analizy Western Blot
<ol>
	<li>Przemyć kulki trzykrotnie buforem do lizy i dodać 100 μl 2x buforu do próbek SDS-PAGE. UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub natychmiast przygotowane do analizy western blot.</li>
	<li>Gotować próbki przez 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie umieścić probówki na lodzie.</li>
	<li>Odwirować próbki przez 3 minuty przy 20 000 x g i odpipetować supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. UWAGA: Ten supernatant zawiera biotynylowane białka błony plazmatycznej z powierzchni komórki oocytu.</li>
	<li>Przeanalizuj 30 μl tego supernatantu za pomocą western blot, aby zbadać fragmenty rozszczepienia na powierzchni komórki.</li>
	<li>Oddzielić biotynylowane białka za pomocą SDS-PAGE (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu) za pomocą odpowiedniego żelu (8%, 10%, 12% w zależności od masy cząsteczkowej badanych fragmentów rozszczepienia).</li>
	<li>Przenieść białka do membran z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą półsuchego blottingu.</li>
	<li>Zbadaj błonę specyficznym przeciwciałem przeciwko ludzkiemu γENaC skierowanemu przeciwko epitopowi na końcu C (patrz ryc. 3 i 13).</li>
	<li>Użyj koziego przeciwciała anty-króliczego znakowanego peroksydazą chrzanową jako przeciwciała drugorzędowego.</li>
	<li>Wykrywanie sygnałów chemiluminescencyjnych.</li>
</ol>

<ol><li>Kleyman, T. R., Carattino, M. D., Hughey, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ENaC+at+the+cutting+edge%3A+regulation+of+epithelial+sodium+channels+by+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ENaC at the cutting edge: regulation of epithelial sodium channels by proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 284, 20447-20451 (2009).</li>
<li>Rossier, B. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+%28ENaC%29+by+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by serine proteases.</a> Annu Rev Physiol. 71, 361-379 (2009).</li>
<li>Poirot, O., Vukicevic, M., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+acid-sensing+ion+channel+1+by+serine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of acid-sensing ion channel 1 by serine proteases.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 38448-38457 (2004).</li>
<li>Vukicevic, M., Weder, G., Boillat, A., Boesch, A., Kellenberger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+cleaves+acid-sensing+ion+channel+1a+in+a+domain+that+is+critical+for+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trypsin cleaves acid-sensing ion channel 1a in a domain that is critical for channel gating.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281, 714-722 (2006).</li>
<li>Clark, E. B., Jovov, B., Rooj, A. K., Fuller, C. M., Benos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+cleavage+of+human+acid-sensing+ion+channel+1+by+the+serine+protease+matriptase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolytic cleavage of human acid-sensing ion channel 1 by the serine protease matriptase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 27130-27143 (2010).</li>
<li>Ossovskaya, V. S., Bunnett, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-activated+receptors%3A+contribution+to+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+reviews%22%5BJournal%5D)">Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease.</a> Physiological reviews. 84, 579-621 (2004).</li>
<li>Garcia-Caballero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+epithelial+sodium+channel+by+the+metalloprotease+meprin+%CE%B2-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%22%5BJournal%5D)">Activation of the epithelial sodium channel by the metalloprotease meprin β-subunit.</a> Channels (Austin. 5, 14-22 (2011).</li>
<li>Haerteis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+activation+of+the+epithelial+sodium+channel+%28ENaC%29+by+the+cysteine+protease+cathepsin-S%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proteolytic activation of the epithelial sodium channel (ENaC) by the cysteine protease cathepsin-S.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 464, 353-365 (2012).</li>
<li>Harris, M., Firsov, D., Vuagniaux, G., Stutts, M. J., Rossier, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+neutrophil+elastase+inhibitor+prevents+elastase+activation+and+surface+cleavage+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel neutrophil elastase inhibitor prevents elastase activation and surface cleavage of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus laevis oocytes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282, 58-64 (2007).</li>
<li>Passero, C. J., Mueller, G. M., Rondon-Berrios, H., Tofovic, S. P., Hughey, R. P., Kleyman, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+activates+epithelial+Na%2B+channels+by+cleaving+the+%CE%B3-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plasmin activates epithelial Na+ channels by cleaving the γ-subunit.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283, 36586-36591 (2008).</li>
<li>Svenningsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+in+nephrotic+urine+activates+the+epithelial+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Plasmin in nephrotic urine activates the epithelial sodium channel.</a> Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 20, 299-310 (2009).</li>
<li>Patel, A. B., Chao, J., Palmer, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+kallikrein+activation+of+the+epithelial+Na+channel%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tissue kallikrein activation of the epithelial Na channel.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 303, (2012).</li>
<li>Haerteis, S., Krappitz, M., Diakov, A., Krappitz, A., Rauh, R., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+and+chymotrypsin+have+distinct+preferences+for+channel+activating+cleavage+sites+in+the+%CE%B3-subunit+of+the+human+epithelial+sodium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plasmin and chymotrypsin have distinct preferences for channel activating cleavage sites in the γ-subunit of the human epithelial sodium channel.</a> The Journal of General Physiology. 140, 375-389 (2012).</li>
<li>Chraibi, A., Vallet, V., Firsov, D., Hess, S. K., Horisberger, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease+modulation+of+the+activity+of+the+epithelial+sodium+channel+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Protease modulation of the activity of the epithelial sodium channel expressed in Xenopus oocytes.</a> The Journal of General Physiology. 111, 127-138 (1998).</li>
<li>Volk, T., Konstas, A. A., Bassalay, P., Ehmke, H., Korbmacher, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Na%2B+removal+attenuates+rundown+of+the+epithelial+Na%2B-channel+%28ENaC%29+by+reducing+the+rate+of+channel+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Na+ removal attenuates rundown of the epithelial Na+-channel (ENaC) by reducing the rate of channel retrieval.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 447, 884-894 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy opisano podejście metodologiczne, które z powodzeniem zastosowano do badania mechanizmów leżących u podstaw aktywacji ENaC przez proteazy8,13. Do funkcjonalnej ekspresji ENaC wykorzystano dobrze znany system ekspresji oocytów Xenopus laevis . Funkcję ENaC oceniano za pomocą konwencjonalnej techniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego. Zastosowano mutagenezę ukierunkowaną na miejsce w celu zidentyfikowania funkcjonalnie istotnych miejsc rozszczepienia proteazy. Eksperymenty biotynylacyjne prowadzone równolegle z pomiarami elektrofizjologicznymi pozwoliły na skorelowanie pojawiania się produktów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki z aktywacją prądu proteolitycznego. Korelacja między przebiegiem w czasie aktywacji prądu a pojawieniem się fragmentów rozszczepienia proteolitycznego na powierzchni komórki potwierdza koncepcję aktywacji kanałów proteolitycznych.
Dwuelektrodowe zapisy napięciowe wymagają nabicia oocytu za pomocą dwóch mikroelektrod. Zabieg ten jest zwykle wykonywany tylko raz w pojedynczym oocycie. Możliwe było jednak usunięcie mikroelektrod po początkowym zarejestrowaniu prądu całego ogniwa bez widocznego uszkodzenia oocytu. Rzeczywiście, błona plazmatyczna w miejscach wbicia na pal wydaje się ponownie uszczelniać w ciągu kilku minut. Tak więc, po zakończeniu pierwszego dwuelektrodowego pomiaru napięcia cęgowego, możliwe jest przeniesienie oocytu z eksperymentalnej komory przepływowej dwuelektrodowego zestawu zacisków napięciowych do probówki mikrofuge lub studzienki z 96-dołkową płytką wypełnioną niewielką objętością roztworu testowego lub kontrolnego. Następnie ten sam oocyt może zostać przeniesiony z powrotem do komory przepływowej i może być ponownie nabity w celu wykonania drugiego pomiaru napięcia dwuelektrodowego. Co ciekawe, prądy, w których pośredniczy ENaC, nie różniły się zbytnio między pierwszym a drugim pomiarem, gdy oocyt był utrzymywany w roztworze kontrolnym. W przeciwieństwie do tego, inkubacja oocytu w roztworze zawierającym proteazę po pierwszym pomiarze spowodowała wzrost prądu za pośrednictwem ENaC w drugim pomiarze (ryc. 2). To odkrycie wskazuje na aktywację kanałów proteolitycznych.
Wykonanie dwóch oddzielnych pomiarów prądu w jednym oocycie ma tę zaletę, że oocyt może być wystawiony na działanie proteaz lub innych środków farmakologicznych między tymi dwoma pomiarami przez różny czas w małej objętości roztworu testowego. Jest to istotne w przypadku stosowania środków drogich i/lub niedostępnych w dużych ilościach, np. oczyszczonych preparatów proteazowych. Ograniczona dostępność środków może uniemożliwić (lub uniemożliwić ich stosowanie) w ciągłych dwuelektrodowych zapisach napięcia cęgowego ze względu na duże objętości roztworu testowego wymaganego do ciągłego superfuzji oocytów z natężeniem przepływu kilku mililitrów na minutę. Co więcej, ciągłe dwuelektrodowe pomiary napięcia cęgowego są ograniczone przez dobrze znane zjawisko spontanicznego spływu kanałów, opisane również dla ENaC 15. W przeciwieństwie do tego, wystawienie oocytów na działanie roztworów testowych między dwoma oddzielnymi pomiarami przez okres do godziny lub dłużej na ogół nie stanowi problemu (patrz ryc. 4A). Wreszcie, dwa sekwencyjne pomiary wykonane w tym samym oocycie pozwalają na sparowane obserwacje działania leku. Ma to przewagę nad niesparowanymi pomiarami z dwóch oddzielnych grup oocytów (traktowanych proteazą i traktowanych nośnikiem), ponieważ zmniejsza problem dużej zmienności między oocytami, zwykle obserwowanej w ekspresji kanałów jonowych. Dzięki sparowanym obserwacjom i możliwości normalizacji danych do pierwszego pomiaru, potrzeba mniej oocytów na grupę eksperymentalną, aby wykazać znaczące działanie środka farmakologicznego. Normalizacja danych ułatwia również podsumowanie danych z różnych partii oocytów o różnych poziomach ekspresji kanałów jonowych, a tym samym różnych prądach podstawowych (ryc. 2D). Oczywiście, eksperymenty kontrolne są niezbędne dla tego podejścia, aby wykazać, że aktywność kanału jonowego, która jest przedmiotem zainteresowania, pozostaje stabilna w oocytach kontrolnych traktowanych nośnikiem od pierwszego do drugiego pomiaru (patrz rysunek 2).
Aby wykazać, że aktywacja prądem proteolitycznym koreluje z pojawieniem się produktów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki, zastosowano podejście biotynylacyjne pierwotnie opisane przez Harrisa i wsp.9 może być użyte. Procedura ta (opisana szczegółowo w sekcji protokołu i pokazana na rysunku 4) została dostosowana w celu wykazania, że ekspozycja kanałów na proteazy i późniejsza aktywacja prądów za pośrednictwem ENaC jest równoległa do zależnego od czasu pojawiania się fragmentów rozszczepienia. Metoda biotynylacji pozwala również na analizę ogólnego wzrostu lub spadku białek błonowych na powierzchni komórki. W związku z tym metoda ta jest odpowiednia do badania wpływu proteaz i innych środków farmakologicznych na wprowadzenie kanału do błony plazmatycznej lub po pobraniu kanału. Co więcej, analiza western blot biotynylowanych białek błony plazmatycznej pozwala na wykrycie fragmentów białek (np. proteolitycznych fragmentów ENaC) lub zmian we wzorcu glikozylacji, które mogą być funkcjonalnie istotne.
Podsumowując, połączenie metod stosowanych do badania stymulującego wpływu proteaz na prądy całokomórkowe za pośrednictwem ENaC oraz do wykazania korelacji z występowaniem produktów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki może być przydatne w szerokim zakresie zastosowań. W szczególności metody te mogą być odpowiednie do odpowiedzi na podobne pytania dotyczące regulacji innych kanałów jonowych, transporterów lub receptorów transbłonowych (np. receptorów aktywowanych proteazą).

Proteazy to enzymy, które biorą udział w różnych reakcjach fizjologicznych, począwszy od dobrze znanej proteolitycznej degradacji białek, w kontekście trawienia, aż po wysoce wyrafinowane kaskady proteaz zaangażowane w złożone regulacyjne szlaki sygnałowe. Proteazy dzielą się na siedem grup w zależności od ich katalitycznego miejsca aktywnego: proteazy asparaginianu, asparaginy, cysteiny, kwasu glutaminowego, metalozyny, seryny i treoniny. Różne proteazy celują w różne miejsca rozszczepienia, które nie zawsze są łatwe do przewidzenia na podstawie pierwotnej struktury białka. Baza danych MEROPS (<a href="http://merops.sanger.ac.uk/">http://merops.sanger.ac.uk/</a>) zawiera szczegółowe informacje na temat szerokiej gamy proteaz i ich preferencyjnych miejsc cięcia. Funkcjonalnie istotne miejsca rozszczepienia można zidentyfikować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.
Jest dobrze znane, że proteolityczne przetwarzanie ENaC jest ważnym mechanizmem aktywacji tego konkretnego kanału jonowego1,2. Co ciekawe, istnieją dowody na to, że funkcja powiązanego kanału jonowego 1a (ASIC1a) może być również modyfikowana przez proteazy3-5. Obecnie otwartym pozostaje pytanie, czy rozszczepienie kanałów proteolitycznych odgrywa istotną rolę fizjologiczną w regulacji aktywności innych kanałów jonowych lub transporterów. Wiadomo jednak, że rozszczepienie proteolityczne aktywuje grupę receptorów sprzężonych z białkiem G, receptorów aktywowanych proteazą (PAR)6. Wykazano, że kilka proteaz serynowych (np. proteazy aktywujące kanały (CAP1-3), chymotrypsyna, trypsyna, furyna, plazmina, elastaza neutrofilowa i kalikreina) proteolitycznie aktywują ENaC2. Oprócz proteaz serynowych inne grupy proteaz mogą być zaangażowane w proteolityczną aktywację ENaC. Rzeczywiście, ostatnie dane pokazują, że metaloproteinaza meprin-β7 i katepsyna proteazy cysteinowejS 8 mogą również aktywować ENaC. Jednak (pato-)fizjologicznie istotne proteazy dla aktywacji ENaC pozostają do ustalenia i mogą się różnić w zależności od tkanki.
Wiadomo, że proteazy preferencyjnie rozszczepiają się w określonych miejscach w sekwencji aminokwasów. Na przykład chymotrypsyna proteazy serynowej wykazuje specyficzny wzór rozszczepienia, rozszczepiając się po resztach aminokwasów aromatycznych fenyloalaniny i tyrozyny. W przeciwieństwie do tego, proteaza serynowa trypsyna preferencyjnie rozszczepia się po podstawowych resztach lizynie lub argininie. Wykorzystując zmutowane ludzkie konstrukty γENaC wygenerowane przez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce, można zidentyfikować funkcjonalnie istotne miejsca cięcia w ENaC heterologicznie wyrażane w systemie ekspresji oocytów8-13.
Poprzez wstrzyknięcie cRNA do trzech podjednostek ENaC (αβγ) do izolowanych oocytów, ENaC może być funkcjonalnie wyrażany w tych komórkach, a aktywność kanałów obecnych na błonie plazmatycznej może być mierzona za pomocą techniki dwuelektrodowego zacisku napięcia. Dzięki zastosowaniu amilorydu moczopędnego, specyficznego inhibitora ENaC, wrażliwy na amiloryd składnik prądu całej komórki, w którym pośredniczy ENaC (ΔIami), można oddzielić od niespecyficznych prądów upływowych lub od prądów przewodzonych przez inne kanały jonowe. Zatem wartości ΔIami odzwierciedlają ogólną aktywność ENaC i można je określić, odejmując prądy całokomórkowe mierzone w obecności amilordu od odpowiadających prądów całokomórkowych zarejestrowanych przy braku amilorku. Aby sprawdzić, czy proteaza ma stymulujący wpływ na ENaC, ΔIami mierzy się dwukrotnie w tym samym oocycie, tj. przed i po inkubacji oocytu w roztworze zawierającym proteazę. WzrostΔI ami od pierwszego do drugiego pomiaru wskazuje na proteolityczną aktywację ENaC. Wiadomo, że chymotrypsyna lub trypsyna maksymalnie stymulują ENaC w systemie ekspresji oocytów2,14 i mogą być stosowane do potwierdzenia, że proteolityczna aktywacja ENaC jest wykrywalna w danej partii oocytów.
Równolegle do pomiarów prądu dla całej komórki, zastosowano metodę biotynylacji9 w celu zbadania, czy wzrostΔI ami wykryty po ekspozycji oocytów na proteazy koreluje z pojawieniem się fragmentów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki. Białka na powierzchni komórki są znakowane biotyną i mogą być oddzielone od białek wewnątrzkomórkowych poprzez wiązanie biotynylowanych białek z kulkami agarozy znakowanymi neutrawidyną. Biotynylowane białka mogą być analizowane za pomocą western blot. Fragmenty rozszczepienia γENaC na powierzchni komórki można wykryć za pomocą specyficznego przeciwciała skierowanego przeciwko epitopowi w C-końcu γENaC. Aby zidentyfikować funkcjonalnie istotne miejsce (miejsca) rozszczepienia, przewidywane miejsca rozszczepienia można zmutować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Kanały typu dzikiego i zmutowanego są porównywane w równoległych eksperymentach z wykorzystaniem oocytów z tej samej partii.
Dzięki temu metodologicznemu podejściu po raz pierwszy wykazano, że proteolityczna aktywacja prądów całokomórkowych za pośrednictwem ENaC koreluje z zależnym od czasu pojawieniem się fragmentów rozszczepienia ENaC na powierzchni komórki. Wyniki te sugerują związek przyczynowo-skutkowy między rozszczepieniem kanału a aktywacją kanału. Ponadto, stosując mutagenezę ukierunkowaną na miejsce przypuszczalnych miejsc rozszczepienia w połączeniu z techniką dwuelektrodowego zacisku napięciowego, zidentyfikowano funkcjonalnie istotne miejsca cięcia plazminy, chymotrypsyny13 i katepsyny-S8.

<table><tbody><tr><td>Wyposażenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zacisk kąpielowy headstage do OC-725C-V</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Źródło zimnego światła - Schott KL 1500 LCD</td><td>Schott</td><td>#SCOC150200EU</td><td>jasność 4; otwór mechaniczny: D; temperatura barwowa: 3 000 K</td></tr><tr><td>E Uchwyt elektrody serii (Str, Vent, Ag Wire, 1,2 mm)</td><td>ADinstruments</td><td>#ESW-F10v</td><td></td></tr><tr><td>Lewy mikromanipulator; MM-33L</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>#64-0055</td><td></td></tr><tr><td>LIH 1600 - interfejs komputerowy</td><td>HEKA System zaworów</td><td></td><td></td></tr><tr><td>magnetycznych (ALA BPS-8) w połączeniu z interfejsem TIB14 (HEKA)</td><td>ALA Scientific Instruments, wzmacniacz HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OC-725C do dwuelektrodowych napięć cęgowych</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 FLAMING/BROWN Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>ciepło = 550; prędkość = 22; czas = 200</td></tr><tr><td>Prawy mikromanipulator; MM-33R</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>#64-0056</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody serii (45&deg;, Odpowietrznik, Uchwyt, Drut Ag, 1.2 mm)</td><td>ADinstruments</td><td>#E45w-f10vh</td><td></td></tr><tr><td>Regulator przepływu grawitacyjnego STAT 2 IV</td><td>Conmed</td><td>#P-S2V-60</td><td></td></tr><tr><td>Generator podciśnienia SEG - do odsysania w celu usunięcia roztworu do kąpieli</td><td>Schmalz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>INFUJECT 60 ml strzykawki z pompką do roztworów</td><td>Braun</td><td>#22050</td> Injekt-F do lizy oocytów Braun#9166033V <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka borokrzemianowa o standardowych ściankach z włóknem</td><td>Sutter Instruments</td><td>#BF150-86-10</td><td>średnica zewnętrzna: 1,5 mm; średnica wewnętrzna: 0,86 mm; długość: 10 cm</td></tr><tr><td>Kompletne, Mini, wolne od EDTA tabletki koktajlowe z inhibitorem proteazy</td><td>Roche Applied Science</td><td>#11836170001</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>#21217</td><td></td></tr><tr><td>Wtórne przeciwciało przeciw królikowi znakowane peroksydazą chrzanową Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>#sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>NeutrAvidin Agaroza</td><td>Thermo Scientific</td><td>#29200</td><td>Koraliki agarozowe znakowane neutrawidyną</td></tr><tr><td>NP40 (Nonidet P-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#I8896</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1 (próbka 2x SDS-PAGE bufor)</td><td>Carl Roth</td><td>#K929.2</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Chemiluminescencyjne podłoże do detekcji sygnałów chemiluminescencyjnych</td><td>Thermo Scientific</td><td>#34095</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td></td></tr></tbody></table>

demonstracja proteolitycznej aktywacji nabłonkowego kanału sodowego (enac) poprzez połączenie pomiarów prądu z detekcją fragmentów rozszczepienia

Demonstration of Proteolytic Activation of the Epithelial Sodium Channel (ENaC) by Combining Current Measurements with Detection of Cleavage Fragments

Opisane metody mogą być użyte do zbadania wpływu proteaz na kanały jonowe, receptory i inne białka błony plazmatycznej heterologicznie wyrażane w oocytach Xenopus laevis. W połączeniu z mutagenezą ukierunkowaną na miejsce, podejście to zapewnia potężne narzędzie do identyfikacji funkcjonalnie istotnych miejsc rozszczepienia. Aktywacja proteolityczna jest charakterystyczną cechą wrażliwego na amilorydy nabłonkowego kanału sodowego (ENaC). Ostatnim etapem aktywacji jest rozszczepienie podjednostki γ kanału w krytycznym regionie potencjalnie celem kilku proteaz, w tym chymotrypsyny i plazminy. Aby określić stymulujący wpływ tych proteaz serynowych na ENaC, wrażliwy na amiloryd prąd całej komórki (ΔIami) mierzono dwukrotnie w tym samym oocycie przed i po ekspozycji na proteazę przy użyciu techniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego. Równolegle z eksperymentami elektrofizjologicznymi zastosowano podejście biotynylacyjne w celu monitorowania pojawiania się fragmentów rozszczepienia γENaC na powierzchni komórki. Za pomocą opisanych metod wykazano, że przebieg w czasie proteolitycznej aktywacji prądów całych komórek za pośrednictwem ENaC koreluje z pojawieniem się produktu rozszczepienia γENaC na powierzchni komórki. Wyniki te sugerują związek przyczynowo-skutkowy między rozszczepieniem kanału a aktywacją kanału. Co więcej, potwierdzają koncepcję, że zdarzenie rozszczepienia w γENaC jest wymagane jako ostatni etap aktywacji kanału proteolitycznego. Opisane tutaj metody mogą mieć zastosowanie do odpowiedzi na podobne pytania dotyczące innych typów kanałów jonowych lub białek błonowych.

Aby zbadać, czy serynowa proteaza plazmina może aktywować prądy pośredniczone przez ENaC, wyznaczono ΔIami poszczególnych oocytów wykazujących ekspresję ENaC przed i po 30 min inkubacji oocytów w roztworze wolnym od proteaz (kontrola) (Rycina 2A) lub w roztworze zawierającym plazminę (Rycina 2B), stosując technikę dwuelektrodowego zacisku napięciowego (voltage-clamp) (patrz Rycina 1). Ekspozycja na plazminę zwiększyła ΔIami w każdym zmierzonym oocycie. W przeciwieństwie do tego, w eksperymentach kontrolnych 30 min inkubacji oocytów wykazujących ekspresję ENaC w roztworze wolnym od proteaz miała pomijalny wpływ (Rycina 2 C,D). Zatem, stosując tę metodę, można wykryć stymulację prądu pośredniczonego przez ENaC przez plazminę.
Aby zbadać wpływ mutacji domniemanych miejsc cięcia na aktywację prądów zależnych od ENaC, a także na cięcie kanału, porównano efekt działania chymotrypsyny na WT-ENaC z efektem na zmutowany ENaC z zmutowanymi miejscami cięcia dla prostazyny i plazminy (γRKRK178AAAA;K189A). Przebieg czasowy aktywacji kanału przez chymotrypsynę, a także pojawienie się produktów cięcia ENaC na powierzchni komórki, zbadano przy użyciu różnych czasów inkubacji z proteazą (Ryc. 4A). Wykazano, że zmutowany kanał opóźnia i redukuje aktywację prądu zależnego od ENaC przez chymotrypsynę. Towarzyszy temu opóźnione pojawienie się fragmentu cięcia γENaC o niższej masie cząsteczkowej 67 kDa, odpowiadającego całkowicie rozszczepionej podjednostce. Fragmenty cięcia wykryto za pomocą przeciwciała przeciwko γENaC skierowanego przeciwko epitopowi w C-końcu (Ryc. 3). To podejście metodologiczne dowodzi, że przebieg czasowy proteolitycznej aktywacji prądów zależnych od ENaC koreluje z pojawieniem się produktu cięcia γENaC o masie 67 kDa na powierzchni komórki (Ryc. 4 B,C). Wspiera to koncepcję związku przyczynowo-skutkowego między proteolitycznym cięciem kanału a jego aktywacją13. Ponadto, łącząc pomiary prądu z detekcją fragmentów γENaC na powierzchni komórki, wykazano, że zmutowane miejsca cięcia są istotne funkcjonalnie dla proteolitycznej aktywacji kanału.
<img alt="Schemat procesu pomiaru ΔI_ami w oocytach ENaC; metoda proteolitycznej aktywacji kanału." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Procedura oznaczania efektu stymulującego proteazy na ENaC heterologicznie ekspresowany w oocytach Xenopus laevis. Aktywność ENaC szacuje się poprzez pomiar komponenty prądu całokomórkowego wrażliwej na amiloryd ΔIami.
<img alt="Eksperyment elektrofizjologiczny; wykresy zmian prądu (ΔI_ami) w warunkach kontrolnych/z plazminą." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Plazmina stymuluje prądy zależne od ENaC w oocytach wykazujących ekspresję ENaC. (A-D) Oocyty wykazujące ekspresję ludzkiego ENaC inkubowano przez 30 min w roztworze wolnym od proteaz (kontrola) lub w roztworze zawierającym plazminę (10 μg/ml). Aby wyznaczyć ΔIami przed (-) i po (+) inkubacji, oocyty utrzymywano przy potencjale trzymania -60 mV. (A,B) Cztery reprezentatywne zapisy prądów całokomórkowych z jednej partii oocytów. Amiloryd (ami) znajdował się w roztworze kąpieli w celu specyficznego zahamowania ENaC, co zaznaczono czarnymi paskami. (C) Punkty danych uzyskane z pojedynczego oocytu są połączone linią. (D) Podsumowanie podobnych eksperymentów, jak pokazano w C. Kolumny przedstawiają względny efekt stymulujący na ΔIami, obliczony jako stosunek ΔIami zmierzonego po 30 min inkubacji (ΔIami 30 min) do początkowego ΔIami (ΔIami initial) zmierzonego przed inkubacją. Liczby wewnątrz kolumn oznaczają liczbę zmierzonych pojedynczych oocytów. N oznacza liczbę różnych partii oocytów. (Rysunek zmodyfikowany na podstawie [Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:10.1085/jgp.201110763])
<img alt="Schemat γ-ENaC; miejsca cięcia proteolitycznego przez plazminę, chymotrypsynę, furynę; miejsce wiązania przeciwciała." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig3highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Model podjednostki γENaC przedstawiający miejsca cięcia dla aktywacji proteolitycznej oraz miejsce wiązania użytego przeciwciała. Cięcie proteolityczne przez konwertazę furynę związaną z aparatem Golgiego jest istotne dla dojrzewania ENaC w szlaku biosyntetycznym, zanim kanał dotrze do błony plazmatycznej. Po cięciu przez furynę na powierzchni komórki można wykryć fragment o masie 76 kDa, stosując metodę biotinylacji i przeciwciało przeciwko epitopowi w C-końcu podjednostki γ. Kluczowy ostatni etap proteolitycznej aktywacji ENaC zachodzi prawdopodobnie w błonie plazmatycznej, gdzie γENaC jest cięty przez proteazy zewnątrzkomórkowe (np. plazminę lub chymotrypsynę) w regionie dystalnym względem miejsca cięcia furyny, co skutkuje powstaniem fragmentu o masie 67 kDa. (Rycina została zmodyfikowana na podstawie [Haerteis et al. 2012 J Gen Physiol 140, 375-389, doi:10.1085/jgp.201110763])
<img alt="Analiza trawienia białka chymotrypsyną; wykresy i western blot pokazujące wyniki 76 kDa, 67 kDa." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Mutacja zarówno miejsca cięcia plazminy (K189), jak i prostazyny (RKRK178) opóźnia aktywację prądów pośredniczonych przez ENaC oraz pojawienie się produktu cięcia o masie 67 kDa podjednostki γ kanału. Oocyty wykazujące ekspresję kanału WT (otwarte symbole) oraz mutanta γRKRK178AAAA;K189AENaC (zamknięte symbole) inkubowano przez 30 min w roztworze wolnym od proteaz (kontrola) lub przez 5, 30 bądź 60 min w roztworze zawierającym chymotrypsynę (2 μg/ml). (A) Aby określić ΔIami przed i po inkubacji, oocyty utrwalono przy potencjale trzymania -60 mV. Okręgi reprezentują stosunek ΔIami zmierzonego po 5, 30 lub 60 min inkubacji (ΔIami min) do początkowego ΔIami (ΔIami initial) zmierzonego przed inkubacją. Każdy punkt danych reprezentuje średnią wartość ΔIami zmierzoną w 22-24 pojedynczych oocytach z czterech różnych serii. (B-D) Równolegle do wykrywania ΔIami, ekspresję biotynylowanej γENaC na powierzchni komórki analizowano za pomocą SDS-PAGE. γENaC wykryto za pomocą przeciwciała przeciwko epitopowi w C-końcu ludzkiej γENaC. Przedstawiono reprezentatywne wyniki western blot z jednej serii oocytów. (C-E) Analiza densytometryczna trzech wyników western blot podobnych do tych pokazanych w B lub D. Dla każdej ścieżki określono sygnały wykryte w obszarach 76 kD (otwarte kolumny) i 67 kD (szare kolumny), a następnie znormalizowano je do sumy całkowitego wykrytego sygnału. N oznacza liczbę różnych serii oocytów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51582/51582fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>

Proteolityczną aktywację nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) heterologicznie wyrażanego w oocytach Xenopus laevis można wykazać łącząc obecne pomiary z podejściem biotynylacyjnym w celu zbadania wyglądu produktów rozpadu kanałów jonowych na powierzchni komórki. Funkcjonalnie ważne miejsca rozszczepienia można zidentyfikować za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.

Demonstracja proteolitycznej aktywacji nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) poprzez połączenie pomiarów prądu z detekcją fragmentów rozszczepienia

The described methods can be used to investigate the effect of proteases on ion channels, receptors, and other plasma membrane proteins heterologously ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie wpływu proteaz na heterologicznie wyrażony w oocytach żaby Xenopus laevis epiteliatny kanał sodowy (ENaC). Osiąga się to poprzez pomiar prądu całokomórkowego w oocycie, wrażliwego na amiloryd. Po regeneracji oocytu zostaje on poddany działaniu proteazy, a następnie ponownie mierzony jest prąd.Następnie równolegle oocyty poddawane są biotynylacji i western blottingowi w celu monitorowania pojawienia się fragmentów cięcia gamma ENaC na powierzchni komórki; wyniki uzyskane dzięki połączeniu techniki twu-elektrodowej clampy napięciowej oraz metody z użyciem biotyny wykazują związek przyczynowy między cięciem kanału a jego aktywacją. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak pomiary nieplanowane, jest możliwość wystawienia oocytu na działanie proteazy lub innych czynników farmakologicznych pomiędzy dwoma pomiarami przez różny czas w małej objętości roztworu testowego. Dwa dni po izolacji oocytów Xenopus laevis i wstrzyknięciu cRNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć roztworu ND 96 do napełnienia jednej strzykawki grawitacyjnego systemu perfuzji oraz roztworu ND 96 zawierającego amid do napełnienia drugiej strzykawki.Po zamontowaniu strzykawek 50 cm nad komorą kąpielową, należy włączyć 150 W halogenowe źródło zimnego światła i ustawić je 10 cm nad komorą kąpielową dla oocytów, aby zapewnić dobrą wizualizację pod mikroskopem binokularnym. Następnie należy włączyć odsysanie i umieścić rurkę ssącą naprzeciwko adaptera rurki do superfuzji w komorze kąpielowej oocytów. W kolejnym kroku, korzystając z urządzenia IV do kontroli przepływu grawitacyjnego, należy ustawić prędkość superfuzji każdego roztworu na 3 do 5 ml/min. Następnie, za pomocą adaptera, należy połączyć rurki do superfuzji z komorą kąpielową oocytów, używając szklanych kapilar wyciąganych mikropipetą, aby uzyskać średnicę końcówki mniejszą niż 1 µm.Następnie należy wypełnić je w około jednej czwartej objętości trzymolowym roztworem chlorku potasu. Wprowadź kapilary do uchwytów elektrod prądowej i napięciowej, a następnie za pomocą mikromanipulatorów umieść je w ND 96 zawierającym dwumikromolowy roztwór amidu. Aby zmierzyć wrażliwe na amid prądy całokomórkowe, należy zacząć od ustawienia przycisku VM offset w celu zerowania potencjału elektrody napięciowej oraz przycisku VE offset w celu zerowania elektrody prądowej.Umieść miejsce UO w komorze kąpielowej w bliskim sąsiedztwie elektrody pomiarowej napięcia. Następnie, używając obu mikroelektrod, delikatnie przebij miejsce UO, ustaw potencjał utrzymujący wzmacniacza na -60 mV i włącz rejestrator. Następnie włącz dopływ roztworu zawierającego amid.Następnie rozpocznij rejestrację i w razie potrzeby dostosuj wzmocnienie. Po osiągnięciu stabilnego plateau mierzonego prądu, przełącz na roztwór wolny od amidu. Po osiągnięciu plateau prądowego przywróć perfuzję roztworem zawierającym amid. Gdy prąd w miejscu UO osiągnie początkowy prąd bazowy, wyłącz zacisk napięciowy (voltage clamp) i ostrożnie wycofaj elektrody, aby umożliwić ponowne zamknięcie błony plazmatycznej w miejscach wkłucia.Umieść miejsce Uoc w jednym dołku płytki 96-dołkowej zawierającej od 100 do 150 µl roztworu ND 96 wolnego od proteaz na pięć minut, przed przeniesieniem miejsca UOC do roztworu zawierającego proteazę lub do roztworu kontrolnego bez proteazy. Przez 30 minut po inkubacji powtórz bieżący pomiar, odrzuć uszkodzone oocyty pod mikroskopem stereoskopowym i przygotuj anti 96 z odpowiednią proteazą oraz bez niej. Przygotuj pipety pastoralne, etykietując je i krótko opalając ich końcówki płomieniem, aby uniknąć uszkodzenia oocytów.Napełnij każde wgłębienie płytki sześciodołkowej 2,5 ml medium ND 96 w temperaturze pokojowej lub medium ND 96 zawierającego proteazę. Następnie dodaj po 30 oocytów do każdego wgłębienia i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po napełnieniu wgłębień nowej płytki sześciodołkowej 2,5 ml medium ND 96, przenieś każdą grupę oocytów do wgłębienia wypełnionego medium ND 96.Przenoś oocyty sekwencyjnie do dwóch kolejnych dołków z ND 96, aby wypłukać pozostałą proteazę, a następnie inkubuj je w ostatnim dołku przez pięć minut; przygotuj biotynę w buforze do elucji biotyny zgodnie z protokołem tekstowym. Po umieszczeniu każdej grupy oocytów w dołku zawierającym 2,5 milliliters buforu do elucji biotyny, inkubuj przez 15 minut przy delikatnym mieszaniu. Następnie, po umieszczeniu każdej grupy oocytów w dołku zawierającym 2,5 milliliters buforu gaszącego w celu zatrzymania reakcji biotyny, przenieś je do drugiego dołka z buforem gaszącym i inkubuj przez pięć minut.Przy delikatnym mieszaniu przenieść każdą grupę oocytów do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i przy użyciu 1 ml buforu lizującego, uzupełnionego o inhibitory proteaz, przeprowadzić lizę komórek, przeciskając je przez igłę o rozmiarze 27 G. Odwirować lizaty przez 10 minut przy 1500 ×g. Przenieść nadsącz do nowej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej TRITTON X 100 oraz MP 40 i inkubować probówki na lodzie przez 20 minut. Po wielokrotnym wstrząsaniu probówek w celu rozpuszczenia białek oraz po zrównoważeniu 100 µl kulek vagaro na grupę oocytów, dodać je do roztworów białek z detergentem i inkubować próbki w rotacji nadgłowicowej w temperaturze 4 °C przez noc.Następnego dnia odwiruj próbki przez trzy minuty przy 1500 ×g. Następnie przenieś nadsącz do nowej probówki, aby wykryć fragmenty cięcia act na powierzchni komórek. Przygotuj próbki do elektroforezy w żelu, przemywając kuleczki trzy razy buforem lizującym przed dodaniem dwukrotnego buforu do próbek SDS-PAGE. Po odwirowaniu próbek przez trzy minuty przy 20 000 ×g, przelej nadsącz do nowych probówek do wirówki mikrocentryfużowej.Próbki należy poddać analizie metodą western blot zgodnie z protokołem tekstowym, aby zbadać, czy serynowa proteaza plazmina potrafi aktywować prądy pośredniczone przez ENaC. Wartość delta IE poszczególnych cytes wykazujących ekspresję ENaC określono przed i po 30-minutowej inkubacji cytes w roztworze wolnym od proteaz lub zawierającym plazminę. Z zastosowaniem techniki dwuelektrodowego zacisku napięciowego (two electrode voltage clamp), przedstawionej w tym materiale, wykazano, że ekspozycja na plazminę zwiększyła delta IE w każdym zmierzonym cyte.Z kolei inkubacja w roztworze wolnym od proteaz miała pomijalny wpływ. Rysunek ten porównuje wpływ chymotrypsyny na ENaC typu dzikiego oraz na ENaC z zmutowanymi miejscami cięcia prostazyny i plazminy. Jak widać, zmutowany kanał opóźnia i ogranicza aktywację prądu pośredniczonego przez ENaC wywołaną przez chymotrypsynę.Ponadto generuje ono fragment cięcia z mniejszą częstotliwością w porównaniu do ENaC typu dzikiego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak kombinacja opisanych metod może zostać wykorzystana do skorelowania stymulującego wpływu proteaz na występowanie wewnętrzne z pojawieniem się produktów cięcia na powierzchni komórki. Może to być przydatne w szerokim zakresie zastosowań, na przykład w celu udzielenia odpowiedzi na podobne pytania dotyczące regulacji innych kanałów jonowych, transporterów lub receptorów transbłonowych.

demonstration-proteolytic-activation-epithelial-sodium-channel-enac

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Demonstracja proteolitycznej aktywacji kanału sodowego nabłonkowego (ENaC) poprzez łączenie pomiarów prądowych z wykrywaniem fragmentów rozszczepienia

Przedstawimy sposób badania wpływu pojedynczej mutacji punktowej na funkcję kanału jonowego.

Mutageneza i analiza funkcjonalna kanałów jonowych heterologicznie eksprymowanych w komórkach ssaków

Metoda "cut-open Vaseline gap" służy do uzyskiwania niskoszumowych zapisów prądów jonowych i bramkujących z zależnych od napięcia kanałów jonowych wyrażonych w oocytach Xenopus z wysoką rozdzielczością kinetyki szybkich kanałów. Przy niewielkich modyfikacjach fluorometria cęgów napięciowych może być sprzężona z protokołem rozcięcia oocytów.

Technika zacisku napięciowego z otwartą szczeliną wazelinową Xenopus z fluorometrią

Tutaj opisano procedurę uzyskiwania długich odcinków zapisu prądu z jednego kanału jonowego za pomocą techniki patch-clamp dołączonej do komórki. Metoda ta pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym wzorca konformacji kanałów otwórz-zamknij, które leżą u podstaw sygnału biologicznego. Dane te informują o właściwościach kanałów w niezakłóconych błonach biologicznych.

Jednokanałowe nagrywanie z zaciskiem krosowym dołączonym do komórki

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Bakteryjne kanały mechanowrażliwe mogą być używane jako przetworniki mechanoelektryczne w urządzeniach biomolekularnych.  Dwuwarstwy interfejsu kropelkowego (DIB), inspirowane komórkami elementami budulcowymi takich urządzeń, stanowią nowe platformy do włączania i stymulowania kanałów mechanowrażliwych.  W tym miejscu demonstrujemy nową metodę tworzenia DIB opartą na mikropipetach, umożliwiającą badanie kanałów mechanoczułych pod wpływem stymulacji mechanicznej.

Wielofunkcyjna, oparta na mikropipetach metoda wprowadzania i stymulacji mechanowrażliwych kanałów jonowych bakterii w dwuwarstwach interfejsu kropelkowego

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Przedstawiono połączone użycie technologii matryc mikroelektrod i stymulacji chemicznej indukowanej 4-aminopirydyną do badania aktywności nocyceptywnej na poziomie sieci w rogu grzbietowym rdzenia kręgowego.

Rejestrowanie aktywności sieci w obwodach nocyceptywnych rdzenia kręgowego za pomocą układów mikroelektrod

Ten protokół opisuje metodę badania elektrogenicznych białek błonowych poprzez pomiar zmian potencjału błonowego. Test ten stanowi platformę do funkcjonalnego odczytu wielu kanałów jonowych ulegających endogenicznej ekspresji w liniach komórkowych nabłonka.

Oparty na fluorescencji test potencjału błonowego do wysokoprzepustowego badania funkcjonalnego dwóch endogennych kanałów jonowych w dwóch nabłonkowych liniach komórkowych

Przedstawione tutaj są metody dostarczające szczegółowych instrukcji do preparowania, dysocjacji, hodowli i rejestracji patch-clamp z neuronów zwojów przedsionkowych i spiralnych ucha wewnętrznego.

Izolowanie i hodowla somaty przedsionkowej i spiralnej zwoju zwojowego od noworodków gryzoni w celu nagrań typu patch-clamp

Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Poznaj metodę badania proteolitycznej aktywacji kanału ENaC w oocytach Xenopus laevis poprzez pomiary prądu i detekcję fragmentów rozszczepienia. Technika ta pozwala na precyzyjną kontrolę czasu ekspozycji na proteazy.

Demonstracja proteolitycznej aktywacji nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) poprzez połączenie pomiarów prądu z detekcją fragmentów rozszczepienia (Wideo) | JoVE Journal

Demonstracja proteolitycznej aktywacji nabłonkowego kanału sodowego (ENaC) poprzez połączenie pomiarów prądu z detekcją fragmentów rozszczepienia

Przeglądaj więcej filmów