Name: Klasyfikacja i zamrażanie tkanek w modelach chorób mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Naucz się zamrażania tkanki mięśni szkieletowych w izopentanie dla zachowania morfologii mikroskopowej. Protokół obejmuje montaż, ochronę przed wilgocią i ocenę histologiczną jakości preparatu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta publikacja jest finansowana przez Cure CMD, grant Association Contre Les Myopathies (AFM) (projekt 16297) oraz National Institutes of Health (granty o numerach K08 AR059750 i L40 AR057721). Chcielibyśmy również podziękować dr Julie Tetzlaff za jej pomoc w poprawieniu tego manuskryptu.

Oznacz pojemniki, które mają być używane do przechowywania mięśni, odpowiednimi identyfikatorami dla zwierzęcia i pobranego mięśnia. Wstępnie schłodzić torby/pojemniki i narzędzia, aby zapobiec zamarzaniu/rozmrożeniu tkanki po jej dodaniu.
1. Rozważania dotyczące projektu badania dotyczącego pobierania tkanki mięśniowej
<ol>
	<li>W przypadku małych zwierzęcych (mysich) modeli choroby mięśni należy użyć całego mięśnia do badania, ponieważ małe modele zwierzęce często wymagają oceny całego mięśnia, aby zapewnić wystarczającą ilość próbek włókien mięśniowych do badań patologicznych. W przypadku dużych zwierzęcych (psich) modeli chorób mięśni należy używać części mięśni o wymiarach co najmniej 0,3 x 0,3 cm lub większych w aspekcie poprzecznym (przekroju poprzecznym). 
	UWAGA: Biopsje gruboigłowe mogą być również stosowane, ale mogą być nieoptymalne dla pierwotnych badań charakterystyki ze względu na problemy z pobieraniem próbek.</li>
	<li>W przypadku badań z udziałem sarkomeru ultrastrukturalny pomiar długości sarkomeru może stanowić krytyczny punkt końcowy i może wymagać specjalistycznego traktowania. Jest to zwykle istotne tylko w chorobach, w których elementy sarkomeru wykazują nieodpowiednią długość, jak w przypadku niektórych przyczyn miopatii nemaliny. Niektóre laboratoria wolą utrwalać mięśnie w stanie nieskurczonym lub rozciągniętym, zamiast wykonywać te pomiary na mięśniach nienapiętych lub nierozciągniętych.
	<ol>
		<li>Jeśli długość sarkomeru nie zostanie zmierzona, utrwal tkankę mięśniową bez wstępnego rozciągania mięśnia, umieszczając go bezpośrednio w pożądanym utrwalaczu EM (patrz Odczynniki).</li>
		<li>Jeśli mierzone będą długości sarkomerów, można zastosować kilka technik wstępnego rozciągania mięśnia (patrz Dyskusja):
		<ol>
			<li>Użyj urządzenia zaciskowego, aby utrzymać mięsień w jego napięciu spoczynkowym, gdy jest jeszcze w zwierzęciu, wyciąć mięsień wokół zewnętrznej strony zacisku i umieścić go bezpośrednio w żądanym utrwalaczu EM (patrz Odczynniki).</li>
			<li>Rozciągnij i przypnij mięsień do powierzchni (takiej jak kawałek korka) na długość podobną do obserwowanej in vivo po jego ekstrakcji od zwierzęcia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Podziel izolowany mięsień szkieletowy na fragmenty, które są odpowiednie dla pożądanych badań (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Dla histologii zamrożonych mięśni:
	<ol>
		<li>Uwzględnij jak najwięcej danego mięśnia, aby zminimalizować błąd systematyczny próbkowania (patrz krok 1.1), ale próbki powinny mieć <1,5 cm, aby uniknąć zamarzania artefaktów.</li>
		<li>Traktuj wszystkie mięśnie z tego samego badania podobnie, aby zapobiec artefaktowym różnicom w wielkości włókien wynikającym z różnic w obchodzeniu się.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do mikroskopii elektronowej (EM):
	<ol>
		<li>Wytnij z próbki pasek mięśni o wymiarach ~0,5 x 0,2 x 0,2 cm, tak aby oś podłużna próbki była równoległa do osi podłużnej oryginalnego mięśnia. 
		UWAGA: Utrwalacz nie będzie odpowiednio penetrował grubszych kawałków tkanki, dlatego utrzymanie grubości próbki na poziomie 2 mm lub mniejszym ma kluczowe znaczenie dla uzyskania odpowiednich wyników. Dodatkowo, ponieważ orientacja tak małych fragmentów mięśni jest często trudna, zaleca się użycie fragmentu tkanki, który naśladuje rzeczywistą orientację mięśnia (tj. najdłuższym aspektem utrwalonej próbki jest podłużna orientacja mięśni/włókien mięśniowych), aby zminimalizować obsługę i zamieszanie podczas przetwarzania EM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do hodowli komórkowej:
	<ol>
		<li>Pożądana wydajność komórek może wpływać na ilość mięśni potrzebnych do założenia hodowli komórkowej. Pojedyncze mięśnie (lub części mięśni) małych zwierząt mogą zapewniać niewystarczającą liczbę komórek do założenia kultur komórkowych, więc jeśli to konieczne, tkankę pulową z wielu mięśni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Utrwalanie i przetwarzanie tkanek w mikroskopii elektronowej (EM)
<ol>
	<li>Umieść fragment mięśnia nie większy niż 2 mm w jego najcieńszym wymiarze bezpośrednio w żądanym utrwalaczu EM (patrz Odczynniki).</li>
	<li>Umieść mięsień w buforze utrwalającym EM (patrz Odczynniki) po 2-48 godzinach od utrwalenia. Długotrwała fiksacja (przez tygodnie lub miesiące) może spowodować utratę szczegółów ultrastrukturalnych w badaniach EM.</li>
	<li>Wyślij do głównego obiektu EM w celu przetworzenia.</li>
</ol>
4. Zamrażanie mięśni w badaniach histologicznych, biochemicznych i molekularnych
<ol>
	<li>Usuń nadmiar wilgoci z próbki, dokładnie osuszając próbkę ręcznikiem papierowym, aż chusteczka lekko przylega do ręcznika. Nadmierna wilgoć spowoduje znaczne artefakty zamarzania w mięśniach. 
	UWAGA: Tkankę można dodatkowo wysuszyć, zwijając ją w puder dla niemowląt. Ten krok na ogół nie jest konieczny dla mięśni, chyba że przebywały one w nadmiernie wilgotnym środowisku.</li>
	<li>Umieść OCT (lub podobny klej, taki jak guma tragakantowa) na dnie płytkiego kriofordu lub na korku, mając tylko tyle OCT, aby zapewnić podstawę dla zorientowanego mięśnia (ryc. 2C). Etykietowanie korka lub foliry cryomold przed zamrożeniem może być przydatne do śledzenia próbki.</li>
	<li>Ostrożnie umieść mięsień w formie w pożądanej orientacji, tak aby większość mięśnia wystawała z OCT, tak aby podzielony mięsień nie stykał się z OCT (ryc. 2C).</li>
	<li>Dodaj izopentan do metalowego kubka, aż osiągnie głębokość około 3-4 cm.</li>
	<li>Załóż termiczne rękawice ochronne i zdejmij pokrywę Dewara.</li>
	<li>Umieść lub przytrzymaj metalowy kubek w kontakcie z ciekłym azotem, tak aby poziom ciekłego azotu na zewnątrz kubka był wyższy niż poziom izopentanu po wewnętrznej stronie kubka. Strategie rozmieszczania tych pojemników pokazano na rysunku 2.
	<ol>
		<li>Nie pozwól, aby ciekły azot dostał się do metalowego kubka, ponieważ wytwarza on bulgoczącą pianę, która może być uciążliwa w pracy (a także jest niewystarczająco zimna do zamrożenia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj izopentan, aby określić, kiedy osiągnął odpowiednią temperaturę. W odpowiedniej temperaturze (optymalnie między -140 a -149 °C) na dnie kubka utworzą się stałe białe kamyki zamrożonego izopentanu (po kilku minutach i po zniknięciu początkowej mgły nad izopentanem) lub roztwór na ogół zgęstnieje do konsystencji melasy. Zamrożenie przed tym etapem przyniesie efekty zamrażania.
	<ol>
		<li>Jeśli izopentan całkowicie zamarznie w stanie stałym, rozmrozić go i ponownie schłodzić do temperatury zamarzania przed kolejnym użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą wstępnie schłodzonych kleszczy opuść próbkę i korek/pleśń do izopentanu na około 10-20 sekund.</li>
	<li>Umieść zamrożoną próbkę we wstępnie schłodzonym pojemniku.</li>
	<li>Próbkę i pojemnik należy przechowywać na suchym lodzie przez cały czas, aż do przeniesienia do zamrażarki o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Jeśli artefakt zamrażania jest obecny w już zamrożonej tkance, możliwe jest poprawienie stopnia zamrożenia artefaktu za pomocą następującej procedury "rozmrażanie i ponowne zamrażanie"
<ol>
	<li>Wyjmij bloki z zamrażarki, pojedynczo i trzymaj je na suchym lodzie. Czas wdrożenia tego protokołu ma kluczowe znaczenie. Rozmrażaj i zamrażaj ponownie tylko jeden blok na raz.</li>
	<li>Przenieść próbkę z suchego lodu do RT.</li>
	<li>Jeśli próbka została osadzona w OCT, należy usunąć otaczające OCT tak całkowicie, jak to możliwe, za pomocą skalpela.</li>
	<li>Pozostawić próbkę do rozmrożenia w temperaturze pokojowej do punktu, w którym jest całkowicie rozmrożona, ale nie do momentu, w którym wysycha.
	<ol>
		<li>Delikatnie szturchnij próbkę kleszczami, aby upewnić się, że próbka jest całkowicie rozmrożona przed przejściem do następnego kroku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrozić mięsień zgodnie z krokami 4.1-4.10.</li>
</ol>
6. Przygotowanie mięśni do testów funkcjonalnych z pojedynczego włókna ze skórą
<ol>
	<li>Procedura przechowywania mięśnia zależy od tego, kiedy mięsień/włókno jest używane do eksperymentów.
	<ol>
		<li>Do użycia w ciągu kilku tygodni umieścić mięsień w roztworze 50% glicerolu/50% roztworu relaksującego (patrz Odczynniki) i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Do użycia po kilku tygodniach umieścić mięsień w roztworze 75% glicerolu/25% roztworu rozluźniającego (patrz Odczynniki) i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Alternatywnie, pozostaw mięśnie do wyschnięcia, przypnij do korka i przechowuj na granulkach krzemionki w temperaturze -80 °C. Te odwodnione mięśnie mogą być używane przez lata.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Przygotowanie świeżych mięśni do wysyłki hodowli komórkowych do zewnętrznych laboratoriów
Protokoły zakładania kultur komórkowych zostały dobrze opisane gdzie indziej4-7.
<ol>
	<li>Napełnij 50 ml sterylnej stożkowej probówki sterylną kompletną pożywką wzrostową.</li>
	<li>Dodaj tkankę mięśniową do rurki za pomocą sterylnych kleszczy, całkowicie zanurzając tkankę w pożywce.
	<ol>
		<li>Napełnij pozostałą część tuby mediami, aby zapobiec wysuszeniu podczas transportu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj okłady z lodu do styropianowego pudełka i umieść stożkową rurkę w pobliżu kilku okładów z lodu.
	<ol>
		<li>Należy pamiętać, że należy używać wyłącznie okładów z lodu (a nie suchego lodu), aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym zamarznięciem płynu i tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysyłaj paczki O/N, ale chusteczki mogą wytrzymać 2 dni w tych warunkach.</li>
</ol>

<ol><li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDubowitz%2C+V+%22Muscle+Biopsy%3A+A+Practical+Approach%22">Muscle Biopsy: A Practical Approach</a>. 15, Elsevier. 407-442 (2007).</li>
<li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+replacement+therapy+rescues+weakness+and+improves+muscle+pathology+in+mice+with+X-linked+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy.</a> Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).</li>
<li>Talmadge, R. J., Roy, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+separation+of+rat+skeletal+muscle+myosin+heavy-chain+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms.</a> J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).</li>
<li>Blau, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+properties+of+pure+populations+of+human+dystrophic+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells.</a> Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).</li>
<li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotubularin-deficient+myoblasts+display+increased+apoptosis%2C+delayed+proliferation%2C+and+poor+cell+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment.</a> Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).</li>
<li>Pavlath, G. K., Gussoni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+myoblasts+and+muscle-derived+SP+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Human myoblasts and muscle-derived SP cells.</a> Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).</li>
<li>Webster, C., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+age-related+decline+in+replicative+life-span+of+Duchenne+muscular+dystrophy+myoblasts%3A+implications+for+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Somat+Cell+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy.</a> Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).</li>
<li>Ottenheijm, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+filament+length+dysregulation+contributes+to+muscle+weakness+in+nemaline+myopathy+patients+with+nebulin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency.</a> Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).</li>
<li>Witt, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulin+regulates+thin+filament+length%2C+contractility%2C+and+Z-disk+structure+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo.</a> EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).</li>
<li>Garton, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+an+automated+computational+method+for+skeletal+muscle+fibre+morphometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis.</a> Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).</li>
<li>Kim, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+segmentation+and+morphometrical+analysis+of+muscle+fiber+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images.</a> Cytometry A. 71, 8-15 (2007).</li>
<li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+activin+receptor+type+IIb+increases+strength+and+lifespan+in+myotubularin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice.</a> Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).</li>
<li>Mula, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+of+skeletal+muscle+fiber+cross-sectional+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area.</a> J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).</li>
<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDubowitz%2C+V+%22Muscle+Biopsy%3A+A+Practical+Approach%22">Muscle Biopsy: A Practical Approach</a>. , Elsevier. 407-442 (2007).</li>
<li>Nance, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+myopathies%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurol+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Congenital myopathies: an update.</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).</li>
<li>Clarke, N. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+TPM3+are+a+common+cause+of+congenital+fiber+type+disproportion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion.</a> Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).</li>
<li>Lawlor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+tropomyosin+3+%28TPM3%29+are+common+and+associated+with+type+1+myofiber+hypotrophy+in+congenital+fiber+type+disproportion%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion.</a> Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mięśnie szkieletowe są tkanką unikalną strukturalnie i funkcjonalnie, dlatego niezbędne są specjalistyczne procedury przygotowawcze, które pozwolą na optymalną ocenę parametrów strukturalnych i funkcjonalnych. Podczas gdy różne tkanki są zwykle zamrażane do badań patologicznych w kontekstach klinicznych i badawczych, protokoły zamrażania tkanek niemięśniowych zwykle obejmują całkowite zanurzenie tkanki w OCT przed zamrożeniem. Jak pokazano na rysunku 3, taki protokół nie nadaje się do patologicznej oceny mięśni szkieletowych, a jednak jest na tyle podobny do opisanego tutaj protokołu, że jest to często spotykany błąd. Celem tego artykułu jest przedstawienie prostego protokołu prawidłowego obchodzenia się z mięśniami, aby uniknąć takich problemów. Opracowano również zalecenia dotyczące właściwego obchodzenia się z mięśniami w badaniach fizjologicznych i komórkowych poza ośrodkiem w celu ułatwienia pozyskiwania wysokiej jakości danych przez zewnętrzne laboratoria podstawowe w przypadkach, gdy badania na miejscu nie są preferowane lub możliwe.
Jak zauważono w tym protokole, elementy, które są absolutnie niezbędne w prawidłowym przetwarzaniu mięśni do badań patologicznych, obejmują minimalizację zawartości wody w tkance, obniżenie temperatury, w której mięsień jest zamrożony, oraz zwiększenie prędkości, z jaką osiąga się zamrażanie. Nadmierna wilgotność w tkance lub nadmierne spowolnienie procesu zamrażania (spowodowane niewystarczającą temperaturą lub brakiem bezpośredniego kontaktu między czynnikiem zamrażającym a tkanką, jak ma to miejsce w przypadku ciekłego azotu) doprowadzi do zamarzania artefaktów, które mogą upośledzać analizę patologiczną. Ponieważ OCT stanowi dodatkowe źródło wilgoci w tkankach, wiele laboratoriów używa innych klejów, takich jak guma tragakantowa, jako podłoża do zatapiania. Nawet w przypadkach, gdy zamrażanie przeprowadza się prawidłowo, należy zachować ostrożność, aby uniknąć późniejszego przypadkowego rozmrożenia próbek w wyniku kontaktu z pojemnikami lub narzędziami do pomiaru rzeczywistego. W związku z tym udany proces zamrażania wymaga pewnego stopnia planowania, które obejmuje wstępne schłodzenie wszystkich narzędzi i pojemników, które mają być używane. W przypadku napotkania artefaktów zamrażających istnieje opisana tutaj metoda odzyskiwania tkanki, która jest wystarczająca do większości ocen patologicznych. Jednak ten cykl zamrażania/rozmrażania nie zapewnia doskonałej histologii i może potencjalnie pogorszyć inne badania molekularne lub enzymatyczne tkanki (oprócz czasu wymaganego do ponownego zamrożenia tkanki), dlatego zdecydowanie preferowane jest stosowanie odpowiednich praktyk początkowego zamrażania. Jednak w przypadkach, gdy artefakt zamrażający napotyka się na wstępnie zamrożoną tkankę, opisana tutaj technika może być niezwykle przydatna.
Utrwalanie i przetwarzanie tkanek pod kątem EM może wiązać się z określonymi wyzwaniami technicznymi, które wymagają planowania przed pobraniem tkanki. Najczęstszym błędem przy pobieraniu próbek do EM jest użycie fragmentów tkanek, które są zbyt gęste, aby aldehyd glutarowy mógł przeniknąć. Ponieważ aldehyd glutarowy wnika tylko na około 0,1 cm w głąb tkanki mięśniowej z danej powierzchni, należy zadbać o to, aby jeden wymiar próbek EM nie był grubszy niż 0,2 cm. Dodatkowo, ponieważ EM jest doskonałym sposobem bezpośredniej oceny aparatu skurczowego, niektórzy badacze opracowali strategie wstępnego napinania lub wstępnego rozciągania mięśnia przed unieruchomieniem, aby umożliwić pomiar elementów kurczliwych przy fizjologicznie odpowiednim napięciu. Nie ma standardowego protokołu wstępnego naprężania, ale w tym protokole pokrótce opisano dwie strategie. Należy zauważyć, że próby wstępnego naprężenia mięśnia mogą dawać nieprzewidywalne rezultaty, chyba że są wykonywane w bardzo specyficzny sposób, a lepszym rozwiązaniem może być utrwalenie mięśni w stanie zwiotczenia, aby zapobiec sztucznym zmianom długości sarkomeru poprzez niestandardową procedurę wstępnego naprężania8,9. W przypadku mięśni, w których takie specyficzne pomiary nie są konieczne (w tym większość biopsji wykonywanych w celach klinicznych), wysiłki mające na celu wstępne napięcie mięśnia na ogół nie są podejmowane, a głównym wpływem na morfologię mięśni jest nierównomierny odstęp między sarkomerami w mięśniu.
Niniejszy artykuł jest pierwszym z serii, w którym przedstawiono standardowe procedury operacyjne (SOP) dotyczące wykonywania testów w dziedzinie wrodzonych chorób mięśni i reprezentuje wysiłki ponad 20 ekspertów w dziedzinie wrodzonych chorób mięśni, którzy rutynowo przeprowadzają badania komórkowe, molekularne, funkcjonalne, fizjologiczne i patologiczne. W nadchodzącym roku zostanie udostępniony szereg opublikowanych standardowych procedur operacyjnych, a niezbędne protokoły i odpowiednie formaty publikacji dla każdego z nich zostały omówione podczas warsztatów Konsorcjum ds. Wrodzonych Chorób Mięśni, które odbyły się w kwietniu 2013 r. w Waszyngtonie. Celem tego wysiłku SOP jest zapewnienie mapy drogowej dla niezbędnych testów i analiz próbek w dziedzinie wrodzonych chorób mięśni, aby 1) ustandaryzować praktyki i punkty końcowe stosowane w naszej dziedzinie w jak największym stopniu oraz 2) zapewnić instrukcje dotyczące standardowych praktyk dla nowych badaczy w naszej dziedzinie. Wierzymy, że zasoby te ułatwią wejście nowych badaczy w naszą niedostatecznie zbadaną dziedzinę, a tym samym poprawią zakres badań, które można przeprowadzić. Ponadto standaryzacja praktyk będzie niezwykle pomocna w porównywaniu danych z badań i identyfikowaniu punktów końcowych podczas planowania i przeprowadzania badań przedklinicznych i klinicznych.
Chociaż główny nacisk kładziony jest na odpowiednie zamrażanie i przygotowanie tkanek do różnych badań, nasza grupa współpracująca omówiła również przydatne punkty końcowe dla patologicznej analizy próbek mięśni. Obecnie nie ma oficjalnego konsensusu co do podejścia, jakie należy przyjąć podczas przeprowadzania analizy patologicznej, a przeprowadza się wiele różnych badań w celu powiązania nowych ustaleń z wcześniejszymi publikacjami dla każdej choroby. W związku z tym pomyśleliśmy, że przydatne będzie zaproponowanie kilku ogólnych wytycznych dotyczących planowania patologicznych punktów końcowych w charakterystyce patologii mięśni. Przed ilościowym określeniem patologii w badaniu należy poświęcić wiele uwagi 1) metodzie pomiaru wielkości włókien, 2) możliwości nieprawidłowości specyficznych dla danego rodzaju włókien lub efektom leczenia, 3) możliwości wystąpienia nieprawidłowości lub efektów, które są ograniczone do poszczególnych mięśni oraz 4) strategii ilościowego określania zmian patologicznych, które są charakterystyczne dla badanej choroby. Wielkość włókien jest niezbędnym punktem końcowym dla większości badań i niestety istnieją duże różnice w sposobie jej ilościowego określania. Wiele badań podaje te wyniki przy użyciu zautomatyzowanych metod kwantyfikacji dostarczanych przez zastrzeżone oprogramowanie do obrazowania, ale wiele z tych programów idzie na skróty (np. zakładając, że włókna są okręgami lub elipsami), co może sprawić, że te automatyczne pomiary będą niedokładne. Konieczne jest zrozumienie, w jaki sposób te zautomatyzowane programy dokonują pomiarów, zanim uzyskają zaufanie do pomiarów, i zachęcamy badaczy do uwzględnienia tych szczegółów w metodach papierowych. Ponadto konkretny pomiar używany do oznaczania rozmiaru włókna jest niezwykle zmienny, a niektóre pomiary są lepsze od innych10,11. Powszechnie stosowanym pomiarem wielkości włókien jest pole przekroju poprzecznego światłowodu (CSA), szczególnie dlatego, że badacze wykonujący badania fizjologiczne standaryzują swoje wyniki do pomiarów CSA uzyskanych za pomocą swoich instrumentów. Niestety, podczas gdy pomiary CSA mogą dokładnie odzwierciedlać rozmiar włókien w idealnych przekrojach poprzecznych, są one w dużym stopniu zależne od orientacji włókien (do tego stopnia, że włókna o przekroju wzdłużnym lub ukośnym będą miały sztucznie zawyżone pomiary CSA) i dlatego nie są idealnymi pomiarami dla rozmiaru włókna. Preferowanym pomiarem wielkości włókna, który jest mniej zależny od pola przekroju poprzecznego włókna, jest minimalna średnica Fereta (średnica MinFeret), która jest miarą mniejszej średnicy w komórce mięśniowej12. Pomiar ten jest tylko nieznacznie zależny od orientacji włókien i jest generalnie klinicznym złotym standardem pomiaru włókien, a badaczy zachęca się do przejścia na stosowanie tej techniki. Pomiary te można często wykonać za pomocą tego samego oprogramowania, które generuje pomiary CSA13, a także można je łatwo zmierzyć ręcznie. Jeśli chodzi o ocenę danych patologicznych w zależności od rodzaju włókna, konkretnego mięśnia oraz w kontekście zmian patologicznych związanych z konkretną chorobą, są to mniej kontrowersyjne kwestie, które należy wziąć pod uwagę tylko podczas planowania badania. Rodzaj włókien można ocenić za pomocą barwienia immunohistochemicznego lub ATPazy, ale warto wziąć pod uwagę, że określone mięśnie i gatunki zwierząt mają określone mieszanki tych rodzajów włókien (co wymaga różnych oczekiwań i strategii testowania). Może wystąpić patologiczne zajęcie specyficzne dla mięśni lub skuteczność leczenia, a całkowita masa mięśni w porównaniu z grupą kontrolną może być wykorzystana do określenia stopnia niejednorodności choroby przed podjęciem decyzji o tym, które mięśnie mają być oceniane patologicznie. Wreszcie, dobrze wiadomo, że wiele chorób mięśni wiąże się ze specyficznymi nieprawidłowościami patologicznymi (takimi jak pręciki nemalinowe w miopatii nemalinowej)14,15, a zatem warto również rozważyć, czy nieprawidłowości te występują w rozmieszczeniu specyficznym dla rodzaju włókien lub mięśni podczas wykonywania analizy16,17. Ogólnie rzecz biorąc, chociaż nie proponujemy sztywnego zestawu standardów oceny mięśni, uważamy, że kwestie te powinny być brane pod uwagę przed przeprowadzeniem badań patologicznych w jakiejkolwiek chorobie mięśni szkieletowych.

Mięsień szkieletowy jest unikalną tkanką ze względu na swoją strukturę i funkcję, co może stanowić szereg wyzwań przy ocenie jej patologii. Chociaż jest to wystarczające, a często nawet optymalne, do oceny większości tkanek po utrwaleniu formaliny i zatopieniu parafiny, proces ten prowadzi do wytwarzania artefaktów kurczenia się komórek, które upośledzają ocenę krytycznych fenotypów we wrodzonych chorobach mięśni (w tym rozmiaru i kształtu włókien mięśniowych). Dodatkowo, zamrożone mięśnie są wymagane podczas wykonywania wielu barwień histochemicznych (w tym zredukowanego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH), oksydazy cytochromowej (COX), dehyrogenazy bursztynianowej (SDH), trifosfatazy adenozynowej (ATPazy) i barwienia czerwieni olejowej O), które są niezbędne do wykrywania określonych nieprawidłowości patologicznych wymaganych do diagnozowania różnych miopatii wrodzonych, miopatii mitochondrialnych i chorób spichrzeniowych. Wiele przeciwciał i narzędzi molekularnych wykorzystywanych do charakteryzowania morfologii i funkcji mięśni zostało w konsekwencji opracowanych i zoptymalizowanych tylko dla zamrożonych tkanek, co dodatkowo ogranicza przydatność preparatów tkanek utrwalonych w badaniach biologii mięśni szkieletowych. W rezultacie, zamrażanie próbek mięśni szkieletowych stało się standardową praktyką w większości wskazań klinicznych i badawczych w dziedzinie wrodzonych chorób mięśni, pomimo wyzwań technicznych, jakie może stwarzać odpowiednie zamrażanie.
Zamrożenie mięśni szkieletowych może być technicznie trudne ze względu na wysokie prawdopodobieństwo tworzenia się kryształków lodu w obrębie włókien mięśniowych,gdy przestrzegany jest niewłaściwy protokół zamrażania1. W większości przypadków artefakty zamarzania występują, gdy zawartość wody w tkance jest zbyt wysoka lub gdy proces zamrażania jest zbyt wolny. Zawartość wody w tkance może zostać przypadkowo zwiększona przez zanurzenie w płynie, na przykład transport mięśni w soli fizjologicznej; lub zamrażanie może być zagrożone, jeśli tkanka została całkowicie zanurzona w OCT. Obie te procedury mogą prowadzić do katastrofalnych artefaktów zamrażania w tkance mięśniowej. Ponadto szereg drobnych błędów w procesie zamrażania może powodować powolne zamrażanie lub przypadkowe rozmrażanie próbek po odpowiednim zamrożeniu, a kwestie te mogą podobnie komplikować ocenę patologiczną. 
Wraz z rozwojem nowych modeli i metod leczenia chorób mięśni szkieletowych, coraz bardziej użyteczne stanie się stosowanie standardowych procedur operacyjnych (SOP) do oceny fenotypów mięśni szkieletowych i skuteczności leczenia. Jest to szczególnie ważne dla patologicznej oceny wrodzonych chorób mięśni, ponieważ rozpoznawanie subtelnych fenotypów obserwowanych w wielu z tych zaburzeń może być zaburzone przez niewłaściwe przygotowanie tkanek. Niniejszy raport stanowi próbę Konsorcjum ds. Wrodzonych Chorób Mięśni (Congenital Muscle Disease Consortium) w celu ustanowienia SOP zamrażania mięśni szkieletowych do badania modeli wrodzonych chorób mięśni. 
Przedstawiony tutaj protokół opisuje strategię stosowaną w naszych laboratoriach klinicznych i badawczych w celu optymalizacji oceny patologii zamrożonych mięśni, a jednocześnie nadaje się do różnych badań opartych na białkach i genetycznych. Przedstawiono również konkretne strategie przygotowania próbek mięśni szkieletowych do mikroskopii elektronowej. Ponadto, ponieważ możliwe jest testowanie funkcjonalne zamrożonej tkanki za pomocą pojedynczych włókien2,3, eksperci w dziedzinie tych technik dostarczyli szczegółowych informacji na temat optymalnych protokołów postępowania z tkankami. Niestety, izolacja linii komórkowych mioblastów nie może być skutecznie przeprowadzona na wstępnie zamrożonej tkance, dlatego w niniejszym artykule przedstawiono strategię krótkoterminowego przechowywania i transportu tkanki mięśniowej w celu założenia hodowli mioblastów w laboratoriach zewnętrznych. Ogólnie rzecz biorąc, opisane tu metody dostarczają wytycznych do prawidłowego przetwarzania tkanki mięśniowej dla różnorodnych badań patologicznych, funkcjonalnych, molekularnych i komórkowych, niezależnie od możliwości terenowych danego laboratorium.

<table><tbody><tr><td>Do zamrażania</td><td></td><td></td><td></td>tkanek</tr><tr><td>Ciekły azot Dewar z urządzeniem do pobierania cieczy</td><td>Niestandardowe systemy biogenne</td><td>Seria Lab-5</td><td>Każdy inny ciekły azot Dewara może zastąpić.</td></tr><tr><td>Pojemnik przewodzący zimno</td><td>Fisher</td><td>02-583A</td><td></td></tr><tr><td>Szeroki izolowany pojemnik zdolny do przechowywania ciekłego azotu</td><td>Nalgene</td><td>4150-2000</td><td></td></tr><tr><td>Oakton Temp 10 Termometr termoparowy</td><td>Thomas Scientific</td><td>1228Y01</td><td>Opcjonalny, ale może być bardzo przydatny w identyfikacji punktu, w którym izopentan zamarza.</td></tr><tr>Do testowania <td></td><td></td><td></td><td>funkcjonalnego pojedynczego włókna</td></tr><tr>szalka<td>Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11</td><td></td></tr><tr><td>Powłoka Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>&nbsp; 3-6636</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy preparacyjny</td><td>Aparat Harvarda</td><td>693101</td><td>Każdy inny mikroskop preparacyjny może zastąpić.</td></tr><tr><td>Do hodowli</td><td></td><td></td><td></td>komórkowych</tr><tr><td>Sterylny kaptur z przepływem laminarnym</td><td>Thermo Scientific</td><td>51022485</td><td>Każdy inny kaptur do hodowli komórkowych może zastąpić.</td></tr><tr><td>Do zamrażania</td><td></td><td></td><td></td>tkanek</tr><tr><td>Worki/pojemniki foliowe</td><td>Nasco</td><td>B01009WA</td><td></td></tr><tr><td>Termiczne rękawice ochronne</td><td>Denville</td><td>G4162</td><td></td></tr><tr><td>Osłona twarzy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47640</td><td></td></tr><tr><td>Długie kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 12-460-807</td><td></td></tr><tr><td>Zszywki</td><td>do markerów</td><td>125328</td><td></td></tr><tr><td>Do hodowli</td><td></td><td></td><td></td>komórkowych</tr><tr><td>Sterylne probówki stożkowe 50 ml</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca PES, 500 ml, 0,22 i mikro; m</td><td>Denville</td><td>F5227</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kleszcze</td><td>Fisher Scientific</td><td>644320</td><td></td></tr><tr><td>Okłady z lodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9909223</td><td></td></tr><tr><td>Izolowane pudełko styropianowe</td><td>Polar Tech</td><td>207F</td><td></td></tr><tr><td>Taśma pakowa</td><td>Zszywki</td><td>795570</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażanie</td><td></td><td></td><td></td>tkanek</tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Airgas</td><td>NI NF160LT350</td><td>Przechowywać ciekły azot w pojemnikach przeznaczonych do cieczy niskotemperaturowych</td></tr><tr><td>Izopentan (2-metylobutan)</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>Przechowywać izopentan&nbsp; w szafie na materiały łatwopalne.&nbsp;</td></tr><tr><td>Utrwalacz EM (wybierz jeden)</td><td></td><td></td><td>bez utrwalacza powinny być również dostępne, ponieważ tkanki utrwalone EM powinny być przenoszone z utrwalacza do bufora po kilku godzinach lub dniach, jeśli nie są natychmiast przetwarzane na EM.</td></tr><tr><td>2,5% aldehydu glutarowego w buforze kakodylowym 0,1 M</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>16537-15</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalacz Karnovsky'ego (3% aldehyd glutarowy + 2% paraformaldehyd w buforze fosforanowym 0,1M)</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej</td><td>15732-10</td><td></td></tr><tr><td>Do badań funkcjonalnych (w razie potrzeby)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór relaksujący, zawierający (w mmol/L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 40 BES</td><td>Sigma</td><td>B9879</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10 EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 6,56 MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 5.88 Na-ATP</td><td>Sigma</td><td>A3377&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.0 Naziemna Telewizja Cyfrowa</td><td>RPI</td><td>D11000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 46.35 K-propionian</td><td></td><td></td><td>Sporządzić roztwór, mieszając kwas proprionowy (Sigma P1386) i KOH (Fisher P250) w stosunku 1:1</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15 fosforan kreatyny, pH 7,0</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0,4 leupeptyna</td><td>Calbiochem</td><td>10895</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0,1 PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7676</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do skórowania, zawierający&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Relaksujące rozwiązanie (patrz wyżej)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0,5% Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Wskazujące granulki</td><td></td><td></td><td></td>krzemionki</tr><tr><td>Płaskie kawałki korka (1 x 1 cal)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>63305</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>Do hodowli komórkowej (w razie potrzeby)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kompletna pożywka wzrostowa, zawierająca (na 500 ml)</td><td></td><td></td><td>Sterylizować, filtrując roztwór przez 500 ml 0,22 &mikro; m Jednostka filtrująca PES.&nbsp; Przechowywać w 4&deg; C i zużyć w ciągu 1 miesiąca.</td></tr><tr><td>395 ml leku Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F6178</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 100X Penicylina-Streptomycyna-Glutamina (PSG)</td><td>Sigma</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Zobacz kartę charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) dla wszystkich innych odczynników w celu uzyskania specyfikacji</td><td></td><td></td><td></td> przechowywania</tr></tbody></table>

klasyfikacja i zamrażanie tkanek w modelach chorób mięśni szkieletowych

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Mięsień szkieletowy jest unikalną tkanką ze względu na swoją strukturę i funkcję, która wymaga określonych protokołów pobierania tkanek w celu uzyskania optymalnych wyników z oceny funkcjonalnej, komórkowej, molekularnej i patologicznej. Ze względu na subtelność niektórych patologicznych nieprawidłowości obserwowanych we wrodzonych zaburzeniach mięśni i możliwość zakłócenia rozpoznania tych cech przez fiksację, patologiczna ocena zamrożonego mięśnia jest lepsza niż mięsień utrwalony podczas oceny mięśni szkieletowych pod kątem wrodzonej choroby mięśni. Dodatkowo, możliwość wytwarzania silnych artefaktów zamrażania w mięśniach wymaga szczególnych środków ostrożności podczas zamrażania mięśni szkieletowych do badania histologicznego, które nie są powszechnie stosowane podczas zamrażania innych tkanek. Manuskrypt ten opisuje protokół szybkiego zamrażania mięśni szkieletowych przy użyciu izopentanu (2-metylobutanu) chłodzonego ciekłym azotem w celu zachowania optymalnej morfologii mięśni szkieletowych. Procedura ta jest również skuteczna w przypadku zamrażania tkanek przeznaczonych do badań genetycznych lub badań ekspresji białek. Ponadto zintegrowaliśmy nasz protokół zamrażania z szerszą procedurą, która opisuje również preferowane metody krótkoterminowej selekcji tkanek w (1) badaniach funkcjonalnych z pojedynczym włóknem i (2) hodowli komórek mioblastów, koncentrując się na minimalnym wysiłku niezbędnym do pobrania tkanki i przetransportowania jej do specjalistycznych laboratoriów badawczych lub referencyjnych w celu ukończenia tych badań. Ogólnie rzecz biorąc, manuskrypt ten zawiera zarys tego, w jaki sposób świeża tkanka może być skutecznie rozprowadzana w różnych badaniach fenotypowych, a tym samym zapewnia standardowe procedury operacyjne (SOP) dla badań patologicznych związanych z wrodzonymi chorobami mięśni.

Aby przedstawić przykłady artefaktów powstających podczas niewłaściwego mrożenia, kilka mięśni czworogłowych uda myszy zamrożono przy użyciu różnych technik (Rysunek 3), aby odtworzyć powszechnie występujące błędy. Jak pokazano na Rysunku 3A, odpowiednio zamrożony mięsień szkieletowy wykazuje ścisłe przyleganie włókien mięśniowych do otaczającej tkanki (zazwyczaj są to inne włókna mięśniowe, lecz czasami przestrzeń śródmięsniowa między włókienkami jest wypełniona zwłóknieniami lub komórkami zapalnymi w przebiegu różnych procesów chorobowych lub urazowych) oraz wyraźnie widoczny przedział cytoplazmatyczny. W analizie patomorfologicznej możliwość obserwacji przestrzeni wewnątrzkomórkowej jest często ważniejsza niż przedział śródmięsniowy, ponieważ zazwyczaj jest to kluczowe dla wyraźnej identyfikacji obecności zmian degeneracyjnych, zmian regeneracyjnych lub innych znalezisk patognomonicznych (jądra centralne, inkluzje wewnątrzkomórkowe) w tej przestrzeni. Zatem obecność kryształków lodu w przedziale wewnątrzkomórkowym stanowi istotny problem w ocenie patomorfologicznej mięśnia.
Prawidłowe mrożenie tkanki mięśniowej wymaga zarówno odpowiednio niskich temperatur, jak i wystarczającej szybkości zamrażania, aby uniknąć tworzenia się kryształków lodu. Nawet przy uwzględnieniu obu tych czynników nadal mogą wystąpić znaczne artefakty mrożenia z powodu nadmiernej wilgotności tkanki mięśniowej. Problem ten najczęściej pojawia się w przypadku tkanki mięśniowej, która była wcześniej zanurzona w soli fizjologicznej i niedostatecznie osuszona lub gdy mięsień miał bezpośredni kontakt z medium montażowym OCT w miejscu wykonywania cięć (Ryc. 3B, 3E). Choć pewien kontakt z OCT jest zazwyczaj nieunikniony w procesie montowania, należy dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć kontaktu między obszarami, które będą oceniane histologicznie, a OCT używanym do montowania. W przeciwieństwie do tego, próbki mrożone w zamrażarce o temperaturze -80 °C (Ryc. 3C) oraz w ciekłym azocie (Ryc. 3D) stanowią przykłady artefaktów mrożenia spowodowanych nieoptymalną temperaturą lub szybkością zamrażania. Powolny proces mrożenia podczas umieszczania tkanki w zamrażarce -80 °C jest ekstremalnym przykładem artefaktu mrożenia. Przy użyciu ciekłego azotu głównym problemem jest fakt, że kontakt między ciekłym azotem a tkanką powoduje powstanie otoczki z azotu gazowego na granicy fazy tkanka-ciecz, a ta granica gazowa nie jest wystarczająco zimna, aby zapewnić szybkie zamrożenie mięśnia1. Może to prowadzić do powstania znacznych artefaktów mrożenia w pobliżu powierzchni preparatu, jednak obszary wewnętrzne preparatu częściej ulegają gwałtownemu zamrożeniu w odpowiednim tempie i mogą być całkowicie wolne od artefaktów. Choć proste zanurzenie tkanki mięśniowej w ciekłym azocie nie jest w żadnym stopniu tak użyteczne jak proces mrożenia w izopentanie, może być pomocne przy zamrażaniu dużych fragmentów mięśni w sytuacjach, gdy izopentan jest niedostępny (np. w przypadku klinicznych materiałów z sekcji zwłok w placówkach nieposiadających klinicznych laboratoriów patologii mięśni). Wyniki przy zastosowaniu tej strategii są zazwyczaj lepsze w przypadku dużych fragmentów tkanki (&gt;2 cm w kilku wymiarach).
Choć unikanie artefaktów mrożenia zapewnia optymalne wyniki histologiczne, opracowano również technikę (opisaną w niniejszym dokumencie), która w znacznym stopniu niweluje artefakty mrożenia, umożliwiając ocenę tkanek zamrożonych nieprawidłowo. Tkankę zamrożoną nieprawidłowo (Rysunek 3E) można rozmrozić i zamrozić ponownie w ściśle kontrolowanych warunkach (Rysunek 3F), co pozwala na redystrybucję wody wewnątrz włókien; stopień zachowania morfologii, który można w ten sposób osiągnąć, może być doskonały. W naszym doświadczeniu proces ten w niezwykłym stopniu zachowuje morfologię wewnątrzkomórkową tkanki, ale często powoduje artefakty w postaci rozdzielenia włókien w przestrzeni endomysium. Ponieważ wiele punktów końcowych patologii znajduje się w przestrzeni wewnątrzkomórkowej, a te w przestrzeni endomysium najlepiej oceniać za pomocą barwień specjalnych (aby uwidocznić włóknienie lub zidentyfikować inne typy komórek), wspomniane zmiany artefaktowe prawdopodobnie nie upośledzą rzetelnej oceny patomorfologicznej mięśnia.
<img alt="Schemat procesu pobierania tkanek: histologia, EM, badania funkcjonalne, metody hodowli komórkowych." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Segregacja tkanki do badań strukturalnych, funkcjonalnych i komórkowych mięśni szkieletowych. W zależności od rodzaju planowanych badań, pobraną tkankę mięśnia szkieletowego można przetworzyć na różne sposoby, aby uzyskać optymalne wyniki. Protokoły opisane w niniejszym opracowaniu przedstawiają metody segregacji lub przetwarzania próbek mięśnia szkieletowego do badań zewnętrznych w celu optymalizacji wyników uzyskiwanych w specjalistycznych jednostkach badawczych.
<img alt="Układ do konserwacji kriogenicznej, proces mrożenia i próbka tkanki utrwalonej w eksperymencie laboratoryjnym." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przykłady aparatury stosowanej do mrożenia mięśni. Zgodnie z opisem w protokole, optymalne mrożenie mięśni wymaga zanurzenia tkanki mięśniowej w izopentanie znajdującym się w temperaturze krzepnięcia. Bezpiecznym i wydajnym sposobem uzyskania lodowatego izopentanu jest zastosowanie metalowego pojemnika na izopentan, który jest chłodzony w otaczającym go naczyniu Dewara zawierającym ciekły azot. Ponieważ często wygodniej jest mieć obie ręce wolne, można użyć podpory, takiej jak statyw laboratoryjny (A), aby utrzymać pojemnik z izopentanem w ciekłym azocie, zapobiegając jednocześnie zmieszaniu obu cieczy. Alternatywnie pojemnik można również trzymać w ciekłym azocie ręcznie (B). W obu przypadkach tkanki nie należy umieszczać w izopentanie, dopóki izopentan nie zacznie widocznie zamarzać na dnie pojemnika (zazwyczaj w formie nieprzezroczystych białych grudek), a następnie należy ją zanurzyć na 10-20 sec, aby umożliwić całkowite zamrożenie. Izopentan w temperaturze krzepnięcia wytwarza minimalną „mgłę” (t.j. temperatura jest niewystarczająca, jeśli występuje znaczna ilość mgły). Po zamrożeniu tkanki należy ją umieścić bezpośrednio w schłodzonych wcześniej pojemnikach (a następnie bezpośrednio w chłodziarce lub zamrażarce), aby zapobiec przypadkowemu rozmrożeniu po zamrożeniu. (C) Odpowiednio zamontowany zamrożony mięsień powinien mieć większość tkanki mięśniowej wystającą z podstawy z zamrożonego OCT.
<img alt="Histologia tkanki mięśniowej, obrazy mikroskopowe, przekroje A-F pokazujące wariacje struktury komórkowej." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przykłady artefaktów zamrażania oraz skutecznego rozmrażania i ponownego zamrażania. Reprezentatywne obrazy (A) mięśnia odpowiednio zamrożonego w izopentanie, (B) mięśnia zamrożonego odpowiednio w izopentanie, ale w kontakcie z medium montującym OCT, (C) mięśnia zamrożonego w zamrażarce -80 °C oraz (D) mięśnia zamrożonego w ciekłym azocie, z czego wszystkie wykazują różny stopień artefaktów zamrażania. Jak pokazano na obrazie (B), wysoka zawartość cieczy w OCT powoduje znaczne artefakty zamrażania w mięśniu, który z nim styka, dlatego należy używać minimalnej ilości OCT niezbędnej do montażu, a mięsień do oceny histologicznej powinien „wystawać” ponad jego powierzchnię. Powolny przebieg procesu zamrażania w (C) zamrażarce -80 °C lub (D) ciekłym azocie (w porównaniu z szybkością zamrażania w lodowatym izopentanie) może prowadzić do powstania znacznych artefaktów zamrażania. Panele E i F pokazują mięsień z tego samego preparatu, który był (E) początkowo zamrożony w sposób nieoptymalny (ze względu na nadmierny kontakt z OCT), a następnie (F) rozmrożony i zamrożony ponownie zgodnie z opisaną tutaj techniką. Choć w próbce zamrożonej ponownie można zaobserwować pewne artefaktowe rozdzielenie włókien, poprawa morfologii wewnątrzkomórkowej włókien mięśniowych jest wyraźnie widoczna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51586/51586fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Analiza tkanek mięśni szkieletowych w celu określenia właściwości strukturalnych, funkcjonalnych i biochemicznych jest znacznie ułatwiona dzięki odpowiedniemu przygotowaniu. Protokół ten opisuje odpowiednie metody przygotowania tkanki mięśni szkieletowych do szerokiego zakresu badań fenotypowania.

Klasyfikacja i zamrażanie tkanek w modelach chorób mięśni szkieletowych

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zamrożenie mięśnia szkieletowego w celu uzyskania optymalnej morfologii mikroskopowej. Cel ten osiąga się poprzez najpierw podzielenie próbek, aby uwzględnić wszystkie zamierzone zastosowania tkanki. W drugim kroku tkanka mięśniowa jest montowana w taki sposób, aby zachować orientację, chroniąc jednocześnie tkankę przed nadmierną wilgocią.Następnie zamontowaną próbkę zamraża się w kąpieli z izopentanu. W ostatnim kroku próbkę przechowuje się w sposób zapobiegający rozmrażaniu i ponownemu zamrażaniu. Ostatecznie jakość konserwacji można ocenić poprzez badanie histologiczne zamrożonej tkanki mięśniowej.Zazwyczaj osoby po raz pierwszy stosujące tę metodę napotykają trudności, ponieważ nawet niewielkie różnice w protokołach mrożenia mogą prowadzić do powstania istotnych artefaktów w morfologii mięśni szkieletowych widocznych pod mikroskopem. Procedurę tę zaprezentuje dziś dr Hui Meg, moja główna asystentka w laboratoriach badawczych i klinicznych, przy pomocy pani Jennifer Tinklenberg. Rozpocznij od podzielenia wyizolowanego mięśnia szkieletowego na fragmenty odpowiednie do planowanych badań, w tym na kawałki tkanki przeznaczone do mikroskopii elektronowej.Wytnij pasek mięśnia o wymiarach około 0,5 x 0,2 x 0,2 cm z próbki, tak aby oś podłużna próbki była równoległa do osi podłużnej oryginalnego mięśnia, aby zminimalizować manipulacje i zapobiec pomyłkom podczas przygotowania do mikroskopii elektronowej. Następnie umieść fragment mięśnia, którego najcieńszy wymiar nie przekracza 2 mm, bezpośrednio w odpowiednim utrwalaczu do mikroskopii elektronowej; po utrwaleniu umieść mięsień w buforze do mikroskopii elektronowej, a następnie przekaż tkankę do specjalistycznego laboratorium mikroskopii elektronowej w celu przetworzenia do badań histologicznych, biochemicznych lub molekularnych. Uwzględnij tak dużą część mięśnia, jak to możliwe, aby zminimalizować błąd próbkowania, dbając jednocześnie o to, aby próbki nie przekraczały 1,5 cm wielkości.Aby uniknąć artefaktów mrożenia, wszystkie mięśnie z tej samej grupy badawczej należy traktować w identyczny sposób, co zapobiegnie wystąpieniu sztucznych różnic w wielkości włókien wynikających z różnic w sposobie manipulacji. Następnie każdy preparat należy dokładnie osuszyć ręcznikiem papierowym, usuwając nadmiar wilgoci, aż tkanka zacznie lekko przylegać do ręcznika. Po tym czasie na podstawkę, taką jak ten kawałek korka, należy nałożyć niewielką ilość środka adhezyjnego, np. OCT, aby stworzyć fundament dla zorientowanego mięśnia.Ostrożnie umieść mięsień w OCT w taki sposób, aby większość mięśnia wystawała z OCT, tak aby tkanka przeznaczona do cięcia nie miała kontaktu z OCT. Następnie do metalowego kubka dolej izopentan, aż osiągnie głębokość około trzech do czterech centymetrów. Załóż rękawice termoodporne i zdejmij pokrywę zbiornika z ciekłym azotem.Najbardziej krytycznymi aspektami tego procesu są: odczekanie, aż izopentan zostanie odpowiednio schłodzony przed próbą zamrożenia mięśnia, a także zamrożenie i przechowywanie mięśnia w sposób zapobiegający jego rozmrożeniu. Umieść metalny kubek w kontakcie z ciekłym azotem tak, aby poziom ciekłego azotu na zewnątrz kubka znajdował się powyżej poziomu izopentanu wewnątrz kubka. Obserwuj izopentan, aby wykryć tworzenie się stałych białych grudek zamrożonego izopentanu na dnie kubka, co wskazuje, że ciecz osiągnęła odpowiednią temperaturę. Użyj wcześniej schłodzonej pęsety, aby zamrozić próbkę w izopentanie przez około 10 do 20 sekund.Na koniec umieść zamrożony preparat w schłodzonym wcześniej pojemniku i przechowuj go na suchym lodzie do momentu przeniesienia do zamrażarki w temperaturze -80 °C. Na tym pierwszym obrazie można zaobserwować prawidłowo zamrożony mięsień szkieletowy, wykazujący ścisłe przyleganie włókien mięśniowych do otaczającej tkanki oraz wyraźnie widoczny przedział cytoplazmatyczny. Powstawanie artefaktów mrożenia wynikających z nadmiernej wilgoci występuje najczęściej w tkance mięśniowej, która była wcześniej zanurzona w soli fizjologicznej i niewystarczająco osuszona, lub w tkance mięśniowej, która w miejscu cięcia miała bezpośredni kontakt z medium montażowym OCT.W przeciwieństwie do nich, obrazy tkanki mrożonej wyłącznie w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie stanowią przykłady artefaktów mrożenia powstałych odpowiednio w wyniku nieoptymalnych temperatur lub prędkości mrożenia, podczas gdy unikanie artefaktów mrożenia pozwala na uzyskanie optymalnych wyników histologicznych; ponadto niewłaściwie zamrożoną tkankę można rozmrozić, a następnie ponownie zamrozić w ściśle kontrolowanych warunkach, aby umożliwić redystrybucję wody w obrębie włókien, co obrazuje tkanka na tym zdjęciu. Stopień zachowania morfologii w zamrożonym preparacie może być doskonały. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować preparaty mięśni szkieletowych do badań patomorfologicznych wymagających zamrożonego mięśnia.

tissue-triage-and-freezing-for-models-of-skeletal-muscle-disease

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przetwarzanie tkanek i ich zamrażanie w modelach chorób mięśni szkieletowych

Ten film opisuje procedurę szybkiego zamrażania tkanki mięśniowej i uzyskiwania jej cienkich odcinków. Technika ta może pomóc w badaniu kacheksji związanej z rakiem w mysich modelach raka jelita grubego.

Błyskawiczne zamrażanie tkanki mięśniowej do cięcia: protokół uzyskiwania ultracienkich skrawków szybko zamrożonej mysiej tkanki mięśniowej

Model przecięcia nerwu piszczelowego jest dobrze tolerowanym, sprawdzonym i powtarzalnym modelem zaniku mięśni szkieletowych. Modelowy protokół chirurgiczny został opisany i zademonstrowany na myszach C57Black6.

Przecięcie nerwu piszczelowego - standaryzowany model atrofii mięśni szkieletowych wywołanej denerwacją u myszy

Ten protokół opisuje techniki izolacji żywych komórek i pierwotnej hodowli linii komórkowych miogennych i fibroblastów z tkanki mięśniowej lub skórnej.  Opisana jest również technika unieśmiertelniania tych linii komórkowych.  Ogólnie rzecz biorąc, protokoły te stanowią niezawodne narzędzie do generowania i przechowywania komórek pochodzących od pacjentów do dalszych zastosowań.

Izolacja i unieśmiertelnienie linii komórkowych pochodzących od pacjentów z biopsji mięśni w celu modelowania choroby

Tutaj demonstrujemy najbardziej efektywne metody zamrażania, osadzania, kriosekcji i barwienia biopsji mięśni, aby uniknąć artefaktów zamrażania.

Co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Ten protokół opisuje procedurę zamrażania tkanek mięśniowych poprzez zanurzanie ich bezpośrednio w ciekłym azocie. Protokół ten podkreśla również nowy kriowial, który może uniknąć "ogólnego efektu" gazowego azotu, gdy ciekły azot styka się z powierzchnią tkanki próbki.

Kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie

Opisany tutaj jest protokół bezpośredniego znakowania immunologicznego martwiczych włókien mięśniowych w kriosekcjach mięśni. Komórki martwicze są przepuszczalne dla białek surowicy, w tym immunoglobuliny G (IgG). Ujawnienie wychwytu IgG przez włókna mięśniowe umożliwia identyfikację i ilościowe określenie włókien mięśniowych, które ulegają martwicy niezależnie od stanu mięśni.

Znakowanie immunologiczne zwyrodnienia włókien mięśniowych w biopsjach mięśni

Ten raport techniczny opisuje odmianę zmodyfikowanej techniki Bergströma do biopsji mięśnia piszczelowego przedniego, która ogranicza uszkodzenia włókien.

Pobieranie biopsji mięśni szkieletowych z górnego przedziału mięśnia piszczelowego ludzkiego mięśnia piszczelowego przedniego w celu oceny mechanicznej

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Obecny protokół opisuje unikalną technikę zwaną treningiem oporowym dostosowanym do dawki (DART), która może być włączona do precyzyjnych badań rehabilitacyjnych przeprowadzanych na małych zwierzętach, takich jak myszy.

Trening oporowy dostosowany do dawki u myszy ze zmniejszonym ryzykiem uszkodzenia mięśni

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych. Porównanie histologii między żwaczem myszy a mięśniem piszczelowym przednim po urazie spowodowanym zamarznięciem potwierdziło zwłóknienie mięśni żwaczy. Model ten ułatwi dalsze badania nad mechanizmem leżącym u podstaw zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych.

Zamrożenie urazu mięśnia żwacza myszy w celu ustalenia modelu zwłóknienia mięśni ustno-twarzowych

Naucz się zamrażania tkanki mięśni szkieletowych w izopentanie dla zachowania morfologii mikroskopowej. Protokół obejmuje montaż, ochronę przed wilgocią i ocenę histologiczną jakości preparatu.

Klasyfikacja i zamrażanie tkanek w modelach chorób mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów