Name: Budowa i charakterystyka nowego bioreaktora fałdów głosowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj budowę nowego bioreaktora fałdów głosowych do badania wpływu stymulacji wibracyjnej na komórki macierzyste mezenchymalne. Ta metoda pozwala analizować odpowiedzi komórkowe na poziomie białek i translacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorowi Jeffreyowi Caplanowi za jego szkolenie i porady dotyczące obrazowania konfokalnego. Dziękujemy również Laboratorium Mikroskopii Elektronowej Kecka i dr Chaoying Ni za pomoc SEM. Praca ta jest finansowana przez National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 i R01DC011377). ABZ przyjmuje do wiadomości program NSF Integrative Graduate Education & Research Traineeship (IGERT) do finansowania.

1. Zespół bioreaktora (Wideo 1)
<ol>
	<li>Wykonaj aluminiową formę (okrągła matryca + kołek dystansowy) o z góry ustalonych wymiarach wewnętrznych i zewnętrznych (rysunek 1).</li>
	<li>Korzystając z formy z kroku 1.1, wyprodukuj membranę silikonową (średnica: 42 mm, grubość: 1,5 mm, rysunek 1) z osadzoną tuleją (średnica: 12 mm, grubość ~0,25 mm, ukształtowana przez kołek dystansowy na rysunku 1) pośrodku, używając dostępnego na rynku zestawu elastomerów silikonowych.</li>
	<li>Wykonaj parę klocków akrylowych (Rysunek 2 (4, 5)) z okrągłym otworem (średnica: 24 mm) pośrodku, wygraweruj górne (1,8 cm grubości) i dolne (0,9 cm grubości) bloki z pasującymi grzbietami i rowkami. 10</li>
	<li>Umieść membranę silikonową między sparowanymi blokami akrylowymi. Przymocuj zespół czterema narożnymi za pomocą mikrowkrętaka dynamometrycznego ustawionego na stałą siłę (35 cN·m). W efekcie powstaje wodoszczelna komora wibracyjna o szerokości 24 mm i głębokości 18 mm (rys. 2C).</li>
	<li>Zamontuj 3-calowy minigłośnik niskotonowy o rozszerzonym zasięgu (Rysunek 2D, 8 Ω/20 W) pod komorą wibracyjną za pomocą innego zestawu narożnych na dolnym bloku akrylowym. W tym momencie montowany jest indywidualny moduł wibracyjny.</li>
	<li>Odtwórz siedem dodatkowych modułów wibracyjnych. Przymocuj cztery z nich do jednej z dwóch stacjonarnych aluminiowych listew (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), umieszczając podstawy głośników w równomiernie rozmieszczonych okrągłych otworach (średnica: 7 cm, grubość: 2 cm) wyciętych w prętach. Ustabilizuj każdy głośnik, wkładając przez bok aluminiowego pręta do każdego okrągłego otworu.</li>
	<li>Indywidualnie steruj głośnikami za pomocą selektora głośników. Podłącz poszczególne głośniki do selektora, podłączając przewody do dodatnich i ujemnych wejść na korpusie głośnika, a następnie do odpowiednich wyjść na selektorze. Przełącznik głośników umożliwia sygnał z generatora funkcyjnego, po przejściu przez wzmacniacz mocy, do wszystkich ośmiu głośników jednocześnie (rysunek 2E).</li>
	<li>Umieść dwie matryce komor, selektor głośników i powiązaną elektronikę w obudowie chroniącej przed wilgocią. Umieść cały zespół w komercyjnym inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Przeprowadź główne (przez rurkę PVC klasy medycznej) łączącą moc amplifier i selektor głośników przez zespół filtra z tyłu inkubatora.</li>
</ol>
2. Wykonanie i charakterystyka rusztowań
<ol>
	<li>Granulki PCL rozpuścić w chloroformie w stężeniu 15% wag. Roztwór należy umieścić w strzykawce o pojemności 10 ml wypełnionej igłą o sile 21 g.</li>
	<li>Zablokować strzykawkę na programowalnej pompie strzykawkowej i ustawić natężenie przepływu na 1 ml/h.</li>
	<li>Umieść kolektor pokryty folią aluminiową naprzeciwko igły poziomo, zachowując odległość między końcówką igły a kolektorem wynoszącą ~18 cm.</li>
	<li>Zacisnąć dodatni zacisk krokodylkowy do środka igły, a zacisk krokodylkowy uziemiający do aluminiowego kolektora, a następnie ustawić napięcie na zasilaczu wysokiego napięcia na 15 kV. UWAGA: wysoka objętośćtage, zachowaj odległość od igły.</li>
	<li>Sekwencyjnie włączaj pompę strzykawkową i zasilacz; szybko oczyść/usuń resztki roztworu polimeru otaczającego końcówkę igły za pomocą suchego ręcznika papierowego, zanim uformują się stabilne strumienie włókien i stożek Taylora19.</li>
	<li>Pozwól, aby włókna zgromadziły się na kolektorze Al do grubości ~250-300 μm (~7 godzin w obecnych warunkach wirowania). Powstałe rusztowania należy przechowywać w eksykatorze próżniowym przez 1-2 dni w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika.</li>
	<li>Wyobraź sobie rusztowania, napylone złotem, za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, aby pokazać spójną morfologię włókien. 10</li>
</ol>
3. Montaż i charakterystyka bioreaktora
<ol>
	<li>Wybij cylindryczny krążek (średnica: 8 mm) czterema ramionami (długość: 2 mm) z maty PCL (rysunek 2A), najpierw używając stempla biopsyjnego o średnicy 12 mm, aby przeciąć zewnętrzną średnicę dysku. Następnie użyj drugiego stemple do biopsji o średnicy 8 mm, aby wykonać cztery nacięcia o długości 2 mm równomiernie rozmieszczone wokół okrągłego ostrza, aby naciąć miejsce, w którym mają zostać przecięte ramiona. Po nacięciu stemplem o średnicy 8 mm za pomocą ostrza skalpela odetnij krawędzie ramion na zewnątrz. Włóż rusztowanie w rowek membrany silikonowej za pomocą przedłużonych ramion (Wideo 1). Spłaszcz wstawione rusztowanie, delikatnie dociskając powierzchnię za pomocą pęsety z płaską główką.</li>
	<li>Przymocuj mały kawałek cienkiej folii aluminiowej (8 mm x 2 mm, kształt prostopadły, rysunek 2B) do rusztowania PCL, aby wspomóc odbicie laserowe.</li>
	<li>Zabezpiecz zmontowaną membranę silikonową/rusztowanie PCL (zgodnie z opisem w kroku 1.4) w komorze wibracyjnej. Dodaj 1,5 ml wody do komory, aby nawodnić rusztowanie PCL przed wibracjami.</li>
	<li>Za pomocą generatora funkcyjnego wprowadzić sygnały drgań (np. fale sinusoidalne 200 Hz o napięciu międzyszczytowym, Vpp, 0,1 V) do komory akrylowej typu sandwich. Użyj woltomierza, aby dokładnie zmierzyć napięcie na każdym wejściu głośnikowym. Uwaga: odczyt Vpp z generatora funkcyjnego będzie się różnił od ostatecznej objętościtage dostarczane do głośnika.</li>
	<li>Zamontuj jednopunktowy LDV i przymocuj światłowodową głowicę czujnika laserowego do statywu z głowicą obrotowo-uchylną. Ustaw głowicę czujnika pod takim kątem, aby była skierowana prostopadle do blatu. Podłącz głowicę czujnika LDV do modułu akwizycji danych za pomocą koncentrycznego, a następnie moduł do laptopa przez USB.</li>
	<li>Skoncentruj wiązkę lasera prostopadle w różnych z góry określonych punktach membrany silikonowej (Rysunek 2B i Rysunek 3).</li>
	<li>Korzystając z oprogramowania do akwizycji danych, zarejestruj przemieszczenie środkowej membrany. Kliknij "Ustawienia pozyskiwania" w menu "Opcje"; następnie zmień tryb pomiaru na "FFT". Następnie kliknij "Pomiar ciągły" na głównym pasku narzędzi, a następnie kliknij szczyt, który tworzy się przy wybranej częstotliwości (Rysunek 6D), aby zarejestrować przemieszczenie.</li>
	<li>Wykreślić normalne przemieszczenie błony środkowej (w0) jako funkcję względnego położenia w poprzek podłoża. Stwórz mapę kolorów 3D profilu wibracyjnego powierzchni za pomocą oprogramowania do analizy danych Origin 8.5.</li>
</ol>
4. Wibracyjna hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Podhodowla MSCs pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego w kolbach kultur tkankowych T150 przy początkowej gęstości wysiewu 4 000-5 000 komórek/cm2 w pożywce podtrzymującej MSC.</li>
	<li>Po 7-8 dniach hodowli komórkowej (do ~85% konfluencji), trypsynizuj komórki odczynnikiem dysocjacji komórek, takim jak akutaza, policz za pomocą hemocytometru, odwiruj (440 x g przez 5 min) i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżej pożywce konserwacyjnej MSC o stężeniu 4,5 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Zanurz rusztowanie PCL w 70% etanolu O/N. Po odparowaniu rozpuszczalnika należy wystawić obie strony rusztowania na działanie bakteriobójczego światła UV (254 nm) przez 5-8 minut.</li>
	<li>Zanurzyć rusztowanie PCL w roztworze fibronektyny o stężeniu 20 μg/ml w temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Włożyć rusztowanie pokryte fibronektyną do membrany silikonowej. Zmontuj bioreaktor zgodnie z opisem w kroku 1.</li>
	<li>Rozprowadzić 40 μl zawiesiny komórek równomiernie na zabezpieczonym rusztowaniu PCL. Pozwól ogniwom przyłączyć się na 1-1,5 godziny przed dodaniem dodatkowych 1,5 ml świeżego podłoża do komory wibracyjnej.</li>
	<li>Hodować rusztowanie PCL obciążone MSC statycznie przez 3 dni i odświeżyć pożywkę po zakończeniu hodowli statycznej.</li>
	<li>Nałóż wybrane reżimy drgań na konstrukty komórkowe. Uwaga: Na przykład ogniwa są poddawane wibracjom 1 godz. na 1 godz. wyłączonym (OF) przy 200 Hz z w0 ~40 μm przez 12 godzin dziennie przez okres do 7 dni. Konstrukty poddane stymulacji wibracyjnej są oznaczone jako próbki wibracyjne, a te hodowane statycznie w identycznych komorach wibracyjnych służą jako statyczne kontrole (Stat).</li>
</ol>
5. Oceny biologiczne
<ol>
	<li>Zebrać 200 μl pożywki do hodowli komórkowych z każdej komory co drugi dzień (dzień 1, 3, 5 i 7) i połączyć podwielokrotności z tej samej próbki (po 800 μl każda).</li>
	<li>Określ ilościowo komórkową produkcję metaloproteinazy macierzy-1 (MMP1) i HA, używając odpowiednio zestawu rozwojowego MMP1 ELISA i zestawu konkurencyjnego testu ELISA kwasu hialuronianowego, zgodnie z procedurą producenta. W międzyczasie oznacz produkcję rozpuszczalnego prekursora elastyny zgodnie z wcześniej opisaną procedurą ELISA. 8</li>
	<li>Po zakończeniu ostatniego cyklu wibracyjnego w 7 dniu, szybko usuń konstrukty komórkowe z komór wibracyjnych za pomocą ostrej pęsety i krótko przepłucz je zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS, 4 °C).</li>
	<li>W przypadku barwienia żywych/martwych należy inkubować konstrukty z jodkiem propidyny (1:2,000 w PBS) i Syto-13 (1:1,000 w PBS) jednocześnie przez 5 minut w RT. Zobrazuj barwione konstrukty za pomocą wielofotonowego mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Oddzielnie zamroź wypłukane PBS konstrukty komórkowe na suchym lodzie i wyekstrahuj całkowite komórkowe RNA zgodnie z wcześniej opisanym protokołem analizy genów. 9</li>
	<li>Sprawdzić ilość i jakość wyekstrahowanego RNA za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Próbki RNA o proporcjach A260/A280 i A260/A230 wynoszących 1,8-2,2 są wykorzystywane do późniejszej analizy qPCR.</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja RNA (500 ng / próbkę) na cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do odwrotnej transkrypcji.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję PCR w systemie wykrywania sekwencji w czasie rzeczywistym przy użyciu dostępnej na rynku głównej mieszanki PCR, postępując zgodnie z poprzednio szczegółową procedurą. 8</li>
	<li>Analizuj wyniki qPCR za pomocą komercyjnego oprogramowania do analizy danych qPCR. Aby zapewnić wiarygodność analizy danych, jako kontrole wewnętrzne stosuje się wiele genów referencyjnych (YWHAZ, TBP, PPIA) i uwzględnia się wariancję określonych wydajności starterów. 8</li>
</ol>

<ol><li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical-Stress+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Mechanical-Stress in Phonation.</a> J. Voice. 8, 99-105 (1994).</li>
<li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Relation+Between+Subglottal+Pressure+and+Fundamental-Frequency+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation.</a> J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).</li>
<li>Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+the+vocal+folds%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of the vocal folds.</a> Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).</li>
<li>Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+and+rheologic+characterization+of+vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring.</a> J. Voice. 16, 96-104 (2002).</li>
<li>Hansen, J. K., Thibeault, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+and+review+of+the+literature%3A+Vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring.</a> J. Voice. 20, 110-120 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Hanson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Mesenchymal+Stem+Cells+From+Human+Vocal+Fold+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts.</a> Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).</li>
<li>Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+behaviors+of+mesenchymal+stem+cells+via+the+combination+of+high-frequency+vibratory+stimulations+and+fibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds.</a> Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).</li>
<li>Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+Fibroblastic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Via+the+Combination+of+Fibrous+Scaffolds+and+Connective+Tissue+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).</li>
<li>Jones, D. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+place+like+home%3A+anatomy+and+function+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">No place like home: anatomy and function of the stem cell niche.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).</li>
<li>Wang, J. H., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+Adult+and+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+of+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of Adult and Stem Cells.</a> Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).</li>
<li>Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+tensile+culture+promotes+fibroblastic+differentiation+of+marrow+stromal+cells+encapsulated+in+poly+%28ethylene+glycol%29-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).</li>
<li>Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+regulates+the+development+of+engineered+smooth+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).</li>
<li>Webb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+increases+fibroblast+proliferation%2C+matrix+accumulation%2C+and+elastic+modulus+of+fibroblast-seeded+polyurethane+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs.</a> J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Regulation+of+Cartilage+Biosynthetic+Behavior+-+Physical+Stimuli.%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli.</a> Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration+stimulates+vocal+mucosa-like+matrix+expression+by+hydrogel-encapsulated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).</li>
<li>Farran, A. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Characterization+of+a+Dynamic+Vibrational+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).</li>
<li>Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speaking+Fundamental-Frequency+Characteristics+as+a+Function+of+Age+and+Professional%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional.</a> J. Voice. 5, 310-315 (1991).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanotransduction%3A+putting+all+the+pieces+together+again%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again.</a> Faseb J. 20, 811-827 (2006).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Moore, J., Thibeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+Into+the+Role+of+Elastin+in+Vocal+Fold+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease.</a> J. Voice. 26, 269-275 (2012).</li>
<li>Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+protein+alterations+in+rabbit+vocal+fold+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar.</a> J. Voice. 17, 377-383 (2003).</li>
<li>Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+fold+wound+healing%3A+A+review+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Vocal fold wound healing: A review for clinicians.</a> J. Voice. 20, 432-442 (2006).</li>
<li>Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+B%22%5BJournal%5D)">The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).</li>
<li>Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+the+vessel+wall%3A+The+role+of+collagen+and+elastic+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers.</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+Therapies+for+the+Vocal+Fold+Lamina+Propria%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B%3A+Rev%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria.</a> Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).</li>
</ol>

Nie istnieją konkurencyjne interesy finansowe.

Skuteczna inżynieria funkcjonalnych tkanek fałdów głosowych in vitro wymaga odtworzenia mikrośrodowiska przypominającego fałd głosowy, które pośredniczyłoby w zachowaniu komórek multipotencjalnych. Ogólnie przyjmuje się, że struktury tkanek lub narządów odzwierciedlają funkcje, do których są wymagane. 22 W przypadku tkanek fałdów głosowych sugeruje się, że drgania o wysokiej częstotliwości, które występują podczas fonacji, mają istotne znaczenie dla dojrzewania tkanek. W naszym badaniu rusztowania PCL...

Ludzki fałd głosowy, składający się z warstwy nabłonkowej, blaszki właściwej (LP) i mięśnia wokalnego, jest wyspecjalizowaną tkanką miękką, która przekształca przepływ powietrza z płuc w fale akustyczne do produkcji dźwięku. 1 Fałdy głosowe oscylują regularnie podczas normalnej fonacji, wykazując napięcia do 30% przy podstawowych częstotliwościach w zakresie 100-300 Hz.2 Dorosłe fałdy głosowe LP to struktura gradientowa składająca się z warstwy powierzchownej (SLP), pośredniej (ILP) i głębokiej (DLP). Dalsza klasyfikacja grupuje nabłonek i SLP jako warstwę błony śluzowej i łączy ILP i DLP w więzadło głosowe. 3 Warstwa SLP zawiera przede wszystkim amorficzną matrycę ze słabo rozproszonymi włóknami kolagenowymi, podczas gdy więzadło jest wzbogacone o dojrzałe włókna kolagenowe i elastynowe, aby zapewnić wystarczającą wytrzymałość. 4 Budowa i mechanika noworodków różnią się znacznie od ich dojrzałych odpowiedników. Chociaż mechanizmy regulujące rozwój i dojrzewanie fałdów głosowych nie są jeszcze w pełni poznane, dowody eksperymentalne wskazują na definiującą rolę stresu mechanicznego pochodzącego z wokalizacji.
Kilka schorzeń, w tym nadużywanie głosu, infekcje, chemiczne czynniki drażniące i zabiegi chirurgiczne, mogą uszkodzić fałd głosowy. Zaburzenia fałdów głosowych dotykają około 3-9% populacji USA. Obecne metody leczenia zaburzeń fałdów głosowych są ograniczone5, a podejście oparte na inżynierii tkankowej oparte na komórkach macierzystych okazało się obiecującą strategią przywracania funkcji fałdów głosowych. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są odpowiednią alternatywą dla pierwotnych fibroblastów fałdów głosowych w inżynierii tkankowej fałdów głosowych. 6-9 Specyfikacja losu komórek macierzystych i późniejszy rozwój tkanek są zapośredniczone przez specyficzną niszę, w której się znajdują, której stan mechaniczny jest istotnym czynnikiem. 10 Siły mechaniczne są niezbędnymi regulatorami morfogenezy i homeostazy tkanek, zwłaszcza w przypadku tkanek, które są rutynowo poddawane obciążeniu. 11 Z punktu widzenia inżynierii tkankowej wykazano, że narażenie na fizjologicznie istotne bodźce mechaniczne sprzyja różnicowaniu komórek macierzystych i specyficznej tkankowo przebudowie macierzy. 12-15
Bioreaktory do hodowli tkankowych są zaprojektowane tak, aby symulować pożądane środowisko fizjologiczne dla wzrostu komórek lub tkanek in vitro. W przypadku inżynierii tkankowej fałdów głosowych szczególnie ważne jest odtworzenie mechanicznego środowiska fonujących fałdów głosowych. Idealny bioreaktor fałdów głosowych powinien skutecznie dostarczać sygnały wibracyjne do komórek hodowlanych, umożliwiając łatwą kontrolę częstotliwości, amplitudy i czasu trwania wibracji. Titze i jego współpracownicy opracowali bioreaktor fałdów głosowych (bioreaktor T1)16, który łączy rozciąganie statyczne z oscylacjami o wysokiej częstotliwości (20-200 Hz) w celu stymulowania komórkowej produkcji białek macierzy. Korzystając z tego bioreaktora, Webbi jego współpracownicy badali wpływ 10-dniowych wibracji o częstotliwości 100 Hz na fibroblasty skóry hodowane w hydrożelu na bazie kwasu hialuronowego (HA). Konstrukty poddane wibracjom wykazywały podwyższoną ekspresję syntazy HA-2 (HAS2), dekoryny, fibromoduliny i metaloproteinazy macierzy-1 (MMP1) w stosunku do kontroli statycznych. Stwierdzono, że efekty stymulujące są zależne od czasu. Niedawno nasza grupa18 zmontowała bioreaktor fałdowania głosowego (bioreaktor J1) przy użyciu wzmacniacza mocy, generatora funkcyjnego, zamkniętego głośnika i zakotwiczonej obwodowo membrany silikonowej, która przenosi oscylujące powietrze do dołączonych komórek. Fibroblasty napletka noworodków hodowane w bioreaktorze J1 poddano 1 godzinnym wibracjom o częstotliwości 60, 110 lub 300 Hz, z naprężeniem w płaszczyźnie do 0,05%. Wyniki qPCR sugerowały, że ekspresja niektórych genów ECM była umiarkowanie zmieniona w odpowiedzi na różne częstotliwości i amplitudy drgań.
Te projekty bioreaktorów, choć intrygujące, mają kilka ograniczeń. Na przykład system T1 wymaga dużej liczby złączy i prętów do sprzęgania mechanicznego, co ogranicza maksymalne osiągalne częstotliwości. Ponadto komórki mogą być poddawane niepożądanym mieszaniom mechanicznym i zaburzeniom płynów, które komplikują interpretację danych. Z kolei bioreaktor J1 wykazuje stosunkowo niską sprawność konwersji energii i nie jest przyjazny dla użytkownika. Ponadto wibracje często odrywają konstrukcje wypełnione komórkami od leżącej pod spodem membrany silikonowej. Opisywany tutaj bioreaktor fałdowania głosowego J2, zaprojektowany w oparciu o tę samą zasadę, co wersja J1, jest zoptymalizowany pod kątem spójności i odtwarzalności. Drgania naśladujące fonację są generowane aerodynamicznie w indywidualnie dopasowanych komorach wibracyjnych, w których skutecznie zabezpieczone są rusztowania włókniste z poli(ε-kaprolaktonu) (PCL) wypełnione przez MSC. Laserowa wibrometria dopplerowska (LDV) pozwala użytkownikowi zweryfikować profil wibracyjny zespołu membrana/rusztowanie. W naszej demonstracji MSC są narażone na drgania sinusoidalne o częstotliwości 200 Hz z wzorcem 1 godz. na 1 godz. przerwy (OF), co daje łącznie 12 godzin dziennie przez 7 dni. Reakcje komórkowe na narzucone sygnały wibracyjne są badane systematycznie. Ogólnie rzecz biorąc, fałd głosowy J2 zapewnia najbardziej przyjazne dla użytkownika funkcje, umożliwiając prowadzenie dynamicznych badań nad kulturami komórkowymi w sposób wysokowydajny i powtarzalny.

<table><tbody><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Utwardź membranę w temperaturze 100 &#176; C dla 2 godzin</td></tr><tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~80 kDa, rozpuść O/N</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>MSCs pochodzące z ludzkiego szpiku kostnego</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Otrzymany z pasażem 2</td></tr><tr><td>Pożywki konserwacyjne MSC</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>10% FBS w pożywce podstawowej uzupełnione L-glutaminą, gentamycyną i amfoterycyną</td></tr><tr><td>Odczynnik do dysocjacji komórek Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet Zestaw ELISA</td><td>R& Systemy D</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA Zestaw ELISA</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&nbsp; K-1200&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidyny&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp;</td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji <td>Life Technologies</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master mix</td><td>Life Technologies</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Głośnik zamienny</td><td>DAYTON audio (przez Parts Express)</td><td>DS90-8</td><td>Stożek papierowy, pełny zakres (80-13,000 Hz), 85 dB</td></tr><tr><td>Wkrętak dynamometryczny Ergo Micro</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>Zakres momentu obrotowego: 20-120 cN&#183; </td></tr><tr><td>m Selektor głośników stereo</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>Maksymalna moc wyjściowa 50 W</td></tr><tr><td>Generator funkcyjny&nbsp;</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>33220A</td><td>Zakres częstotliwości 1 i mikro; Hz-20 MHz</td></tr><tr><td>Wzmacniacz mocy&nbsp;</td><td>PYLE audio</td><td>PylePro PT2400</td><td>Pasmo przenoszenia: 10 Hz-50 kHz, dwa kanały głośnikowe </td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa&nbsp;</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz wysokonapięciowy</td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>Napięcie wyjściowe: 0-30 kV</td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy&nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>Biurko do napylania złotego</td><td>Denton Vacuum</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>Wibrometr laserowy Doppler&nbsp;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>Bezkontaktowy pomiar prędkości (0-22 kHz)</td></tr><tr><td>System detekcji sekwencji PCR&nbsp;</td><td></td><td>ABI7300Wielofotonowy</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss Zeiss</td><td>510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spektrofotometr</td> Zeiss 510Meta&nbsp;<td>Produkty NanoDrop za pośrednictwem oprogramowania do</td> akwizycji danych Thermo Scientific <td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>VibSoft</td><td>Polytec</td><td></td><td>Pasmo akwizycji do 40 MHz</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych Origin 8.5&nbsp;</td><td>Oprogramowanie do analizy danych OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qbasePlus qPCR&nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>Stop aluminium&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td>Alloy 6061</td><td></td></tr><tr><td>Bloki akrylowe</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliwęglanowa komora przeciwwilgociowa</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>Odporna na uderzenia&nbsp; Wkręty z poliwęglanu</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroniczny / drut</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki PVC klasy medycznej</td><td>US Plastic Corp.</td><td>Tygon S-50-HL</td><td>Clear, biokompatybilna</td></tr><tr><td>strzykawka 10 ml&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G Igła z zakończeniem</td><td>Małe części</td><td>NE-213PL-25</td> Adaptery zacisków krokodylkowych <td>o długości 1-1 / 2 "</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td>W pełni izolowany</td></tr><tr><td>dziurkacz do biopsji 8 mm</td><td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx? IDDZIAŁ=10& CategoryID=96">Sklar&nbsp; Instrumenty chirurgiczne</a></td><td>96-1152</td><td>Sterylny, jednorazowy</td></tr><tr><td>stemple do biopsji 12 mm</td><td>Acuderm (przez Fisher Scientific)</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych</td><td>Hodowla komórek Corning</td><td></td><td>Poddana zabiegowi</td></tr></tbody></table>

budowa i charakterystyka nowego bioreaktora fałdów głosowych

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Inżynieria in vitro tkanek aktywnych mechanicznie wymaga przedstawienia fizjologicznie istotnych warunków mechanicznych hodowanym komórkom. Aby naśladować dynamiczne środowisko fałdów głosowych, skonstruowano i scharakteryzowano nowatorski bioreaktor fałdów głosowych zdolny do wytwarzania stymulacji wibracyjnych przy podstawowych częstotliwościach fonacji. Urządzenie składa się z generatora funkcyjnego, wzmacniacza mocy, selektora głośników i równoległych komór wibracyjnych. Indywidualne komory wibracyjne są tworzone poprzez umieszczenie specjalnie wykonanej membrany silikonowej pomiędzy parą bloków akrylowych. Membrana silikonowa służy nie tylko jako dno komory, ale także zapewnia mechanizm zabezpieczający rusztowanie obciążone komórkami. Sygnały wibracyjne, generowane przez głośnik zamontowany pod dolnym blokiem akrylowym, są przenoszone do membrany aerodynamicznie przez oscylujące powietrze. Osiem identycznych modułów wibracyjnych, zamocowanych na dwóch nieruchomych metalowych prętach, jest umieszczonych w komorze przeciwwilgociowej do długotrwałej pracy w inkubatorze do hodowli komórkowych. Charakterystyka drgań bioreaktora fałdów głosowych jest analizowana nieniszcząco za pomocą laserowego wibrometru dopplerowskiego (LDV). Użyteczność urządzenia do hodowli dynamicznej wykazano poprzez hodowlę konstruktów komórkowych w obecności drgań sinusoidalnych 200 Hz z przemieszczeniem błony środkowej 40 μm. Mezenchymalne komórki macierzyste hodowane w bioreaktorze reagują na sygnały wibracyjne, zmieniając syntezę i degradację istotnych dla fałdów głosowych składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Prezentowany w niniejszym artykule nowatorski system bioreaktorów stanowi doskonałą platformę in vitro do badania mechanotransdukcji indukowanej drganiami oraz do inżynierii funkcjonalnych tkanek fałdów głosowych.

Rusztowania z PCL wykonane metodą elektroprzędzenia zawierają porowe przestrzenie międzywłókniste o rozmiarach mikronowych oraz losowo splątane włókna o średniej średnicy 4,7 µm (Rysunek 4A). Przy większym powiększeniu na pojedynczych włóknach widoczne są nanometrowe rowki i pory (Rysunek 4B). Pokrycie rusztowań fibronektyną poprawia hydrofilowość i ułatwia początkową adhezję oraz rozprzestrzenianie się komórek na rusztowaniu z PCL (niepublikowana obserwacja).
<p class="jove_content"...

Skonstruowano i scharakteryzowano nowatorski bioreaktor fałdowania głosowego, zdolny do dostarczania fizjologicznie istotnej, wibracyjnej stymulacji do hodowanych komórek. To dynamiczne urządzenie do hodowli, w połączeniu z włóknistym rusztowaniem poli(ε-kaprolaktonu), tworzy środowisko wokalno-mimetyczne, które moduluje zachowanie mezenchymalnych komórek macierzystych.

Budowa i charakterystyka nowego bioreaktora fałdów głosowych

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie wpływu stymulacji wibracyjnej na mezenchymalne komórki macierzyste z wykorzystaniem bioreaktora zaprojektowanego do emulacji fonacji. Osiąga się to poprzez stworzenie rusztowań z poli epsilon-kaprolaktonu, które zapewniają trójwymiarowy podłoże dla kultur komórkowych, podobne do więzadła głosowego. W drugim kroku rusztowania są wbudowywane w membrany silikonowe, które ułatwiają przekazywanie oscylacji do konstruktów komórkowych.Następnie wykorzystuje się laserową wibrometrię dopplerowską w celu określenia charakterystyki wibracyjnej każdej kombinacji błony i rusztowania. Ostatecznie można przeprowadzić analizy EISA oraz ilościowe R-T-P-C-R, aby ocenić odpowiedzi komórkowe na poziomie białkowym i translacyjnym. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie laryngologii, takie jak proces dojrzewania fałdów głosowych oraz konsekwencje niewłaściwego użytkowania głosu.Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla leczenia schorzeń fałdów głosowych ze względu na poziom kontroli komórkowej, który jest obecnie możliwy przy użyciu tej metody do wytwarzania rusztowania. Najpierw rozpuścić granulki PCL w chloroformie w stężeniu 15% wagowych. Następnie wprowadzić otrzymany roztwór do strzykawki o pojemności 10 ml z założoną igłą tępą o rozmiarze 21 G. Zamocować strzykawkę w programowalnej pompie strzykawkowej i ustawić szybkość przepływu na 1 ml na godzinę.Następnie umieść poziomo kolektor pokryty folią aluminiową naprzeciwko igły, w odległości około 18 centymetrów od jej końcówki. Dalej, przymocuj dodatni zacisk typu „krokodylk” do środkowej części igły, a zacisk uziemi do kolektora. Ustaw napięcie w wysokiego napięcia zasilaczu na 15 kilowoltów, dbając o zachowanie bezpiecznej odległości od igły.Następnie włącz pompę strzykawkową oraz zasilacz. Użyj suchego ręcznika papierowego, aby szybko usunąć pozostałości roztworu polimeru wokół końcówki igły, zanim uformuje się stabilny strumień włókien i stożek Taylora. Pozostaw włókna do osadzenia się na aluminiowym kolektorze przez około siedem godzin, aż do uzyskania grubości od 250 do 300 µm, a następnie przechowuj otrzymane rusztowania w sucharce próżniowej przez jeden lub dwa dni w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika. Rusztowania z PCL będą zawierać porowatość śródmiąższową w skali mikronowej oraz losowo splątane włókna o średniej średnicy około 4,7 µm.Przy większym powiększeniu na poszczególnych włóknach widoczne będą nanostrukturalne rowki i pory służące do montażu bioreaktora. Należy rozpocząć od użycia wykrojnika do biopsji o średnicy 12 milimetrów, aby wyciąć zewnętrzną średnicę okrągłego dysku o średnicy ośmiu milimetrów z niedawno przędzonej maty PCL. Następnie należy użyć drugiego wykrojnika do biopsji o średnicy ośmiu milimetrów, aby zaznaczyć miejsca przecięcia ramion.Po nacięciu, za pomocą ostrza skalpela przetnij krawędzie ramion na zewnątrz i wprowadź rusztowanie do rowka membrany silikonowej przez rozszerzone ramiona. Wyrównaj wprowadzone rusztowanie, delikatnie dociskając powierzchnię płaskimi pęsetami, a następnie przymocuj kawałek cienkiej folii aluminiowej o wymiarach 8 mm na 2 mm do rusztowania z PCL. Aby wspomóc odbicie lasera, zamocuj zmontowaną membranę silikonową z rusztowaniem z PCL w komorze wibracyjnej.Następnie umieść membranę silikonową pomiędzy sparowanymi blokami akrylowymi. Zabezpiecz zespół za pomocą czterech śrub narożnych, używając mikrośrubokręta dynamometrycznego ustawionego na stałą siłę 35 cNm, tworząc wodoszczelną komorę wibracyjną o szerokości 24 mm i głębokości 18 mm. Następnie zamontuj trzystopowy mini-woofer o rozszerzonym zakresie pod komorą wibracyjną, wykorzystując kolejny zestaw śrub narożnych w dolnym bloku akrylowym, co kończy montaż pojedynczego modułu wibracyjnego.Po powieleniu siedmiu dodatkowych modułów wibracyjnych, przymocuj cztery z nich do jednego z dwóch stacjonarnych aluminiowych prętów, umieszczając podstawy głośników w rozmieszczonych równomiernie okrągłych otworach. W prętach wykonaj nacięcia, a następnie ustabilizuj każdy głośnik, wkręcając śrubę z boku aluminiowego pręta do każdego okrągłego otworu. Następnie podłącz poszczególne głośniki do przełącznika, mocując przewody do wejść dodatnich i ujemnych na obudowie głośnika oraz do odpowiadających im wyjść w przełączniku.Przełącznik głośników umożliwia przekazanie sygnału z generatora funkcji, po przejściu przez wzmacniacz mocy, do wszystkich ośmiu głośników jednocześnie. Następnie umieść dwie macierze komór, przełącznik głośników oraz powiązaną elektronikę w obudowie chroniącej przed wilgocią, a następnie umieść cały zestaw w komercyjnym inkubatorze do hodowli komórkowych. Przewieź główne kable przez odcinek rurki z PVC klasy medycznej i podłącz wzmacniacz mocy oraz przełącznik głośników przez zespół filtrów z tyłu inkubatora.Aby najpierw scharakteryzować bioreaktor, należy wlać 1,5 ml wody do komory wibracyjnej w celu nawodnienia rusztowania z PCL przed rozpoczęciem wibracji. Następnie, korzystając z generatora funkcji, należy wprowadzić sygnały wibracyjne do warstwowej komory akrylowej. Należy precyzyjnie posługiwać się woltomierzem.Zmierz napięcie na każdym wejściu głośnika, a następnie zmontuj jednopunktowy laserowy wibrometr dopplerowski. Zamocuj światłowodowy czujnik laserowy. Ustaw statyw z głowicą typu pan-tilt i skieruj głowicę czujnika tak, aby była prostopadła do blatu stołu.Następnie podłącz głowicę czujnika do modułu akwizycji danych za pomocą kabla koncentrycznego, a moduł do laptopa przez port USB. Skoncentruj wiązkę lasera prostopadle na różnych, wcześniej wyznaczonych punktach membrany silikonowej, a następnie w oprogramowaniu do akwizycji danych wybierz ustawienia akwizycji z menu opcji. Następnie zmień tryb pomiaru na FFT, a potem kliknij narzędzie pomiaru ciągłego na głównym pasku narzędzi.Kliknij pik, który powstaje przy wybranej częstotliwości, aby zarejestrować przemieszczenie i wykreślić normalne przemieszczenie środka błony w funkcji względnej pozycji w poprzek podłoża. Aby przygotować wibracyjną hodowlę komórkową, najpierw przeprowadź pasaż mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego w kolbach do hodowli tkankowej T150 przy początkowej gęstości wysiewu od 4 do 5 × 10³ komórek/cm² w pożywce utrzymującej przez 7 do 8 dni. W dniu poprzedzającym eksperyment zanurz rusztowanie PCL w 70% etanolu na noc.Następnego ranka odspojone komórki za pomocą Accutane, a następnie odwiruj je i resuspenduj osad w świeżej pożywce utrzymującej do stężenia 4,5 × 10⁶ komórek/ml. Po odparowaniu etanolu naświetl obie strony rusztowania bakteriobójczym światłem UV przez 5–8 minut. Następnie namocz rusztowanie PCL w roztworze fibronektyny o stężeniu 20 µg/ml w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Bioreaktor w sposób właśnie zademonstrowany, a następnie równomiernie rozprowadź 40 µL zawiesiny komórkowej na zabezpieczonym rusztowaniu. Pozostaw komórki do przytwierdzenia na czas od 1 do 1,5 godziny, a następnie dodaj kolejne 1,5 mL świeżej pożywki do komory wibracyjnej. Po statycznej hodowli rusztowania PCL z zadanymi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi przez trzy dni, wymień pożywkę, a następnie zastosuj wybrane schematy wibracji w odniesieniu do konstruktów komórkowych.Częstotliwości wibracji dobrano tak, aby odzwierciedlały one podstawowe częstotliwości mowy ludzkiej; w zakresie od 0 do 0,125 V występuje liniowa zależność między przemieszczeniem normalnym a szczytowym napięciem tope. Dla wszystkich badanych częstotliwości przy danym szczytowym napięciu tope przemieszczenie normalne maleje wraz ze wzrostem częstotliwości od 100 do 300 Hz. Reakcje komórkowe na stymulację wibracyjną, badane na poziomie mRNA pod kątem ekspresji kluczowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej fałdów głosowych, takich jak elastyna, syntaza hialuronianowa 1, kolagen typu III alpha 1 oraz metaloproteinaza macierzy 1, wykazują, że cykliczna wibracja w trybie jedna godzina włączone / jedna godzina wyłączone prowadzi do 2,3-krotnego wzrostu ekspresji elastyny w stosunku do kontroli statycznej.W siódmym dniu stymulacja wibracyjna powoduje również umiarkowany wzrost ekspresji kolagenu. Warto zauważyć, że ekspresja głównych enzymów przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej, syntazy hialuronianu 1 oraz metaloproteinazy macierzy 1, jest znacznie zwiększona pod wpływem sygnałów wibracyjnych od trzeciego do siódmego dnia. Komórki hodowane dynamicznie produkują 4,2 ± 0,1 µg/mg suchej masy rusztowania rozpuszczalnej elastyny, co wykryto metodą Elisa po siedmiu dniach wibracji.Podczas gdy kontrole statyczne akumulują jedynie 2,7 ± 0,2 µg na mg elastyny. Średnio siedmiodniowe wibracje w cyklu jednej godziny pracy i jednej godziny przerwy skutkują odpowiednio 2,2- i 4,7-krotnym wzrostem wydzielania kwasu hialuronowego oraz MMP1 w stosunku do odpowiednich kontroli statycznych. Chociaż nasz system został zaprojektowany do badania fizjologii VOCO form, może on zostać zastosowany również w wielu innych układach.Na przykład tkanki ucha i ludzkiej skóry. Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.

construction-and-characterization-of-a-novel-vocal-fold-bioreactor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano metodologię wytwarzania syntetycznych modeli fałdów głosowych. Modele mają rzeczywistą wielkość i naśladują wielowarstwową strukturę ludzkich fałdów głosowych. Wyniki pokazują, że modele wykazują samopodtrzymujące się oscylacje przy ciśnieniach porównywalnych z ciśnieniem płuc oraz wykazują odpowiedzi wibracyjne indukowane przepływem, podobne do tych występujących w ludzkich fałdach głosowych.

Wytwarzanie syntetycznego, wielowarstwowego, samowzbudnego modelu fałdów głosowych

Opisano rotujący system hodowli komórkowej, który umożliwia wzrost komórek nabłonkowych w warunkach fizjologicznych, co prowadzi do tworzenia trójwymiarowych agregatów komórkowych. Powstałe agregaty wykazują cechy podobne do tych obserwowanych in vivo, których nie stwierdzono w konwencjonalnych modelach hodowli, i służą jako dokładniejszy organotypowy system modelowy dla wielu badań naukowych.

Hodowla i zastosowania trójwymiarowych modeli komórek nabłonkowych otrzymywanych w bioreaktorze z rotującą ścianką (Rotating Wall Vessel)

Polipy fałdów głosowych mogą zakłócać dynamikę fałdów głosowych, a tym samym mogą mieć katastrofalne konsekwencje dla zdolności pacjenta do komunikowania się. Trójwymiarowa separacja przepływu indukowana przez naścienny polip modelowy i jego wpływ na obciążenie ciśnieniowe ściany jest badana za pomocą prędkości obrazu cząstek, wizualizacji linii tarcia skóry i pomiarów ciśnienia w ścianie.

Badanie trójwymiarowej separacji przepływu indukowanej przez modelowy polip fałdu głosowego

Funkcjonalne zachowanie komórek w hodowli można poprawić poprzez hodowlę w bardziej podobnych do in vivo 3-wymiarowych środowiskach hodowli16-21. Niniejszy manuskrypt opisuje konfigurację i działanie systemu bioreaktora z pustymi włóknami do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo.

Bioreaktory z pustych włókien do hodowli tkanek ssaków podobnych do in vivo

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

To badanie demonstruje produkcję modeli nielepiących się i super miękkich fałdów głosowych poprzez wprowadzenie specyficznego sposobu tworzenia warstw fałdów głosowych, dostarczając szczegółowego opisu procedury produkcyjnej i charakteryzując właściwości modeli.

Proces produkcji nieprzywierających modeli super-miękkich fałdów głosowych

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Fermentory są używane do zwiększania wydajności hodowli i produktywności komórek bioinżynieryjnych.  Po przesiewie wielu kandydatów na hodowle mikrobiologiczne lub komórki zwierzęce w kolbach wstrząsowych, następnym logicznym krokiem jest zwiększenie biomasy wybranej kultury za pomocą fermentora. Ten film pokazuje konfigurację i działanie typowego systemu bioreaktora laboratoryjnego.

Działanie bioreaktora laboratoryjnego

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Poznaj budowę nowego bioreaktora fałdów głosowych do badania wpływu stymulacji wibracyjnej na komórki macierzyste mezenchymalne. Ta metoda pozwala analizować odpowiedzi komórkowe na poziomie białek i translacji.

Budowa i charakterystyka nowego bioreaktora fałdów głosowych

Przeglądaj więcej filmów