4.10: Genotypowanie myszy

Genotypowanie to proces wykrywania obecności lub braku określonych sekwencji DNA w genomie danego organizmu.

Ponieważ geny mogą wpływać na fenotyp myszy, będąc w stanie zbadać skład genetyczny pojedynczej myszy lub ?genotyp,? ma kluczowe znaczenie dla przypisania fenotypu określonemu genowi. W tym filmie przyjrzymy się genetyce myszy, zademonstrujemy kluczowe etapy procedury genotypowania i wyjaśnimy, jak interpretować wyniki genotypowania opartego na PCR.

Aby zrozumieć, czego szukają naukowcy podczas genotypowania myszy, przyjrzyjmy się kilku powszechnym manipulacjom genetyki myszy.

Aby zbadać gen, naukowcy często zakłócają jego funkcję, zmieniając jego sekwencję genetyczną. Jednak myszy są diploidalne, więc mają dwie kopie dowolnego genu. Ponieważ większość genów potrzebuje tylko jednej normalnej kopii do funkcjonowania, myszy muszą być hodowane, aby wyprodukować zwierzę z zaburzonymi obydwoma genami przed badaniem fenotypu.

Ten genotyp nazywa się ?homozygotycznym nokautem'. A częściej po prostu ?nokaut? w skrócie. I odwrotnie, normalna mysz z dwiema funkcjonalnymi kopiami nazywana jest ?homozygotycznym typem dzikim. czy po prostu ?wildtype.? Wreszcie, myszy z tylko jedną funkcjonalną kopią są określane jako "heterozygotyczne". lub ?hets.?

Zamiast usuwać materiał genetyczny, niektóre eksperymenty wymagają wprowadzenia sekwencji DNA do genomu myszy. Te wstawione fragmenty DNA nazywane są "transgenami". A myszy, które je noszą, są ?transgeniczne'. Najczęstszy ?transgen? wprowadzony do myszy to taki, który napędza ekspresję białka zielonej fluorescencji lub GFP z meduz. Dzięki zastosowaniu swoistego tkankowo promotora (sekwencji regulatorowej, która "promuje" aktywność genu) do napędzania produkcji GFP, komórki z określonego typu tkanki można łatwo zidentyfikować za pomocą zielonej fluorescencji.

Ponieważ wiele zmian genetycznych nie prowadzi do łatwo obserwowalnego fenotypu, takiego jak ekspresja GFP, myszy muszą być genotypowane, aby określić, które konkretne zwierzę powinno być wykorzystane w eksperymentach. Przed genotypowaniem myszy powinny być starannie oznakowane, aby można je było później ponownie zidentyfikować. Nie, będziesz potrzebować czegoś bardziej trwałego. Jedną z powszechnych metod jest wykonanie nacięć w uchu, tak aby pozycja i liczba nacięć odpowiadały numerowi identyfikacyjnemu.

Po oznaczeniu myszy zbierz mały kawałek tkanki (zwykle 2 ? 5 mm ogona, używając żyletki lub nożyczek), z którego chcesz wyekstrahować DNA. Jeśli pobierasz tkankę od więcej niż jednej myszy, zaznacz używane segmenty ostrza, aby upewnić się, że nie użyjesz tej samej części na następnym zwierzęciu, co może prowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego próbek.

Aby rozpocząć proces oddzielania materiału genetycznego od innych składników tkanki, próbka jest trawiona w buforze do lizy zawierającym enzym proteinazę K. Po całonocnym trawieniu próbka jest odwirowywana w celu osadzenia włosów i innego niestrawionego materiału. Aby wyizolować DNA z strawionego lizatu, prostą i skuteczną metodą jest dodanie alkoholu w celu wytrącenia kwasów nukleinowych. Po krótkiej inkubacji próbka jest ponownie odwirowywana w celu zebrania DNA w postaci osadu.

Po umyciu 70% etanolem w celu usunięcia nadmiaru soli, osad DNA jest ponownie zawieszany w wodzie lub buforze i jest gotowy do genotypowania.

Istnieje wiele strategii określania, czy określona sekwencja DNA jest obecna u twoich myszy. Większość z nich wymaga uprzedniego amplifikacji interesującego regionu genetycznego za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR. Aby uzyskać więcej informacji na temat tego, jak skonfigurować PCR, zapoznaj się z JoVE Science Education ? Przewodnik po PCR.?

Jedną z metod rozróżniania genotypów jest wykrywanie zmian w wielkości fragmentu amplifikowanego PCR. Załóżmy, że przeprowadzasz badania przesiewowe myszy z insercją genetyczną 700 par zasad. Po PCR prążki typu dzikiego mają 200 par zasad, a prążki transgenowe powinny mieć 900 par zasad.

Po przeprowadzeniu PCR oddziel produkty reakcji na odpowiednim procentowym żelu agarozowym, aby można było rozróżnić rozmiary swoich fragmentów. Kontrolka typu dzikiego powinna mieć tylko pasmo 200 par zasad typu dzikiego; Kontrola transgeniczna powinna mieć tylko jedną 900 parę zasad, pasmo transgenu; a het control powinien mieć oba pasma. Na koniec ?brak szablonu? kontrola jest dołączona, aby upewnić się, że odczynniki nie zawierają żadnego zanieczyszczającego DNA, a zatem nie powinny generować żadnych prążków.

Teraz, gdy mamy pewność, że kontrolki działały zgodnie z oczekiwaniami, sprawdźmy nieznane myszy. Ponieważ myszy 1 i 2 mają tylko jeden prążek typu dzikiego, są homozygotyczne typu dzikiego. Myszy 4 i 6 mają tylko jedną prążek transgenową, a zatem są homozygotyczne transgeniczne.

A myszy 3 i 5 mają po dwa pasma, a zatem są hetami.

Wreszcie, kiedy wrócisz, aby znaleźć myszy o pożądanym genotypie, wystarczy dopasować wzór nacięć w uszach do numeru identyfikacyjnego myszy.

Po zrozumieniu, czym jest genotypowanie i jak się je wykonuje, przyjrzyjmy się kilku przykładom, dlaczego jest ono przydatne.

W niektórych przypadkach do wytworzenia pożądanego fenotypu wymagane są bardziej złożone modyfikacje genetyczne. Na przykład, aby ustalić ten model raka skóry u myszy, potrzebne są dwa transgeny. Jeden jest nosicielem indukowalnego ?onkogenu,? lub gen, który może powodować raka, a drugi przenosi enzym rekombinazę Cre, który ulega ekspresji tylko w komórkach skóry i wycina sekwencję, która zapobiega transkrypcji onkogenu, umożliwiając w ten sposób ekspresję onkogenu. Aby uzyskać potomstwo z obydwoma transgenami, myszy heterozygotyczne dla każdego z nich są kojarzone. Genotypowanie jest następnie wykorzystywane do identyfikacji pożądanego potomstwa.

Czasami genotypowanie myszy przed eksperymentem może nie być możliwe. Na przykład w tym badaniu częstości akcji serca embrionów nie jest możliwe pobranie tkanki do genotypowania z zarodków bez zakłócania ich zachowania. Dlatego pozycje zarodka w obrębie matki są najpierw starannie oznaczane, a następnie rejestrowane są pomiary ultrasonograficzne. Na koniec pobiera się biopsje ogona w celu określenia wpływu genotypu na częstość akcji serca.

Ten film zademonstrował jedną z metod ekstrakcji DNA, ale istnieje wiele odmian. Na przykład system Direct PCR wymaga mniej niż pięć minut trawienia tkankowego. Dodatkowo, po odwirowaniu niestrawionego materiału, supernatant jest gotowy do PCR, eliminując potrzebę oczyszczania DNA.

Właśnie obejrzałeś przewodnik JoVE na temat genotypowania myszy. W tym filmie omówiliśmy podstawy genetyki myszy, sposób przygotowywania i analizowania próbek DNA myszy, a także niektóre praktyczne zastosowania tej techniki. Dzięki za oglądanie!