Genotypowanie myszy

Genotypowanie to proces wykrywania obecności lub braku specyficznych sekwencji DNA w genomie danego organizmu.

Ponieważ geny mogą wpływać na fenotyp myszy, możliwość zbadania budowy genetycznej, czyli „genotypu”, poszczególnych osobników jest kluczowa dla przypisania konkretnego fenotypu do określonego genu. W tym filmie zostaną omówione zagadnienia z zakresu genetyki myszy, zademonstrowane kluczowe etapy procedury genotypowania oraz wyjaśniony sposób interpretacji wyników genotypowania opartych na metodzie PCR.

Aby zrozumieć, czego badacze szukają podczas genotypowania myszy, przyjrzyjmy się kilku powszechnym manipulacjom w genetyce myszy.

W celu zbadania genu naukowcy często zaburzają jego funkcję poprzez zmianę sekwencji genetycznej. Ponieważ jednak myszy są diploidalne, posiadają dwie kopie każdego genu. Ponieważ większość genów do prawidłowego funkcjonowania wymaga tylko jednej normalnej kopii, przed badaniem fenotypu należy wyhodować zwierzęta z zaburzonymi obiema kopiami genu.

Taki genotyp nazywa się „homozygotycznym nokautem” lub częściej po prostu „nokautem”. I odwrotnie, normalną mysz z dwiema funkcjonalnymi kopiami nazywa się „homozygotycznym typem dzikim” lub po prostu „typem dzikim”. Z kolei myszy z tylko jedną funkcjonalną kopią określa się jako „heterozygotyczne” lub w skrócie „hety”.

Zamiast usuwania materiału genetycznego, niektóre eksperymenty wymagają wprowadzenia sekwencji DNA do genomu myszy. Te wprowadzone fragmenty DNA nazywa się „transgenami”, a myszy, które je niosą, są „transgeniczne”. Najczęstszym „transgenem” wprowadzanym u myszy jest taki, który steruje ekspresją zielonego białka fluorescencyjnego, GFP, pochodzącego z meduzy. Poprzez zastosowanie promotora tkankowo-specyficznego (sekwencji regulatorowej, która „promuje” aktywność genu) do sterowania produkcją GFP, komórki konkretnego typu tkanki można łatwo zidentyfikować dzięki zielonej fluorescencji.

Ponieważ wiele zmian genetycznych nie prowadzi do łatwo obserwowalnego fenotypu, takiego jak ekspresja GFP, myszy muszą zostać poddane genotypowaniu, aby ustalić, które konkretne zwierzę należy wykorzystać w eksperymentach. Przed genotypowaniem myszy należy starannie oznakować, aby można było je później ponownie zidentyfikować. Nie, będziesz potrzebować czegoś trwalszego. Jedną z powszechnych metod jest nacinanie uszu w taki sposób, aby pozycja i liczba nacięć odpowiadała numerowi identyfikacyjnemu.

Po oznakowaniu myszy należy pobrać mały fragment tkanki (zazwyczaj 2 — 5 mm ogona, używając żyletki lub nożyczek), z której zostanie wyizolowane DNA. Jeśli pobierasz tkankę od więcej niż jednej myszy, zaznaczaj zużyte segmenty ostrza, aby upewnić się, że nie użyjesz tej samej części u kolejnego zwierzęcia, co mogłoby prowadzić do kontaminacji krzyżowej próbek.

Aby rozpocząć proces oddzielania materiału genetycznego od innych składników tkanki, próbkę trawiono w buforze lizującym zawierającym enzym proteinazę K. Po całonocnym trawieniu próbkę wiruje się w celu osadzenia włosów i wszelkiego innego nietrawionego materiału. W celu izolacji DNA z przetrawionego lizatu prostą i skuteczną metodą jest dodanie alkoholu w celu wytrącenia kwasów nukleinowych. Po krótkiej inkubacji próbkę ponownie wiruje się, aby zebrać DNA w postaci osadu.

Po przemyciu 70% etanolem w celu usunięcia nadmiaru soli, osad DNA resuspendsuje się w wodzie lub buforze, po czym jest on gotowy do genotypowania.

Istnieje wiele strategii pozwalających określić, czy w organizmach badanych myszy występuje konkretna sekwencja DNA. Większość z nich wymaga uprzedniego powielenia interesującego regionu genetycznego za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy, czyli PCR. Więcej informacji na temat przygotowania reakcji PCR można znaleźć w przewodniku JoVE Science Education „Guide to PCR”.

Jedną z metod rozróżniania genotypów jest wykrywanie zmian w wielkości fragmentu powielonego w procesie PCR. Załóżmy, że przesiewamy myszy w poszukiwaniu genetycznej insercji o wielkości 700 par zasad. Po przeprowadzeniu PCR prążki typu dzikiego mają 200 par zasad, natomiast prążki transgenu powinny mieć 900 par zasad.

Po przeprowadzeniu PCR produkty reakcji należy rozdzielić na żelu agarozowym o odpowiednim stężeniu, aby móc rozróżnić wielkości fragmentów. Kontrola typu dzikiego powinna wykazywać jedynie prążek typu dzikiego o wielkości 200 par zasad; kontrola transgeniczna powinna wykazywać tylko jeden prążek transgenu o wielkości 900 par zasad, a kontrola hetrozygotyczna powinna wykazywać oba prążki. Na koniec dołączana jest kontrola „bez matrycy” (no template), aby upewnić się, że odczynniki nie zawierają zanieczyszczeń DNA, a zatem nie powinny one generować żadnych prążków.

Skoro mamy pewność, że kontrole zadziałały zgodnie z oczekiwaniami, sprawdźmy myszy o nieznanym genotypie. Ponieważ myszy 1 i 2 mają każda tylko jeden prążek typu dzikiego, są one homozygotami typu dzikiego. Myszy 4 i 6 mają każda tylko jeden prążek transgenu, a zatem są homozygotami transgenicznymi.

Z kolei myszy 3 i 5 mają każda dwa prążki, co oznacza, że są heterozygotami.

Na koniec, aby odnaleźć myszy o pożądanym genotypie, wystarczy dopasować wzór nacięć na uszach do numeru identyfikacyjnego myszy.

Po zapoznaniu się z tym, czym jest genotypowanie i jak się je przeprowadza, przyjrzyjmy się kilku przykładom jego przydatności.

W niektórych przypadkach do uzyskania pożądanego fenotypu wymagane są bardziej złożone modyfikacje genetyczne. Na przykład do stworzenia tego modelu raka skóry u myszy niezbędne są dwa transgeny. Jeden niesie indukowalny „onkogen”, czyli gen mogący wywołać nowotwór, a drugi niesie enzym rekombinaza Cre, który jest eksprymowany wyłącznie w komórkach skóry i wycina sekwencję zapobiegającą transkrypcji onkogenu, umożliwiając tym samym jego ekspresję. Aby uzyskać potomstwo z oboma transgenami, krzyżuje się myszy heterozygotyczne pod kątem każdego z nich. Następnie stosuje się genotypowanie w celu zidentyfikowania pożądanych osobników potomnych.

Czasami genotypowanie myszy przed eksperymentem może być niemożliwe. Na przykład w tym badaniu częstotliwości akcji serca zarodków pobranie tkanki do genotypowania z embrionów bez zakłócenia ich funkcjonowania nie jest wykonalne. Dlatego najpierw starannie oznacza się położenie zarodków w organizmie matki, a następnie rejestruje pomiary ultrasonograficzne. Na koniec pobiera się biopsje z ogona, aby określić wpływ genotypu na częstotliwość akcji serca.

W tym filmie zaprezentowano jedną metodę ekstrakcji DNA, jednak istnieje wiele jej wariantów. Na przykład system Direct PCR wymaga mniej niż pięciu minut trawienia tkanki. Dodatkowo, po odwirowaniu nieprzetrawionego materiału, nadsącz jest gotowy do reakcji PCR, co eliminuje konieczność oczyszczania DNA.

Właśnie obejrzeli Państwo przewodnik JoVE po genotypowaniu myszy. W tym filmie omówiliśmy podstawy genetyki myszy, sposób przygotowania i analizy próbek DNA myszy, a także niektóre praktyczne zastosowania tej techniki. Dziękujemy za uwagę!