Opracowanie hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do odrastania szkliwa in vitro z gęstym interfejsem

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie protokołu wytwarzania AMLO i hydrożelu chitozanu do powierzchownej rekonstrukcji szkliwa. Osiąga się to poprzez przygotowanie najpierw wytrawionych plastrów zębów. W drugim kroku przygotowywany jest świeży hydrożel AMLO i kitan.

Następnie na powierzchnię plastra zęba nakłada się AMLO i hydrożel kitan. Na koniec szkliwo zębów jest odrastane za pomocą hydrożelu AMLO chizen w sztucznej ślinie. Ostatecznie obróbka ultradźwiękowa i nano indenture mogą być wykorzystane do oceny wytrzymałości mechanicznej nowo powstałej warstwy i jej wiązania z naturalnym szkliwie.

Implikacje tej techniki rozciągają się na opracowanie przez nas technologii, która po zastosowaniu na dotknięte szkliwo zębów, zarówno u dorosłych, jak i u dzieci, zatrzymuje wczesne zmiany próchnicowe, odbudowuje ubytki szkliwa spowodowane próchnicą, zachowuje strukturę zębów i zapobiega postępowi próchnicy. Procedurę zademonstruje dr Chittar, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Zacznij od wybrania ludzkiego trzeciego zęba trzonowego bez przywróconej próchnicy.

Użyj chłodzonej wodą wolnoobrotowej piły diamentowej, aby przeciąć koronę wzdłużnie na plastry o grubości dwóch milimetrów, a następnie ultradźwiękowo usuń część korzeniową zęba trzonowego. Czyść plastry przez dwie minuty, a następnie spłucz je trzykrotnie zjonizowaną wodą, aby zasymulować zmiany erozyjne. Wytrawiaj dwie plastry 30% kwasem fosforowym przez 30 sekund.

Następnie natychmiast spłucz je zjonizowaną wodą. Następnie ultradźwiękowo. Ponownie oczyść wytrawione plastry przez dwie minuty i spłucz je zjonizowaną wodą.

Jeszcze trzy razy. Aby przygotować roztwór podstawowy Kazań. Najpierw rozpuść 1% wagowo na objętość, Kazań w roztworze kwasu octowego 1% objętości objętości, a następnie mieszaj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez noc.

Po schłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej przecedź esan przez filtr 0,45 mikrometra, a następnie dodaj jeden molowy wodorotlenek sodu, aby dostosować pH do 5,0. Aby przygotować roztwór podstawowy wapnia i fosforanu, odważyć chlorek wapnia i wymieszać roztwór o stężeniu 0,1 molowym. Następnie zmieszaj roztwór, aż się oczyści i dostosuj wartość pH do 11 za pomocą jednego molowego wodorotlenku sodu.

Następnie odważyć diba fosforan sodu. Wymieszaj roztwór o stężeniu 0,1 mola i wiruj, aż roztwór będzie klarowny. Aby przygotować hydrożel kaizan AMLO Genin, należy dodać 960 mikrolitrów świeżo przygotowanego 1% roztworu esanu do probówki zawierającej 200 mikrogramów rekombinowanego geninu AMLO

Następnie zmieszaj roztwór, aż będzie klarowny. Teraz dodaj 25 mikrolitrów 0,1-molowego roztworu chlorku wapnia, a następnie 15 mikrolitrów 0,1-molowego roztworu fosforanu sodu diba do roztworu AMLO zawierającego ozan. Wiruj roztwór przez pięć minut.

Następnie ostrożnie dodaj jeden molowy wodorotlenek sodu, aby dostosować pH roztworu AMLO i ozanu do 6,5 AMLO, a hydrożel ozan utworzy się, gdy wartość pH osiągnie 6,5, aby zainicjować odrost szkliwa w AMLO andaz, hydrożelu. Najpierw dostosuj pH roztworu sztucznej śliny do 7,0 za pomocą jednego molowego wodorotlenku sodu i przechowuj roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie za pomocą strzykawki nałóż około 20 mikrolitrów AMLO i hydrożelu chizen na plasterek zęba na krawędzi i umieść go w suchym środku do suszenia w temperaturze pokojowej.

Po dwóch godzinach dodaj 300 PPM fluorku sodu do roztworu śliny, a następnie przenieś plasterek zęba do zlewki zawierającej 30 mililitrów roztworu. Przykryj zlewkę folią aluminiową, a następnie wstaw zlewkę do piekarnika nagrzanego do 37 stopni Celsjusza. Na koniec usuń plasterek zęba po trzech do siedmiu dniach i umieść go w wysuszaczu w temperaturze pokojowej do wyschnięcia po naprawie przez AMLO i hydrożel chizen na siedem dni, na wytrawionej powierzchni szkliwa tworzy się warstwa przypominająca szkliwo o grubości 15 mikrometrów.

Nowo wyhodowana warstwa zbudowana jest z wysoce uporządkowanych układów kryształów o średnicy około 50 nanometrów rosnących preferencyjnie wzdłuż osi morza prostopadłej do powierzchni. Zauważ, że te przypominające igły kryształy są zorganizowane w wiązki podobne do podstawowych jednostek naturalnego szkliwa. Wybrany obszar dyfrakcji elektronów obrazu naprawianej warstwy wykazuje wzór w kształcie łuku, ujawniający hierarchiczne ułożenie nowo wyhodowanych kryształów.

Wzdłuż kierunku 0 0 2 analiza dyfrakcji rentgenowskiej potwierdza, że nowo wyhodowana warstwa składa się z apetytu, które są ustawione wzdłuż krystalograficznej osi C zgodnie ze skaningową mikroskopią elektronową i obserwacjami dyfrakcji elektronowej w wybranym obszarze na tym obrazie, pokazano mikrostrukturę granicy faz między nowo wyrosłą warstwą a naturalnym szkliwem. Należy zauważyć, że nowo wyhodowane kryształy nie rosły w tym samym kierunku, co oryginalny krystalit szkliwa, a wzrost apetytu za pośrednictwem białka powoduje prostopadłą orientację nowo wyhodowanych kryształów w stosunku do naturalnych kryształów szkliwa. Nie ma widocznej szczeliny na styku między nowo wyrosłą warstwą a podłożem emaliowanym.

W nanoskali szkliwo i odrastające kryształy połączyły się ze sobą, tworząc płynny interfejs. Po 10 minutach obróbki ultradźwiękowej nowo wyhodowana warstwa utworzona w hydrożelu chito AMLO Genin jest nadal ściśle związana z powierzchnią szkliwa, a zorganizowana struktura jest zachowana dla próbki potraktowanej hydrożelem tizen bez mologenu. Obserwuje się jednak dużą szczelinę między szkliwem a naprawioną warstwą, aby wyraźnie odróżnić nowo wyrosłą warstwę od naturalnego szkliwa.

W tym eksperymencie genina AMLO w nowo wyhodowanej warstwie została znakowana immunofluorescencyjnie, a obecność geniny AMLO została następnie potwierdzona przez zieloną fluorescencję w nowo wyhodowanej warstwie. Jak pokazano na wykresie po trawieniu kwasem, twardość i moduł powierzchni szkliwa spadają odpowiednio o prawie 98 i 88%. Grupa kontrolna leczona hydrożelem ozan bez geniny AMLO wykazuje jedynie ograniczoną poprawę zarówno twardości, jak i modułu.

Natomiast po mineralizacji w AMLO i hydrożelu ozan obserwuje się prawie czterokrotny wzrost modułu i dziewięciokrotny wzrost twardości po jego opracowaniu. W VI i dalszej ocenie w modelach, protokół ten może zostać rozszerzony w celu zaprojektowania technologii leczenia wad enam, takich jak wczesna próchnica i erozja. Ena.