Name: Opracowanie hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do odrastania szkliwa in vitro z gęstym interfejsem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę tworzenia hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do odbudowy szkliwa zębów. Technika umożliwia wzrost kryształów apatytu in situ, tworząc gęsty interfejs i poprawiając wytrzymałość mechaniczną odbudowanej warstwy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Stevenowi Nuttowi i Panu Yuzheng Zhangowi za asystę przy Focus Ion Beam, oraz Centrum Mikroskopii Elektronowej i Mikroanalizy (CEMMA) na USC za mikroskopię elektronową. Badania były wspierane przez granty NIH-NIDCR; DE-13414 i DE-020099 do J.M.O.

Ludzkie zęby trzonowe zostały pobrane zgodnie ze standardowymi procedurami ekstrakcji w Ostrów School of Dentistry Uniwersytetu Południowej Kalifornii i podjęte za zgodą Institutional Review Board.
1. Przygotowanie wytrawionego kwasem plastra zęba
<ol>
	<li>Wybierz trzeci ząb trzonowy człowieka bez przywróconej próchnicy.</li>
	<li>Usuń część korzeniową zęba trzonowego i pokrój koronę zęba trzonowego wzdłużnie na plastry o grubości 2 mm za pomocą chłodzonej wodą wolnoobrotowej piły diamentowej. Czyść te plastry ultradźwiękowo przez 2 minuty, a następnie spłucz je 3 razy wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Aby zasymulować zmiany nadżerkowe, należy wytrawić plastry zębów 30% kwasem fosforowym przez 30 sekund, a następnie natychmiast spłukać je wodą dejonizowaną.</li>
	<li>Wyczyść ultradźwiękowo wytrawione plastry przez 2 minuty, a następnie spłucz je 3 razy wodą dejonizowaną.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego chitozanu
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1% (w/v) chitozan (średnia masa cząsteczkowa, 75-85% deacetylowany) w 1% (v/v) roztworze kwasu octowego, a następnie wymieszać w temperaturze 80 °C O/N.</li>
		<li>Po schłodzeniu roztworu do temperatury rynkowej przefiltrować roztwór chitozanu za pomocą filtra 0,45 μm. Dostosować wartość pH do 5,0, dodając 1 M roztwór NaOH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego wapnia i fosforanów (0,1 M)
	<ol>
		<li>Odważyć chlorek wapnia (CaCl2) i przygotować 0,1 M roztwór, a następnie mieszać za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny. Dostosować wartość pH do 11, dodając 1 M roztwór NaOH.</li>
		<li>Odważyć dwuzasadowy fosforan sodu (Na2HPO4) i przygotować 0,1 M roztwór, a następnie mieszać za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanej amelogeniny17-18 
	Zastosowana tutaj rekombinowana amelogenina wieprzowa o pełnej długości (rP172) ma 172 aminokwasy i jest analogiem pełnowymiarowej rodzimej świni P173, ale brakuje N-końcowej metioniny, a także grupy fosforanowej na Ser16 18.
	<ol>
		<li>Dodać 20 g bulionu lizogenicznego (LB) w proszku agarowym do 500 ml wody dejonizowanej, roztworu sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C (ustawienie cieczy) przez 20 minut. Pozostawić agar do ostygnięcia do temperatury ~ 55 °C, dodać ampicylinę (100 μg/ml) do roztworu agaru.</li>
		<li>Przenieś roztwór agaru na szalki Petriego, pozwól każdej płytce ostygnąć, aż stanie się twarda, a następnie odwróć, aby uniknąć kondensacji na agrze. Przechowywać talerze w plastikowych torebkach w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Na płytce agarowej LB umieścić prążki rekombinowanymi komórkami (E.coli–BC21) z glicerolu (-80 °C). Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować 50 ml pożywki NZCYM i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia, dodać 50 μl 100 μg/ml ampicyliny do pożywki o objętości 50 ml.</li>
		<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki agarowej LB do 50 ml pożywki NZCYM uzupełnionej ampicyliną. Inkubować komórki O/N w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przygotować 1 l pożywki NZCYM i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Dodać 1 ml ampicyliny 100 mg/ml do 1 000 ml pożywki. Wykonaj odczyt gęstości optycznej (OD) jako ślepą próbę za pomocą spektrofotometru UV-Vis. UWAGA: Nie wyrzucaj tego po pierwszym przeczytaniu.</li>
		<li>Zaszczepić 10 ml kultury komórkowej z kroku 2.3.5 do 1 000 ml pożywki z kroku 2.3.6. Odczytać gęstość optyczną przy 595 nm natychmiast po inokulacji. Wykonuj okresowy odczyt gęstości optycznej, aby śledzić wzrost. UWAGA: Czytaj puste miejsce za każdym razem, gdy pobierana jest średnica zewnętrzna.</li>
		<li>Indukować 700 μl izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG, 1 M), gdy wzrost bakterii osiągnie około 0,75 ~ 0,8 OD przy 595 nm.</li>
		<li>Zbierz komórki, gdy OD osiągnie 1,1. Wlej zawartość kolby do 6 plastikowych butelek. Zrównoważyć i zważyć butelki przed użyciem wirówki. Wirować przez 20 minut w temperaturze 8,554 x g w temperaturze 4 °C. Przechowywać osad komórkowy w temperaturze -20 °C O/N.</li>
		<li>Wyjmij granulki komórek i połącz je w probówce o pojemności 50 ml. Dodać 3,5 ml 4M chlorowodorku guanidyny na litr fermentacji. Sonikuj 2-3 razy na lodzie, za każdym razem 30 sekund, w odstępach 1 minut.</li>
		<li>Wykonać 6-krotne rozcieńczenie objętości komórki 0,5% kwasem mrówkowym i pozostawić do mieszania w chłodni przez 2 godziny. Wirować przez 30 minut, 8,554 x g w temperaturze 4 °C. Zachować supernatant. Dodać 20% nasyconego siarczanu amonu za pomocą nasyconego roztworu podstawowego i wymieszać w chłodni, O/N.</li>
		<li>Wirować przez 30 minut, 8,554 x g w temperaturze 4 °C i zachować osad. Rozpuść granulki w 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA), załaduj na kolumnę C4 (10 x 250 mm, 5 μm) i frakcjonuj przy użyciu gradientu liniowego A=0,1% TFA i B=60% acetonitrylu w TFA, przy natężeniu przepływu 1,5 ml·min-1.</li>
		<li>Zamrozić roztwór białkowy na suchym lodzie i liofilizować zamrożoną próbkę O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie hydrożelu amelogenina-chitozan (CS-AMEL) (ryc. 1A)
	<ol>
		<li>Dodać 200 μg rp172 do probówki zawierającej 960 μl 1% roztworu chitozanu, a następnie mieszać za pomocą wiru, aż roztwór będzie klarowny.</li>
		<li>Dodać 25 μl 0,1 M roztworu CaCl2, a następnie 15 μl 0,1 M Na2HPO4 roztworu do roztworu chitozanu zawierającego amelogeninę, a następnie mieszać za pomocą wiru przez 5 minut.</li>
		<li>Doprowadzić pH roztworu CS-AMEL do 6,5, ostrożnie dodając 1 M roztwór NaOH. Hydrożel CS-AMEL powstanie, gdy wartość pH osiągnie 6,5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Odrost szkliwa w hydrożelu amelogeninowo-chitozanowym
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu sztucznej śliny
	<ol>
		<li>Rozpuścić pewną ilość chlorku magnezu (MgCl2, 0,2 mM), chlorku wapnia (CaCl2, 1 mM), diwodorofosforanu potasu (KH2PO4 4 mM), chlorku potasu (KCl, 16 mM) i chlorku amonu (NH4Cl, 4,5 mM) w 20 mM buforze HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy)12.</li>
		<li>Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą 1 M NaOH i przechowywać sztuczny roztwór śliny w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przed użyciem roztworu dodać fluorek sodu (NaF, 300 ppm).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowanie hydrożelu CS-AMEL
	<ol>
		<li>Nałóż około 20 μl hydrożelu CS-AMEL na wytrawiony plaster zęba za pomocą strzykawki (Rysunek 1B).</li>
		<li>Pokryty hydrożelem plaster zęba wysuszyć w eksykatorze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Przenieś plaster zęba do zlewki zawierającej 30 ml roztworu sztucznej śliny. Przykryj zlewkę folią aluminiową, a następnie przechowuj ją w piekarniku w temperaturze 37 °C przez 7 dni.</li>
		<li>Usuń plasterek zęba i wysusz go w eksykatorze o temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Charakterystyka interfejsu między nowo wyhodowaną warstwą a szkliwem
Mikrostruktura granicy faz między nowo wyrosłą warstwą a szkliwem została zaobserwowana za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej o wysokich obrotach (HR-TEM). Próbkę TEM przygotowano przy użyciu techniki skupionej wiązki jonów (FIB), której kroki są następujące.
<ol>
	<li>Załaduj próbkę do przyrządu FIB-SEM i zakończ wszystkie wyrównania zgodnie z instrukcją obsługi. UWAGA: Regulację Fine Z należy wykonać co najmniej 2 razy.</li>
	<li>Osadzać warstwę węgla (15 × 3 μm) na próbce w celu ochrony podstawowej struktury (rysunek 2A).</li>
	<li>Ostrożnie zmiel próbkę po górnej, dolnej i prawej stronie warstwy węgla, aby przygotować cienki kawałek próbki, a następnie odetnij dolną stronę tego cienkiego kawałka. UWAGA: Sprawdź wyrównanie wiązki jonów przed każdym etapem frezowania (Rysunek 2B).</li>
	<li>Przyspawaj końcówkę Pt do cienkiego kawałka i odetnij lewą stronę, aby oddzielić próbkę (Rysunek 3C). UWAGA: Sprawdź wyrównanie wiązki jonów przed etapem spawania.</li>
	<li>Powoli wyjmij końcówkę Pt z próbką i zamontuj blaszkową próbkę na wysuwanej siatce TEM.</li>
	<li>Odłączyć końcówkę od próbki i rozcieńczyć próbkę, aż jej grubość będzie mniejsza niż 100 nm (rysunek 3D). Wyjąć próbkę z przyrządu w celu przeprowadzenia obserwacji TEM. UWAGA: Sprawdź wyrównanie wiązki jonów przed każdym procesem przerzedzania.</li>
</ol>
5. Ocena właściwości wiążących i mechanicznych nowo wyrastającej warstwy
<ol>
	<li>Wytrzymałość wiązania ocenia się za pomocą obróbki ultradźwiękowej. Naprawiony plaster zęba należy przechowywać w myjce ultradźwiękowej (42 kHz, 100 W) przez 10 minut, a następnie obserwować granicę faz między naprawioną warstwą a naturalnym szkliwem za pomocą analizy SEM z rozproszonymi wstecznie elektronami.</li>
	<li>Zmierz twardość i moduł sprężystości w 20 punktach testowych na każdej naprawionej powierzchni szkliwa (n=3) za pomocą nano-wgłębnika z końcówką Berkovicha.</li>
</ol>
6. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Umyj plaster zęba solą fizjologiczną Tris buffer soli fizjologicznej (TBS) przez 15 minut.</li>
	<li>Blok z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w TBS przez 15 min.</li>
	<li>Usunąć ciecz i inkubować próbkę O/N z 1°Ab (1:500 anty-amelogenina kurczaka) rozcieńczoną w TBS (0,1% BSA, 0,3% Triton X-100).</li>
	<li>Przemyć próbkę TBS przez 30 minut i inkubować O/N z 2°Ab (1:100 Anti-Chicken FITC) rozcieńczonym w TBS.</li>
	<li>Umyć próbkę TBS przez 30 minut i pozostawić do wyschnięcia na kolejne 30 minut.</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-+mediated+enamel+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Protein- mediated enamel mineralization.</a> Frontiers in Bioscience. 17, 1996-2023 (2012).</li>
<li>Palmer, L. C., Newcomb, C. J., Kaltz, S. R., Spoerke, E. D., Stupp, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+Systems+for+Hydroxyapatite+Mineralization+Inspired+By+Bone+and+Enamel%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biomimetic Systems for Hydroxyapatite Mineralization Inspired By Bone and Enamel.</a> Chem. Rev. 108, 4754-4783 (2008).</li>
<li>Onuma, K., Yamagishi, K., Oyane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+growth+of+hydroxyapatite+nanocrystals+for+nondestructive+repair+of+early+caries+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth%22%5BJournal%5D)">Nucleation and growth of hydroxyapatite nanocrystals for nondestructive repair of early caries lesions.</a> J. Cryst. Growth. 282, 199-207 (2005).</li>
<li>Xie, R. Q., Feng, Z. D., Li, S. W., Xu, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDTA-Assisted+Self-Assembly+of+Fluoride-Substituted+Hydroxyapatite+Coating+on+Enamel+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst.+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">EDTA-Assisted Self-Assembly of Fluoride-Substituted Hydroxyapatite Coating on Enamel Substrate.</a> Cryst. Growth Des. 11, 5206-5214 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Inspired+Enamel+Repair+via+Glu-Directed+Assembly+of+Apatite+Nanoparticles%3A+an+Approach+to+Biomaterials+with+Optimal+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Inspired Enamel Repair via Glu-Directed Assembly of Apatite Nanoparticles: an Approach to Biomaterials with Optimal Characteristics.</a> Advanced Materials. 23, (2011).</li>
<li>Yin, Y. J., Yun, S., Fang, J. S., Chen, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+regeneration+of+human+tooth+enamel+under+near-physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chemical regeneration of human tooth enamel under near-physiological conditions.</a> Chem. Commun. , 5892-5894 (2009).</li>
<li>Fan, Y., Sun, Z., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+remineralization+of+enamel+in+the+presence+of+amelogenin+and+fluoride%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled remineralization of enamel in the presence of amelogenin and fluoride.</a> Biomaterials. 30, 478-483 (2009).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+enamel+by+using+hydroxyapatite+nanoparticles+as+the+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of enamel by using hydroxyapatite nanoparticles as the building blocks.</a> J. Mater. Chem. 18, 4079-4084 (2008).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+synthesis+of+a+human+enamel-like+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Acellular synthesis of a human enamel-like microstructure.</a> Advanced Materials. 18, (2006).</li>
<li>Yamagishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+enamel+for+rapid+tooth+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic enamel for rapid tooth repair.</a> Nature. 433, 819-819 (2005).</li>
<li>Bleek, K., Taubert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+polymer-controlled%2C+bioinspired+calcium+phosphate+mineralization+from+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">New developments in polymer-controlled, bioinspired calcium phosphate mineralization from aqueous solution.</a> Acta Biomaterialia. 9, 6283-6321 (2013).</li>
<li>Fletcher, J., Walsh, D., Fowler, C. E., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+mats+of+PVP%2FACP+nanofibres+for+remineralization+of+enamel+tooth+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Crystengcomm%22%5BJournal%5D)">Electrospun mats of PVP/ACP nanofibres for remineralization of enamel tooth surfaces.</a> Crystengcomm. 13, 3692-3697 (2011).</li>
<li>Fang, P. -A., Conway, J. F., Margolis, H. C., Simmer, J. P., Beniash, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+self-assembly+of+amelogenin+and+the+regulation+of+biomineralization+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hierarchical self-assembly of amelogenin and the regulation of biomineralization at the nanoscale.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14097-14102 (2011).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Amelogenin+Orchestrates+the+Organization+of+Hierarchical+Elongated+Microstructures+of+Apatite%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">How Amelogenin Orchestrates the Organization of Hierarchical Elongated Microstructures of Apatite.</a> Journal of Physical Chemistry B. 114, 2293-2300 (2010).</li>
<li>Li, H., Fujiki, Y., Sada, K., Estroff, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+incorporation+inside+of+organic+single+crystals+grown+in+agarose+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Crystengcomm%22%5BJournal%5D)">Gel incorporation inside of organic single crystals grown in agarose hydrogels.</a> Crystengcomm. 13, 1060-1062 (2011).</li>
<li>Ruan, Q., Zhang, Y., Yang, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amelogenin-chitosan+matrix+promotes+assembly+of+an+enamel-like+layer+with+a+dense+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">An amelogenin-chitosan matrix promotes assembly of an enamel-like layer with a dense interface.</a> Acta Biomater. 9, 7289-7297 (2013).</li>
<li>Hu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+cDNA+sequence%2C+and+alternative+splicing+of+porcine+amelogenin+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning, cDNA sequence, and alternative splicing of porcine amelogenin mRNAs.</a> Journal of Dental Research. 75, 1735-1741 (1996).</li>
<li>Bromley, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelogenin+Processing+by+MMP-20+Prevents+Protein+Occlusion+Inside+Calcite+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst.+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Amelogenin Processing by MMP-20 Prevents Protein Occlusion Inside Calcite Crystals.</a> Cryst. Growth Des. 12, 4897-4905 (2012).</li>
<li>Fan, Y., Sun, Z., Abbott, C., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+enamel+inspired+nanocomposite+fabrication+through+amelogenin+supramolecular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A enamel inspired nanocomposite fabrication through amelogenin supramolecular assembly.</a> Biomaterials. 28, 3034-3042 (2007).</li>
<li>Wright, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+etiologies+and+associated+phenotypes+of+amelogenesis+imperfecta%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Gent.+A%22%5BJournal%5D)">The molecular etiologies and associated phenotypes of amelogenesis imperfecta.</a> Am. J. Med. Gent. A. 140 (23), 2547-2555 (2006).</li>
<li>Eimar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+enamel+hardness+by+its+crystallographic+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Regulation of enamel hardness by its crystallographic dimensions.</a> Acta Biomaterialia. 8, 3400-3410 (2012).</li>
<li>Ruan, Q., Siddiqah, N., Li, X., Nutt, S., Moradian-Oldak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelogenin-chitosan+matrix+for+human+enamel+regrowth%3A+effects+of+viscosity+and+supersaturation+degree%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Amelogenin-chitosan matrix for human enamel regrowth: effects of viscosity and supersaturation degree.</a> Connect Tissue Res. , (2014).</li>
<li>Pouget, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Initial+Stages+of+Template-Controlled+CaCO3+Formation+Revealed+by+Cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Initial Stages of Template-Controlled CaCO3 Formation Revealed by Cryo-TEM.</a> Science. 323, 1455-1458 (2009).</li>
<li>Gebauer, D., Volkel, A., Colfen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Prenucleation+Calcium+Carbonate+Clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stable Prenucleation Calcium Carbonate Clusters.</a> Science. 322, 1819-1822 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż zawartość minerałów w szkliwie jest wysoka, co czyni ją najtwardszą zmineralizowaną tkanką w ludzkim ciele, ta bioceramika jest podatna na procesy demineralizacji, które często występują jako próchnica lub erozja. Mutacje genów mogą również powodować cienkie lub miękkie szkliwo, prowadząc do szeregu dziedzicznych chorób wad rozwojowych szkliwa zwanych Amelogenesis Imperfecta20. Produkty do higieny jamy ustnej zawierające fluor lub CPP-ACP są dostępne na rynku od kilku lat (tj.</em...

Szkliwo zębów to twarda, zmineralizowana powierzchnia ludzkich zębów. Składa się z licznych przypominających igły kryształów apatytu, które są połączone w zorganizowane, równoległe pryzmaty, aby zapewnić wyjątkową wytrzymałość mechaniczną i ochronę biologiczną, jaką zapewnia szkliwo1-2. W przeciwieństwie do innych zmineralizowanych tkanek, takich jak kości i zębina, dojrzałe szkliwo jest bezkomórkowe i nie może się zregenerować po znacznej utracie minerałów1-2, co często występuje jako próchnica lub erozja. Dostępne na rynku produkty, takie jak lakiery zawierające fluor, pasty do zębów i płyny do płukania jamy ustnej, są skuteczne w remineralizacji szkliwa, ale żaden z nich nie ma potencjału do promowania tworzenia zorganizowanych kryształów apatytu. Klinicznie konwencjonalne leczenie naprawy szkliwa polega na procedurze wypełniania sztucznymi materiałami, takimi jak amalgamat, ceramika lub żywica kompozytowa 3. Jednak materiały te zwykle nie łączą się dobrze z naturalną tkanką otaczającą zmianę, ponieważ ich struktury, składniki i właściwości różnią się od naturalnego szkliwa. W rezultacie próchnica wtórna często rozwija się z czasem na styku zęba z ciałami obcymi. Dlatego odrastanie szkliwa in situ z gęstym interfejsem jest atrakcyjnym celem dla dziedzin materiałoznawstwa i stomatologii. Jednym ze szczególnie obiecujących sposobów osiągnięcia tego celu jest biomimetyczna synteza materiału podobnego do szkliwa na powierzchni szkliwa. W ostatnim czasie podjęto liczne próby przygotowania materiałów podobnych do szkliwa in vitro przy użyciu systemów biomimetycznych zawierających nanoapatyty lub różne dodatki organiczne 4-12. Jednak opracowanie optymalnej strategii biomimetycznej w celu promowania kryształów remineralizacji w celu uzyskania idealnego gęstego interfejsu nadal stanowi wyzwanie. 
Podczas mineralizacji szkliwa, zorientowany wzrost i wydłużenie kryształów apatytu jest regulowane przez bogatą w amelogeninę matrycę 1,13-14. Aby naśladować matrycę organiczną w rozwoju szkliwa, w niniejszym artykule opisujemy szczegółowy protokół wytwarzania hydrożelu amelogenina-chitozan (CS-AMEL) do odrastania szkliwa in situ na trawionej kwasem powierzchni szkliwa używanej jako model zmian erozyjnych. Jako "najbardziej wszechstronne podłoże wzrostowe" dla kryształów 15, matryce hydrożelowe mają przewagę nad systemem roztworów, ponieważ klinicznie są łatwiejsze w obsłudze. Co więcej, CS-AMEL jest biokompatybilny, biodegradowalny i ma unikalne właściwości przeciwdrobnoustrojowe i adhezyjne, które wypadają korzystnie w porównaniu z innymi systemami biomimetycznymi do zastosowań dentystycznych 16. Co ważne, mineralizacja in situ kryształów apatytu na powierzchni szkliwa zapewnia gęste pasmo faz między naprawianą warstwą a naturalnym szkliwem, co może potencjalnie poprawić trwałość uzupełnień i zapobiec powstawaniu nowej próchnicy na brzegu uzupełnienia.

<table><tbody><tr><td>Trzeci trzonowiec ludzki&nbsp;</td><td>Ostrowska Szkoła Stomatologii Uniwersytetu Południowej Kalifornii&nbsp;</td><td>Nie dotyczy</td><td>Ludzkie zęby trzonowe zostały pobrane zgodnie ze standardowymi procedurami ekstrakcji w Ostrów School of Dentistry Uniwersytetu Południowej Kalifornii i podjęte za zgodą Institutional Review Board.</td></tr><tr><td>Rekombinowana amelogenina pocinowa</td><td>Ekspresja i oczyszczanie&nbsp; w laboratorium</td><td>N/A</td><td>rP172, pełnej długości&nbsp;</td></tr><tr><td>Chitozan&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448877</td><td>Średnia masa cząsteczkowa, 75-85% deacetylowany</td></tr><tr><td>kwas fosforowy&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AA033266</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>VWR</td><td>A036289</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>VWR</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan sodu bezwodny</td><td>VWR</td><td>BDH0316</td><td></td></tr><tr><td>BL21-CodonPlus (DE3)-RP&nbsp;</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td></td>230255</tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>VWR</td><td>BDH8001</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>VWR</td><td>AAAL06374</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>VWR</td><td>BDH1103</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH0244</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH9268</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu&nbsp;</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AAAA15000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy)</td><td>VWR</td><td>AAA14777</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu&nbsp;</td><td>VWR</td><td>AA11561</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana trisem</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td>10 razy; TBS</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>12659</td><td>CalBioChem, Albumina, Surowica bydlęca, frakcja V, metale o niskiej zawartości metali ciężkich&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Milipore&nbsp;</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Amelogenina</td><td>z kurczaka N/A</td> N<td>/A</td><td>Prezent od prof. Malcolma Sneada, Uniwersytet Południowej Kalifornii</td></tr><tr><td>Bydlęce IgY-FITC</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-2700</td><td></td></tr><tr><td>Wysokowydajny system chromatografii cieczowej</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Kolumna Varian Prostar 210</td><td></td></tr><tr><td>C4</td><td>Fenomenx&nbsp;</td><td>Jupiter 5&mu; 300A</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowa mikroskopia elektronowa&nbsp;</td><td>JEOL&nbsp;</td><td>JSM-7001</td><td></td></tr><tr><td>FIB-SEM&nbsp;</td><td>JEOL&nbsp;</td><td>JIB-4500</td><td></td></tr><tr><td>Transmisyjna mikroskopia elektronowa&nbsp;</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100F</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa wolnoobrotowa piła diamentowa</td><td>MTI Corporation</td><td>SYJ-150</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia fluorescencyjna</td><td>Leica</td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa&nbsp;</td><td>Bransona&nbsp;</td><td>2510</td><td>42 kHz, 100 W</td></tr><tr><td>Nano-indendent&nbsp;</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Punkty MTS XP</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do odrastania szkliwa in vitro z gęstym interfejsem

Development of Amelogenin-chitosan Hydrogel for In Vitro Enamel Regrowth with a Dense Interface

Biomimetyczna rekonstrukcja szkliwa jest ważnym tematem w materiałoznawstwie i stomatologii jako nowatorskie podejście do leczenia próchnicy lub erozji. Udowodniono, że amelogenina jest krytycznym białkiem kontrolującym zorganizowany wzrost kryształów apatytu. W artykule przedstawiono szczegółowy protokół powierzchownej rekonstrukcji szkliwa przy użyciu nowego hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego. W porównaniu z innymi konwencjonalnymi metodami leczenia, takimi jak miejscowe fluoryzowanie i płyn do płukania jamy ustnej, metoda ta nie tylko może zapobiegać rozwojowi próchnicy, ale także sprzyja znacznej i trwałej odbudowie szkliwa. Zorganizowana mikrostruktura przypominająca szkliwo regulowana przez zespoły amelogeniny może znacznie poprawić właściwości mechaniczne wytrawionej szkliwa, podczas gdy gęsta granica faz odbudowy szkliwa utworzona przez odrastanie in situ kryształów apatytu może poprawić skuteczność i trwałość uzupełnień. Ponadto hydrożel chitozanowy jest łatwy w użyciu i może hamować infekcje bakteryjne, które są głównym czynnikiem ryzyka wystąpienia próchnicy. Dlatego ten biokompatybilny i biodegradowalny hydrożel amelogeninowo-chitozanowy jest obiecujący jako biomateriał do zapobiegania, przywracania i leczenia wadliwego szkliwa.

Skuteczność opisanego tutaj protokołu wykazano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), dyfrakcji elektronów z wybranej obszaru (SAED) oraz dyfrakcji rentgenowskiej (XRD). Po 7 dniach naprawy za pomocą hydrożelu amelogeniny i chitosanu (CS-AMEL), na trawionej powierzchni szkliwa utworzyła się warstwa przypominająca szkliwo o grubości 15 μm. Nowo powstała warstwa składała się z wysoce uporządkowanych struktur kryształów o średnicy ~50 nm, rosnących preferencyjnie wzdłuż osi c, prostopadle do powierzchni (strz...

W tym artykule opisujemy protokół wytwarzania hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do powierzchownej rekonstrukcji szkliwa. Zorganizowany in situ wzrost kryształów apatytu w hydrożelu utworzył gęstą granicę faz szkliwo-odbudowę, co poprawi skuteczność i trwałość uzupełnień.

Opracowanie hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do odrastania szkliwa in vitro z gęstym interfejsem

Biomimetic enamel reconstruction is a significant topic in material science and dentistry as a novel approach for the treatment of dental caries or ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie protokołu wytwarzania hydrożelu z AMLO i chitosanu do rekonstrukcji powierzchownych uszkodzeń szkliwa. Jest to realizowane poprzez wstępne przygotowanie trawionych plastrów zęba. W drugim kroku przygotowany jest świeży hydrożel z AMLO i chitosanu.Następnie na powierzchnię skrawka zęba nanosi się hydrożel AMLO i kitan. Na koniec, w sztucznej ślinie, przeprowadza się regenerację szkliwa zęba przy użyciu hydrożelu AMLO chizen. Ostatecznie można zastosować badanie ultradźwiękowe oraz nanoindentację, aby ocenić wytrzymałość mechaniczną nowo powstałej warstwy oraz stopień jej wiązania z naturalnym szkliwem.Zastosowanie tej techniki pozwala na opracowanie technologii, która po użyciu na uszkodzonym szkliwie zębów, zarówno u dorosłych, jak i dzieci, zatrzymuje wczesne zmiany próchnicowe, odbudowuje utracone szkliwie w wyniku próchnicy, zachowuje strukturę zęba oraz zapobiega postępowaniu procesu próchnicy. Procedurę zademonstruje dr Chittar, stażysta postdoctoral z mojego laboratorium. Rozpocznij od wyboru ludzkiego trzeciego trzonowca bez żadnych wypełnień w miejscach próchnicy.Użyj chłodzonej wodą niskobiegowej piły diamentowej, aby prz

development-amelogenin-chitosan-hydrogel-for-vitro-enamel-regrowth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowanie hydrożelu amelogenina-chitozanowego do in vitro odrostów szkliwa z gęstą interfejsem

Główną przeszkodą w obecnych terapiach komórkami macierzystymi jest określenie najskuteczniejszej metody dostarczania tych komórek do tkanek gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy metodę dostarczania opartą na chitosanie, która jest wydajna i prosta w zastosowaniu, a jednocześnie pozwala komórkom macierzystym pochodzącym z tkanki tłuszczowej zachować ich wielopotencjalność.

Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

Tutaj opisujemy łatwe przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu przy użyciu dynamicznej chemii iminowej. Przedstawiono metody regulacji wytrzymałości mechanicznej hydrożelu i jego zastosowania w hodowli komórkowej 3D.

Przygotowanie hydrożeli iniekcyjnych na bazie chitozanu i jego zastosowanie w hodowli komórkowej 3D

Zrozumienie powstawania szkliwa i możliwych zmian wymaga zbadania aktywności ameloblastów. W tym miejscu opisano wiarygodną i spójną metodę mikropreparacji narządów szkliwa zawierających ameloblasty w fazie sekrecji i dojrzewania, które mogą być wykorzystane do dalszych ilościowych i jakościowych procedur eksperymentalnych.

Mikropreparacja narządu szkliwa z siekacza żuchwy szczurów narażonych na działanie toksyn środowiskowych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli sferoidów komórek ludzkiego więzadła przyzębia (PDL) za pomocą filmów chitozanowych. Hodowla trójwymiarowych (3D) sferoid komórkowych stanowi alternatywę dla konwencjonalnego systemu hodowli polistyrenowych do hodowli tkankowych (TCPS).

Tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu

Ten protokół przedstawia metodę hodowli i 3D hodowli komórek podobnych do ameloblastów w mikrograwitacji, aby zachować ich wydłużony i spolaryzowany kształt, a także ekspresję białek specyficzną dla szkliwa. Opisano również warunki hodowli konstruktów inżynierii przyzębia i narządów płuc w warunkach mikrograwitacji.

Rozmnażanie komórek i narządów zębów i dróg oddechowych w mikrograwitacji

Przedstawiamy protokół rozwoju kultur organoidów nabłonkowych, zaczynając od ludzkiego zęba. Organoidy są bardzo rozprężalne i rekapitulują nabłonkowe komórki macierzyste zęba, w tym ich zdolność do różnicowania ameloblastów. Unikalny model organoidowy stanowi obiecujące narzędzie do badania biologii ludzkiej uzębienia (komórek macierzystych) z perspektywami podejścia regeneracyjnego zębów.

Ustanowienie organoidów z ludzkiego zęba jako potężnego narzędzia w kierunku badań mechanistycznych i terapii regeneracyjnej

Obecny protokół opisuje nieopartą na emulsji metodę wytwarzania mikrożeli chitozanowo-genipinowych. Wielkość tych mikrożeli może być precyzyjnie kontrolowana i mogą one wykazywać pęcznienie zależne od pH, ulegać degradacji in vivo i być naładowane cząsteczkami terapeutycznymi, które uwalniają się z czasem w sposób ciągły, co czyni je bardzo istotnymi dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Wytwarzanie mikrożeli chitozanowo-genipinowych o kontrolowanej wielkości i wolnych od emulsji do zastosowań w inżynierii tkankowej

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia model laboratoryjny przeznaczony do oceny kompatybilności materiałów do opatrunków z podciśnieniowymi systemami leczenia ran poprzez ocenę ciśnienia i zbierania płynów przez 72 godziny przy ciągłych i przerywanych ustawieniach ciśnienia.

Opracowanie modelu laboratoryjnego do oceny kompatybilności materiałów opatrunkowych z podciśnieniowymi systemami leczenia ran

Przedstawiamy tutaj zintegrowany protokół generowania kontrolowanych zmian kostnych-chondralnych u kolan owiec, aby ustanowić eksperymentalny model odpowiedni do badań regeneracji tkanek kości i chrząstki. Protokół określa metodę wywołania pełnogrubego ubytku kości kostnodzielnej w kłykciu udowym, wykorzystując techniki minimalizujące wpływ na dobrostan zwierząt oraz zmienność wyników.

Ustanowienie i ocena modelu owiec o pełnej grubości ubytku kości kościowego

Poznaj metodę tworzenia hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do odbudowy szkliwa zębów. Technika umożliwia wzrost kryształów apatytu in situ, tworząc gęsty interfejs i poprawiając wytrzymałość mechaniczną odbudowanej warstwy.

Opracowanie hydrożelu amelogeninowo-chitozanowego do odrastania szkliwa in vitro z gęstym interfejsem

Przeglądaj więcej filmów