Bezkarmowe wyprowadzanie komórek progenitorowych grzebienia nerwowego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie progenitorowych komórek grzebienia neuronalnego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zgodnie z krótkim, powtarzalnym i zdefiniowanym protokołem. Komórki te mogą być następnie wykorzystane do badań in vitro nad chorobami związanymi z grzebieniem neuronalnym lub do dalszej dyferencjacji tych komórek w komórki potomne. Cel ten osiąga się poprzez wstępne wysianie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych o wysokiej gęstości w monowarstwie na matrigelu.

Drugim krokiem jest różnicowanie komórek w komórki neuroepithelialne z wykorzystaniem określonej sekwencji i kombinacji małych cząsteczek wpływających na kluczowe szlaki sygnalizacyjne. Następnie komórki neuroepithelialne są przesiewane i dalej różnicowane w komórki progenitorowe grzebienia nerwowego. Ostatnim etapem jest izolacja komórek grzebienia nerwowego przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Ostatecznie, aby wykazać, że wygenerowano odpowiednie komórki grzebienia neuronalnego, stosuje się immunofluorescencję oraz testy funkcjonalne, takie jak badanie zdolności komórek do migracji. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi protokołami otrzymywania komórek grzebienia neuronalnego z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych jest jej krótszy czas trwania. Wynosi on zaledwie 18 dni.

Metoda ta charakteryzuje się większą powtarzalnością dzięki wyeliminowaniu komórek karmicielk MS5. Jest łatwa do przeskalowania i wykazuje wysoką powtarzalność w różnych liniach ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na badania nad mechanizmami ludzkich chorób związanych z linią neuroektodermalną i wskazuje na potencjał w zakresie usprawnienia szczegółowego modelowania in vitro oraz przesiewania leków w kontekście tych schorzeń.

Przed rozpoczęciem protokołu należy upewnić się, że kolonie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych są wystarczająco duże, aby były widoczne gołym okiem, oraz że wciąż mają ostre krawędzie z niewielką liczbą komórek różnicujących się na ich obrzeżach. Gdy hPSC są gotowe do pasażowania, odessać medium, przemyć raz 5 mL 1x PBS i dodać do komórek 4 mL 0,05% trypsyny w EDTA. Następnie energicznie potrząsać naczyniem w płaszczyźnie poziomej przez 2 minuty, aż w mikroskopie będzie widać odrywanie się embrionalnych fibroblastów mysich od powierzchni płytki w postaci pojedynczych komórek.

Kolonie HPSC pozostaną przytwierdzone do naczynia w formie kolonii; następnie należy niezwłocznie i dokładnie odessać trypsynę i pozostawić płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie do czterech minut. Do płytki należy dodać dwa mililitry medium HES i za pomocą pipety P 1000 odkleić komórki. Jeśli komórki nie odrywają się łatwo, należy inkubować płytkę przez dodatkowe dwie do trzech minut.

W temperaturze pokojowej przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml pożywki HES, uzupełnionej o 10 µM dihydrochlorku Y 2 7 6 3 2. Następnie odessać matrigel z wcześniej przygotowanej szalki 10 cm i wysiać komórki w stosunku jeden do jednego lub jeden do dwóch na płytkę pokrytą matrigelem. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2.

Dokarmiać komórki codziennie pożywką HES, aż będą gotowe do różnicowania. Następnie rozpocząć różnicowanie neuronalne, gdy komórki osiągną 90% do 100% konfluencji. Jest to dzień zero.

Od dnia zerowego do trzeciego codziennie dokarmiaj komórki 10 mililitrami pożywki różnicującej KSR zawierającej 0,1 mikromol LDN 193189 oraz 10 mikromol SB 431542. Następnie w dniu czwartym i piątym dokarmiaj komórki 10 mililitrami pożywki składającej się w 75% z pożywki różnicującej KSR i w 25% z pożywki różnicującej And 2, z dodatkiem 0,1 mikromol LDN 193189 i 10 mikromol SB 431542. W dniu szóstym i siódmym dokarmiaj komórki pożywką dostosowaną tak, aby zawierała 50% pożywki różnicującej KSR i 50% pożywki różnicującej And 2, uzupełnioną o 0,1 mikromol LDN 193189 i 10 mikromol SB 431542.

W ósmym i dziewiątym dniu karmić komórki pożywką różnicującą 25% KSR oraz pożywką różnicującą 75% N2, obie zawierające 0,1 µM LDN 193189 oraz 10 µM SB 431542. Następnie w dziewiątym i dziesiątym dniu przygotować naczynia hodowlane z poli-L-ornityną, lamininą 1 i fibronektyną zgodnie z opisem w protokole tekstowym, które zostaną wykorzystane do ponownego wysiania komórek. W jedenastym dniu karmić komórki pożywką różnicującą N2 uzupełnioną o 0,1 µM LDN 193189 oraz 10 µM SB 431542. W dziesiątym lub jedenastym dniu odessać roztwór lamininy 1 i fibronektyny z wcześniej przygotowanych naczyń hodowlanych i pozostawić je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej w dygestorium do hodowli tkankowych przez 20 do 30 minut.

Następnie należy usunąć pożywkę z różnicujących się komórek i przemyć je raz roztworem XPBS. Potem do każdej płytki 10 centymetrowej należy dodać osiem mililitrów acuate i inkubować płytki przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji, za pomocą zgarniacza do komórek (cell lifter), należy odkleić komórki, a następnie resuspendować je w roztworze Accutane.

Za pomocą pipety o pojemności 5 ml przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie dodaj do probówki 5 ml 1x PBS i wiruj komórki przez 5 minut przy 115 g. Odlej nadosad i ponownie zawieś osad komórkowy w 10 ml 1x PBS. Następnie przefiltruj zawiesinę komórkową przez sito komórkowe o oczkach 40 µm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Policz komórki za pomocą cytometru hemocytometrycznego. Ponownie odwiruj komórki przez pięć minut przy 115 Gs i resuspenduj je do stężenia od 100 000 do 150 000 komórek na 10 µL uzupełnionej pożywki różnicującej N2. Używając pipety wielokrotnej, nanieś krople po 10 µL zawiesiny komórkowej na 15 cm szalki hodowlane, które zostały uprzednio potraktowane poli-L-ornityną.

Laminina 1 i fibronektyna. Pozostawić krople w temperaturze pokojowej na 15 do 20 minut. Następnie bardzo ostrożnie dodać do płytki 30 ml uzupełnionej pożywki różnicującej N2, nie naruszając kropli.

Inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO₂. W 12. dniu ostrożnie zasil komórki 20 ml medium do różnicowania N2 zawierającego 200 µM kwasu ascorynowego, 20 ng/ml czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF), 100 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów 8 (FGF8) oraz 20 ng/ml białka sonic hedgehog na każdą szalkę o średnicy 15 cm.

Następnie od 14. do 17. dnia karmić komórki co dwa do trzech dni pożywką różnicującą N2 zawierającą jedynie 200 µM kwasu retinoikowego, 20 ng/mL czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego oraz 100 ng/mL czynnika wzrostu fibroblastów 8. W 16. i 17. dniu przygotować płytki z poli-L-lizyną, lamininą 1 i fibronektyną, które zostaną wykorzystane do ponownego wysiania komórek grzebienia neuronalnego.

Po analizie FACS w 18. dniu, gdy komórki zostaną posortowane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), należy policzyć komórki grzebienia nerwowego, a następnie odwirować je z prędkością 115 G przez pięć minut. Osad komórkowy należy zawiesić w medium różnicującym N2 uzupełnionym o 10 ng/mL.

FGF2 w stężeniu 20 ng/mL, EGF oraz 10 µM Y 27632 dihydrochlorku przy zagęszczeniu 30 000 komórek na 10 µL. Całkowicie osusz naczynia hodowlane, które wcześniej przygotowano za pomocą poli-L-ornityny, lamininy 1 i fibronektyny. Następnie nanieś około 50–70 kropel zawiesiny komórkowej na szalkę 10 cm.

Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 15 do 20 minut, dodając do każdej szalki 10 cm 20 ml pożywki różnicującej N2 uzupełnionej o 10 ng/ml FGF2, 20 ng/ml EGF oraz 10 µM Y 27632 dihydrochloride, nie naruszając kropli.

Następnie inkubować komórki przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2. Po inkubacji utrzymywać i pasażować komórki grzebienia neuronalnego zgodnie z towarzyszącym protokołem tekstowym; komórki grzebienia neuronalnego zostały wyprowadzone z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu 18 dni, z zastosowaniem tego nowego protokołu różnicowania in vitro bez warstwy komórek karmicielskich.

Analiza FACS w 18. dniu pozwoliła zidentyfikować komórki wykazujące pozytywny wynik dla HNK-1 oraz P75, co potwierdziło obecność komórek grzebienia neuronalnego. Zarówno w protokole różnicowania bez komórek dokarmiających, jak i w protokole zależnym od komórek dokarmiających, komórki grzebienia neuronalnego przeszły przez stadium rozet neuronalnych. Ponadto komórki wyselekcjonowane metodą FACS posiadały identyczną morfologię i wykazywały ekspresję markerów grzebienia neuronalnego HNK-1 oraz P75. Porównanie globalnej ekspresji genów komórek grzebienia neuronalnego pochodzących z tych dwóch protokołów różnicowania wykazało, że obie grupy komórek tworzą blisko położone klastry.

Analiza zdolności migracyjnej komórek grzebienia neuronalnego uzyskanych przy użyciu protokołu bez warstwy wspomagającej (feeder-free) wykazała, że komórki pomyślnie migrowały w obszar zadrapania po 48 godzinach. Komórki te wykazują również potencjał do różnicowania się w komórki autonomicznego układu nerwowego, co zostało potwierdzone pozytywnym barwieniem na mash one oraz touch one po dodatkowych czterech dniach różnicowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić neuralizację ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz jak uzyskać in vitro progenitorowe komórki grzebienia neuronalnego.