Name: Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika umożliwia jednoczesną analizę ponad 250 parametrów immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Project Grants #1010395 (BQ i CP) oraz #525431 (CR), oraz Program Grant #455395 (CP) od National Health and Medical Research Council of Australia, grant Australijskiego Centrum Wirusowego Zapalenia Wątroby i HIV EOI 2012 (CR i RJJ) oraz grant od Fundacji Gordona i Małgosi Bootes (BQ i CR). Pragniemy podziękować Harpreet Vohra i Michaelowi Devoyowi za doskonałe utrzymanie laboratorium JCSMR FACS, Australijskiej Fundacji Badań nad Rakiem Biomolecular Resource Facility, JCSMR, ANU, za syntezę peptydów oraz dr Davidowi Boyle'owi z CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australia za dostarczenie zapasów rodzicielskiej szczepionki przeciwko HIV.

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
<li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li>
<li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+multi-gene%2C+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li>
<li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb%2FC+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li>
<li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+%28CFSE%29+to+monitor+lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
<li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li>
<li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li>
<li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer%2Fantigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li>
<li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zaletą testów opartych na FTA jest to, że umożliwiają one dyskryminację >250 żywotnych i w pełni funkcjonalnych populacji komórek docelowych od pojedynczego zwierzęcia gospodarza za pomocą cytometrii przepływowej. Zapewnia to poziom złożoności testów opartych na cytometrii przepływowej in vivo , który wcześniej nie był możliwy. Zostało to podkreślone w 2 doświadczeniach na zwierzętach pokazanych powyżej, w których odpowiedzi na 7 różnych epitopów wirusa w 6 stężeniach można było monitorować w powtórzeniach 6 jed...

Limfocyty T odgrywają kluczową rolę w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i często są celem manipulacji w immunoterapii. Limfocyty T efektorowe CD4 + reagują na obcy antygen, wydzielając cytokiny, które regulują wiele aspektów odporności, a także mogą bezpośrednio pomagać limfocytom B w wytwarzaniu przeciwciał. Ctotoksyczne limfocyty T CD8 + (CTL) mogą również reagować na obcy antygen poprzez wydzielanie cytokin, a także odgrywać kluczową rolę w bezpośrednim zabijaniu komórek wyrażających obcy antygen. Podstawowa interakcja, która inicjuje te funkcje efektorowe limfocytów T, obejmuje interakcję receptora limfocytów T (TCR) z obcymi peptydami wyświetlanymi na cząsteczkach MHC na powierzchni komórek. Limfocyty T CD4 + rozpoznają peptydy wyświetlane na cząsteczkach MHC klasy II na komórkach prezentujących antygen, a limfocyty T CD8 + rozpoznają peptydy wyświetlane na cząsteczkach MHC klasy I, które są zwykle wyświetlane na komórkach zakażonych drobnoustrojami.
Aby ocenić rolę limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej, konieczne jest, aby ich funkcje efektorowe były mierzone za pomocą wiarygodnych i czułych technik. Typowe metody oceny odpowiedzi limfocytów T obejmują; Reaktywność tetrameru MHC klasy I/II/peptydu; wytwarzanie cytokin metodą ELISPOT i barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych; i zdolność zabijania za pomocą 51testów uwalniania Cr. Testy te są jednak zwykle wykonywane ex vivo ze stymulacją in vitro lub zapewniają ograniczony wgląd w funkcję komórek T. Idealnie, przy pomiarze odpowiedzi limfocytów T korzystne byłoby ich ocenianie in situ, in vivo w momencie ich wystąpienia, bez manipulacji limfocytami T, aby uniknąć zmian parametrów funkcjonalnych, które mogą wystąpić w wyniku stymulacji in vitro. Niektóre z najczęściej stosowanych testów funkcjonalnych limfocytów T in vivo opierają się na pomiarze zabijania komórek docelowych za pośrednictwem CTL pulsacyjnie peptydami wiążącymi MHC klasy I, które są zliczane in vivo poprzez ich wykrywanie poprzez znakowanie fluorescencyjne za pomocą ważnych barwników, takich jak CFSE. Chociaż tego typu testy mogą monitorować zabijanie celów za pośrednictwem CTL, gdy dzieje się to in vivo, wcześniej miały stosunkowo ograniczoną zdolność do oceny zabijania wielu celów o różnych stężeniach i różnych typach epitopów peptydowych, co jest wymagane, aby umożliwić ocenę parametrów jakościowych, takich jak awidność funkcjonalna i reaktywność krzyżowa wariantu epitopu. Testy te również nie dostarczają żadnych informacji na temat odpowiedzi za pośrednictwem limfocytów T CD4 +.
Aby przezwyciężyć wiele ograniczeń obecnych metod stosowanych do oceny odpowiedzi limfocytów T, niedawno opracowaliśmy test multipleksowy oparty na fluorescencyjnych matrycach docelowych (FTA), który pozwala na monitorowanie odpowiedzi limfocytów T na >250 komórek docelowych jednocześnie u jednego zwierzęcia za pomocą cytometrii przepływowej >1,2. FTA składają się z limfocytów znakowanych kilkoma stężeniami i kombinacjami ważnych barwników, takich jak CFSE, CTV i CPD, co pozwala na wygenerowanie >250 klastrów komórek o unikalnej fluorescencji. Ponieważ komórki te pozostają żywotne i w pełni funkcjonalne, można je wstrzykiwać zwierzętom, aby umożliwić monitorowanie ich interakcji z efektorowymi limfocytami T in vivo3. Na przykład klastry komórek FTA mogą być pulsowane peptydami wiążącymi MHC klasy I, aby umożliwić ocenę zabijania komórek docelowych za pośrednictwem CTL specyficznego dla antygenu1. Ponadto klastry komórek FTA mogą być również pulsowane peptydami wiążącymi MHC klasy II, co pozwala na ocenę aktywności komórek pomocniczych T specyficznych dla antygenu (TH) poprzez ocenę aktywacji (poprzez ocenę markerów aktywacji, takich jak CD69, CD44 i / lub CD62L) komórek B w FTA zawierających pokrewny peptyd2. Ponieważ jednocześnie można wykryć ponad 250 celów, możliwe jest zmierzenie odpowiedzi CTL iT H na wiele docelowych klastrów komórek pulsujących licznymi peptydami o różnych stężeniach i włączeniu wielu powtórzeń. Test FTA zapewnia zatem bezprecedensowy poziom oceny odpowiedzi efektorowej limfocytów T in vivo.
Tutaj szczegółowo opisujemy konstrukcję FTA i pokazujemy, jak można je zastosować do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo. Procedura opisuje konstrukcję FTA składającej się z 252 dostrzegalnych klastrów komórkowych przy użyciu trzech ważnych barwników, składających się z 6 powtórzeń 42 klastrów komórkowych pulsowanych peptydami wiążącymi MHC klasy I i II. Oznakowanie 42 klastrów komórek odbywa się w probówkach o pojemności 10 ml ze stożkowym dnem i pomocne jest ułożenie ich w stojaku na probówki, jak pokazano w tabeli 1. Metodę tę można dostosować do mniejszej liczby dostrzegalnych klastrów zgodnie z wymaganiami, zmniejszając ilość etykietowania każdego wykonanego barwnika1.
Podkreślamy użyteczność testu, pokazując, jak może on mierzyć reakcje generowane przez szczepienie rekombinowanym wirusem ospy przeciwko wielu epitopom w małej kohorcie myszy. Pokazuje to, w jaki sposób test FTA może być wykorzystany do pomiaru skumulowanych odpowiedzi i awidności funkcjonalnej poprzez, odpowiednio, zastosowanie ocen pola pod krzywą (AUC) i pomiar efektywnego stężenia peptydu wymaganego do wygenerowania odpowiedzi połowicznych maksymalnych (EC50).

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anty-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD69 fioletowy brylantowy 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Eppendorf (Fortessa lub odpowiednik z niebieskim, czerwonym i fioletowym źródłem lasera)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów t in vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Możliwość monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej i projektowania immunoterapii. Tutaj opisujemy zastosowanie technologii fluorescencyjnej macierzy docelowej (FTA), która wykorzystuje niezbędne barwniki, takie jak ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE), fioletowe barwniki pobudliwe laserem (CellTrace Violet: CTV) i barwniki pobudliwe czerwonym laserem (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) do kombinatoryjnego znakowania mysich limfocytów w >250 rozpoznawalnych klastrach komórek fluorescencyjnych. Klastry komórkowe w tych FTA mogą być pulsowane peptydami wiążącymi główną zgodność tkankową (MHC) klasy I i MHC klasy II, a tym samym działać jako komórki docelowe odpowiednio dla limfocytów T CD8 + i CD4 +. Te komórki FTA pozostają żywotne i w pełni funkcjonalne, a zatem mogą być podawane myszom, aby umożliwić ocenę zabijania komórek docelowych FTA za pośrednictwem limfocytów T CD8 + i pomocy komórek docelowych komórek B komórek B FTA za pośrednictwem limfocytów T CD4 + w czasie rzeczywistym in vivo za pomocą cytometrii przepływowej. Ponieważ >250 komórek docelowych może być ocenianych jednocześnie, technika ta umożliwia monitorowanie odpowiedzi limfocytów T na kilka epitopów antygenowych w kilku stężeniach i w wielu powtórzeniach. W związku z tym technika ta może mierzyć odpowiedzi limfocytów T zarówno na poziomie ilościowym (np. skumulowana wielkość odpowiedzi), jak i jakościowym (np. awidność funkcjonalna i reaktywność krzyżowa epitopów odpowiedzi). W tym artykule opisujemy, w jaki sposób zbudowane są te FTA i podajemy przykład, w jaki sposób można je zastosować do oceny odpowiedzi limfocytów T indukowanych przez rekombinowaną szczepionkę przeciwko wirusowi ospy.

Jako przykład zastosowania testu FTA, mysz szczepu BALB/c zimmunizowano rekombinowanym wirusem ospy krowiej (VV) wykazującym epitopy HIV-I (VV-HIV), a następnie oceniono odpowiedzi na epitopy CTL HIV-I (Gag, Gag mut, Env i Pol), epitopy CTL VV (F2L i F2L mut) oraz epitop komórek TH HIV-I, Gag Th (opisany w2), wykorzystując test FTA o 252 parametrach (Rycina 1B). Warianty epitopów Gag (Gag mut) i F2L (F2L mut) nie są ekspresowane w wektorze VV-HIV, zatem odpowiedzi przeciwko tym epit...

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia >250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie macierzy do 252 wyraźnie oznakowanych fluorescencyjnie komórek docelowych do testów immunologicznych z wykorzystaniem wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Jest to realizowane poprzez wstępne znakowanie limfocytów docelowych unikalnymi kombinacjami i intensywnościami barwników witalnych, takich jak CFSE i CTV. Następnym krokiem jest inkubacja każdej odrębnej populacji limfocytów docelowych z kandydującymi epitopami peptydowymi wiążącymi się z MHC klasy I oraz MHC klasy II.Następnie komórki są poddawane intensywnemu płukaniu w celu zachowania specyficzności epitopów, a następnie są łączone w jedną pulę i wstrzykiwane zwierzęciu. Ostatnie etapy polegają na odzyskaniu komórek z matrycy znaczników fluorescencyjnych z określonych tkanek, ich znakowaniu oraz ocenie odpowiedzi specyficznych dla peptydów MHC. W rezultacie wyniki cytometrii przepływowej mogą wykazać odpowiedzi CTL poprzez pomiar śmierci komórek docelowych, a także odpowiedzi limfocytów T pomocniczych CD4+ poprzez pomiar zwiększonej ekspresji markerów aktywacji w docelowych limfocytach B. Główną zaletą tej techniki nad konwencjonalnymi testami CTL in vivo jest możliwość jednoczesnego pomiaru ponad 250 komórek docelowych u jednego zwierzęcia; procedurę tę zaprezentuje Ben Quire, stażysta naukowy w moim laboratorium.Procedura wymaga limfocytów pobranych z wyizolowanej śledziony i/lub węzłów chłonnych myszy, przefiltrowanych i resuspendowanych w stężeniu do 200 milionów komórek na mililitr w 11,5 mililitrach medium RPMI zawierającego 5% płodowej surowicy cielęcej. Przygotowanie FDA rozpoczyna się od etykietowania. W 42 plastikowych probówkach stożkowych o pojemności 10 mililitrów, ponumerowanych od 1 do 42, wszystkie komórki zostaną poddane impulsowej ekspozycji na siedem różnych epitopów peptydowych w sześciu różnych stężeniach, powtórzonych sześciokrotnie, aby wygenerować 252 rozróżnialne klastry komórek.Następnie dokładnie resuspenduj limfocyty, odwracając probówkę kilka razy. Do probówek o pojemności 10 ml ponumerowanych od 37 do 42 dodaj po 1,9 ml zawiesiny komórkowej, uważając, aby nie zwilżyć górnej połowy probówek.Teraz należy odkręcić nakrętkę z probówki 38 i położyć ją poziomo nad probówką 38. Dodać 83 µL PBS. Następnie dodać 17 µL odpowiedniego roztworu CTV z zapasu, zgodnie z tabelą 2 w protokole tekstowym.Po napełnieniu probówki należy ją wymieszać na wibratorze vortex. Powtórz tę czynność dla probówek od 39 do 42, upewniając się, że każda probówka otrzyma inny zapas CTV, zgodnie z listą w tabeli dwa.Następnie inkubuj komórki przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej. Potem dodaj pięć mililitrów RPMI zawierającego 5% FCS do każdej probówki. Dokładnie resuspenduj komórki, mieszając każdą probówkę na wirówce typu vortex. Przenieś jeden mililitr zawiesiny do sześciu innych probówek, stosując sugerowany schemat rozlewania opisany w protokole tekstowym; podczas każdego przenoszenia ważne jest, aby nie zamoczyć górnej części napełnionej probówki. Aby znakować komórki CFSE, zdejmij nakrętki z probówek 31 do 36 zawierających jeden mililitr komórek i ułóż probówki poziomo obok siebie.Najpierw należy dodać 103 µL PBS, rozpylając go na suchej górnej ściance. Następnie dodaje się siedem µL odpowiedniego roztworu zapasu CFSE zgodnie z tabelą 3 protokołu tekstowego i natychmiast miesza próbkę w wirówce typu vortex. Czynność tę powtarza się dla pozostałych probówek zgodnie z grupami określonymi w tabeli 3.Należy upewnić się, że do każdej probówki zostanie dodany inny stok CFSE. Wszystkie probówki należy inkubować przez co najmniej pięć minut w temperaturze pokojowej. Po upływie pięciu minut należy wypłukać komórki, aby zakończyć proces znakowania.Każdą zawiesinę należy rozcieńczyć dziewięcioma mililitrami medium RPMI z 5% FCS w temperaturze pokojowej. Komórki należy odwirować przy 300 GS przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć nadsączki poprzez aspirację za pomocą pipety transferowej. Sposób przygotowania peptydów wiążących MHC klasy I oraz MHC klasy II został przedstawiony w protokole tekstowym. Niniejsza sekcja pokazuje, jak przeprowadzić pulsacyjne znakowanie komórek tymi peptydami.Najpierw resuspenduj pellet komórkowy w pozostałym medium, na przykład przesuwając probówki wzdłuż kratki. Następnie uzupełnij całkowitą objętość zawiesiny komórkowej do 250 µL w medium PMI zawierającym 5% FCS. Każdy pellet komórkowy powinien wymagać około 200 µL medium.Następnie do wyznaczonych probówek dodaj 250 µL wcześniej przygotowanych roztworów stokowych peptydów wymienionych w tabeli pięć. Postępuj zgodnie ze schematem przedstawionym w tabeli jeden i pamiętaj o uwzględnieniu probówki kontrolnej z samym PBS w celu obliczenia odpowiedzi limfocytów T. Kluczowe jest, aby każdy epitop peptydowy i każde stężenie peptydu przypisać do jednej probówki i wyraźnie to odnotować, opierając się na oczekiwanej fluorescencji komórek w danej probówce.Ponieważ sygnatura fluorescencyjna tego klastra zdefiniuje ten peptyd, wymieszaj każdą zawiesinę komórkową za pomocą wortexu, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po inkubacji przystąp do przemywania komórek. Najpierw dodaj pięć ml lodowatego medium RPMI z 5% FCS do każdej zawiesiny komórkowej i resuspenduj komórki poprzez odwracanie probówek.Następnie pod każdą zawiesinę komórkową ostrożnie podłożyć trzy mililitry schłodzonego w lodzie osadu FCS, wirowanego przez 10 minut przy 300 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Należy zastosować powolne przyspieszanie i hamowanie, aby zapewnić utrzymanie granicy faz w każdej probówce. Ostrożnie odessać medium RPMI, a następnie odessać FCS, nie naruszając wypłukanego osadu komórkowego.Po wyizolowaniu osadów, należy ponownie przemyć komórki. Zawiesić dwukrotnie przemyte osady komórkowe w 10 ml lodowatego medium RPMI z 5% FCS i powtórzyć wirowanie, a po zakończeniu procesu odlać nadsącz. Następnie połączyć wszystkie populacje w nowej probówce o pojemności 10 ml z 6 ml lodowatego medium RPMI zawierającego 5% FCS, osadzić połączone komórki poprzez wirowanie i odessać nadsącz pipetą transferową na tym etapie całej procedury.Sześć powtórzeń wewnątrzanalizy można uzyskać, znakując komórki poddane impulsowi peptydowemu sześcioma różnymi stężeniami CPD. Po pierwsze, do połączonego osadu komórkowego należy dodać 11,4 mililitrów medium RPMI o temperaturze pokojowej zawierającego 5% FCS i dokładnie resuspendować za pomocą pipetowania. Po drugie, do sześciu nowych probówek o pojemności 10 mililitrów, oznakowanych od A do F, należy dodać 1,9 mililitra zawiesiny komórkowej, dbając o to, aby nie zwilżyć górnej połowy probówki.Aby rozpocząć znakowanie komórek, należy wziąć niezakorkowaną probówkę B z CPD i ułożyć ją poziomo wzdłuż suchej ścianki. Najpierw dodać 92 µL PBS, a następnie objętość zapasu CPD zgodnie z tabelą 4. Następnie wymieszać zawartość za pomocą wirówki vortex. Powtórzyć ten krok dla probówek od C do F, upewniając się, że do każdej probówki trafia inny zapas CPD, zgodnie z tabelą 4.Po wymieszaniu wszystkich probówek należy inkubować je przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie komórki należy przemyć dwukrotnie: najpierw resuspender w 10 ml medium w temperaturze pokojowej, następnie odwirować, a na koniec odessać nadsącz za pomocą pipety transferowej.Następnie powtórz ten proces. Teraz połącz wszystkie komórki z probówek od A do F w jednej probówce w 8 mL schłodzonej pożywki.Zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie przystąpić do ich iniekcji u zwierząt i późniejszej analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Szczegóły podano w protokole tekstowym. Myszy BC zaszczepiono rekombinowanym wirusem vaccinia ekspresującym epitopy HIV V1, a odpowiedzi na poszczególne epitopy oceniono za pomocą 252-parametrowego testu FTA.Dwa warianty epitopów gag mute i FTL mute nie zostały wyrażone w wektorze, a myszy naiwne otrzymały również wstrzyknięty FTA. TA odróżniono od komórek gospodarza (myszy) za pomocą znakowania P KH 26, natomiast komórki FTAB odróżniono za pomocą barwienia przeciwciałem B two 20 w cytometrii przepływowej. Każda z sześciu powtórzeń wewnątrz zwierzęcia została poddana bramkowaniu na podstawie fluorescencji CPD. Cele FTA wyrażające różne stężenia epitopów zostały poddane bramkowaniu na podstawie fluorescencji CFSE i CTV.Odsetek specyficznej eliminacji dla każdej powtórki oceniono poprzez porównanie śmierci komórek w klastrach FTA u zwierząt prymowanych w stosunku do odpowiadających im klastrów FTA u zwierząt naiwnych. Aktywność limfocytów T pomocniczych oceniano, porównując upregulację CD 69 w limfocytach B klastrów FTA u zwierząt prymowanych w stosunku do odpowiadających im klastrów limfocytów B FTA u zwierząt naiwnych. Z analizy tej wynika, że infekcja V-V-H-I-V wywołała najsilniejszą odpowiedź CTL przeciwko immunodominującemu epitopowi VV F two L, przy czym ze śledziony usunięto 100% docelowych komórek FDA impulsowanych epitopem w stężeniu 0,001 micromolar lub wyższym.Oprócz odpowiedzi CTL, test FTA służył również do pomiaru odpowiedzi limfocytów T pomocniczych poprzez ocenę aktywacji komórek FTAB wykazujących epitop wiążący klasy drugiej H-I-V-M-H-C HIV gag th. Wykazało to, że u zwierząt uwrażliwionych wystąpiła specyficzna dla antygenu aktywacja limfocytów B, co sugeruje generowanie efektorowych limfocytów T pomocniczych specyficznych dla HIV gag. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wygenerować fluorescencyjną macierz celów składającą się z ponad 250 komórek docelowych.

the-use-fluorescent-target-arrays-for-assessment-t-cell-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie fluorescencyjnych tablic docelowych do oceny reakcji limfocytów T in vivo

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Ten film demonstruje technikę wielospektralnej fluorescencji in-situ do analizy różnych subpopulacji infiltrujących limfocytów T w tkance nowotworowej. Kriosekcja tkankowa raka nerkowokomórkowego jest traktowana przeciwciałami znakującymi limfocyty T CD8 +, które wyrażają specyficzne receptory hamujące i wykazują fenotyp oporny na immunoterapię. Oznaczony odcinek jest wizualizowany za pomocą mikroskopu wielospektralnego w celu identyfikacji odrębnych subpopulacji limfocytów T CD8 +.

Multipleksowane obrazowanie immunofluorescencyjne w celu analizy subpopulacji limfocytów T opornych na immunoterapię

Opisujemy protokół monitorowania ruchliwości radialnej nieprzylegających komórek odpornościowych in vitro za pomocą kolektora sedymentacyjnego/suwaka komórkowego. Migracja komórek jest śledzona na monowarstwach komórek nowotworowych lub na białkach macierzy zewnątrzkomórkowej. Badanie za pomocą mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej pozwala na obserwację ruchliwości komórek i funkcjonalności cytotoksycznej.

Ruchliwość promieniowa i funkcja cytotoksyczna retrowirusowych limfocytów T transdukowanych wektorem replikującym, nieadherentnych alloreagujących limfocytów T

Tutaj opisujemy test wysokiej wydajności chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (HPLC-MS/MS) do ilościowego oznaczania immunosupresyjnego takrolimusu w wysuszonych plamach krwi przy użyciu prostego ręcznego etapu wytrącania białka i ekstrakcji kolumnowej online.

Oznaczanie ilościowe takrolimusu działającego immunosupresyjnie na wysuszonych plamkach krwi za pomocą LC-MS/MS

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Poznaj metodę fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika umożliwia jednoczesną analizę ponad 250 parametrów immunologicznych.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Przeglądaj więcej filmów