Name: Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika umożliwia jednoczesną analizę ponad 250 parametrów immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Project Grants #1010395 (BQ i CP) oraz #525431 (CR), oraz Program Grant #455395 (CP) od National Health and Medical Research Council of Australia, grant Australijskiego Centrum Wirusowego Zapalenia Wątroby i HIV EOI 2012 (CR i RJJ) oraz grant od Fundacji Gordona i Małgosi Bootes (BQ i CR). Pragniemy podziękować Harpreet Vohra i Michaelowi Devoyowi za doskonałe utrzymanie laboratorium JCSMR FACS, Australijskiej Fundacji Badań nad Rakiem Biomolecular Resource Facility, JCSMR, ANU, za syntezę peptydów oraz dr Davidowi Boyle'owi z CSIRO Animal Health Laboratories, Geelong, Australia za dostarczenie zapasów rodzicielskiej szczepionki przeciwko HIV.

<ol><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+killing+assay%3A+A+multiplex+cytotoxic+T-cell+assay+to+measure+detailed+T-cell+antigen+specificity+and+avidity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo.</a> Cytometry A. 81, 679-690 (2012).</li>
<li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+target+array+T+helper+assay%3A+a+multiplex+flow+cytometry+assay+to+measure+antigen-specific+CD4%2B+T+cell-mediated+B+cell+help+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo.</a> J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+methods+for+measuring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+using+CFSE-like+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes.</a> J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).</li>
<li>Mata, M., Paterson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1+T+cell+responses+to+HIV-1+Gag+protein+delivered+by+a+Listeria+monocytogenes+vaccine+are+similar+to+those+induced+by+endogenous+listerial+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens.</a> J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).</li>
<li>Earl, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+evaluation+of+multi-gene%2C+multi-clade+HIV-1+MVA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines.</a> Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).</li>
<li>Wild, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+the+immunogenicity+of+C-type+HIV-1-based+DNA+and+NYVAC+vaccines+in+the+Balb%2FC+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model.</a> Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).</li>
<li>Takeshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+same+HIV+peptide+functionally+binding+to+both+a+class+I+and+a+class+II+MHC+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule.</a> J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nature Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+viable+cells+for+high-throughput+analysis+of+glycine+receptor+function+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry.</a> Cytometry A. 75, 440-449 (2009).</li>
<li>Quah, B. J., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+%28CFSE%29+to+monitor+lymphocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Hermans, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+VITAL+assay%3A+a+versatile+fluorometric+technique+for+assessing+CTL-+and+NKT-mediated+cytotoxicity+against+multiple+targets+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo.</a> J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).</li>
<li>Busch, D. H., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+affinity+maturation+by+selective+expansion+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell affinity maturation by selective expansion during infection.</a> J Exp Med. 189, 701-710 (1999).</li>
<li>Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+basis+for+T+cell+receptor+repertoire+selection+during+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response.</a> Immunity. 10, 485-492 (1999).</li>
<li>Wang, X. L., Altman, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveats+in+the+design+of+MHC+class+I+tetramer%2Fantigen-specific+T+lymphocytes+dissociation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays.</a> J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).</li>
<li>von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+behind+functional+avidity+maturation+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells.</a> Clin Dev Immunol. , (2012).</li>
<li>Prussin, C., Metcalfe, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracytoplasmic+cytokine+using+flow+cytometry+and+directly+conjugated+anti-cytokine+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies.</a> J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).</li>
<li>Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intracellular+cytokines+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. , (2007).</li>
<li>Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+solid-phase+enzyme-linked+immunospot+%28ELISPOT%29+assay+for+enumeration+of+specific+antibody-secreting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells.</a> J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).</li>
<li>Klinman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISPOT+assay+to+detect+cytokine-secreting+murine+and+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells.</a> Curr Protoc Immunol. , (2008).</li>
<li>Yerly, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cytotoxic+T-lymphocyte+epitope+variant+cross-recognition+and+functional+avidity+are+associated+with+hepatitis+C+virus+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance.</a> J Virol. 82, 3147-3153 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zaletą testów opartych na FTA jest to, że umożliwiają one dyskryminację >250 żywotnych i w pełni funkcjonalnych populacji komórek docelowych od pojedynczego zwierzęcia gospodarza za pomocą cytometrii przepływowej. Zapewnia to poziom złożoności testów opartych na cytometrii przepływowej in vivo , który wcześniej nie był możliwy. Zostało to podkreślone w 2 doświadczeniach na zwierzętach pokazanych powyżej, w których odpowiedzi na 7 różnych epitopów wirusa w 6 stężeniach można było monitorować w powtórzeniach 6 jed...

Limfocyty T odgrywają kluczową rolę w adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej i często są celem manipulacji w immunoterapii. Limfocyty T efektorowe CD4 + reagują na obcy antygen, wydzielając cytokiny, które regulują wiele aspektów odporności, a także mogą bezpośrednio pomagać limfocytom B w wytwarzaniu przeciwciał. Ctotoksyczne limfocyty T CD8 + (CTL) mogą również reagować na obcy antygen poprzez wydzielanie cytokin, a także odgrywać kluczową rolę w bezpośrednim zabijaniu komórek wyrażających obcy antygen. Podstawowa interakcja, która inicjuje te funkcje efektorowe limfocytów T, obejmuje interakcję receptora limfocytów T (TCR) z obcymi peptydami wyświetlanymi na cząsteczkach MHC na powierzchni komórek. Limfocyty T CD4 + rozpoznają peptydy wyświetlane na cząsteczkach MHC klasy II na komórkach prezentujących antygen, a limfocyty T CD8 + rozpoznają peptydy wyświetlane na cząsteczkach MHC klasy I, które są zwykle wyświetlane na komórkach zakażonych drobnoustrojami.
Aby ocenić rolę limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej, konieczne jest, aby ich funkcje efektorowe były mierzone za pomocą wiarygodnych i czułych technik. Typowe metody oceny odpowiedzi limfocytów T obejmują; Reaktywność tetrameru MHC klasy I/II/peptydu; wytwarzanie cytokin metodą ELISPOT i barwienie cytokin wewnątrzkomórkowych; i zdolność zabijania za pomocą 51testów uwalniania Cr. Testy te są jednak zwykle wykonywane ex vivo ze stymulacją in vitro lub zapewniają ograniczony wgląd w funkcję komórek T. Idealnie, przy pomiarze odpowiedzi limfocytów T korzystne byłoby ich ocenianie in situ, in vivo w momencie ich wystąpienia, bez manipulacji limfocytami T, aby uniknąć zmian parametrów funkcjonalnych, które mogą wystąpić w wyniku stymulacji in vitro. Niektóre z najczęściej stosowanych testów funkcjonalnych limfocytów T in vivo opierają się na pomiarze zabijania komórek docelowych za pośrednictwem CTL pulsacyjnie peptydami wiążącymi MHC klasy I, które są zliczane in vivo poprzez ich wykrywanie poprzez znakowanie fluorescencyjne za pomocą ważnych barwników, takich jak CFSE. Chociaż tego typu testy mogą monitorować zabijanie celów za pośrednictwem CTL, gdy dzieje się to in vivo, wcześniej miały stosunkowo ograniczoną zdolność do oceny zabijania wielu celów o różnych stężeniach i różnych typach epitopów peptydowych, co jest wymagane, aby umożliwić ocenę parametrów jakościowych, takich jak awidność funkcjonalna i reaktywność krzyżowa wariantu epitopu. Testy te również nie dostarczają żadnych informacji na temat odpowiedzi za pośrednictwem limfocytów T CD4 +.
Aby przezwyciężyć wiele ograniczeń obecnych metod stosowanych do oceny odpowiedzi limfocytów T, niedawno opracowaliśmy test multipleksowy oparty na fluorescencyjnych matrycach docelowych (FTA), który pozwala na monitorowanie odpowiedzi limfocytów T na >250 komórek docelowych jednocześnie u jednego zwierzęcia za pomocą cytometrii przepływowej >1,2. FTA składają się z limfocytów znakowanych kilkoma stężeniami i kombinacjami ważnych barwników, takich jak CFSE, CTV i CPD, co pozwala na wygenerowanie >250 klastrów komórek o unikalnej fluorescencji. Ponieważ komórki te pozostają żywotne i w pełni funkcjonalne, można je wstrzykiwać zwierzętom, aby umożliwić monitorowanie ich interakcji z efektorowymi limfocytami T in vivo3. Na przykład klastry komórek FTA mogą być pulsowane peptydami wiążącymi MHC klasy I, aby umożliwić ocenę zabijania komórek docelowych za pośrednictwem CTL specyficznego dla antygenu1. Ponadto klastry komórek FTA mogą być również pulsowane peptydami wiążącymi MHC klasy II, co pozwala na ocenę aktywności komórek pomocniczych T specyficznych dla antygenu (TH) poprzez ocenę aktywacji (poprzez ocenę markerów aktywacji, takich jak CD69, CD44 i / lub CD62L) komórek B w FTA zawierających pokrewny peptyd2. Ponieważ jednocześnie można wykryć ponad 250 celów, możliwe jest zmierzenie odpowiedzi CTL iT H na wiele docelowych klastrów komórek pulsujących licznymi peptydami o różnych stężeniach i włączeniu wielu powtórzeń. Test FTA zapewnia zatem bezprecedensowy poziom oceny odpowiedzi efektorowej limfocytów T in vivo.
Tutaj szczegółowo opisujemy konstrukcję FTA i pokazujemy, jak można je zastosować do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo. Procedura opisuje konstrukcję FTA składającej się z 252 dostrzegalnych klastrów komórkowych przy użyciu trzech ważnych barwników, składających się z 6 powtórzeń 42 klastrów komórkowych pulsowanych peptydami wiążącymi MHC klasy I i II. Oznakowanie 42 klastrów komórek odbywa się w probówkach o pojemności 10 ml ze stożkowym dnem i pomocne jest ułożenie ich w stojaku na probówki, jak pokazano w tabeli 1. Metodę tę można dostosować do mniejszej liczby dostrzegalnych klastrów zgodnie z wymaganiami, zmniejszając ilość etykietowania każdego wykonanego barwnika1.
Podkreślamy użyteczność testu, pokazując, jak może on mierzyć reakcje generowane przez szczepienie rekombinowanym wirusem ospy przeciwko wielu epitopom w małej kohorcie myszy. Pokazuje to, w jaki sposób test FTA może być wykorzystany do pomiaru skumulowanych odpowiedzi i awidności funkcjonalnej poprzez, odpowiednio, zastosowanie ocen pola pod krzywą (AUC) i pomiar efektywnego stężenia peptydu wymaganego do wygenerowania odpowiedzi połowicznych maksymalnych (EC50).

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Serana</td><td>FCS-500</td><td></td></tr><tr><td>CTV</td><td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>CFDA, SE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>CPD</td><td>eBioscience</td><td>65-0840-90</td><td></td></tr><tr><td>anty-B220 PerCp-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>110730</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD69 fioletowy brylantowy 605</td><td>Biolegend</td><td>104529</td><td></td></tr><tr><td>PKH-26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Vortex</td><td>Scientific Industries Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Eppendorf (Fortessa lub odpowiednik z niebieskim, czerwonym i fioletowym źródłem lasera)</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów t in vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Możliwość monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej i projektowania immunoterapii. Tutaj opisujemy zastosowanie technologii fluorescencyjnej macierzy docelowej (FTA), która wykorzystuje niezbędne barwniki, takie jak ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny (CFSE), fioletowe barwniki pobudliwe laserem (CellTrace Violet: CTV) i barwniki pobudliwe czerwonym laserem (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) do kombinatoryjnego znakowania mysich limfocytów w >250 rozpoznawalnych klastrach komórek fluorescencyjnych. Klastry komórkowe w tych FTA mogą być pulsowane peptydami wiążącymi główną zgodność tkankową (MHC) klasy I i MHC klasy II, a tym samym działać jako komórki docelowe odpowiednio dla limfocytów T CD8 + i CD4 +. Te komórki FTA pozostają żywotne i w pełni funkcjonalne, a zatem mogą być podawane myszom, aby umożliwić ocenę zabijania komórek docelowych FTA za pośrednictwem limfocytów T CD8 + i pomocy komórek docelowych komórek B komórek B FTA za pośrednictwem limfocytów T CD4 + w czasie rzeczywistym in vivo za pomocą cytometrii przepływowej. Ponieważ >250 komórek docelowych może być ocenianych jednocześnie, technika ta umożliwia monitorowanie odpowiedzi limfocytów T na kilka epitopów antygenowych w kilku stężeniach i w wielu powtórzeniach. W związku z tym technika ta może mierzyć odpowiedzi limfocytów T zarówno na poziomie ilościowym (np. skumulowana wielkość odpowiedzi), jak i jakościowym (np. awidność funkcjonalna i reaktywność krzyżowa epitopów odpowiedzi). W tym artykule opisujemy, w jaki sposób zbudowane są te FTA i podajemy przykład, w jaki sposób można je zastosować do oceny odpowiedzi limfocytów T indukowanych przez rekombinowaną szczepionkę przeciwko wirusowi ospy.

Jako przykład zastosowania testu FTA, mysz szczepu BALB/c zimmunizowano rekombinowanym wirusem ospy krowiej (VV) wykazującym epitopy HIV-I (VV-HIV), a następnie oceniono odpowiedzi na epitopy CTL HIV-I (Gag, Gag mut, Env i Pol), epitopy CTL VV (F2L i F2L mut) oraz epitop komórek TH HIV-I, Gag Th (opisany w2), wykorzystując test FTA o 252 parametrach (Rycina 1B). Warianty epitopów Gag (Gag mut) i F2L (F2L mut) nie są ekspresowane w wektorze VV-HIV, zatem odpowiedzi przeciwko tym epit...

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia >250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie macierzy do 252 wyraźnie oznakowanych fluorescencyjnie komórek docelowych do testów immunologicznych z wykorzystaniem wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Jest to realizowane poprzez wstępne znakowanie limfocytów docelowych unikalnymi kombinacjami i intensywnościami barwników witalnych, takich jak CFSE i CTV. Następnym krokiem jest inkubacja każdej odrębnej populacji limfocytów docelowych z kandydującymi epitopami peptydowymi wiążącymi się z MHC klasy I oraz MHC klasy II.Następnie komórki są poddawane intensywnemu płukaniu w celu zachowania specyficzności epitopów, a następnie są łączone w jedną pulę i wstrzykiwane zwierzęciu. Ostatnie etapy polegają na odzyskaniu komórek z matrycy znaczników fluorescencyjnych z określonych tkanek, ich znakowaniu oraz ocenie odpowiedzi specyficznych dla peptydów MHC. W rezultacie wyniki cytometrii przepływowej mogą wykazać odpowiedzi CTL poprzez pomiar śmierci komórek docelowych, a także odpowiedzi limfocytów T pomocniczych CD4+ poprzez pomiar zwiększonej ekspresji markerów aktywacji w docelowych limfocytach B. Główną zaletą tej techniki nad konwencjonalnymi testami CTL in vivo jest możl

the-use-fluorescent-target-arrays-for-assessment-t-cell-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie fluorescencyjnych tablic docelowych do oceny reakcji limfocytów T in vivo

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Opisujemy jednokomórkowy test wysokoprzepustowy do pomiaru cytotoksyczności limfocytów T podczas inkubacji z komórkami docelowymi nowotworu. Metoda ta wykorzystuje gęsty, elastomerowy układ dołków sub-nanolitrowych (~ 100 000 dołków / tablicę) w celu przestrzennego ograniczenia limfocytów T i komórek docelowych w określonych proporcjach i jest sprzężona z mikroskopią fluorescencyjną w celu monitorowania koniugacji efektor-cel i późniejszej apoptozy.

Ilościowy, wysokoprzepustowy test cytotoksyczności pojedynczej komórki dla limfocytów T

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Poznaj metodę fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika umożliwia jednoczesną analizę ponad 250 parametrów immunologicznych.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Przeglądaj więcej filmów