Name: Zautomatyzowany pomiar prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj metodę automatycznego pomiaru prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu przerzutów nowotworowych do płuc szczurów przy użyciu zamkniętej klatki piersiowej i mikroskopii intrawitalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Naukowe porady doktorów Timothy'ego McMahona i Siqing Shan są doceniane. Prelegenci dziękują doktorom Davidowi Kirschowi i Patricii Steeg za hojny dar w postaci fluorescencyjnie znakowanego mięsaka myszy i przerzutowych komórek MDAMB-231. Praca ta została częściowo sfinansowana przez Amerykańską Agencję Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności (DARPA) o numerze N66001-10-C-2134, a częściowo przez Wydział Radioterapii Onkologicznej Centrum Medycznego Uniwersytetu Duke'a.

UWAGA: Wszystkie procedury związane ze zwierzętami opisane w tym protokole zostały wcześniej zatwierdzone przez Duke University Institutional Animal Care and Use Committee (DUIACUC).
1. Hodowla i iniekcja komórek rakowych
<ol>
	<li>Hoduj znakowane fluorescencyjnie przerzutowe komórki rakowe (np. ludzkie komórki raka piersi MDAMB231-GFP, dar od dr Patricii Steeg, NCI, i komórki mięsaka myszy znakowane YFP, dar od dr Davida Kirscha, Duke University Medical Center, Wydział Radioterapii Onkologicznej) w odpowiedniej pożywce hodowlanej (np. Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną/streptawidyną) w temperaturze 37 °C do około 90% zlewania się.</li>
	<li>Trypsynizuj komórki, umyj je 2 razy PBS, policz, a następnie wstrzyknij do żył ogonowych 10-tygodniowych samic nagich szczurów znieczulanych izofluranem w ilości 5 milionów komórek na zwierzę, używając strzykawki z igłą 27 G. Znieczulenie na poziomie chirurgicznym weryfikuje brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.</li>
</ol>
2. Monitorowanie przerzutów za pomocą MicroCT
<ol>
	<li>Badaj szczury raz w tygodniu za pomocą mikro-CT/mikro-naświetlacza, aby wykryć obecność przerzutów o średnicy powyżej około 2 mm. Mikrotomografia komputerowa jest uruchamiana zgodnie z wcześniejszym opisem12.
	<ol>
		<li>Poddaj szczury 3% znieczuleniu izofluranem przed obrazowaniem. Potwierdź głębokie znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi.</li>
		<li>Po rozpoczęciu znieczulenia należy szybko przenieść szczury do kołyski obrazowej w komorze obrazowania i połączyć za pomocą stożka nosowego z mieszaniną izofluranu i powietrza w ilości 2,5-3%. Dostosuj pozycję szczura w kołysce w taki sposób, aby jego klatka piersiowa znajdowała się w wiązce fotonów skanera MicroCT, korzystając z zewnętrznych elementów sterujących położeniem i ogranicznika laserowego na podstawce do obrazowania. Upewnij się, że drzwi do komory obrazowania są zamknięte, aby chronić badacza przed promieniowaniem gamma.</li>
		<li>Ponownie kontroluj pozycję zwierzęcia za pomocą kolorowej kamery wideo. Wykonaj test obrazowania CT o niskiej rozdzielczości i użyj uzyskanego obrazu, aby dostosować pole widzenia do wymiarów xyz klatki piersiowej.</li>
		<li>Zobrazuj klatkę piersiową szczura za pomocą filtra Al 2 mm przy 40 kVp, 2,5 mA i 0,008 woksela przy 7 klatkach na sekundę i umieść zwierzę z powrotem w klatce. Obrazowanie jednego zwierzęcia nie powinno trwać dłużej niż 15 lub 20 minut. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.</li>
		<li>Potwierdź przerzuty poprzez pojawienie się stosunkowo nieprzezroczystych dla promieni rentgenowskich obiektów, których nie można wyjaśnić za pomocą naczyń krwionośnych wewnątrz klatki piersiowej (ryc. 1A)</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Chirurgia komory okiennej
<ol>
	<li>Znieczulenie, parametry życiowe i cewnikowanie żył ogonowych
	<ol>
		<li>Wybierz zwierzęta z obecnością choroby przerzutowej. Wstrzyknąć zwierzęciu dawkę dootrzewnową 50 mg/kg pentobarbitalu. Przed kontynuowaniem potwierdź znieczulenie na poziomie chirurgicznym przez uszczypnięcie palca u nogi. 
		 Uwaga: Protokoły anestezjologiczne powinny być dopasowane do odpowiedniej konfiguracji eksperymentalnej. Pentobarbital został tutaj wybrany jako długo działający środek znieczulający, w celu wywołania głębokiego znieczulenia podczas długich zabiegów, oferując jednocześnie możliwość łatwego ponownego dawkowania. Jednak utrata zwierząt w wyniku przedawkowania jest częstym problemem związanym ze znieczuleniem pentobarbitalem. Inną opcją, która zachowuje odruchy autonomiczne w większym stopniu niż pentobarbital, jest ketamina w połączeniu ze środkami uspokajającymi, takimi jak ksylazyna lub medetomidyna, która jednak pozwala tylko na jeden cykl ponownego dawkowania.</li>
		<li>Gol zwierzęta po tej stronie ciała, która ma chorobę przerzutową, oraz w okolicy szyi za pomocą maszynki do strzyżenia. Zetrzyj wszystkie pozostałe luźne włosy ze skóry. Po usunięciu luźnych włosów nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. 
		UWAGA: Nagie szczury atymiczne mogą mieć resztki włosów, które wymagają usunięcia przed przystąpieniem do zabiegów chirurgicznych. Bardzo ważne jest dokładne usunięcie wszystkich włosów, ponieważ może to przeszkadzać w zabiegach chirurgicznych i obrazowaniu.</li>
		<li>Unieruchom zwierzę w pozycji leżącej na plecach na metalowej płycie, która jest umieszczona na poduszce grzewczej z cyrkulacją wody o temperaturze 37 °C. Przednie i tylne kończyny są przymocowane do płyty za pomocą taśmy. 
		UWAGA: Jest przydatny do kontrolowania i rejestrowania parametrów życiowych, takich jak tętno i natlenienie krwi tętniczej za pomocą pulsoksymetru, podczas zabiegów chirurgicznych i eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Intubacja tchawicy
	<ol>
		<li>Aby umieścić cewnik do wentylacji zwierzęcia, najpierw wykonaj poprzeczne nacięcie skóry szyjki macicy, a następnie środkowe oddzielenie podłużnej mięśni brzusznej od tchawicy.</li>
		<li>Użyj powtarzających się czynności otwierania i zamykania ostrymi kleszczami, aby utworzyć przejście dla szwu przez grzbietową stronę tchawicy.</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie w tchawicy po stronie brzusznej, nie więcej niż półkoliste, mniej więcej między drugim a trzecim pierścieniem tchawicy. Pozostaw wystarczająco długą część tchawicy odsłoniętą na powierzchni grzbietowej, aby umożliwić zamocowanie cewnika dotchawiczego.</li>
		<li>Włóż kaniulę tchawicy "Y" o średnicy od 2,5 do 3,0 mm do tchawicy i zaciśnij szwem monofilamentowym 4-0. Upewnij się, że kaniula jest podłączona do respiratora z cyklicznymi zmianami ciśnienia z butelką podłączoną do kanału wydechowego, który jest wypełniony 6 cm wody, aby utrzymać dodatnie ciśnienie płucne. Dopływający gaz powinien być w 100% tlenem, chyba że eksperymentalnie pożądane jest inaczej.</li>
		<li>Wprowadzić cewnik z igłą 25-27 G i wypełnić go heparynizowaną solą fizjologiczną do jednej z żył ogonowych szczura i przymocować taśmą. 
		UWAGA: Zapewnić drożność cewnika do żyły ogonowej przez cały czas trwania zabiegu, wielokrotnie wstrzykując niewielką ilość heparynizowanej soli fizjologicznej do żyły ogonowej. Również intubacja ustno-tchawicza, czyli prowadzenie rurki tchawicy przez usta znieczulonego zwierzęcia i przez krtań do tchawicy, jest możliwą alternatywą dla opisanej tutaj procedury tracheotomii. Jednak ta metoda wymaga specjalnego szkolenia i doświadczenia, aby uniknąć uszkodzenia tchawicy, a także zapobiec przypadkowej kaniulacji przełyku. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastosowanie okna płucnego
	<ol>
		<li>Usuń skórę z boku klatki piersiowej, w której zlokalizowana jest choroba z przerzutami, tworząc nacięcie, a następnie odrywając skórę za pomocą rozwarstwienia. 
		 Uwaga: Skórę można wyciąć i usunąć po oderwaniu</li>
		<li>Kontynuuj, analizując dwie warstwy nakładających się mięśni (piersiowy, zębaty i najszerszy grzbietu), ale pozostawiając nienaruszone mięśnie międzyżebrowe. Utworzyć perforację w jamie klatki piersiowej o średnicy około 1,5 cm, usuwając części zazwyczaj dwóch sąsiednich żeber. Idealnie zlokalizuj perforację w okolicy szóstego i siódmego żebra.</li>
		<li>Osteotomia:
		<ol>
			<li>Aby zminimalizować krwawienie i uszkodzenie powierzchni płuc, podczas cięcia mocno trzymaj żebro, które ma zostać przecięte, ząbkowanymi kleszczami chirurgicznymi. Za pomocą nożyczek chirurgicznych najpierw przetnij przyśrodkową stronę żebra pod kątem około 45°, pozostawiając spiczastą stronę pozostałej kości żebra skierowaną na zewnątrz.</li>
			<li>Następnie przeciąć boczną stronę kości żebra w podobny sposób, ponownie pozostawiając spiczastą stronę kości żebrowej skierowaną na zewnątrz, aby zapobiec uszkodzeniu powierzchni płuca.</li>
			<li>Powtórz procedurę dla sąsiedniego żebra, a następnie przetnij mięśnie międzyżebrowe i usuń wycięty kawałek. Podczas tej procedury należy utrzymywać ciśnienie w płucach w taki sposób, aby zminimalizować interakcję mechaniczną między powierzchnią płuc a klatką piersiową. W tym celu należy odpowiednio regulować ciśnienie wdechu na wentylatorze.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wstawianie okna:
		<ol>
			<li>Włóż wykonane na zamówienie okienko płuc, składające się ze szkła nakrywkowego, które jest przymocowane do gniazda z pleksiglasu (rysunek 1B). Przymocuj okno do gniazda przez przyklejenie lub nałożenie bardzo małej ilości smaru próżniowego. Wstawić okienko w taki sposób, aby przerzuty powierzchniowe znajdowały się blisko środka okienka. W razie potrzeby wyreguluj włożony otwór, aby doprowadzić mikroprzerzuty do środka okna, lekko powiększając otwór w odpowiednią stronę. 
			UWAGA: Chorobę z przerzutami na powierzchni opłucnej można zidentyfikować jako wyraźnie rozpoznawalne białe kropki lub obszary w zdrowych częściach powierzchni płuc w kolorze różowym do łososiowego, które pojawiają się głównie wzdłuż szczelin. Podczas gdy mikroprzerzuty mogą wystąpić w innych obszarach zewnętrznej części opłucnej, badane linie komórkowe prawie zawsze wykazują pojawiające się mikroprzerzuty w obszarze perforowanym, gdy choroba przerzutowa może zostać wykryta radiologicznie.</li>
			<li>Po wprowadzeniu zębodołu do perforacji i stworzeniu bezpośredniego kontaktu z opłucną trzewną płuca, należy zszyć krawędzie ramy okiennej do otaczającego mięśnia międzyżebrowego za pomocą nici 4,0 (ryc. 1C). Nieznacznie zwiększ ciśnienie wdechu na wentylatorze, aby pomóc w ucieczce resztek powietrza i stworzyć uszczelnienie. 
			 Uwaga: Częstość oddechów szczurów może się znacznie różnić, w zależności od stanu znieczulenia, stanu podniecenia lub niepokoju, stężenia tlenu we wdychanym powietrzu (FiO2) itp. Zaleca się regulację częstości oddechów w zakresie od 70 do 90 uderzeń na minutę. Ciśnienie wdechu należy regulować ostrożnie i nie powinno być ustawione na więcej niż ok. 8 cm H2O (0,6 mmHg), aby uniknąć uszkodzenia powierzchni płuc.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść zwierzę w specjalnie zaprojektowanym ograniczniku, który ma na celu wyeliminowanie ruchu w kierunku Z (rysunek 1D) na stalowej płycie, która jest umieszczona na termostatycznym (elektrycznym) kocu grzewczym, pod mikroskopem fluorescencyjnym. Kontroluj temperaturę ciała zwierzęcia za pomocą termistora doodbytniczego. Wyreguluj ogranicznika dla zwierząt i ciśnienie wdechu na wentylatorze, aby uzyskać optymalną kontrolę ruchu bocznego. 
		 Uwaga: Naturalne oddychanie u ssaków obejmuje wszystkie trzy kierunki ruchu płuc i wyprost klatki piersiowej: obustronny, grzbietowo-brzuszny i czaszkowo-ogonowy. Aby w jak największym stopniu zachować naturalny ruch oddechowy, ważne jest, aby w niezbędnym stopniu zminimalizować kompresję w kierunku Z. Ze względu na to, że unieruchomienie w wymiarze Z może wprowadzać artefakty, które mogą wpływać na przepływ krwi i inne parametry, zaleca się utrzymywanie stałych warunków podczas serii powtarzających się pomiarów u tego samego zwierzęcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie i pomiar mikrokrążenia przepływu krwi
<ol>
	<li>Zbierz czerwone krwinki przez nakłucie serca i oznacz je DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 = 3 = -nadchloran tetrametylo-indokarbocyjaniny), jak opisano wcześniej 10.</li>
	<li>Wstrzyknąć 300 μl znakowanych czerwonych krwinek do żyły ogonowej szczura przed wykonaniem operacji w komorze okiennej, aby uniknąć efektu przylegania pierwszego przejścia do szklanego okienka. Należy usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki lub cewnika, ponieważ wprowadzenie powietrza do żyły zahamuje dalsze wstrzyknięcia.</li>
	<li>Obraz przepływu krwi za pomocą mikroskopowej kamery CCD w temperaturze chłodzenia chipa -40 °C i około 100-krotnej rozdzielczości ogólnej (tj. za pomocą obiektywu mikroskopowego 10X i okularu 10X przed kamerą). Stosować standardowe zestawy filtrów Rhodamina/TRITC (wzbudzenie 450-490 nm, emisja >515 nm). Rejestruj rzeczywistą liczbę klatek na sekundę i rozdzielczość pikseli wynikowych sekwencji obrazów. Zapisz co najmniej 200 (najlepiej około 300) obrazów na stos, aby zapewnić pomyślną analizę prędkości przepływu.</li>
	<li>Uzupełnić ubytek płynów u zwierzęcia, wstrzykując około 1 ml soli fizjologicznej co godzinę 
	UWAGA: Ustawienia eksperymentalne, które obejmują interwencję, np. lek modyfikujący prędkość przepływu krwi w przerzutach raka płuc, wymagają wielokrotnych pomiarów prędkości przepływu krwi w raku płuc z przerzutami. W przypadku tych rozszerzonych eksperymentów ważne jest, aby uzupełnić zwierzę wystarczającą ilością płynów.</li>
	<li>Poddać zwierzęta eutanazji przez wlew 3 ml 3N KCl do żyły ogonowej</li>
	<li>Oceń stosy obrazów za pomocą opublikowanego, publicznie dostępnego algorytmu komputerowego opartego na Matlab, który utworzy mapy prędkości przepływu, skali szarości i kodowania kolorów dla wszystkich śladów przepływu krwi 10,11. Następnie oceń uzyskane obrazy w skali szarości za pomocą komercyjnego lub publicznie dostępnego oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J, po progowym wyłączeniu wartości wskazujących na brak ruchu komórek krwi, tj. brak aktywnego układu krwi.</li>
</ol>

<ol><li>Billingsley, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+metastases+from+soft+tissue+sarcoma%3A+analysis+of+patterns+of+diseases+and+postmetastasis+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Pulmonary metastases from soft tissue sarcoma: analysis of patterns of diseases and postmetastasis survival.</a> Ann Surg. 229, 602-610 (1999).</li>
<li>Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+role+of+surgery+in+the+management+of+breast+cancer+lung+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Dis%22%5BJournal%5D)">The evolution of the role of surgery in the management of breast cancer lung metastasis.</a> J Thorac Dis. 4, 420-424 (2012).</li>
<li>Mayer, A., Vaupel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2C+lactate+accumulation%2C+and+acidosis%3A+siblings+or+accomplices+driving+tumor+progression+and+resistance+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia, lactate accumulation, and acidosis: siblings or accomplices driving tumor progression and resistance to therapy.</a> Advances in experimental medicine and biology. 789, 203-209 (2013).</li>
<li>Okunieff, P., O'Dell, W., Zhang, M., Zhang, L., Maguire, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+oxygen+measurements+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+experimental+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Tumor oxygen measurements and personalized medicine.</a> Advances in experimental medicine and biology. 765, 195-201 (2013).</li>
<li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+molecular+imaging+and+analysis+in+mice+using+dorsal+window+chamber+models+applied+to+hypoxia%2C+vasculature+and+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters.</a> Nature protocols. 6, 1355-1366 (2011).</li>
<li>Palmer, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+tumor+hypoxia+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of tumor hypoxia dynamics.</a> Journal of biomedical optics. 15, (2010).</li>
<li>Funakoshi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+lung+metastasis+for+intravital+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A new model of lung metastasis for intravital studies.</a> Microvasc Res. 59, 361-367 (2000).</li>
<li>Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+assessment+of+pulmonary+vascular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses.</a> Proc Am Thorac Soc. 8, 458-465 (2011).</li>
<li>Tabuchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precapillary+oxygenation+contributes+relevantly+to+gas+exchange+in+the+intact+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Precapillary oxygenation contributes relevantly to gas exchange in the intact lung.</a> Am J Respir Crit Care Med. 188, 474-481 (2013).</li>
<li>Hanna, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+measurement+of+blood+flow+velocity+and+direction+and+hemoglobin+oxygen+saturation+in+the+rat+lung+using+intravital+microscopy.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Automated measurement of blood flow velocity and direction and hemoglobin oxygen saturation in the rat lung using intravital microscopy. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. 304, 86-91 (2013).</li>
<li>Fontanella, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+hemodynamics+in+the+lung%2C+brain%2C+and+dorsal+window+chamber-grown+tumors+using+a+novel%2C+automated+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of hemodynamics in the lung, brain, and dorsal window chamber-grown tumors using a novel, automated algorithm.</a> Microcirculation. , (2013).</li>
<li>Newton, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commissioning+a+small-field+biological+irradiator+using+point%2C+2D%2C+and+3D+dosimetry+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+physics%22%5BJournal%5D)">Commissioning a small-field biological irradiator using point, 2D, and 3D dosimetry techniques.</a> Medical physics. 38, 6754-6762 (2011).</li>
<li>Vaupel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironmental+physiology+and+its+implications+for+radiation+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironmental physiology and its implications for radiation oncology.</a> Seminars in radiation oncology. 14, 198-206 (2004).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> J Appl Physiol. 104, 338-346 (2008).</li>
<li>Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+the+study+of+pulmonary+microcirculation%3A+determination+of+pulmonary+edema+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats.</a> J Surg Res. 57, 385-393 (1994).</li>
<li>Manzoor, A. A., Schroeder, T., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-stop-shop+tumor+imaging%3A+buy+hypoxia%2C+get+lactate+free%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">One-stop-shop tumor imaging: buy hypoxia, get lactate free.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 1616-1619 (2008).</li>
<li>Evans, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analytical+methods+as+applied+to+the+evaluation+of+vasculature+and+hypoxia+in+human+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+research%22%5BJournal%5D)">Imaging and analytical methods as applied to the evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors.</a> Radiation research. 170, 677-690 (2008).</li>
<li>Radiloff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+theophylline+and+endothelin+receptor+antagonism+improves+exercise+performance+of+rats+under+simulated+high+altitude%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">The combination of theophylline and endothelin receptor antagonism improves exercise performance of rats under simulated high altitude.</a> Journal of applied physiology. 113, 1243-1252 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono model, który umożliwia obrazowanie zmian w mikrokrążącym przepływie krwi i innych dynamicznych procesach w przerzutach do płuc szczurów, przy użyciu mikroskopii przyżyciowej i obliczeniowej analizy przepływu krwi. Chociaż istnieją inne metody wykonywania mikroskopii na odsłoniętych płucach w otwartej klatce piersiowej gryzoni, ten model jest również pierwszym, który obrazuje przerzuty do płuc przez perforację ściany klatki piersiowej w warunkach zamkniętej klatki piersiowej. Za pomocą tej metody wykazano mo...

Płuco jest jednym z najważniejszych organów docelowych choroby przerzutowej, a ponieważ ten stan jest trudny do skutecznego leczenia za pomocą chemio- i radioterapii, wyleczenie jest nadal rzadkie1,2. Specyficzne cechy patofizjologiczne i mikrokrążenia guzów litych pierwotnych i przerzutowych, takie jak niedotlenienie mikroregionalne, ograniczenie dyfuzji i nieefektywne unaczynienie guza, w znacznym stopniu przyczyniają się do ich oporności na leczenie przeciwnowotworowe3,4. Ze względu na skalę mikroskopową i dynamiczny charakter parametrów, takich jak mikrokrążeniowy przepływ krwi, mikroskopia przyżyciowa guza u żywego zwierzęcia stała się bardzo ważnym narzędziem badawczym w tej dziedzinie5. Podczas gdy modele mikroskopowe przyżyciowe zostały zastosowane do guzów w różnych miejscach narządów, w tym w płucach z przerzutami w otwartej klatce piersiowej, nie opracowano jeszcze protokołu do badań nad przerzutami do płuc w fizjologicznie zachowującym środowisku z zamkniętą klatką piersiową6,7. Takie przedsięwzięcie jest szczególnie utrudnione ze względu na konieczność chirurgicznego dostępu do klatki piersiowej bez wpływu na ogólną funkcję płuc7-9. Niedawno wprowadzono metodę obrazowania mikrokrążącego przepływu krwi w płucach w warunkach blisko klatki piersiowej u żywych szczurów, przy użyciu fluorescencyjnej mikroskopii przyżyciowej10. Protokół ten umożliwia systematyczne ilościowe określanie prędkości przepływu krwi z wstrzykniętych, znakowanych fluorescencyjnie krwinek czerwonych, przy użyciu analizy komputerowej, przy jednoczesnym utrzymaniu fizjologicznej stabilności zwierzęcia i zachowaniu integralności płuc11. W niniejszym badaniu pokazano, w jaki sposób można zmodyfikować tę technologię w celu obrazowania i ilościowego określenia mikrokrążącego przepływu krwi w przerzutach płucnych zaszczepionych żyłami ogonowymi na powierzchni opłucnej u szczura z obniżoną odpornością. Model ten jest również pierwszym, w którym bada się przerzutowe guzy płuc w warunkach mikroskopii przyżyciowej z zamkniętą klatką piersiową.

<table><tbody><tr><td>Atymiczne nagie szczury</td><td>Charles River</td><td>Kod szczepu 316</td><td>Samica 10-tygodniowych atymicznych nagich szczurów</td></tr><tr><td>mikro-CT / mikro-Irradiator&nbsp;</td><td>Precyzyjne promieniowanie rentgenowskie Inc.</td><td>Xrad 225Cx</td><td>Użyj MicroCT do wykrywania przerzutów</td></tr><tr><td>DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 = 3 = -nadchloran tetrametylo-indokarbocyjaniny)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>468495-100MG</td><td>Wymieszaj 100 ul wypełnionych czerwonych krwinek ze 100 ul 0,5 mg / ml DiI w 200 proof etanolu, 2 ml 5% roztworu dekstrozy w wodzie i napełnij do 10 ml końcowej objętości solą fizjologiczną</td></tr><tr><td>Wentylator dla małych zwierząt</td><td></td><td></td> <td>Kent Scientific TOPOUrządzenie jest ważne dla utrzymania dodatniego ciśnienia w płucach po zastosowaniu odmy opłucnowej</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Zeiss Axioskop pionowy</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td>Axioskop</td><td>do obrazowania przyżyciowego</td></tr><tr><td>Kamera CCD Andor</td><td></td><td>iXonEM 885</td><td>Kamera CCD do obrazowania przepływu krwi na żywo</td></tr><tr><td>Pulsoksymetr</td><td>StarrLife</td><td>MouseOx</td><td>Pulsoksymetr</td></tr><tr><td>Mikroskop</td> <td>fluorescencyjnyMikroskop</td><td>fluorescencyjny</td> Zeiss <td>Axioskop</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany pomiar prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc szczurów

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Ponieważ płuco jest głównym narządem docelowym choroby przerzutowej, modele zwierzęce do badania fizjologii przerzutów do płuc mają ogromne znaczenie. Jednak do tej pory istnieje bardzo niewiele metod dynamicznego badania przerzutów do płuc na poziomie mikrokrążenia, ze względu na trudności w dostępie do płuc pod mikroskopem. W tym miejscu przedstawiono metodę mikroskopii przyżyciowej w celu funkcjonalnego obrazowania i ilościowego określenia mikrokrążenia powierzchownych przerzutów do płuc u szczurów, przy użyciu okna płucnego z zamkniętą klatką piersiową i automatycznej analizy prędkości i kierunku przepływu krwi. Wykazano przydatność tej metody do pomiaru wzrostu prędkości przepływu krwi w odpowiedzi na interwencję farmakologiczną oraz do obrazowania dobrze znanego krętego unaczynienia guzów litych. Jest to pierwsza demonstracja mikroskopii przyżyciowej przerzutów do płuc w modelu z zamkniętą klatką piersiową. Ze względu na zminimalizowaną inwazyjność, a także ze względu na względną łatwość i praktyczność, technologia ta ma potencjał, aby znaleźć szerokie zastosowanie w laboratoriach specjalizujących się w badaniach nad nowotworami płuc.

Znane jest, że układ naczyniowy w guzach litych różni się znacząco od prawidłowego unaczynienia, wykazując większy stopień krętości oraz większe odległości między naczyniami13. W związku z tym ścieżki przepływu krwi w eksperymentalnych przerzutach raka piersi i mięsaka w płucach mają nieregularne kształty i duże przerwy między naczyniami (Rysunek 2A, dwa dolne panele) w porównaniu z prawidłową mikrocyrkulacją płucną (Rysunek 2A, górny panel). W poprzednim badaniu wykazano, że ...

Przedstawiono metodę pomiaru prędkości przepływu krwi mikrokrążącej w raku płuc z przerzutami do powierzchni opłucnej u szczurów w sposób zautomatyzowany, przy użyciu mikroskopii przyżyciowej płuc z zamkniętą klatką piersiową. Model ten ma potencjał do wykorzystania jako szeroko rozpowszechnione narzędzie do prowadzenia badań fizjologicznych nad przerzutami do płuc u gryzoni.

Zautomatyzowany pomiar prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc szczurów

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie okna klatki piersiowej do mikroskopii przyżyciowej u szczura z przerzutami do płuc. Osiąga się to poprzez znieczulenie zwierzęcia z przerzutami, intubację oraz podłączenie go do respiratora dla małych zwierząt w celu zapewnienia wentylacji ciśnieniowej. Następnie do żyły ogonowej zwierzęcia wstrzykuje się fluorescencyjnie znakowane erytrocyty.Następnie chirurgicznie uzyskano dostęp do jam klatki piersiowej, uważając, aby nie uszkodzić powierzchni płuc; zidentyfikowano przerzuty i wprowadzono okienko. Na koniec przeprowadzono obrazowanie mikroskopowe zwierzęcia. Ostatecznie chirurgiczne otwarcie płuca i wprowadzenie okienka do mikroskopii doraźnej u żywego szczura umożliwiły zautomatyzowane pomiary przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach płucnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie klatki piersiowej za pomocą mikro-CT, nieinwazyjna mikroskopia epitoresowana oraz mikro-PET raka płuc, jest możliwość pomiarów w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną mikrokrążenia przerzutów płucnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie p

automated-measurement-microcirculatory-blood-flow-velocity-pulmonary

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Automatyczne pomiary prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc u szczurów

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Niedotlenienie naczyń płucnych (HPV) jest ważnym zjawiskiem fizjologicznym, dzięki któremu przy niedotlenieniu pęcherzyków płucnych perfuzja płuc jest dopasowana do wentylacji. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. W tym miejscu opisujemy nasz protokół analizy HPV mysich naczyń płucnych o średnicach 20-100 μm.

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Izolowany preparat płucny z perfuzją krwi umożliwia wizualizację sieci mikronaczyń na powierzchni płuc. W tym miejscu opisujemy podejście do ilościowego określania przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanych płucach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w czasie rzeczywistym.

Kwantyfikacja przepuszczalności pojedynczych mikronaczyń w izolowanym preparacie płuc szczura z perfuzją krwi

Zmodyfikowana technika Landisa umożliwia sparowany pomiar przewodnictwa hydraulicznego poszczególnych mikronaczyń w krezce normalnych i genetycznie zmodyfikowanych szczurów w warunkach kontrolnych i testowych przy użyciu technik mikroperfuzji. Stanowi wygodną metodę oceny mechanizmów regulujących przepuszczalność mikronaczyń i wymianę transnaczyniową w warunkach fizjologicznych.

Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Ten manuskrypt opisuje rozwój modelu zwierzęcego, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na przerzuty i rozszyfrowywanie mechanizmów jego działania. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na mięsaku Ewinga, podobne podejście można zastosować do innych typów nowotworów.

In vivo (in vivo) Model do badania wpływu hipoksji na przerzuty nowotworu

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego wszczepienia na stałe stałego okna optycznego dla mysiej klatki piersiowej, który umożliwia wysokorozdzielcze, przyżyciowe obrazowanie płuc. Trwałość okienka sprawia, że dobrze nadaje się ono do badania dynamicznych procesów komórkowych w płucach, zwłaszcza tych, które powoli ewoluują, takich jak progresja przerzutowa rozsianych komórek nowotworowych.

Stałe okno do badania przerzutów raka do płuc

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Protokół ten szczegółowo wprowadza doświadczenie z metodą cewnikowania prawego serca do wykrywania ciśnienia w tętnicy płucnej u szczurów, co pomoże uzyskać dokładniejsze dane i zwiększyć skuteczność eksperymentu. Metoda ta poprawia również powtarzalność eksperymentów w różnych laboratoriach.

Pomiar ciśnienia w tętnicy płucnej u szczurów za pomocą cewnikowania prawego serca

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Poznaj metodę automatycznego pomiaru prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu przerzutów nowotworowych do płuc szczurów przy użyciu zamkniętej klatki piersiowej i mikroskopii intrawitalnej.

Zautomatyzowany pomiar prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc szczurów

Przeglądaj więcej filmów