Zautomatyzowany pomiar prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc szczurów

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie okna piersiowego do mikroskopii intrażyciowej u szczura z przerzutami do płuc. Osiąga się to poprzez pierwsze znieczulenie zwierzęcia z przerzutami, intubację go i podłączenie do respiratora dla małego zwierzęcia w celu wentylacji ciśnieniowej. Następnie znakowane fluorescencyjnie krwinki czerwone są wstrzykiwane do żyły ogonowej zwierzęcia.

Następnie chirurgicznie uzyskuje się dostęp do klatki piersiowej bez uszkodzenia powierzchni płuc, identyfikuje się przerzuty i wprowadza się okienko. Na koniec wykonuje się obrazowanie mikroskopowe zwierzęcia. Ostatecznie chirurgiczne otwarcie płuca i wprowadzenie okienka do ostrej mikroskopii u żywego szczura pozwala na automatyczne pomiary przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikrotomografia komputerowa klatki piersiowej, nieinwazyjna mikroskopia klatki piersiowej i mikro badanie rakowego płuca, jest to, że umożliwia ona pomiary w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną mikrokrążenia przerzutów do płuc. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów do płuc, takie jak to, w jaki sposób leczenie lub progresja raka mogą zmienić przepływ krwi i ostatecznie niedotlenienie w przerzutach do płuc. Implikacje tej techniki rozciągają się na diagnostykę i terapię raka płuc z przerzutami, ponieważ pozwala na bezprecedensowy wgląd w dynamikę mikrokrążenia i mikrośrodowiska metabolicznego tych przerzutowych guzów.

Metoda ta otworzy drzwi do zrozumienia dynamiki przerzutów do płuc, mikrokrążenia, a tym samym pomoże udoskonalić obecne strategie leczenia. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ wymaga ona doświadczenia, aby dostosować ustawienie w sposób, który minimalizuje autonomiczny ruch płuc. Po wywołaniu i potwierdzeniu raka z przerzutami u szczura zgodnie z protokołem tekstowym i znieczuleniu go dootrzewnową dawką pentobarbitalu, wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić sedację.

Ogol zwierzę po tej stronie ciała, która ma przerzuty i w okolicy szyi, a następnie zetrzyj wszystkie pozostałe luźne włosy ze skóry, aby nie zakłócały obrazowania. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. Umieść zwierzę w pozycji leżącej na metalowej płycie, która znajduje się na poduszce grzewczej z cyrkulacją wody o temperaturze 37 stopni Celsjusza i użyj taśmy, aby przymocować przednie i tylne kończyny.

Podłącz pulsoksymetr do kontrolowania i rejestrowania parametrów życiowych podczas całej procedury intubacji szczura. Zacznij od wykonania poprzecznego nacięcia skóry szyjki macicy. Następnie oddziel przyśrodkowo mięśnie podłużne brzuszne do tchawicy za pomocą ostrych kleszczy.

Użyj powtarzającego się działania od otwarcia do zamknięcia, aby utworzyć przejście dla szwu przez grzbietową stronę tchawicy po stronie brzusznej między drugim a trzecim pierścieniem tchawicy. Wykonaj małe nacięcie w tchawicy. Pozostaw wystarczająco długą część tchawicy odsłoniętą na powierzchni grzbietowej, aby umożliwić zamocowanie cewnika.

Następnie włóż kaniulę dotchawiczą Y o średnicy od 2,5 do 3,0 milimetra do tchawicy i użyj czteropunktowego szwu monofilamentowego, aby zacisnąć. Aby utrzymać dodatnie ciśnienie płucne, podłącz kaniulę do 100% tlenu przez respirator z cyklicznymi zmianami ciśnienia z butelką podłączoną do kanału wydechowego, który jest wypełniony sześciocentymetrową wodą. Następnie za pomocą igły o rozmiarze od 25 do 27 i strzykawki wypełnionej heparynizowaną solą fizjologiczną, włóż cewnik do jednej z żył ogonowych i użyj taśmy, aby przymocować go na miejscu za pomocą czerwonych krwinek wcześniej pobranych i oznaczonych DII zgodnie z protokołem tekstowym, wstrzyknij 300 mikrolitrów do żyły ogonowej szczura, aby utworzyć okno płucne.

Wykonaj nacięcie po rakowej stronie klatki piersiowej i oderwij skórę za pomocą rozwarstwienia. Rozetnij dwie warstwy nakładających się na siebie mięśni i pozostaw nienaruszone mięśnie międzyżebrowe w okolicy szóstego i siódmego żebra. Wykonaj perforację w jamie klatki piersiowej o średnicy około 1,5 centymetra, aby wykonać osteotomię.

Rozpocznij regulację ciśnienia wdechu na respiratorze tak, aby zminimalizować interakcję mechaniczną między powierzchnią płuc a klatką piersiową. Usuń części szóstego i siódmego żebra za pomocą kleszczy chirurgicznych do zębów, aby mocno przytrzymać żebro, które ma zostać przecięte, oraz nożyczek chirurgicznych. Przetnij przyśrodkową stronę żebra pod kątem około 45 stopni z ostrą stroną skierowaną na zewnątrz.

Przetnij boczną stronę kości w podobny sposób, ponownie, pozostawiając spiczastą stronę na zewnątrz. Aby uniknąć uszkodzenia płuca, powtórz osteotomię z sąsiednim żebrem przed przecięciem mięśni międzyżebrowych i usunięciem wyciętego kawałka. Stwórz długie okno na zamówienie, używając kleju lub niewielkiej ilości smaru próżniowego, aby przymocować szkło nakrywkowe do gniazda z pleksi.

Następnie włóż okienko tak, aby przerzuty powierzchniowe znajdowały się blisko środka okna, w razie potrzeby powiększając otwór z jednej strony. Po wprowadzeniu zębodołu do perforacji i stworzeniu bezpośredniego kontaktu z opłucną trzewną płuca, należy użyć czterech zerowych szwów monofilamentowych, aby zszyć krawędzie ramy okiennej do otaczającego mięśnia międzyżebrowego. Zwiększ ciśnienie wdechu na wentylatorze, aby ułatwić ucieczkę resztek powietrza i stworzyć uszczelnienie.

Następnie umieść zwierzę w specjalnie wykonanym unieruchomieniu, zaprojektowanym w celu wyeliminowania ruchu w kierunku Z i umieść je na rozgrzanej stalowej płycie pod mikroskopem fluorescencyjnym. Następnie włóż termistor doodbytniczy, aby kontrolować temperaturę ciała zwierzęcia. Wyreguluj ogranicznika dla zwierząt i ciśnienie wdechu na wentylatorze, aby uzyskać optymalną kontrolę ruchu bocznego.

Do obrazowania i pomiarów przepływu krwi w mikrokrążeniu. Użyj kamery CCD przy ujemnej temperaturze chłodzenia chipa 40 stopni Celsjusza i obiektywie 10x. Za pomocą standardowych zestawów filtrów prętowych Domine Trit C rejestruj rzeczywistą liczbę klatek na sekundę i rozdzielczość pikseli wynikowych sekwencji obrazów.

Zapisz co najmniej 200 obrazów na stos, aby zapewnić pomyślną analizę prędkości przepływu podczas sesji obrazowania w celu uzupełnienia ubytku płynów u zwierzęcia. Aby utrzymać stałą prędkość przepływu krwi. Wykonuj dootrzewnowe wstrzyknięcie około jednego mililitra soli fizjologicznej co godzinę.

Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z protokołem tekstowym po zakończeniu obrazowania. Wiadomo, że unaczynienie w guzach litych znacznie różni się od normalnego ukrwienia, wykazując większy stopień krętości i większe odległości międzynaczyniowe. W związku z tym, jak pokazano tutaj, ścieżki przepływu krwi w eksperymentalnym raku płuc piersi i przerzutach mają nieregularne kształty i duże przerwy międzynaczyniowe w porównaniu z normalnym mikrokrążeniem.

W tym badaniu, podobnie jak to, co wykazano w zdrowych płucach po podaniu kombinacji efedryny i antagonisty receptora endoteliny, entyna zwiększała prędkość przepływu krwi w mięsaku myszy. Każdy punkt danych reprezentuje zbiorcze indywidualne średnie z trzech pomiarów w pięciominutowych odstępach uśrednionych na podstawie danych uzyskanych od pięciu zwierząt. Pierwsze wstrzyknięcie znacznie zwiększyło prędkość przepływu krwi w obszarze guza z 0,61 plus minus 0,12 milimetra na sekundę do 0,74, plus minus 0,19.

Natomiast drugi wtrysk utrzymywał podwyższoną prędkość przepływu na poziomie 0,74 plus minus 0,19 milimetra na sekundę. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby unikać wybitnej spiczastej struktury punktowej podczas przecinania klatki piersiowej, ponieważ spowoduje to późniejsze obrażenia i krwawienie z płuc po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad przerzutami do płuc w celu zbadania punktów końcowych związanych z opracowywaniem leków przeciwnowotworowych, takich jak dyfuzja, ograniczenie dostarczania leków cytotoksycznych oraz dyfuzja, ograniczone niedotlenienie i szczurze modele przerzutów do płuc

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać chirurgiczny dostęp do przerzutowego lub zdrowego płuca szczura i wykonać na nim obrazowanie mikroskopowe.