Name: Wysokoprzepustowa analiza receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptorów poprzez aktywność lucyferazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-02T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego pomiaru aktywacji receptorów węchowych ssaków za pomocą testu lucyferazowego. Technika ta umożliwia szybką identyfikację ligandów receptorów i badanie kodowania zapachów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez R01 DC013339, R03 DC011373 oraz Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. Część prac została wykonana przy użyciu Monell Chemosensory Receptor Signaling Core, który jest częściowo wspierany przez finansowanie z NIH-NIDCD Core Grant P30 DC011735. Autorzy dziękują C. Sezille za pomoc w zbieraniu danych.

1. Hodowla komórek Hana3A
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę M10, uzupełniając minimalną niezbędną pożywkę (MEM) 10% (v/v) FBS.</li>
	<li>Utrzymanie kultury
	<ol>
		<li>Utrzymuj komórki w pożywce M10. UWAGA: Wektory ekspresyjne dla RTP1L, RTP2, REEP1 i Gαolf nadają komórkom Hana3A oporność na puromycynę, ale utrzymanie komórek z tym antybiotykiem nie wpływa znacząco na wyniki testów.</li>
		<li>Subkultura w proporcji 1:8 na 10 cm naczynia co 2-3 dni.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Komórki poszycia do transfekcji
<ol>
	<li>Odessać pożywkę ze 100% zlewającej się 10-centymetrowej płytki komórek Hana3A.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając 10 ml PBS, obracając naczynie i zasysając PBS.</li>
	<li>Dodaj 3 ml 0,05% trypsyny/EDTA i poczekaj, aż komórki się rozdzielą (około 1 minuta).</li>
	<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml M10 i rozbij grudki komórek, rozcierając około 10 razy pipetą o pojemności 10 ml. Pipetę należy uważnie, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do podłoża.</li>
	<li>Na każdą 96-dołkową płytkę przenieść 1 ml komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 200 x g przez 5 minut i zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 6 ml M10 na 1 ml komórek przeniesionych w kroku 2.5.</li>
	<li>Pobrać pipetę 50 μl komórek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Transfekcja receptorów węchowych
<ol>
	<li>Przygotowanie plazmidowego DNA
	<ol>
		<li>Przygotuj plazmidowe DNA za pomocą protokołu wolnego od endotoksyn. UWAGA: Użyj zestawów do przygotowania plazmidowego DNA oznaczonych jako "wolne od endotoksyn" lub dodaj etap ekstrakcji fenolowo-chloroformowej do protokołu przygotowania plazmidowego DNA.</li>
		<li>Rozcieńczyć DNA do stężenia 100 ng/μl w buforze TE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwować posiane komórki (krok 2.7), aby zapewnić prawidłowe zlewanie się około 30-50% na studzienkę i wrócić do inkubatora. UWAGA: Chociaż ta konfluencja nie jest optymalna dla odczynnika do transfekcji lipidów, konfluencja 30-50% na tym etapie jest optymalna do pomiaru aktywności lucyferazy 24 godziny po transfekcji.</li>
	<li>Przygotowanie mieszanki transfekcyjnej
	<ol>
		<li>Pipetować plazmidy RTP1S-pCI, M3-R-pCI, pCRE-luc i pSV40-RL do pożywki MEM zgodnie z objętościami wyszczególnionymi w Tabeli 1, aby wymieszać plazmid (podane objętości dotyczą płytki 96-dołkowej).
		<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:356px;">
			<tbody>
				<tr wysokość="22">
					<td colspan="3" height="22" style="wysokość:22px;szerokość:356px;">Mieszanka plazmidu</td>
				</tr>
				<tr wysokość="21">
					<td height="21" style="wysokość:21px;"></td>
					<td>na studnię</td>
					<td>na płytkę 96-dołkową</td>
				</tr>
				<tr wysokość="21">
					<td height="21" style="wysokość:21px;">MEM</td>
					<td>--</td>
					<td>500 μl</td>
				</tr>
				<tr wysokość="21">
					<td height="21" style="wysokość:21px;">RTP1S-pCI</td>
					<td>5 ngów</td>
					<td>480 ng</td>
				</tr>
				<tr wysokość="21">
					<td height="21" style="wysokość:21px;">M3-R-pCI</td>
					<td>2,5 nga</td>
					<td>240 ng</td>
				</tr>
				<tr wysokość="21">
					<td height="21" style="wysokość:21px;">pCRE-luc</td>
					<td>10 ng</td>
					<td>960 ng</td>
				</tr>
				<tr wysokość="22">
					<td height="22" style="wysokość:22px;">pSV40-RL</td>
					<td>5 ngów</td>
					<td>480 ng</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table> 
Tabela 1. Składniki mieszanki plazmidowej. Na studzienkę i na 96-dołkową płytkę objętości RTP1S-pCI, M3-R-pCI, pCRE-luc i pSV40-RL oraz MEM.
		</li>
		<li>Dla każdej płytki 96-dołkowej rozcieńczyć 18 μl odczynnika do transfekcji lipidów w 450 μl pożywki MEM.</li>
		<li>Pipeta Mieszanina plazmidu (z kroku 3.3.1), receptor węchowy znakowany rodopsyną w plazmidzie pCI (Rho-OR-pCI) i mieszanina transfekcji lipidów (z kroku 3.3.2), aby uzyskać kompleks szczegółowo opisany w tabeli 2. Wymieszać roztwór przez rozcieranie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Zatrzymać reakcję, dodając M10 zgodnie z tabelą 2. UWAGA: ta reakcja jest zależna od czasu i nie powinna trwać dłużej niż 30 minut. Obliczenie studni + 10% jest ważne, aby zapewnić wystarczającą objętość dla kolejnych kroków.
		<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
			<tbody>
				<tr wysokość="21">
					<td colspan="3" height="21" style="wysokość:21px;szerokość:472px;">Złożony</td>
				</tr>
				<tr wysokość="21">
					<td height="21" style="wysokość:21px;"></td>
					<td>na studnię</td>
					<td>za studnię + 10%</td>
				</tr>
				<tr wysokość="21">
					<td height="21" style="wysokość:21px;">Mieszanka plazmidu</td>
					<td>4,2 μl</td>
					<td>4,58 μl</td>
				</tr>
				<tr wysokość="21">
					<td height="21" style="wysokość:21px;">Rho-OR-pCI</td>
					<td>0,05 ngsa</td>
					<td>0,06 ng</td>
				</tr>
				<tr wysokość="21">
					<td height="21" style="wysokość:21px;">Mieszanka transfekcji lipidów</td>
					<td>4,2 μl</td>
					<td>4,58 μl</td>
				</tr>
				<tr wysokość="22">
					<td height="22" style="wysokość:22px;">M10</td>
					<td>41,7 μl</td>
					<td>45,83 μl</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table> 
Tabela 2. Złożone komponenty. Na studzienkę i na studzienkę + 10% objętości mieszaniny plazmidowej (Tabela 1), plazmid receptora węchowego (Rho-OR-pCI) i mieszanina transfekcji lipidów. M10 dodaje się w celu wygaszenia reakcji po 15 minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej.
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<ol start="4">
	<li>Wytrząśnij nośnik z płytek ogniw.</li>
	<li>Odpipetować pipetą 50 μl kompleksu do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Stymulacja zapachowa
<ol>
	<li>Obserwuj transfekowane komórki, aby zapewnić prawidłową konfluencję 50-80% na studzienkę i wróć do inkubatora. UWAGA: Jeśli komórki są mniej niż 50% zlewające się, odczyty lucyferazy świetlika i lucyferazy renilla mogą być zbyt niskie, aby zmierzyć aktywację receptora. Rozważ wyrzucenie talerza.</li>
	<li>Przygotuj 1 M roztwory podstawowe każdego zapachu w DMSO.</li>
	<li>Przygotować roztwory stymulujące zapachy w podłożu CD293.
	<ol>
		<li>W przypadku eksperymentów przesiewowych rozcieńczyć roztwór podstawowy o zapachu do 100 μM. Przygotuj również kontrolę bezzapachową (tylko CD293) w celu kontroli aktywacji w tle sali operacyjnej. UWAGA: W przypadku eksperymentów przesiewowych każda para OR/zapach jest testowana tylko raz na eksperyment. Ponieważ możliwa jest pewna dyfuzja zapachu w studzienkach, zaleca się stymulację jednym środkiem zapachowym na każdą płytkę.</li>
		<li>W przypadku eksperymentów z reakcją na dawkę należy przygotować siedem 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń roztworu podstawowego zapachu w trzech egzemplarzach, zaczynając od 1 mM dla każdego receptora. Przygotuj również te same rozcieńczenia zapachu w trzech egzemplarzach dla pustych komórek transfekowanych wektorami w celu kontroli aktywacji tła zapachu. UWAGA: W przypadku eksperymentów dotyczących reakcji na dawkę, każde badanie stężenia zapachu należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrząśnij nośnik z płytek ogniw.</li>
	<li>Odpipetować pipetą 25 μl roztworu do stymulacji zapachów do każdego dołka i inkubować przez 4 godziny.</li>
</ol>
5. Pomiar aktywności OR za pomocą testu lucyferazy
<ol>
	<li>Zawiesić substrat lucyferazy świetlika zgodnie z instrukcjami producenta i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Rozmrozić 1 ml substratu lucyferazy świetlika na 96-dołkową płytkę.</li>
	<li>Przygotować świeży środek wygaszający reakcję lucyferazy świetlika i odczynnik substratu lucyferazy Renilla (5 μl substratu lucyferazy wygaszającej/lucyferazy Renilla na 1 ml buforu). UWAGA: Potrzeba około 1 ml odczynnika na płytkę 96-dołkową.</li>
	<li>Przygotuj czytnik mikropłytek luminescencyjnych. Otwórz oprogramowanie czytnika mikropłytek. W ikonie systemu:
	<ol>
		<li>W zakładce "Podgrzewanie wstępne" zaznacz pole "WŁĄCZONE" i ustaw temperaturę urządzenia na 25 °C.</li>
		<li>W zakładce "Dozownik" napełnij każdy dozownik 1 000 μl 70% etanolu, a następnie 1 000 μl wody destylowanej. UWAGA: Do każdego dozownika należy używać oddzielnych porcji alkoholu i wody. Do dezynfekcji dozowników używa się etanolu, a woda usuwa resztki etanolu.</li>
		<li>Zalać każdy dozownik 1 500 μl powietrza (wyjąć dozowniki z płynu). UWAGA: zalewanie powietrzem zapewnia, że substraty lucyferazy nie są rozcieńczane resztkową wodą.</li>
		<li>Zalać dozownik 1 1,080 μl substratu lucyferazy świetlików (od kroku 5.2). Zalać dozownik 2 substratem lucyferazy Renilla (od kroku 5.3). UWAGA: Uważaj, aby nie zanieczyścić krzyżowo substratów lucyferazy. Zalewanie substratami lucyferazy wypełnia martwą przestrzeń w dozownikach odczynników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonfiguruj następujący protokół, aby odczytywać luminescencję lucyferazy świetlika i Renilla. W oprogramowaniu powiązanym z czytnikiem mikropłytek, w menu "Plik" kliknij "Nowe zadanie". Zaznacz "Protokoły" i kliknij "Utwórz nowy". W kolejnym oknie należy zaznaczyć kółko obok "Standard Protocol". Kliknij "OK". Kliknij dwukrotnie "Procedura" po lewej stronie ekranu.
	<ol>
		<li>Dozuj 10 μl substratu lucyferazy świetlików do wszystkich studzienek za pomocą dozownika 1. W menu "Akcje" kliknij "Dozuj". W oknie "Etap dozowania" ustaw: "Dozownik" na 1, "Zalewanie" na brak, "Objętość dozowania" na 10 μl i "Szybkość" na 225 μl/sek. Kliknij "OK".</li>
		<li>Potrząsaj płytką przez 30 sekund. W menu "Akcje" kliknij "Potrząśnij". W oknie "Shake Step" ustaw "Intensywność" na Średni i "Czas trwania" na 0:30 MM:SS. Kliknij "OK".</li>
		<li>Odczytaj luminescencję wszystkich studzienek przez 0,5 sekundy na studzienkę. W menu "Akcje" kliknij "Przeczytaj". W oknie "Krok odczytu" ustaw: "Metoda wykrywania" na Luminescencja, "Typ odczytu" na Punkt końcowy, "Czas integracji" na 0:00:50 MM:SS:ss, "Zestawy filtrów" na 1, "Emisja" na Otwór, "Pozycja optyki" na Górę, "Wzmocnienie" na 135 i "Wysokość odczytu" na 1,00 mm. Kliknij "OK".</li>
		<li>Dozować 10 μl substratu lucyferazy Renilla do wszystkich studzienek za pomocą dozownika 2. Ustaw warunki jak w kroku 5.6.1, z wyjątkiem ustawienia "Dozownik" na 2.</li>
		<li>Potrząsaj płytką przez 30 sekund. Ustaw warunki jak w kroku 5.6.2.</li>
		<li>Odczytaj luminescencję wszystkich dołków przez 0,5 sekundy na studzienkę. Ustaw warunki jak w kroku 5.6.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdjąć pokrywkę z płytki 96-dołkowej i umieścić ją w czytniku mikropłytek. Uruchom program skonfigurowany w kroku 5.5, aby odczytać luminescencję płyty.</li>
	<li>Wyczyść pompy dozownika odczynników. Z ikony systemu w zakładce "Dyspenser":
	<ol>
		<li>Usuń 1,000 μl substratu lucyferazy świetlika z dozownika lucyferazy świetlika do probówki regeneracyjnej. UWAGA: Lucyferazy świetlika można przechowywać w temperaturze -80 °C i ponownie wykorzystać.</li>
		<li>Zalać każdy dozownik 1 000 μl wody destylowanej, następnie 1 000 μl 70% etanolu, a na końcu 1 500 μl powietrza (wyjąć dozowniki z płynu). UWAGA: Woda usuwa substraty lucyferazy z pomp odczynników, etanol dezynfekuje, a powietrze suszy wszelkie pozostałości etanolu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Eksport danych
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu czytnika mikropłytek kliknij dwukrotnie na "Kreatory raportów/eksportu" po lewej stronie ekranu.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Nowy eksport do Excela" i kliknij "OK".</li>
		<li>Podświetl Eksport1 i kliknij "Edytuj".
		<ol>
			<li>W sekcji "Zawartość" zaznacz "Opis systemu", "Procedura", "Opis tablicy" i "Matryca układu płyt". Uwzględnij "Surowe dane" i "Obliczone dane".</li>
			<li>W sekcji "Przepływ pracy" zaznacz "Automatyczne wykonywanie po zakończeniu procedury". W trybie eksportu zaznacz "Wszystkie płyty w tym samym skoroszycie" i "Jako nowy arkusz".</li>
			<li>W sekcji "Plik" wybierz format nazwy pliku i lokalizację pliku, a następnie kliknij "OK".</li>
			<li>Zamknij okno "Kreatory raportów/eksportu".</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać znormalizowane wartości lucyferazy, podziel odczyt luminescencji lucyferazy świetlika dla każdej studzienki (Krok 5.6.3) przez odczyt luminescencji Renilla dla każdej studzienki (Krok 5.6.6).</li>
</ol>

<ol><li>Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sensitivity+of+a+human+olfactory+receptor+functionally+expressed+in+human+embryonic+kidney+293+cells+and+Xenopus+Laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).</li>
<li>Spehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+testicular+odorant+receptor+mediating+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis.</a> Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).</li>
<li>Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -C., Briand, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+odorant+specificity+of+two+human+olfactory+receptors+from+different+phylogenetic+classes+and+evidence+for+antagonism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism.</a> Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).</li>
<li>Matarazzo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+two+human+olfactory+receptors+expressed+in+the+baculovirus+Sf9+insect+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system.</a> Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).</li>
<li>Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+extended+receptive+ligand+repertoire+of+the+human+olfactory+receptor+OR17-40+comprising+structurally+related+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds.</a> Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+heat+shock+protein+enhances+the+expression+of+mammalian+olfactory+receptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins.</a> Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).</li>
<li>Shirokova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+ligands+for+orphan+olfactory+receptors.+G+protein-dependent+agonism+and+antagonism+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants.</a> The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).</li>
<li>Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+a+human+odorant+receptor+alters+odour+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception.</a> Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).</li>
<li>Menashe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+elucidation+of+human+hyperosmia+to+isovaleric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid.</a> PLoS biology. 5 (11), (2007).</li>
<li>Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odor+coding+by+a+Mammalian+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Odor coding by a Mammalian receptor repertoire.</a> Science signaling. 2 (60), (2009).</li>
<li>Jaeger, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mendelian+Trait+for+Olfactory+Sensitivity+Affects+Odor+Experience+and+Food+Selection%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection.</a> Current Biology. 23, 1-5 (2013).</li>
<li>DeMaria, S., Ngai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of smell.</a> The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Zhang, X., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+olfactory+receptor+gene+superfamily+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+nauroscience%22%5BJournal%5D)">The olfactory receptor gene superfamily of the mouse.</a> Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).</li>
<li>Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+human+olfactory+subgenome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">The complete human olfactory subgenome.</a> Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).</li>
<li>Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+olfactory+receptor+%28OR%29+gene+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily.</a> Human Genomics. 3 (1), 87(2008).</li>
<li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+ligands+for+odorant%2C+vomeronasal+and+taste+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).</li>
<li>Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+receptor+codes+for+odors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Combinatorial receptor codes for odors.</a> Cell. 96 (5), 713-723 (1999).</li>
<li>Araneda, R. C., Kini, aD., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+receptive+range+of+an+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular receptive range of an odorant receptor.</a> Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).</li>
<li>Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTP+family+members+induce+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors.</a> Cell. 119 (5), 679-691 (2004).</li>
<li>Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+a+broad+but+selective+ligand+spectrum+of+a+mouse+olfactory+receptor%3A+mapping+the+odorant-binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).</li>
<li>Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+Reticulum+Retention%2C+Degradation%2C+and+Aggregation+of+Olfactory+G-Protein+Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors.</a> Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).</li>
<li>McClintock, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+olfactory-adrenergic+receptor+chimeras+and+intracellular+retention+of+heterologously+expressed+olfactory+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Molecular+brain+research%22%5BJournal%5D)">Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors.</a> Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).</li>
<li>Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Expression+of+a+Mammalian+Odorant+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li>
<li>Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+bases+of+odor+discrimination%3A+Reconstitution+of+olfactory+receptors+that+recognize+overlapping+sets+of+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).</li>
<li>Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Ligands+for+Olfactory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Ligands for Olfactory Receptors.</a> Cell. 95, 917-926 (1998).</li>
<li>Li, Y. R., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+state+of+the+M3+muscarinic+acetylcholine+receptor+modulates+mammalian+odorant+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling.</a> Science signaling. 4 (155), (2011).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cell-surface+expression+and+measuring+activation+of+mammalian+odorant+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells.</a> Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).</li>
<li>Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metric+for+odorant+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A metric for odorant comparison.</a> Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).</li>
<li>Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Receptors%3A+From+basic+science+to+applications+in+flavors+and+fragrances%5BTitle%5D)+AND+%22Perfumer+and+Flavorist%22%5BJournal%5D)">Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances.</a> Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).</li>
<li>Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+expression+defines+functional+units+in+the+mouse+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system.</a> The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).</li>
<li>Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptor+map+in+the+mouse+olfactory+bulb%3A+in+vivo+sensitivity+and+specificity+of+receptor-defined+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli.</a> Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).</li>
<li>Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+mammalian+odorant+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a mammalian odorant receptor.</a> Science. 279 (5348), 237-242 (1998).</li>
<li>Touhara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+and+reconstitution+of+an+odorant+receptor+in+single+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).</li>
<li>Zhuang, H., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+accessory+factors+in+functional+expression+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).</li>
<li>McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+the+odorant+receptor+OR2J3+is+associated+with+the+ability+to+detect+the+%26%2334%3Bgrassy%26%2334%3B+smelling+odor%2C+cis-3-hexen-1-ol%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the &#34;grassy&#34; smelling odor, cis-3-hexen-1-ol.</a> Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).</li>
<li>Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+evolution+of+mammalian+odorant+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Functional evolution of mammalian odorant receptors.</a> PLoS genetics. 8 (7), (2012).</li>
<li>Zhuang, H., Chien, M. -S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+functional+evolution+of+an+odorant+receptor+for+sex-steroid-derived+odors+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).</li>
<li>Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+odorant+derivative+as+an+antagonist+for+an+olfactory+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+senses%22%5BJournal%5D)">An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor.</a> Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).</li>
<li>Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+receptor+antagonism+between+odorants%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Olfactory receptor antagonism between odorants.</a> The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).</li>
<li>Fawcett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+ROC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Pattern+Recognition+Letters%22%5BJournal%5D)">An introduction to ROC analysis.</a> Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).</li>
<li>Baghaei, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Olfactory+Recept.+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Olfactory Receptors.</a> Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).</li>
<li>Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+surface+expression+of+chemosensory+receptors+in+heterologous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells.</a> Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tożsamość substancji zapachowej jest kodowana przez wzorce aktywacji receptorów węchowych, ale wzorce aktywacji receptorów, w tym które receptory są aktywowane i w jakim stopniu, są znane dla mniej niż 6% ludzkich receptorów węchowych1-11. Wysiłki zmierzające do scharakteryzowania receptorów węchowych zostały ograniczone przez ich pracochłonne metody lub możliwość zastosowania tylko do podzbioru rodziny receptorów węchowych17,23,24,33,34. Heterologiczny system ekspresji Hana3A wspiera solidną ekspre...

System węchowy ssaków ma zdolność reagowania na ogromną liczbę bodźców zapachowych, co pozwala na wykrywanie i rozróżnianie tysięcy zapachów. Receptory węchowe (OR) to czujniki molekularne wyrażane przez węchowe neurony czuciowe w nabłonku węchowym12. Rozpoznawanie zapachu u ssaków następuje poprzez różnicową aktywację OR przez substancje zapachowe, a rodzina genów OR jest rozległa, z około 1000 mysich i 400 ludzkich receptorów12-16. Wcześniejsze analizy funkcjonalne OR w neuronach węchowych i komórkach heterologicznych wykazały, że różne substancje zapachowe są rozpoznawane przez unikalne, ale nakładające się na siebie zespoły OR10,17-20. Dopasowanie ligandów do OR ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia kodu węchowego i jest niezbędne do budowania realnych modeli węchu. Ze względu na trudności w ekspresji OR w układach heterologicznych, a także dużą liczbę zarówno nawaniaczy, jak i OR, dane te były w dużej mierze niedostępne w terenie; rzeczywiście, mniej niż 6% ludzkich OR ma opublikowany ligand1-11. Protokół ten opisuje zastosowanie testu lucyferazy do scharakteryzowania interakcji odorant/OR. Test ten umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę OR, co jest zadaniem niezbędnym do zrozumienia interakcji nawaniacz/sala operacyjna, a także opracowania modelu kodowania zapachów.
Wysokoprzepustowe badania ORs stoją przed trzema głównymi wyzwaniami. Po pierwsze, OR ulegały ekspresji w komórkach heterologicznych, a następnie ulegały degradacji w proteasomie21,22, zapobiegając interakcji OR z substancjami zapachowymi w systemie testowym23-25. Problem ten został rozwiązany poprzez odkrycie białek pomocniczych, które ułatwiają stabilną ekspresję na powierzchni komórki szerokiego zakresu OR19,26,27. Białka transportujące receptory 1 i 2 (RTP1 i 2) promują ekspresję i aktywację powierzchni komórki OR w odpowiedzi na stymulację odorantem19. Na podstawie tej pracy komórki HEK293T zmodyfikowano w celu stabilnej ekspresji RTP1 long (RTP1L) i RTP2, białka zwiększającego ekspresję receptora 1 i Gαolf, w wyniku czego powstała linia komórkowa Hana3A19,27. Ponadto receptor muskarynowy acetylocholiny typu 3 (M3-R) oddziałuje z OR na powierzchni komórki i zwiększa aktywację w odpowiedzi na substancje zapachowe26. Kotransfekcja OR z RTP1S i M3-R do komórek Hana3A powoduje solidną, spójną i funkcjonalną ekspresję szerokiego zakresu OR na powierzchni komórki27. Po drugie, repertuar sal operacyjnych ssaków jest dość duży. Na przykład u ludzi repertuar OR jest o rząd wielkości liczniejszy niż repertuar receptorów smakowych i o 2 rzędy wielkości liczniejszy niż repertuar receptorów wzrokowych. Chociaż klonowanie pojedynczego operatora operacyjnego jest stosunkowo prostym protokołem, wygenerowanie obszernej biblioteki wymaga znacznego wysiłku z góry. Po trzecie, chociaż wiemy, że w widzeniu długość fali przekłada się na kolor, a częstotliwość słyszenia przekłada się na wysokość dźwięku, organizacja zapachów jest słabo poznana, co utrudnia badaczom interpolację z reprezentatywnej próbki substancji zapachowych. Chociaż na tym froncie poczyniono pewne postępy10,28, mapa krajobrazu węchowego pozostaje niekompletna. Badania przesiewowe dziesiątek tysięcy cząsteczek pod kątem setek OR to trudne zadanie; Ekrany o wysokiej przepustowości w tej domenie wymagają starannie zdefiniowanych kampanii. Głównymi pozostałymi wyzwaniami są kwestie logistyczne i kosztowe, a nie problemy związane z tą techniką. Chociaż heterologiczne badania przesiewowe nie były powszechnie stosowane do identyfikacji ligandów przez grupy akademickie, prywatna firma wykorzystała tę samą technikę do identyfikacji ligandów dla 100 ludzkich OR 29. Niestety, dane te pozostają zastrzeżone.
Opisany tutaj test lucyferazy o wysokiej przepustowości ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami używanymi do oceny aktywacji OR. Chociaż odpowiedzi natywnych węchowych neuronów czuciowych zostały zmierzone za pomocą elektrofizjologii i obrazowania wapnia, techniki te mają trudności z odróżnieniem, który OR prowadzi do odpowiedzi neuronu ze względu na nakładanie się właściwości odpowiedzi dla neuronów węchowych. Chociaż wkłucie typu receptoraznakowanego GFP 30,31, dostarczenie specyficznych receptorów za pośrednictwem adenowirusa do mysich neuronów węchowych32,33 lub wykonanie RT-PCR po nagraniach17,24,33 może połączyć nagrania z pojedynczymi typami receptorów, metody te są niskoprzepustowe i nie nadają się do badań przesiewowych na dużą skalę. Heterologiczne systemy przesiewowe są bardziej skalowalne, a w literaturze można znaleźć dwie główne formy: reportery szlaku cAMP i reportery szlaku trifosforanu inozytolu (IP3). Po stymulacji zapachu OR aktywują kaskadę sygnalizacyjną transdukcjiG-αolf, która powoduje wytwarzanie cyklicznego AMP (cAMP)12. Poprzez kotransfekcję genu reporterowego lucyferazy świetlika pod kontrolą elementu odpowiedzi cAMP (CRE), produkcję lucyferazy można zmierzyć jako funkcję odpowiedzi na zapach, co pozwala na ilościowe określenie aktywacji OR. Aktywacja OR może być również powiązana ze szlakiem IP3 poprzez koekspresję białek G, takich jak Gα15/16 lub chimera Gα15-olf 24,25,34. Wybraliśmy przedstawiony tutaj test w oparciu o trzy czynniki: (1) koekspresja RTP1 z receptorami węchowymi znakowanymi Rho poprawia ekspresję receptorów węchowych na powierzchni komórki19,27; (2) zastosowanie genu reporterowego reagującego na cAMP pozwala na pomiar aktywacji OR przez kanoniczny drugi szlak przekaźnikowy; oraz (3) test dobrze nadaje się do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.
Ten wysokoprzepustowy test lucyferazy ma zastosowanie do wielu badań cennych dla dziedziny węchu. Po pierwsze, duża liczba OR może być przesiewana pod kątem pojedynczego środka zapachowego w celu określenia wzorca aktywacji receptora dla określonego środka zapachowego. W tego typu badaniu zidentyfikowano OR7D4 jako salę operacyjną odpowiedzialną za odpowiedź na steroidowy środek zapachowy androstenon8. I odwrotnie, jedna sala operacyjna może być przesiewana pod kątem panelu substancji zapachowych w celu określenia profilu odpowiedzi receptora10. Gdy za pomocą tych ekranów zostaną zidentyfikowane pary zapachowo-nawaniaczy/sala operacyjna, interakcję można potwierdzić, przeprowadzając eksperyment z odpowiedzią na dawkę, badając reakcję sali operacyjnej na rosnące stężenia środka zapachowego. Krzywe dawka-odpowiedź mogą również ocenić, w jaki sposób zmienność genetyczna na sali operacyjnej wpływa na odpowiedź zapachową in vitro 8,9,11,35, a badania te można rozszerzyć na międzygatunkową zmienność OR, co pozwala na zbadanie ewolucji receptorów między gatunkami i mutacji przyczynowych w ewolucji36,37, Wreszcie, test ten można wykorzystać do badań przesiewowych pod kątem antagonistów zapachu, którzy są w stanie zantagonizować odpowiedź OR na określony zapach dla znanej pary zapachownik/receptor38,39. Podsumowując, ten wysokoprzepustowy test lucyferazy ma zastosowanie w szeregu badań, które pomogą scharakteryzować wzorce aktywacji OR i zapewnią lepsze zrozumienie kodowania zapachu w układzie węchowym.

<table><tbody><tr><td>Ogniwa Hana3A</td><td>Dostępne w Laboratorium Matsunami na żądanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RTP1S-pCI</td><td>Dostępne w Laboratorium Matsunami na żądanie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M3-R-pCI</td><td>Dostępne w Laboratorium Matsunami na życzenie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCRE-luc</td><td>Agilent</td><td>219076</td><td><a href="http://www.chem.agilent.com/store/ProductDetail.aspx?productID=219076%28Agilent%29">LUC</a></td></tr><tr><td>pSV40-RL</td><td>Promega</td><td>E2231</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/prl-renilla-luciferase-control-reporter-vectors/">RL</a></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media, Eagle</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M4655</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m4655?lang=en&amp; region=US">MEM</a></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/16000044? ICID=szukaj-16000044">FBS</a></td></tr><tr><td>PBS (bez Ca2+ i Mg2+)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><<td>a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS</a></td></tr><tr><td>Trypsin (0,05% trypsyny EDTA)</td><td>Life Technologies</td><td>25300</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300054? ICID=produkt-wyszukiwania">Trypsin</a></td></tr><tr><td>CD293</td><td>Life Technologies</td><td>11913-019</td><td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/11913019? ICID=search-11913019">CD293</a></td></tr><tr><td>96-well PDL biała/przezroczysta płytka</td><td>BD BioCoat</td><td>356693</td><td><a href="http://www.thomassci.com/Supplies/Tissue-Culture-Cellware/_/BD-Biocoat-Poly-D-Lysine-Culture-Dishes?q=356693">plates</a></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji lipidów: Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/11668019? ICID=szukaj-11668019">Lipofectamine</a>Substrat</td></tr> <tr><td>lucyferazy świetlika, wygaszacz lucyferazy świetlika/Renilla substrat lucyferazy: Test Dual-Glo</td><td>Promega</td><td>E2980</td><td><a href="http://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-assays/dual_glo-luciferase-assay-system/?__utma=1.1932750276.1376486173.1376486173.1376486173.1&__utmb=1.1.10.1376486173&amp;__utmc=1&__utmx=-&__utmz=1.1376486173.1.1.utmcsr=google|utmc">dual glo</a></td></tr><tr><td>Synergy S2&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>SLAD</td><<td>a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">Oprogramowanie do czytnika BioTek S2</a></td></tr><tr><td>Microplate: Oprogramowanie do analizy danych</td><td>Gen5 BioTek</td><td>Gen5</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/gen5_data_analysis_software.html">Gen5</a></td></tr><tr><td>BIOSTACK</td><td>BioTek</td><td>BIOSTACK2WR</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/microplate_software/biostack_microplate_stacker.html">BioStack</a></td></tr><tr><td>Multiflo</td><td>BioTek</td><td>MFP</td><td><a href="http://www.biotek.com/products/liquid_handling/multiflo_microplate_dispenser.html">MultiFlo</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips</td><td>Integra</td><td>4414</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_4_e.html">GripTips</a></td></tr><tr><td>300 &#956; l GripTips ViaFlo96</td><td>Integra</td><td>6433</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ końcówki</a></td></tr><tr><td>12.5 &#956; l GripTips 384 XYZ</td><td>Integra</td><td>6403</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/pipette_tips_griptips_XYZ_4_e.html">XYZ tips</a></td></tr><tr><td>384ViaFlo</td><td>Integra</td><td>6030</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.com/sites/us/96_384_channel_pipette.html">384ViaFlo</a></td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Macherey Nagel</td><td>740797.1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en&amp; region=US">DMSO</a></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-CN100-0010</td><td><a href="http://www.thomassci.com/007635F0-AA41-4B24-B46A-05723D685997/_/FORSKOLIN-10MG?q=c002e24">FOR</a></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa analiza receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptorów poprzez aktywność lucyferazy

High-throughput Analysis of Mammalian Olfactory Receptors: Measurement of Receptor Activation via Luciferase Activity

Odoranty tworzą unikalne i nakładające się na siebie wzorce aktywacji receptorów węchowych, pozwalając rodzinie około 1000 mysich i 400 ludzkich receptorów rozpoznać tysiące zapachów. Ligandy zapachowe zostały opublikowane dla mniej niż 6% ludzkich receptorów1-11. Ten brak danych wynika częściowo z trudności w funkcjonalnej ekspresji tych receptorów w systemach heterologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę ekspresji większości rodziny receptorów węchowych w komórkach Hana3A, a następnie wysokoprzepustową ocenę aktywacji receptorów węchowych za pomocą testu reporterowego lucyferazy. Test ten można wykorzystać do (1) przesiewania paneli substancji zapachowych przed panelami receptorów węchowych; (2) potwierdzić interakcję między nazapachem a receptorem za pomocą krzywych dawka-odpowiedź; oraz (3) porównać poziomy aktywacji receptorów między wariantami receptorów. W naszej próbie 328 receptorów węchowych zostało przebadanych pod kątem 26 substancji zapachowych. Pary odorant/receptor o różnych wynikach odpowiedzi zostały wybrane i przetestowane pod kątem odpowiedzi na dawkę. Dane te wskazują, że badanie przesiewowe jest skuteczną metodą wzbogacania o pary substancji zapachowej/receptora, które przejdą eksperyment z reakcją na dawkę, tj. receptory, które reagują na środek zapachowy w dobrej wierze. Dlatego ten wysokoprzepustowy test lucyferazy jest skuteczną metodą charakteryzowania receptorów węchowych - niezbędnym krokiem w kierunku modelu kodowania zapachu w układzie węchowym ssaków.

W ramach wstępnego przesiewu przetestowano 328 receptorów węchowych (OR) w obecności 26 zapachów o stężeniu 100 µM. Wykazano, że takie stężenie substancji zapachowych skutecznie aktywuje znaczną część receptorów OR o znanych ligandach10. W pierwszej kolejności obliczono znormalizowaną aktywność lucyferazy, dzieląc odczyt lucyferazy świetlikowej przez odczyt lucyferazy Renilla. Następnie wyznaczono wartości bazowe poprzez odjęcie znormalizowanych odczytów lucyferazy dla kontroli bez zapachu od znormali...

Wzorce aktywacji receptorów węchowych kodują tożsamość zapachu, ale brak opublikowanych danych identyfikujących ligandy zapachowe dla receptorów węchowych ssaków utrudnia opracowanie kompleksowego modelu kodowania zapachu. Protokół ten opisuje metodę ułatwiającą wysokoprzepustową identyfikację ligandów receptorów węchowych i ilościowe określenie aktywacji receptora.

Wysokoprzepustowa analiza receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptorów poprzez aktywność lucyferazy

Odorants create unique and overlapping patterns of olfactory receptor activation, allowing a family of approximately 1,000 murine and 400 human receptors ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przeprowadzenie wysokoprzepustowego pomiaru aktywacji receptorów węchowych za pomocą testu lucyferazy. Osiąga się to poprzez transekcję komórek H 3A z wektorami zawierającymi białka pomocnicze, lucyferazy świetlika i wanilii oraz receptory węchowe w celu ekspresji innego receptora węchowego. W każdym dołku na płytce 96-dołkowej.W drugim etapie komórki są stymulowane zapachami. Następnie dodawany jest substrat lucyferazy, powodując, że komórki, które wytwarzały enzym lucyferazy, świecą, działając w ten sposób jako reporter aktywacji receptora węchowego. Ostatecznie wyniki pokazują reakcje populacji receptorów węchowych na zapachy w oparciu o luminescencję każdego dołka w płytce.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak adenowirus, transdukcja natywnych neuronów lub obrazowanie wapnia, jest to, że technika ta zarówno skaluje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, jak i wykorzystuje natywną drugą ścieżkę przekaźnikową za pośrednictwem CM do badania aktywacji receptorów węchowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie węchu, takie jak dopasowanie ligandów zapachowych, a więc receptorów węchowych oraz zbadanie wpływu zmienności genetycznej na aktywację receptorów węchowych. Komórki Hanna trzy A użyte w tym protokole są utrzymywane w pożywce M 10 w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 i powinny być w 100% zlewające się w celu płytki komórek do transfekcji aspiratu z 10-centymetrowego naczynia komórek do mycia komórek.Dodając 10 mililitrów PBS, obracając naczynie i zasysając PBS, dodaj trzy mililitry 0,05% tripsin EDTA i poczekaj około minuty, aż komórki zdysocjują w temperaturze pokojowej. Dezaktywuj trypsynę, dodając pięć mililitrów pożywki M 10, rozbijając grudki komórek, trzykrotnie oceniając około 10 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety. Pipetę należy uważnie, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza do podłoża.Na każdą 96-dołkową płytkę przenieś jeden mililitr komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Wirować przy 200-krotności grawitacji przez pięć minut i zasysać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Zawieś komórki w 12 mililitrach M 10, pipetuj 50 mikrolitrów komórek do każdego dołka z 96 płytek dołkowych i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2.Przed rozpoczęciem tej procedury należy obserwować komórki posiane poprzedniego dnia, aby zapewnić odpowiednią płynność około 30 do 50% na studzienkę. Włóż płytki z powrotem do inkubatora i kontynuuj. Aby przygotować transfekcję, wymieszaj plazmidy do ekspresji białek dodatkowych.Lucyferazy świetlika i lucyferazy waniliowej zostały rozcieńczone do stężenia 100 nanogramów na mikrolitr w buforze TE, aby plazmidy wymieszały pipetować plazmidy na pożywkę mem zgodnie z objętościami wskazanymi w tej tabeli. Na każdą 96-dołkową płytkę rozcieńczyć 18 mikrolitrów odczynnika do transfekcji lipidów w 450 mikrolitrach pożywki mem, aby uzyskać mieszaninę transfekcji lipidów. Następnie odpipetuj plazmid.Wymieszaj plazmid z receptorem węchowym znakowanym opsyną, a transfekcja lipidów wymieszaj na czystą płytkę MICROTITER. Aby kompleks był szczegółowo opisany w tej tabeli, ważne jest obliczenie studni plus 10%, aby zapewnić wystarczającą objętość dla kolejnych kroków. Wymieszaj roztwór przez tri curation i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Zatrzymaj reakcję, dodając M 10 zgodnie z tabelą. Aby ta procedura zakończyła się sukcesem, ważne jest, aby komórki nigdy nie pozostawały bez podłoża na dłużej niż dwie minuty. Podczas gdy roztwory są dodawane do studni.Usunąć komórki z inkubatora i odwrócić płytkę komórkową i wystukać z pożywki, pipetę 50 mikrolitrów kompleksu do każdej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 następnego dnia po transfekcji receptorów węchowych. Obserwuj transfekowane komórki, aby zapewnić odpowiednią płynność od 50 do 80% na studzienkę, zwróć komórki do inkubatora. Zapach został rozcieńczony do stężenia podstawowego jednego mola, a DMSO do eksperymentów przesiewowych rozcieńcza każdy roztwór podstawowy zapachu do 100 mikromolów.Ponadto należy przygotować środek do kontroli bez zapachu, zawierający tylko pożywkę CD2 93 do kontroli aktywacji tła receptorów węchowych. Wyjmij komórki z inkubatora i strzepnij pożywkę z płytek komórkowych. Odpipetować 25 mikrolitrów roztworu do stymulacji zapachów do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2 przez cztery godziny.Rozpocznij tę procedurę. Rozmrażanie jednego mililitra substratu lucyferazy świetlików na 96. Dobrze przygotuj świeży wygaszacz reakcji lucyferazy świetlika i uruchom odczynnik substratu lucyferazy waniliowej.Potrzeba około jednego mililitra odczynnika na 96 płyt spawalniczych. Następnie przygotuj czytnik mikropłytek luminescencyjnych w ikonie systemu pod zakładką podgrzewania. Zaznacz pole włączone i ustaw temperaturę urządzenia na 25 stopni Celsjusza pod zakładką dozownika.Napełnij każdy dozownik 1000 mikrolitrami 70% etanolu, a następnie 1000 mikrolitrami wody destylowanej. Do każdego dozownika należy używać oddzielnych porcji alkoholu i wody. Zalać każdy dozownik 1 500 mikrolitrami dozownika powietrza zalewającego.Jeden z 1080 mikrolitrami głównego dozownika substratu lucyferazy świetlika. Dwa z substratem lucyferazy ranil. Uważaj, aby nie zanieczyścić krzyżowo substratów lucyferazy.Skonfiguruj następujący protokół, aby odczytać luminescencję lucyferazy świetlików i lucyferazy waniliowej w oprogramowaniu. W menu plików. Kliknij nowe protokoły podświetlania zadań i kliknij utwórz nowe.W kolejnym oknie należy zaznaczyć kółko obok standardowego protokołu. Kliknij w porządku. Kliknij dwukrotnie procedurę.Po lewej stronie ekranu dozuj 10 mikrolitrów substratu lucyferazy świetlika do wszystkich studzienek za pomocą dozownika jeden w menu akcji, kliknij dozować w oknie kroku dozowania. Ustaw dozownik na jeden. Gruntowanie do braku.Dozuj objętość do 10 mikrolitrów i szybkość do 225 mikrolitrów na sekundę, kliknij dobrze. Potrząsaj płytką przez 30 sekund w menu akcji, kliknij potrząśnij w oknie kroku potrząsania. Ustaw intensywność na średnią i czas trwania na 30 kliknięć. Porządku.Odczytaj luminescencję wszystkich studzienek przez 0,5 sekundy na studzienkę w menu akcji. Kliknij odczyt w oknie kroku odczytu, ustaw metodę wykrywania na typ odczytu luminescencji do punktu końcowego, czas integracji na 50 zestawów filtrów na jedną emisję do całej pozycji optycznej, na górne wzmocnienie na 1, 35 i wysokość odczytu na 1,00 milimetra. Kliknij w porządku.Dozuj 10 mikrolitrów substratu lucyferazy do wszystkich studzienek za pomocą dozownika drugiego. Ustaw warunki korzystania z dozownika, jak pokazano. Jeden z wyjątkiem ustawionego dozownika na dwa.Potrząsaj płytką przez 30 sekund. Odczytaj luminescencję wszystkich dołków przez 0,5 sekundy na studzienkę. Zdjąć pokrywkę z płytki 96-dołkowej i umieścić płytkę w czytniku mikropłytek.Uruchom wcześniej skonfigurowany program, aby odczytać luminescencję płyty po zakończeniu odczytu. Wyczyść pompy dozownika odczynnika za pomocą ikony systemu pod zakładką dozownika. Usuń 1000 mikrolitrów substratu lucyferazy świetlików z dozownika lucyferazy świetlika do probówki regeneracyjnej.Każdy dozownik zawiera 1000 mikrolitrów wody destylowanej, a następnie 1000 mikrolitrów 70% etanolu. I wreszcie, 1500 mikrolitrów powietrza pokazanych tutaj to wyniki pierwotnego badania przesiewowego, w którym przetestowano 328 receptorów węchowych lub OR przeciwko 26 zapachom o stężeniu 100 mikromolowym. Ten histogram przedstawia częstość lub liczbę wyjściowych wartości lucyferazy obliczonych dla każdego zapachu lub pary na ekranie, ponieważ pary aktywacji receptora zapachowego są rzadkie.Większość wartości jest wyśrodkowana na zero, a duży rozkład centralny szacuje rozkład szumu dla tego testu. Krzywe odpowiedzi na dawkę przeprowadzono na 48 nazapachach lub parach losowo rozmieszczonych w zakresie wartości wyjściowych, jak wskazano kolorowymi paskami. Niebieskie słupki to pary, które zostały sklasyfikowane jako agoniści na podstawie pełnej odpowiedzi na dawkę, a czerwone słupki to pary, które nie zostały sklasyfikowane jako agoniści.Odsetek wyników prawdziwie dodatnich został następnie zestawiony ze wskaźnikiem wyników fałszywie dodatnich przy użyciu pakietu statystycznego R. Obszar pod krzywą lub UC wynosi 0,68, co wskazuje, że nawaniacz lub pary o wyższych wartościach ekranu lucyferazy mają większe szanse na przejście odpowiedzi na dawkę niż te o niższych wartościach. Dane te sugerują, że pierwotne badanie przesiewowe jest użyteczną metodą wzbogacania o substancje zapachowe lub pary, które zostaną sklasyfikowane jako agoniści w eksperymencie z pełną odpowiedzią na dawkę.Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu około sześciu godzin na 5 96 płytek, z wyłączeniem czasu inkubacji, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić wysokoprzepustową analizę receptorów węchowych za pomocą transfekcji, stymulacji zapachu i pomiaru aktywacji za pomocą testu lucyferazy.

high-throughput-analysis-mammalian-olfactory-receptors-measurement

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Analiza o wysokiej wydajności receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptora poprzez aktywność luciferase

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

W niniejszym materiale prezentujemy protokół barwienia żywych komórek, który umożliwia wygodne wykrywanie receptorów zapachowych na powierzchni komórek HEK293T. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do analizy ekspresji powierzchniowej innych receptorów chemosensorycznych lub receptorów GPCR.

Oznaczanie ekspresji powierzchniowej receptorów chemosensorycznych w komórkach heterologicznych

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

Ten film demonstruje protokół pomiaru aktywacji receptora zapachowego w transfekowanych komórkach za pomocą cyklicznego biosensora adenozynomonofosforanu (cAMP) i detekcji luminescencji. Metoda ta jest stosowana do badania interakcji receptor-ligand i szlaków sygnałowych w neuronach węchowych.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego za pomocą cyklicznego testu monofosforanu adenozyny w czasie rzeczywistym

Źródło: de March, C. A. et. al., Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora odorantu przez nawaniacz w fazie gazowej. J. Vis. Exp. (2019)Ten film przedstawia metodę monitorowania aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym w rekombinowanych komórkach ssaków za pomocą pomiaru luminescencji. Wiązanie odorantu wyzwala aktywację białka G i produkcję cAMP, aktywując białka glosensor, które emitują luminescencję po związaniu substratu, zapewniając ilościową miarę...

Monitorowanie w czasie rzeczywistym aktywacji receptorów zapachowych w komórkach rekombinowanych

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Scharakteryzowanie funkcji receptorów zapachowych jest nieodzowną częścią procesu desierotyzacji. Opisujemy metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym za pomocą testu cAMP.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym

Fizjologicznie, receptory zapachowe są aktywowane przez cząsteczki odorantu wdychane w fazie gazowej. Jednak większość systemów in vitro wykorzystuje stymulację odorantem w fazie ciekłej. W tym artykule przedstawiamy metodę, która pozwala na monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego po stymulacji odoranta w fazie gazowej.

Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Poznaj metodę wysokoprzepustowego pomiaru aktywacji receptorów węchowych ssaków za pomocą testu lucyferazowego. Technika ta umożliwia szybką identyfikację ligandów receptorów i badanie kodowania zapachów.

Wysokoprzepustowa analiza receptorów węchowych ssaków: pomiar aktywacji receptorów poprzez aktywność lucyferazy

Przeglądaj więcej filmów