Kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym
26 sierpnia 2014
Ten manuskrypt opisuje protokół, który stosuje kompleksowe profilowanie do analizy programów transkrypcyjnych indukowanych w określonych jądrach mózgowych gryzoni zgodnie z paradygmatami behawioralnymi. W niniejszym artykule podejście to zostało zilustrowane w kontekście profilowania genów indukowanych w jądrze półleżącym (NAc) myszy po ostrej ekspozycji na kokainę, z wykorzystaniem mikroprzepływowych macierzy qPCR.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie dynamiki transkrypcyjnej i określonych jąder mózgu myszy po doświadczeniu behawioralnym. Osiąga się to poprzez uprzednią habituację zwierząt i rejestrację ich aktywności lokomocyjnej po wstrzyknięciu soli fizjologicznej. Po habituacji rejestrowana jest aktywność lokomocyjna po pojedynczej dawce kokainy, a następnie pobierane są próbki z jądra półleżącego, które służą do izolacji RNA i przygotowania cDNA.
Następnie przeprowadzana jest analiza qPCR w celu zbadania ekspresji genów indukowanej przez zachowanie. Ostatecznie uzyskuje się wyniki ukazujące dynamikę transkrypcyjną po doświadczeniu z kokainą. Protokół zaprezentują dr Hatu, kierownik laboratorium, Dum Muer, doktorant z laboratorium oraz Duran, student studiów licencjackich z laboratorium. Przez trzy kolejne dni każda mysz jest oswajana z procedurami obsługi i wstrzykiwania; przed rozpoczęciem eksperymentu myszy są rozmieszczone w klatkach w taki sposób, aby w przyszłości nie było konieczności ich przenoszenia między klatkami i aby myszy nigdy nie pozostawały w izolacji przez dłuższy czas.
Na 30 minut przed rozpoczęciem testów wszystkie klatki testowe należy przenieść do pomieszczenia behawioralnego, aby umożliwić zwierzętom aklimatyzację do środowiska. Podaj dożylnie 250 microliters soli fizjologicznej; bezpośrednio po iniekcji umieść mysz w komorze behawioralnej, aby monitorować aktywność lokomotoryczną przez 15 minut. Mysz można pozostawić w komorze behawioralnej na 20 minut.
Aktywność monitorowano od drugiej do 17. minuty. Powtórz te kroki o tej samej porze dnia przez kolejne dwa dni. Czwartego dnia podaj pojedynczy zastrzyk kokainy lub soli fizjologicznej, w zależności od grupy, a następnie niezwłocznie umieść mysz w komorze, aby monitorować lokalną aktywność motoryczną przez 20 minut w wybranych punktach czasowych po ekspozycji na kokainę; wyjmij mózg i umieść go w lodowatym roztworze A CSF na jedną do dwóch minut w celu schłodzenia i utwardzenia.
Po usunięciu móżdżku i odsączeniu nadmiaru płynu, przyklej mózg do stolika wibratomu częścią rostralną skierowaną do góry. Wypełnij komorę lodowatym A CSF i wykonuj przekroje o grubości 200 micron, aż do wyraźnej identyfikacji jądra półleżącego. Podczas cięcia zwracaj szczególną uwagę na kształt ciała modzelowatego, lokalizację i kształt spoiwa przedniego oraz komór mózgu.
Po zidentyfikowaniu właściwego obszaru należy wyciąć dwa skrawki o grubości 400 mikronów, z których jądro półleżące zostanie wypreparowane pod stereoskopem. Do oddzielenia jądra półleżącego od skrawków należy użyć cienkiego ostrza. Cztery szybkie cięcia w odpowiednim miejscu powinny natychmiast wyizolować właściwą tkankę.
Umieść wyizolowaną tkankę w 900 µL odczynnika lizującego i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA. Przed rozpoczęciem rozmroź probówki w temperaturze 37 °C i homogenizuj. Przy użyciu igły o rozmiarze 25 G pierwsze kilka cykli może być utrudnione i wymagać dociskania tkanki do ścianki probówki w celu homogenizacji na małe fragmenty. Aby zapewnić prawidłową homogenizację, nanieś lizat pipetą na kolumienkę Kaya Shredder Mini Spin i odwiruj w wirówce.
Przenieś lizat pipetą do nowej probówki do mikrocentryfugi i wyizoluj RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Po oczyszczeniu RNA przeprowadza się odwrotną transkrypcję do cDNA, a następnie specyficzną dla celu preamplifikację próbek przy użyciu starterów skierowanych przeciwko grupie genów wybranych do analizy. Procedury te zostały opisane w wersji tekstowej protokołu.
Komercyjne chipy mikrofluidyczne do kompleksowej analizy QPCR są dostępne w formacie 48 na 48, co umożliwia analizę 48 próbek z użyciem 48 zestawów sond, lub w formacie 96 na 96, w którym analizuje się 96 próbek przy użyciu 96 sond. W większości przypadków wybór chipa zależy przede wszystkim od liczby analizowanych próbek.
W pierwszej kolejności należy przygotować mieszaninę próbek zgodnie z chipem wybranym do eksperymentu. Należy zachować ostrożność podczas pipetowania 20-krotnego odczynnika ładującego z barwnikiem wiążącym DNA. Roztwory mieszanin próbek należy mieszać przez co najmniej 20 sekund, a następnie wirować przez minimum 30 sekund.
Przygotowane reakcje można przechowywać przez krótki czas w temperaturze 4 °C do momentu, gdy chip będzie gotowy do załadowania. Następnie należy przygotować mieszaninę testową, dokładnie wymieszać mieszaninę próbek i odwiruwać, aby osadzić wszystkie składniki na dnie. Jak pokazano wcześniej, chip IFC do dynamicznych macierzy posiada wloty dla próbek i testów, a także dedykowane wloty dla płynu linii kontrolnej używanego doyciśnienia komór mikrofluidycznych.
W pierwszej kolejności wstrzyknij płyn z linii kontrolnej do każdego akumulatora na chipie. Następnie przygotuj chip, umieszczając go w kontrolerze IFC i uruchamiając odpowiedni skrypt. Po zakończeniu działania skryptu wyjmij przygotowany chip z kontrolera IFC i nanieś pipetą 5 µL każdego testu.
Wymieszaj na chipie. Dodaj pięć µL każdej mieszaniny próbek do odpowiednich wlotów, a następnie umieść chip z powrotem w kontrolerze IFC, korzystając z oprogramowania kontrolera IFC. Uruchom skrypt, aby wprowadzić próbki i testy do chipa.
Po zakończeniu działania skryptu mieszania ładunku, wyjmij załadowany chip z kontrolera IFC. Następnie umieść chip w termocyklerze i utwórz nowy przebieg dla chipa, który obejmuje analizę krzywej topnienia. Korzystając z oprogramowania termocyklera, upewnij się, że komory reakcyjne zostały prawidłowo rozpoznane, a następnie pozwól reakcji dobiec do końca.
Wzrost aktywności lokomotorycznej był widoczny po pojedynczym ostrym wstrzyknięciu kokainy. Na tym przekroju czołowym grube białe linie zaznaczyły miejsca nacięć wykonanych w celu wyznaczenia granic jądra półleżącego. Podczas sekcji krzywe amplifikacji starterów skierowanych przeciwko CFOs i phos B wykazują, że pary starterów amplifikują docelowy transkrypty z wydajnością wynoszącą około 100%.
W każdym cyklu wyniki wskazują, że kokaina indukuje najwyższą ekspresję CFO i phos B w jądrze półleżącym jedna oraz dwie godziny po ekspozycji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie następnej generacji (NGS), w celu zidentyfikowania nowych, niecharakteryzowanych transkryptów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt opisuje protokół analizy programów transkrypcyjnych w określonych jądrach mózgu gryzoni po zastosowaniu paradygmatów behawioralnych. Podejście to zostało zilustrowane poprzez profilowanie genów indukowanych w jądrze półleżącym (NAc) myszy po ostrej ekspozycji na kokainę.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Analiza behawioralna
- Profilowanie ekspresji genów
Wstęp
- Dynamika transkrypcyjna ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia reakcji mózgu na zachowanie.
- Jądro półleżące jest kluczowym obszarem zaangażowanym w mechanizmy nagrody i uzależnień.
- Ekspozycja na kokainę zmienia ekspresję genów w mózgu.
- Mikroprzepływowe matryce qPCR umożliwiają szczegółowe profilowanie genów.
Cel badania
- Zbadanie zmian transkrypcyjnych w jądrze półleżącym po ekspozycji na kokainę.
- Opracowanie protokołu izolacji RNA i analizy ekspresji genów.
- Zrozumienie wpływu behawioralnego na ekspresję genów u gryzoni.
Zastosowane metody
- Przyzwyczajanie myszy do obchodzenia oraz iniekcji soli fizjologicznej.
- Rejestracja aktywności lokomocyjnej po podaniu kokainy.
- Pobieranie próbek z jądra półleżącego w celu izolacji RNA.
- Analiza QPCR w celu oceny zmian w ekspresji genów.
Główne wyniki
- Obserwowano dynamikę transkrypcyjną po ekspozycji na kokainę.
- Zidentyfikowano specyficzne geny ulegające indukcji w NAc.
- Protokół wykazał skuteczność w profilowaniu ekspresji genów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia molekularnych podstaw uzależnienia.
Wnioski
- Badanie dostarcza solidnego protokołu analizy ekspresji genów w odpowiedzi na bodźce behawioralne.
- Wyniki poszerzają wiedzę na temat odpowiedzi transkrypcyjnych w badaniach nad uzależnieniami.
- Podejście to można zastosować w innych paradygmatach behawioralnych w neuronauce.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym ilościową ocenę dynamiki transkrypcyjnej w określonych obszarach mózgu po zaburzeniach behawioralnych lub farmakologicznych, co wspiera walidację celów w procesie odkrywania leków neuropsychiatrycznych. Dzięki zapewnieniu powtarzalnych, ilościowych wyników ekspresji genów z ograniczonych próbek tkanek, metoda ta zwiększa pewność predykcyjną we wczesnych badaniach mechanistycznych i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go w przypadku terapeutyków celowanych w OUN. Podejście to jest szczególnie wartościowe w celu minimalizacji ryzyka hipotez związanych z uzależnieniami, szlakami nagrody oraz fenotypami behawioralnymi przed zainwestowaniem zasobów w optymalizację związku wiodącego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie programów transkrypcyjnych w jądrze półleżącym w celu walidacji funkcjonalnego znaczenia genów zaangażowanych w odpowiedzi behawioralne indukowane kokainą.
- Wartość operacyjna: Wspiera rzetelne testowanie hipotez dotyczących celów molekularnych przy użyciu mikrofluidycznego qPCR, co pozwala na wysokoczułe ilościowe określenie zmian w ekspresji genów z ograniczonej ilości tkanki mózgowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych układów biologicznych do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie bazowych profili transkrypcyjnych po ostrym wyzwaniu farmakologicznym.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów dzięki ustandaryzowanym procedurom izolacji RNA, odwrotnej transkrypcji oraz mikrofluidycznego qPCR, które można zastosować w wielu próbkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych dla przebiegu choroby odczytów transkrypcyjnych w dobrze opracowanym modelu odpowiedzi na psychostymulanty, co wspiera dopasowanie biomarkerów i redukcję ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez dostarczanie ilościowych, multipleksowych danych o ekspresji genów, odpowiednich do potwierdzenia w różnych platformach analitycznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, wspierając walidację celów opartą na hipotezach oraz opracowywanie testów przed podjęciem wysiłków w celu identyfikacji wiodących związków w programach odkrywania leków ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia mechanistyczną analizę dynamiki transkrypcyjnej po doświadczeniu behawioralnym, co wspiera wyjaśnienie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka związanego z doborem celów terapeutycznych.
- Przesiewanie: Generuje ilościowe, multipleksowe wyniki, które zapewniają gotowość i powtarzalność testów w kampaniach przesiewowych związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza znormalizowane pomiary ekspresji genów z mikroprzepływowych macierzy qPCR, umożliwiając statystyczne porównanie różnych warunków eksperymentalnych i punktów czasowych.
- Badania translacyjne: Łączy ostre reakcje behawioralne z sygnaturami molekularnymi w obwodach nagrody, co wspiera trafność translacyjną w modelach uzależnień.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę profilowania transkrypcyjnego możliwą do wielokrotnego wykorzystania w różnych paradygmatach behawioralnych i wyzwaniach farmakologicznych w badaniach nad neuronauką.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych poprzez powiązanie fenotypów behawioralnych z określonymi odpowiedziami transkrypcyjnymi w kluczowych obszarach mózgu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność analizy ekspresji genów dzięki ustandaryzowanym mikrofluidycznym protokołom qPCR odpowiednim do przetwarzania wielu próbek.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka w przypadku celów w OUN poprzez uzyskanie wglądu w mechanizmy działania przed kosztowną optymalizacją wiodących związków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów skorygowaną o ryzyko, dostarczając ilościowych dowodów na aktywację ścieżek sygnałowych po podaniu czynnika farmakologicznego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu technik neuronaukowych, w tym testów behawioralnych, sekcji mózgu oraz pracy z RNA.
- Metoda zależy od dostępu do mikrofluidycznych platform qPCR oraz powiązanej aparatury do wysokoprzepustowego profilowania genów.
- Konieczne jest stosowanie zestandaryzowanych protokołów pobierania próbek, izolacji RNA oraz syntezy cDNA w celu zapewnienia spójności między eksperymentami.
- Wymagane są rozważania dotyczące adaptacji protokołu przy jego stosowaniu w odniesieniu do różnych obszarów mózgu, gatunków lub paradygmatów behawioralnych poza odpowiedziami jądra półleżącego indukowanymi kokainą.
- Ograniczenia praktyczne obejmują niską wydajność tkanki z małych jąder mózgu oraz konieczność dokładnej normalizacji w celu uwzględnienia zmienności próbek.
