Name: Kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj analizę dynamiki transkrypcji w jądrze półleżącym myszy po ekspozycji na kokainę. Ta metoda umożliwia badanie zmian ekspresji genów związanych z uzależnieniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) oraz Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Pierwsze kroki w projekcie zostały sfinansowane ze stypendium podoktorskiego AXA dla AC. Doceniamy hojne fundusze na rozpoczęcie działalności zapewnione przez Centrum Nauk o Mózgu im. Edmonda i Lily Safra.
Krytyczna lektura przez członków laboratorium Citri jest bardzo mile widziana.

UWAGA: Protokół jest zgodny z wytycznymi Uniwersytetu Hebrajskiego w Jerozolimie.
1. Przygotowanie roztworu ACSF
<ol>
	<li>Przygotować roztwór ACSF zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przygotować 1 l w czystości ddH2O (>18 MΩ), doprowadzając osmolarność do ~300 mOsm/L z odpowiednim dodatkiem wody lub NaCl.</li>
</ol>
2. Wyposażenie i konfiguracja pomieszczenia
Sprzęt do monitorowania zachowań lokomotorycznych wywołanych przez kokainę składa się z komór behawioralnych (50 x 45 cm) połączonych z wewnętrznym źródłem światła, wentylatorem i kamerą (lub czujnikami podczerwieni), oraz wyposażonych w wewnętrzną skrzynkę z pleksiglasu (30 x 30 cm), w której myszy mogą się swobodnie poruszać, podczas gdy ich poruszanie się jest monitorowane. Testy behawioralne należy przeprowadzać od 1 godziny po włączeniu świateł do 1 godziny przed wyłączeniem światła, w regularnym cyklu światła/ciemności. Zwierzęta powinny być szkolone konsekwentnie o tej samej porze każdego dnia.
<ol>
	<li>Podłącz kamerę lub system podczerwieni do odpowiedniego systemu w celu monitorowania i rejestrowania zachowań lokomotorycznych myszy.</li>
	<li>Wyczyść komory po każdej próbie środkiem dezynfekującym dostarczonym przez mysz i/lub odczynnikiem usuwającym zapachy, aby zapobiec odchyleniu sygnałów węchowych i zapewnić właściwą dezynfekcję.</li>
</ol>
WAŻNE: Podczas obchodzenia się z myszami bądź cichy, spokojny i ostrożny.
3. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Trzymaj 5 samców myszy C57BL6 (6-12 tygodni; ~25-35 g wagi) w klatce, w pomieszczeniu z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności i swobodnym dostępem do jedzenia i wody, zgodnie ze standardami i wymaganiami lokalnych wytycznych i protokołów Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami. Przed rozpoczęciem eksperymentu zważ myszy i zapisz dane. Kokaina jest później podawana w zależności od wagi myszy.</li>
	<li>Przenieś wszystkie klatki zawierające myszy do pokoju behawioralnego 30 minut przed rozpoczęciem pierwszej próby.</li>
	<li>Przyzwyczaj wszystkie myszy użyte w eksperymencie do obsługi przez eksperymentatora, wstrzykiwania i monitorowania w konfiguracji zachowania. Osiąga się to poprzez 3 kolejne codzienne wstrzyknięcia dootrzewnowe 250 μl soli fizjologicznej, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie 250 μl soli fizjologicznej. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy umieścić mysz w komorze behawioralnej w celu monitorowania aktywności lokomotorycznej przez 15 minut. Powtarzaj tę czynność przez 3 kolejne dni, codziennie o tej samej godzinie.</li>
	<li>Czwartego dnia podziel myszy na dwie grupy. Przygotować podstawowy roztwór kokainy o stężeniu 2 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej. Grupie doświadczalnej należy podać pojedyncze wstrzyknięcie roztworu kokainy (końcowe 20 mg/kg) w zależności od masy ciała myszy (np. dla myszy o wadze 25 g – wstrzyknąć 250 μl, podczas gdy mysz o wadze 30 g otrzyma 300 μl). Podawać sól fizjologiczną grupie kontrolnej. Bezpośrednio po wstrzyknięciu należy umieścić mysz na 20 minut w komorze behawioralnej w celu monitorowania aktywności lokomotorycznej (zazwyczaj monitorowane są pierwsze 15 minut).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu kokainy należy złożyć myszy w ofierze w różnych punktach czasowych (0, 1, 2, 4, 8 i 24 godziny po wstrzyknięciu). Co ważne, należy upewnić się, że myszy referencyjne (0 punkt czasowy) nie otrzymają w tym dniu żadnego zastrzyku. Ze względu na jego znaczenie konieczne jest uwzględnienie powtórzeń grupy referencyjnej.</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie jądra półleżącego
<ol>
	<li>Znieczulić myszy izofluranem w odpowiednim czasie po wstrzyknięciu kokainy/soli fizjologicznej. Izofluran musi być bezpośrednio odprowadzany z pomieszczenia. Dlatego zabieg powinien być wykonywany w dygestorium chemicznym.</li>
	<li>Monitoruj głębokość znieczulenia, testując odruch tylnej stopy. Uszczypnij łapę, aby wywołać reakcję wycofania się zwierzęcia. Zwierzę, które wykazuje odruch, nie jest w znieczuleniu chirurgicznym i nie jest w stanie do eutanazji.</li>
	<li>Ekstrakcja mózgu:
	<ol>
		<li>Poddaj mysz eutanazji przez ścięcie.</li>
		<li>Usuń skórę powyżej środka czaszki i przetnij czaszkę ostrymi nożyczkami.</li>
		<li>Włóż nożyczki w miejscu, w którym rdzeń kręgowy wchodzi do mózgu (otwór wielki) i wykonaj dwa boczne cięcia.</li>
		<li>Od tego samego miejsca wykonaj długie nacięcie strzałkowe wzdłuż szwu strzałkowego. Po dotarciu do opuszki węchowej przypnij w lewo i w prawo.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń czaszkę, mocno chwytając każdą połowę czaszki i ciągnąc na bok, uważając, aby nie naciskać na mózg ani go nie uszkodzić.</li>
		<li>Usuń mózg podczas przecinania nerwów czaszkowych za pomocą odwróconej szpatułki z mikro łyżką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść mózg w lodowatym roztworze ACSF na 1-2 minuty, aby schłodził się i stwardniał.</li>
	<li>Usuń mózg z ACSF, odchodnij nadmiar płynu ręcznikiem papierowym, utwórz koronalne cięcie między móżdżkiem a resztą mózgu i przyklej mózg, z częścią rostralną skierowaną do góry, do etapu wibratomu.</li>
	<li>Cięcie NAc:
	<ol>
		<li>Utrzymuj roztwory ACSF w lodowatych temperaturach w komorze krojenia wibratomu. Sekcja w odległości 200 μm do momentu, gdy jądro półleżące (NAc) zostanie wyraźnie zidentyfikowane zgodnie z atlasem mózgu myszy Paxinos i Franklina (około 1,8 mm przed Bregmą; należy zwrócić uwagę na kształt ciała modzelowatego, położenie i kształt spoidła przedniego i komór, a także ogólną morfologię odcinka mózgu). W tym momencie utwórz dwie sekcje o wielkości 400 μm, z których zostanie wycięty NAc.</li>
		<li>Pod stereoskopem użyj cienkiego ostrza, aby wyciąć obszar NAc z plastrów. Definicja NAc jest zgodna z atlasem mózgu myszy Paxinos i Franklina i może być wygodnie wypreparowana w odpowiednich sekcjach przez cztery szybkie ruchy ostrza po tkance. (Rysunek 2).</li>
		<li>Natychmiast umieścić skrawki NAc w 900 μl odczynnika do lizy Trizol w probówce mikrowirówkowej i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ekstrakcja RNA i odwrotna transkrypcja cDNA
<ol>
	<li>Rozmrozić probówki zawierające skrawki jądra półleżącego w odczynniku do lizy trizolu w temperaturze pokojowej i homogenizować lizat za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do igły 25 G, aż tkanka zostanie całkowicie zhomogenizowana (co najmniej 15-20 razy). Pierwsze kilka rund jest trudnych i wymaga dociśnięcia tkanki do ścianki rurki w celu rozbicia jej na małe kawałki, które mogłyby dostać się do końcówki igły.</li>
	<li>Aby zapewnić homogenizację, odpipetuj lizat do mini kolumny wirowej QIAshredder i odwiruj przy 12 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Odpipetować lizat do nowej probówki do mikrowirówki i wyekstrahować RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Zmierz stężenie RNA, przeanalizuj integralność i jakość za pomocą bioanalizatora lub równoważnego sprzętu. Użyj 100-500 ng RNA dla każdej rundy przygotowania cDNA z losowymi starterami heksameru.</li>
</ol>
6. Projektowanie podkładów i testowanie podkładów
<ol>
	<li>Wybór dobrych starterów: Aby uzyskać optymalną parę starterów do qPCR transkryptów mRNA, postępuj zgodnie z poniższymi wymaganiami (ryc. 3):
	<ol>
		<li>Zaprojektuj podkłady zawierające nie więcej niż 17-28 zasad. Unikaj powtórzeń nukleotydów, ponieważ sprzyjają one niewłaściwemu torowaniu.</li>
		<li>Projektuj podkłady o temperaturze topnienia (Tm) w zakresie 56-68°C (optymalnie 60-64°C). Tm w parze starterów powinny znajdować się w odległości nie większej niż 1 °C od siebie.</li>
		<li>Należy pamiętać, że rozmiar produktu powinien wynosić od 80 do 150 pz.</li>
		<li>Upewnij się, że co najmniej jeden ze starterów zakrywa połączenie ekson-ekson lub amplikon zawiera duży intron (rozpiętość intronu), aby uniknąć amplifikacji zanieczyszczeń genomowego DNA.</li>
		<li>Użyj niezawodnego oprogramowania opartego na Primer3 (przykłady patrz Tabela 2) w celu ulepszenia projektu podkładu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Testowanie starterów: W celu zapewnienia swoistości i skuteczności starterów należy przeprowadzić kontrolną reakcję qPCR:
	<ol>
		<li>Użyć próbki dodatniej (zawierającej matrycę cDNA dla wszystkich istotnych par starterów) i miareczkować cDNA (np. osiem trzykrotnych rozcieńczeń od początkowego stężenia ~10 ng) w zduplikowanych równoległych reakcjach. Dołącz kontrolę bez szablonu, która kontroluje zanieczyszczenie w roztworach używanych do reakcji.</li>
		<li>Oblicz wydajność podkładu, korzystając ze wzoru: (10(−1/nachylenie)-1) × 100, tak aby krzywa optymalnego nachylenia wynosiła − 3,333 (tj. 10(− 1/3,333) = 2) (Rysunek 4).</li>
		<li>Określ specyficzność wzmocnienia. Specyficzne wzmocnienie jest wykazywane przez pojedynczy wyraźny pik wspólny dla wszystkich krzywych topnienia amplifikowanych produktów, podczas gdy amplifikacja poza celem wydaje się oczywistym odchyleniem od pojedynczego dużego piku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza qPCR
<ol>
	<li>Przedwzmacniacz:
	<ol>
		<li>Kompleksowa analiza qPCR opiera się na równoległym odpytywaniu o graniczne ilości RNA z dużą liczbą par starterów. Dlatego niezbędny jest etap wstępnego wzmocnienia. Na tym etapie cDNA przechodzi 14-18 cykli wstępnej amplifikacji z mieszaniną wszystkich starterów, które zostaną wykorzystane do odpytywania próbki w przyszłości (do 800 par starterów).</li>
		<li>Rozcieńczyć wszystkie startery w TE (low EDTA) do 50 μM w celu specyficznego wzmocnienia celu (STA).</li>
		<li>Zebrać razem 1 μl podwielokrotności wszystkich 50 μM zestawów starterów, które mają być włączone do reakcji STA, do 800 testów.</li>
		<li>Przygotować wstępną mieszankę i próbki do STA zgodnie z opisem w tabeli 3. Dopuszczaj błędy, przygotowując mieszaninę dla 110% liczby próbek, które muszą zostać amplifikowane. </li>
		<li>Podwielokrotność 3,75 μl mieszanki wstępnej STA dla każdej próbki. Dodaj 1,25 μl cDNA do każdego.</li>
		<li>Wirować, aby wymieszać reakcje i odwirować przez 10 sekund.</li>
		<li>Umieść reakcje STA w termocyklerze i cykluj zgodnie z tabelą 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie egzonukleazą I (ExoI):
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć Exo I, jak wskazano w Tabeli 5.</li>
		<li>Dodać 2 μl rozcieńczonego ExoI (4 U/μl) do każdej 5 μl reakcji STA, odwirować, odwirować (>6 000 x g) i umieścić w termocyklerze w temperaturze 37 °C na 30 minut, a następnie w temperaturze 80 °C na 15 minut.</li>
		<li>Rozcieńczyć produkty końcowe do odpowiedniego stężenia do badań. Użyj buforu TE (dodać 43 μl buforu TE do 7 μl próbki TSA).</li>
		<li>Rozcieńczone produkty STA należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zestaw startera i próbki do qPCR:
	<ol>
		<li>Przygotować próbki, jak pokazano w tabeli 6. Przygotuj mieszankę zgodnie z chipem wybranym do eksperymentu i dodaj odpowiednie próbki.</li>
		<li>Mieszać roztwory mieszanki próbek przez co najmniej 20 sekund i wirować (>6 000 x g) przez co najmniej 30 sekund. Przygotowane reakcje można przechowywać przez krótki czas w temperaturze 4 °C, aż wiór będzie gotowy do załadowania.</li>
		<li>Przygotować testy zgodnie z opisem w tabeli 7.</li>
		<li>Mieszaj mieszankę testową przez co najmniej 20 sekund i odwiruj (>6 000 x g) przez co najmniej 30 sekund, aby odwirować wszystkie składniki. 
		WAŻNE: Dokładnie wymieszać i odwirować wszystkie próbki i roztwory testowe przed pipetowaniem do wlotów chipów. Niezastosowanie się do tego może spowodować pogorszenie jakości danych. 
		UWAGA: Końcowe stężenie każdego startera wynosi 5 μM na wlocie i 500 nM w reakcji końcowej.</li>
	</ol></li>
	<li>Gruntowanie i ładowanie układu IFC (zintegrowany obwód fluidyczny) Dynamic Array. Chip IFC posiada wloty dla próbek i testów, a także określone wloty (akumulatory) dla płynu z przewodu kontrolnego (oleju mineralnego) używanego do zwiększania ciśnienia w komorach mikroprzepływowych (rysunek 4A).
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć płyn z przewodu sterującego do każdego akumulatora na chipie.</li>
		<li>Usuń i wyrzuć niebieską folię ochronną ze spodu chipa.</li>
		<li>Umieść chip w odpowiednim kontrolerze IFC (kontroler MX dla 48.48 Dynamic Array IFC lub kontroler IFC HX dla 96.96 Dynamic Array IFC), a następnie uruchom skrypt Prime (113x) dla 48.48 Dynamic Array IFC lub skrypt Prime (136x) dla 96.96 Dynamic Array IFC, aby zalać chip.</li>
		<li>Po zakończeniu skryptu usuń zalany układ scalony z kontrolera IFC.</li>
		<li>Odpipetować 5 μl każdej mieszaniny testowej i 5 μl każdej mieszanki próbek do ich wlotów.</li>
		<li>Zwróć chip do kontrolera IFC.</li>
		<li>Korzystając z oprogramowania kontrolera IFC, uruchom skrypt Load Mix (113x) dla 48.48 Dynamic Array IFC) lub skrypt Load Mix (136x) dla 96.96 Dynamic Array IFC, aby załadować próbki i testy do chipa. Po zakończeniu skryptu Load Mix wyjmij załadowany układ z kontrolera IFC.</li>
		<li>Załaduj chip do termocyklera, utwórz nowy przebieg chipa (zgodnie z wytycznymi producenta), w tym analizę krzywej topnienia. Korzystając z oprogramowania termocyklera, upewnij się, że komory reakcyjne są prawidłowo rozpoznawane i pozwól reakcji przebiegać do końca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza danych
<ol>
	<li>Zapewnienie jakości: Aby zapewnić jakość danych, należy zweryfikować jakość starterów, odnosząc się do krzywych rozcieńczenia (jak opisano powyżej). Monitoruj specyficzność amplifikacji, przeglądając krzywe topnienia amplikonów, których piki powinny być optymalnie wyrównane29.</li>
	<li>Wizualizacja: Do wizualizacji dużych ilości danych uzyskanych za pomocą wysokoprzepustowego qPCR należy użyć map cieplnych generowanych przez oprogramowanie, w których wyrażenie jest oznaczone kolorami według intensywności. Ponadto wyświetlaj dynamikę transkrypcji pojedynczych genów w postaci liniowych wykresów punktowych.</li>
	<li>Publikacja: Publikując wyniki ekspresji genów, zaleca się przestrzeganie wytycznych MIQE dotyczących publikacji ilościowych eksperymentów PCR w czasie rzeczywistym, szczegółowo określających minimalne informacje, które należy podać w eksperymencie qPCR, aby zapewnić jego przydatność, dokładność, prawidłową interpretację i odtwarzalność.</li>
</ol>

<ol><li>Amit, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+module+of+negative+feedback+regulators+defines+growth+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling.</a> Nature genetics. 39, 503-512 (2007).</li>
<li>Citri, A., Yarden, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF-ERBB+signalling%3A+towards+the+systems+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EGF-ERBB signalling: towards the systems level.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 505-516 (2006).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).</li>
<li>Kleim, J. A., Jones, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+experience-dependent+neural+plasticity%3A+implications+for+rehabilitation+after+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+speech%2C+language%2C+and+hearing+research%22%5BJournal%5D)">Principles of experience-dependent neural plasticity: implications for rehabilitation after brain damage.</a> Journal of speech, language, and hearing research. 51, S225-S239 (2008).</li>
<li>Kauer, J. A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 8, 844-858 (2007).</li>
<li>Grueter, B. A., Rothwell, P. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+synaptic+plasticity+and+striatal+circuit+function+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Integrating synaptic plasticity and striatal circuit function in addiction.</a> Current opinion in neurobiology. 22, 545-551 (2012).</li>
<li>Robinson, T. E., Kolb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+associated+with+exposure+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity associated with exposure to drugs of abuse.</a> Neuropharmacology. 47, Suppl 1. 33-46 (2004).</li>
<li>Koob, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiological+mechanisms+in+the+transition+from+drug+use+to+drug+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+biobehavioral+reviews%22%5BJournal%5D)">Neurobiological mechanisms in the transition from drug use to drug dependence.</a> Neuroscience and biobehavioral reviews. 27, 739-749 (2004).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+mechanisms+of+addiction%3A+the+role+of+reward-related+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural mechanisms of addiction: the role of reward-related learning and memory.</a> Annual review of neuroscience. 29, 565-598 (2006).</li>
<li>Beurrier, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+inhibition+of+synaptic+transmission+by+dopamine+in+the+nucleus+accumbens+during+behavioral+sensitization+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced inhibition of synaptic transmission by dopamine in the nucleus accumbens during behavioral sensitization to cocaine.</a> The Journal of neuroscience. 22, 5817-5822 (2002).</li>
<li>Robinson, T. E., Berridge, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+psychology+and+neurobiology+of+addiction%3A+an+incentive-sensitization+view%5BTitle%5D)+AND+%22Addiction%22%5BJournal%5D)">The psychology and neurobiology of addiction: an incentive-sensitization view.</a> Addiction. 95, Suppl 2. S91-S117 (2000).</li>
<li>Boening, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+an+addiction+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+transmission%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of an addiction memory.</a> Journal of neural transmission. 108, 755-765 (2001).</li>
<li>Everitt, B. J., Robbins, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+systems+of+reinforcement+for+drug+addiction%3A+from+actions+to+habits+to+compulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neural systems of reinforcement for drug addiction: from actions to habits to compulsion.</a> Nature neuroscience. 8, 1481-1489 (2005).</li>
<li>Volkow, N. D., Fowler, J. S., Wang, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+addicted+human+brain%3A+insights+from+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The addicted human brain: insights from imaging studies.</a> The Journal of clinical investigation. 111, 1444-1451 (2003).</li>
<li>Carlezon, W. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cocaine+reward+by+CREB%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of cocaine reward by CREB.</a> Science. 282, 2272-2275 (1998).</li>
<li>Hope, B., Kosofsky, B., Hyman, S. E., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immediate+early+gene+expression+and+AP-1+binding+in+the+rat+nucleus+accumbens+by+chronic+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of immediate early gene expression and AP-1 binding in the rat nucleus accumbens by chronic cocaine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5764-5768 (1992).</li>
<li>Hope, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+long-lasting+AP-1+complex+composed+of+altered+Fos-like+proteins+in+brain+by+chronic+cocaine+and+other+chronic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of a long-lasting AP-1 complex composed of altered Fos-like proteins in brain by chronic cocaine and other chronic treatments.</a> Neuron. 13, 1235-1244 (1994).</li>
<li>Pulipparacharuvil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+regulates+MEF2+to+control+synaptic+and+behavioral+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cocaine regulates MEF2 to control synaptic and behavioral plasticity.</a> Neuron. 59, 621-633 (2008).</li>
<li>Robison, A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+epigenetic+mechanisms+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and epigenetic mechanisms of addiction.</a> Nature reviews. Neuroscience. 12, 623-637 (2011).</li>
<li>Hyman, S. E., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addiction+and+the+brain%3A+the+neurobiology+of+compulsion+and+its+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Addiction and the brain: the neurobiology of compulsion and its persistence.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 695-703 (2001).</li>
<li>Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+cocaine+addiction.+Science+%26+practice+perspectives+%2F+a+publication+of+the%5BTitle%5D)+AND+%22National+Institute+on+Drug+Abuse%2C+National+Institutes+of+Health%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of cocaine addiction. Science & practice perspectives / a publication of the.</a> National Institute on Drug Abuse, National Institutes of Health. 3, 4-10 (2005).</li>
<li>Robbins, T. W., Everitt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobehavioural+mechanisms+of+reward+and+motivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurobehavioural mechanisms of reward and motivation.</a> Current opinion in neurobiology. 6, 228-236 (1996).</li>
<li>Kaplan, G. B., Moore, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cognitive+enhancers+in+animal+models+of+fear+extinction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+biochemistry%2C+and+behavior%22%5BJournal%5D)">The use of cognitive enhancers in animal models of fear extinction.</a> Pharmacology, biochemistry, and behavior. 99, 217-228 (2011).</li>
<li>Chauvet, C., Goldberg, S. R., Jaber, M., Solinas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+enrichment+on+the+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental enrichment on the incubation of cocaine craving.</a> Neuropharmacology. 63, 635-641 (2012).</li>
<li>Nithianantharajah, J., Hannan, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriched+environments%2C+experience-dependent+plasticity+and+disorders+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enriched environments, experience-dependent plasticity and disorders of the nervous system.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 697-709 (2006).</li>
<li>Silingardi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+pathway+activation+bidirectionally+affects+visual+recognition+memory+and+synaptic+plasticity+in+the+perirhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+behavioral+neuroscience%22%5BJournal%5D)">ERK pathway activation bidirectionally affects visual recognition memory and synaptic plasticity in the perirhinal cortex.</a> Frontiers in behavioral neuroscience. 5, 84(2011).</li>
<li>Tropea, D., Majewska, A. K., Garcia, R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+dynamics+of+synapses+in+vivo+correlate+with+functional+changes+during+experience-dependent+plasticity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Structural dynamics of synapses in vivo correlate with functional changes during experience-dependent plasticity in visual cortex.</a> The Journal of neuroscience. 30, 11086-11095 (2010).</li>
<li>Steketee, J. D., Kalivas, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+wanting%3A+behavioral+sensitization+and+relapse+to+drug-seeking+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Drug wanting: behavioral sensitization and relapse to drug-seeking behavior.</a> Pharmacological reviews. 63, 348-365 (2011).</li>
<li>Citri, A., Pang, Z. P., Sudhof, T. C., Wernig, M., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+qPCR+profiling+of+gene+expression+in+single+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive qPCR profiling of gene expression in single neuronal cells.</a> Nature protocols. 7, 118-127 (2012).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Pomyślna charakterystyka ekspresji genów z tkanki mózgowej zgodnie z paradygmatami behawioralnymi zależy od: 1) Starannego obchodzenia się z myszami podczas paradygmatu behawioralnego; 2) Szybkie i precyzyjne wypreparowanie interesującej tkanki; 3) środki bezpieczne dla RNA w celu zapewnienia integralności RNA; oraz 4) Staranne planowanie starterów i układu eksperymentalnego, a także precyzja i dbałość o szczegóły w ramach przygotowań do analizy qPCR.
Celem opisanej procedury jest scharakteryz...

Dynamiczna organizacja mózgu umożliwia elastyczność poznawczą i behawioralną. Doświadczenia są kodowane poprzez modyfikacje struktury i siły połączeń między neuronami w mózgu3. Ta "plastyczność zależna od doświadczenia" jest wynikiem indukcji określonych wzorców ekspresji genów, które dostarczają białek niezbędnych do modyfikacji struktury i siły synaptycznej4. Identyfikacja sieci regulacyjnych genów pośredniczących w tworzeniu wspomnień długotrwałych jest centralnym założeniem neuronauki molekularnej, z oczekiwaniem, że identyfikacja dominujących elementów programów transkrypcyjnych zapewni wgląd w podstawowe zasady regulujące tworzenie pamięci, a także cele w leczeniu zaburzeń neurodegeneracyjnych i neuropsychiatrycznych. Programy transkrypcyjne rozwijają się w określonych czasowo falach, z których każda koduje geny o innym charakterze, które są ważne dla różnych etapów realizacji wyniku zdarzenia sygnalizacyjnego1,2. Dlatego ważne jest, aby zająć się dynamiką transkrypcji w szczegółowej skali czasowej, aby zidentyfikować pełny zestaw indukowanych genów i uzyskać wgląd w ich potencjalną funkcję zgodnie z dynamiką ich indukcji.
Uzależnienie od narkotyków to silna forma plastyczności zależnej od doświadczenia, spowodowana długotrwałym wpływem narkotyków na obwody nerwowe w mózgu5,6. Początkowe, ostre narażenie na narkotyki może prowadzić do rozwoju uzależnienia i przejścia do przewlekłego używania. Informacje kontekstowe są kluczowym elementem w rozwoju uzależnienia. Sygnały środowiskowe związane z narkotykami mają duże znaczenie w umysłach osób nadużywających narkotyków. Informacje kontekstowe przypominające osobie nadużywającej narkotyków o wcześniejszych doświadczeniach związanych z narkotykami mogą wywołać nawrót głodu narkotykowego nawet po długich okresach abstynencji od kontaktu z narkotykami7,8. Stąd wielkie wyzwanie kliniczne w uzależnieniu – skłonność osób uzależnionych do nawrotów nawet długo po ustąpieniu objawów odstawienia9.
Behawioralne uwrażliwienie na kokainę to prosty model doświadczenia z kokainą, przydatny w badaniu mechanizmów uzależnienia od narkotyków. W tym szeroko badanym modelu długotrwałego uczulenia wywołanego przewlekłym narażeniem na narkotyki, gryzonie są najpierw przyzwyczajane do iniekcji z soli fizjologicznej (dootrzewnowej; IP) w nowym środowisku (otwarta komora polowa, w której monitorowana jest ich aktywność lokomotoryczna); następnie otrzymują codzienne zastrzyki kokainy w otwartych komorach polowych, podczas gdy ich aktywność jest monitorowana10 (ryc. 1). Ten paradygmat behawioralny zazwyczaj skutkuje silnym uwrażliwieniem na zachowania lokomotoryczne (8-12 razy powyżej aktywności wyjściowej)11, które utrzymuje się przez okres miesięcy po zaprzestaniu wstrzykiwania kokainy, co świadczy o tworzeniu się wszechobecnego śladu pamięciowego po doświadczeniu narkotykowym.
Obwody neuronalne nagrody, naturalnie zaangażowane we wzmacnianie zachowań niezbędnych dla sukcesu gatunku (np. karmienie, seks), są wykorzystywane przez narkotyki do wzmacniania zachowań związanych z narkotykami12,13. Mechanizmy molekularne i komórkowe, dzięki którym nasila się doświadczanie nadużywania narkotyków, wydają się być podobne do mechanizmów leżących u podstaw tworzenia wspomnień deklaratywnych lub semantycznych w innych strukturach mózgu14. W związku z tym solidność modelu uwrażliwiania behawioralnego sprawia, że jest on atrakcyjnym systemem modelowym do badania mechanizmów plastyczności zależnej od doświadczenia.
Jądro półleżące (NAc) jest centralnym integratorem obwodu nagrody w mózgu i jest szeroko związane z rozwojem uzależnienia5,6. Powstawanie uzależnienia zależy od transkrypcji nowych białek w jądrze półleżącym, a po doświadczeniu z kokainą obserwuje się silną indukcję wyraźnie ustrukturyzowanych programów transkrypcyjnych w NAc15-19. Ostra odpowiedź transkrypcyjna na ekspozycję na kokainę może funkcjonować na wielu poziomach w celu przystosowania się do silnego bodźca indukcyjnego i ukierunkowania produkcji nowych białek, które są odpowiedzialne za zmiany strukturalne i elektrofizjologiczne wywołane ekspozycją na narkotyk 6,19-22. 
Aby promować badania nad molekularnymi mechanizmami plastyczności zależnej od doświadczenia w mózgu, opisano protokół kompleksowej analizy dynamiki transkrypcji w próbkach tkanki mózgowej po manipulacji behawioralnej. Protokół jest zilustrowany w kontekście doświadczeń behawioralnych badanych w laboratorium Citri – behawioralnego uwrażliwienia na kokainę, wykorzystującego dynamiczne układy mikroprzepływowe do analizy transkrypcyjnej. Opisany protokół nie ogranicza się oczywiście do badania jądra półleżącego w kontekście uwrażliwienia behawioralnego, ale może być zastosowany do dużej liczby paradygmatów behawioralnych i regionów mózgu. W rzeczywistości protokół ten może być stosowany do tkanek ciała poza mózgiem, a różne doświadczenia lub manipulacje organizmu mogą być badane.
Protokół jest z grubsza podzielony na cztery kroki. W pierwszym kroku zwierzę poddawane jest paradygmatowi behawioralnemu; w drugim etapie tkanka jest mikropreparowana; w trzecim kroku – mRNA jest oczyszczane, poddawane odwrotnej transkrypcji i sondowane, a w ostatnim etapie dane są analizowane.
W kontekście badania dynamiki transkrypcji, dokładny czas i definicja doświadczenia są prawdopodobnie najważniejszymi parametrami eksperymentalnymi do kontrolowania. Z tego powodu naszym preferowanym modelem behawioralnym jest behawioralne uwrażliwienie na kokainę, system, który umożliwia wysoki poziom kontroli eksperymentatora nad parametrami doznania. Dostępne są dodatkowe paradygmaty behawioralne, które umożliwiają precyzyjne wyczucie czasu i odnoszą się do różnych modeli plastyczności zależnej od doświadczenia lub tworzenia pamięci. Modele te obejmują warunkowanie strachu23, ostre wzbogacenie środowiska24,25, eksplorację nowychobiektów26 oraz doświadczenie wizualne po mrocznym wychowaniu27. Mimo to, behawioralne uwrażliwienie na kokainę jest konsekwentnie silną manipulacją behawioralną, tworzącą wysoce wszechobecny ślad pamięciowy, który utrzymuje się przez miesiące po doświadczeniu z kokainą.
Mózg jest dzielony na sekcje, a następnie następuje manualna mikrodysekcja jądra półleżącego. Z naszego doświadczenia wynika, że ręczna mikrodysekcja z szybko przygotowanych wycinków mózgu zapewnia najbardziej niezawodną i szybką metodę ekstrakcji tkanki istotnej dla paradygmatu behawioralnego, a wraz z doświadczeniem granice tkanki stają się oczywiste i łatwo rozpoznawalne. Alternatywnie można przygotować drobne plastry, a następnie przeprowadzić mikrodysekcję laserową. Chociaż metoda ta umożliwia precyzyjne wyznaczenie obszaru zainteresowania, jest powolna (co grozi utratą labilnego mRNA), żmudna i wymaga kosztownego dedykowanego sprzętu (mikroskopu wyposażonego w zestaw do wychwytywania laserowego). Protokół zdefiniowany w niniejszym dokumencie może być również dostosowany do analizy transkrypcji pojedynczej komórki, poprzez ręczne aspiracje cytoplazmy wizualnie zidentyfikowanych komórek za pomocą pipet plastrowych29. Ważne jest, aby pamiętać, że opisany protokół zapewnia średnią populacji, podczas gdy jest wysoce prawdopodobne, że w większości przypadków tylko subpopulacja komórek w tkance jest faktycznie zaangażowana w reagowanie na doświadczenie. Interesujące jest profilowanie transkrypcji w sposób selektywny w określonych populacjach komórek reagujących na doświadczenie, ale dyskusja na temat tych podejść wykracza poza obecny zakres.
W przypadku oczyszczania mRNA, odwrotnej transkrypcji i zapytania qPCR, tkanka jest niszczona przez przepuszczenie jej przez cienkie igły, a następnie użycie dostępnych na rynku zestawów (więcej informacji znajdziesz w Tabeli 8). Wybór jest podyktowany doświadczeniem w stosowaniu tych metodologii, które zapewniają niezawodną ekstrakcję wysokiej jakości RNA i solidne wyniki z dalszych zastosowań.
Chociaż protokół jest opisany dla qPCR o wysokiej przepustowości z wykorzystaniem dynamicznych tablic, próbki mogą być badane pod kątem ekspresji genów za pomocą PCR punktu końcowego, qPCR o niskiej przepustowości, mikromacierzy ekspresji genów lub głębokiego sekwencjonowania. Preferowanie wysokoprzepustowego qPCR z wykorzystaniem dynamicznych macierzy wynika z faktu, że mRNA uzyskane z jąder mózgu zgodnie z paradygmatami behawioralnymi ma często ograniczone ilości. Tablice dynamiczne stanowią platformę, która umożliwia wydajną, kompleksową analizę transkryptów z dużej liczby równoległych próbek w jednym eksperymencie. Po początkowym nabyciu systemu mikroprzepływowego (zwykle zakupie instytucjonalnym), eksperymenty są stosunkowo niedrogie w prowadzeniu. Po tej analizie można przeprowadzić dalsze przeszukiwanie próbek przy użyciu bardziej kosztownych platform w celu poszukiwania nowych transkryptów (za pomocą mikromacierzy lub RNAseq), przy czym dynamiczne tablice stanowią kompleksowe odniesienie dla zapewnienia jakości. Wreszcie, do analizy danych stosuje się standardowe podejścia. Szczegółowe wskazówki dotyczące kwestii, które mogą się pojawić, zostaną omówione w tekście protokołu.
Ten protokół jest najbardziej odpowiedni dla badaczy zainteresowanych dokładnym zbadaniem swojego systemu, badaniem wielu warunków i replikacji. Protokół jest również najbardziej odpowiedni dla badaczy, którzy już udoskonalili (poprzez eksperymenty z mikromacierzą lub RNAseq) na podzbiorze 50-500 genów będących przedmiotem zainteresowania, które są zainteresowani wielokrotnym badaniem.

<table><tbody><tr><td>Virusol</td><td>Oriek Medical</td><td>J29D</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP 100%</td><td>MINRAD INC</td><td>NDC 60307-110-25</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy plus Uniwersalny mini zestaw</td><td>QIAGEN</td><td>73404</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Invitrogen</td><td>AB-4368814</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td> <td>TEKomora behawioralna Invitrogen</td><td>1355656</td><td></td></tr><tr><td>(MDF; 50 x 45 cm)</td><td></td><td></td><td>Samodzielna zmontowana</td></tr><tr><td>wewnętrzna skrzynka z pleksiglasu (30 x 30 cm)</td><td></td><td></td><td>Samodzielna</td></tr><tr><td>kamera i magnetowid</td><td>Campden Inst.</td><td>CMD-80051</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do nagrywania multimediów</td><td>Noldus</td><td>NDS-NMR3-00M</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki</td><td>FST</td><td>FST-14062-09</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Inst.</td><td>Bioanalizator 7000SMZ-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td> Bioanalizator <td></td><td>Agilent 2100</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>1852048</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócona szpatułka do mikrołyżek</td><td>Bochem Instrument GmbH</td><td>3213</td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD Reader</td><td>Fluidigm</td><td>BMHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>Układ dynamicznej matrycy do ekspresji genów 96,96</td><td>Fluidigm</td><td>Zobacz materiał BMK-M-96.96</td><td></td></tr></tbody></table> TGL

kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

Kodowanie doświadczeń w mózgu i konsolidacja długotrwałych wspomnień zależy od transkrypcji genów. Identyfikacja funkcji określonych genów w kodowaniu doświadczenia jest jednym z głównych celów neuronauki molekularnej. Co więcej, funkcjonalne powiązanie zdefiniowanych genów z określonymi zachowaniami ma implikacje dla zrozumienia podstaw zaburzeń neuropsychiatrycznych. Indukcję solidnych programów transkrypcyjnych zaobserwowano w mózgach myszy po różnych manipulacjach behawioralnych. Podczas gdy niektóre elementy genetyczne są wykorzystywane cyklicznie po różnych manipulacjach behawioralnych i w różnych jądrach mózgu, programy transkrypcyjne są ogólnie unikalne dla bodźców indukujących i struktury, w której są badane1,2.
W tej publikacji opisano protokół solidnego i wszechstronnego profilowania transkrypcyjnego z jąder mózgowych myszy w odpowiedzi na manipulację behawioralną. Protokół ten został zademonstrowany w kontekście analizy dynamiki ekspresji genów w jądrze półleżącym po ostrym doświadczeniu z kokainą. Po zdefiniowanym doświadczeniu in vivo docelowa tkanka nerwowa jest preparowana; następnie oczyszczanie RNA, odwrotna transkrypcja i wykorzystanie macierzy mikroprzepływowych do kompleksowej analizy qPCR wielu docelowych genów. Protokół ten jest nastawiony na kompleksową analizę (obejmującą 50-500 genów) ograniczonych ilości materiału wyjściowego, takiego jak małe próbki mózgu, a nawet pojedyncze komórki.
Protokół jest najkorzystniejszy do równoległej analizy wielu próbek (np. pojedynczych komórek, dynamicznej analizy po perturbacjach farmaceutycznych, wirusowych lub behawioralnych). Jednak protokół może również służyć do charakterystyki i zapewnienia jakości próbek przed badaniami całego genomu za pomocą mikromacierzy lub RNAseq, a także walidacji danych uzyskanych z badań całego genomu.

Jakość wyników uzyskanych przy zastosowaniu tego protokołu w kluczowy sposób zależy od szeregu parametrów. Odpowiednie planowanie eksperymentu pozwoli zminimalizować stres u myszy doświadczalnych, tak aby badane doświadczenie (w tym przykładzie ekspozycja na kokainę) było dominującym zdarzeniem w ich niedawnej historii, co zapewni uzyskanie silnego i specyficznego programu transkrypcyjnego. Rysunek 1 przedstawia plan eksperymentalny dla behawioralnej sensytyzacji na kokainę, określając punkty czasowe po ...

Ten manuskrypt opisuje protokół, który stosuje kompleksowe profilowanie do analizy programów transkrypcyjnych indukowanych w określonych jądrach mózgowych gryzoni zgodnie z paradygmatami behawioralnymi. W niniejszym artykule podejście to zostało zilustrowane w kontekście profilowania genów indukowanych w jądrze półleżącym (NAc) myszy po ostrej ekspozycji na kokainę, z wykorzystaniem mikroprzepływowych macierzy qPCR.

Kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie dynamiki transkrypcyjnej i określonych jąder mózgu myszy po doświadczeniu behawioralnym. Osiąga się to poprzez uprzednią habituację zwierząt i rejestrację ich aktywności lokomocyjnej po wstrzyknięciu soli fizjologicznej. Po habituacji rejestrowana jest aktywność lokomocyjna po pojedynczej dawce kokainy, a następnie pobierane są próbki z jądra półleżącego, które służą do izolacji RNA i przygotowania cDNA.Następnie przeprowadzana jest analiza qPCR w celu zbadania ekspresji genów indukowanej przez zachowanie. Ostatecznie uzyskuje się wyniki ukazujące dynamikę transkrypcyjną po doświadczeniu z kokainą. Protokół zaprezentują dr Hatu, kierownik laboratorium, Dum Muer, doktorant z laboratorium oraz Duran, student studiów licencjackich z laboratorium. Przez trzy kolejne dni każda mysz jest oswajana z procedurami obsługi i wstrzykiwania; przed rozpoczęciem eksperymentu myszy są rozmieszczone w klatkach w taki sposób, aby w przyszłości nie było konieczności ich przenoszenia między klatkami i aby myszy nigdy nie pozostawały w izolacji przez dłuższy czas.Na 30 minut przed rozpoczęciem testów wszystkie klatki testowe należy przenieść do pomieszczenia behawioralnego, aby umożliwić zwierzętom aklimatyzację do środowiska. Podaj dożylnie 250 microliters soli fizjologicznej; bezpośrednio po iniekcji umieść mysz w komorze behawioralnej, aby monitorować aktywność lokomotoryczną przez 15 minut. Mysz można pozostawić w komorze behawioralnej na 20 minut.Aktywność monitorowano od drugiej do 17. minuty. Powtórz te kroki o tej samej porze dnia przez kolejne dwa dni. Czwartego dnia podaj pojedynczy zastrzyk kokainy lub soli fizjologicznej, w zależności od grupy, a następnie niezwłocznie umieść mysz w komorze, aby monitorować lokalną aktywność motoryczną przez 20 minut w wybranych punktach czasowych po ekspozycji na kokainę; wyjmij mózg i umieść go w lodowatym roztworze A CSF na jedną do dwóch minut w celu schłodzenia i utwardzenia.Po usunięciu móżdżku i odsączeniu nadmiaru płynu, przyklej mózg do stolika wibratomu częścią rostralną skierowaną do góry. Wypełnij komorę lodowatym A CSF i wykonuj przekroje o grubości 200 micron, aż do wyraźnej identyfikacji jądra półleżącego. Podczas cięcia zwracaj szczególną uwagę na kształt ciała modzelowatego, lokalizację i kształt spoiwa przedniego oraz komór mózgu.Po zidentyfikowaniu właściwego obszaru należy wyciąć dwa skrawki o grubości 400 mikronów, z których jądro półleżące zostanie wypreparowane pod stereoskopem. Do oddzielenia jądra półleżącego od skrawków należy użyć cienkiego ostrza. Cztery szybkie cięcia w odpowiednim miejscu powinny natychmiast wyizolować właściwą tkankę.Umieść wyizolowaną tkankę w 900 µL odczynnika lizującego i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA. Przed rozpoczęciem rozmroź probówki w temperaturze 37 °C i homogenizuj. Przy użyciu igły o rozmiarze 25 G pierwsze kilka cykli może być utrudnione i wymagać dociskania tkanki do ścianki probówki w celu homogenizacji na małe fragmenty. Aby zapewnić prawidłową homogenizację, nanieś lizat pipetą na kolumienkę Kaya Shredder Mini Spin i odwiruj w wirówce.Przenieś lizat pipetą do nowej probówki do mikrocentryfugi i wyizoluj RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Po oczyszczeniu RNA przeprowadza się odwrotną transkrypcję do cDNA, a następnie specyficzną dla celu preamplifikację próbek przy użyciu starterów skierowanych przeciwko grupie genów wybranych do analizy. Procedury te zostały opisane w wersji tekstowej protokołu.Komercyjne chipy mikrofluidyczne do kompleksowej analizy QPCR są dostępne w formacie 48 na 48, co umożliwia analizę 48 próbek z użyciem 48 zestawów sond, lub w formacie 96 na 96, w którym analizuje się 96 próbek przy użyciu 96 sond. W większości przypadków wybór chipa zależy przede wszystkim od liczby analizowanych próbek.W pierwszej kolejności należy przygotować mieszaninę próbek zgodnie z chipem wybranym do eksperymentu. Należy zachować ostrożność podczas pipetowania 20-krotnego odczynnika ładującego z barwnikiem wiążącym DNA. Roztwory mieszanin próbek należy mieszać przez co najmniej 20 sekund, a następnie wirować przez minimum 30 sekund.Przygotowane reakcje można przechowywać przez krótki czas w temperaturze 4 °C do momentu, gdy chip będzie gotowy do załadowania. Następnie należy przygotować mieszaninę testową, dokładnie wymieszać mieszaninę próbek i odwiruwać, aby osadzić wszystkie składniki na dnie. Jak pokazano wcześniej, chip IFC do dynamicznych macierzy posiada wloty dla próbek i testów, a także dedykowane wloty dla płynu linii kontrolnej używanego doyciśnienia komór mikrofluidycznych.W pierwszej kolejności wstrzyknij płyn z linii kontrolnej do każdego akumulatora na chipie. Następnie przygotuj chip, umieszczając go w kontrolerze IFC i uruchamiając odpowiedni skrypt. Po zakończeniu działania skryptu wyjmij przygotowany chip z kontrolera IFC i nanieś pipetą 5 µL każdego testu.Wymieszaj na chipie. Dodaj pięć µL każdej mieszaniny próbek do odpowiednich wlotów, a następnie umieść chip z powrotem w kontrolerze IFC, korzystając z oprogramowania kontrolera IFC. Uruchom skrypt, aby wprowadzić próbki i testy do chipa.Po zakończeniu działania skryptu mieszania ładunku, wyjmij załadowany chip z kontrolera IFC. Następnie umieść chip w termocyklerze i utwórz nowy przebieg dla chipa, który obejmuje analizę krzywej topnienia. Korzystając z oprogramowania termocyklera, upewnij się, że komory reakcyjne zostały prawidłowo rozpoznane, a następnie pozwól reakcji dobiec do końca.Wzrost aktywności lokomotorycznej był widoczny po pojedynczym ostrym wstrzyknięciu kokainy. Na tym przekroju czołowym grube białe linie zaznaczyły miejsca nacięć wykonanych w celu wyznaczenia granic jądra półleżącego. Podczas sekcji krzywe amplifikacji starterów skierowanych przeciwko CFOs i phos B wykazują, że pary starterów amplifikują docelowy transkrypty z wydajnością wynoszącą około 100%.W każdym cyklu wyniki wskazują, że kokaina indukuje najwyższą ekspresję CFO i phos B w jądrze półleżącym jedna oraz dwie godziny po ekspozycji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie następnej generacji (NGS), w celu zidentyfikowania nowych, niecharakteryzowanych transkryptów.

comprehensive-analysis-transcription-dynamics-from-brain-samples

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Wszechstronna analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym

Do niedawna badania nad ekspresją w ludzkim mózgu ograniczały się do ilościowego oznaczania RNA lub białek. Dzięki technikom immunoprecypitacji chromatyny opisanym w niniejszej pracy, możliwe będzie mapowanie metylacji histonów oraz innych epigenetycznych regulatorów ekspresji genów w materiale mózgu pobranym po śmierci.

Analiza chromatyny dla tkanki mózgu człowieka

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Mechanizm leżący u podstaw terapeutycznych efektów operacji Głębokiej Stymulacji Mózgu (DBS) wymaga zbadania. Metody przedstawione w tym manuskrypcie opisują eksperymentalne podejście do badania zdarzeń komórkowych wywoływanych przez DBS poprzez analizę profilu ekspresji genów kandydujących, które mogą ułatwić neurogenezę po operacji DBS.

Analiza zmian ekspresji genów w hipokampie szczura po głębokiej stymulacji mózgu przedniego jądra wzgórza

Identyfikacja molekuł i szlaków kontrolujących plastyczność synaptyczną i pamięć jest nadal głównym wyzwaniem w neurobiologii. W tym miejscu opisano przepływ pracy dotyczący względnej kwantyfikacji białek synaptycznych rzekomo zaangażowanych w molekularną reorganizację synaps podczas uczenia się i konsolidacji pamięci w paradygmacie uczenia się słuchowego.

Ilościowe profilowanie proteomu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości regionów mózgu myszy po uczeniu się dyskryminacji słuchowej

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Tutaj opisujemy protokół i implementację Methyl-Seq, platformy epigenomicznej, wykorzystującej model szczura do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z przewlekłym narażeniem na stres. Wyniki pokazują, że platforma Methyl-Seq u szczurów jest w stanie wykryć różnice w metylacji, które wynikają z ekspozycji na stres u szczurów.

Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

Prezentujemy metodę specjalnie dostosowaną do obrazowania całego mózgu dorosłego Drosophila podczas zachowania i w odpowiedzi na bodźce. Głowa jest ustawiona tak, aby umożliwić optyczny dostęp do całego mózgu, podczas gdy mucha może poruszać nogami i czułkami, czubkiem trąbki, a oczy mogą odbierać bodźce czuciowe.

Przygotowanie dorosłego osobnika Drosophila melanogaster do obrazowania całego mózgu podczas reakcji na zachowanie i bodźce

Ten protokół opisuje użycie specjalnie zaprojektowanego urządzenia rejestrującego i elektrod do rejestrowania lokalnych potencjałów pola i badania przepływu informacji w hipokampie myszy i korze przedczołowej.

Podwójne nagrania zewnątrzkomórkowe w hipokampie myszy i korze przedczołowej myszy

Prezentowany tutaj jest potok analizy wideo, który pokonuje wyzwania związane z monitorowaniem zachowań w środowiskach MRI, pozwalając na wykrywanie nieinstruowanych reakcji behawioralnych na zewnętrzne sygnały. Analiza ta ułatwi bardziej kompleksowe zrozumienie wywołanych zmian stanu wewnętrznego i aktywności całego mózgu.

Profilowanie reakcji na zachowanie matki podczas obrazowania całego mózgu

Protokół ten zapewnia zintegrowane ramy oparte na zaawansowanych obliczeniowych metodach neuroetologicznych w celu zrozumienia kodowania mózgu w kontekstach naturalistycznych.

Dekodowanie naturalnego zachowania na podstawie osadzenia neuroetologicznego

W tym artykule przedstawiono protokół korzystania z DeepSpaceDB, dynamicznej, interaktywnej bazy danych do transkryptomiki przestrzennej, oferującej przepływy pracy analizy i przykłady do badania organizacji tkanek i ekspresji genów związanych z chorobą.

Eksploracja zbiorów danych transkryptomiki przestrzennej przy użyciu bazy danych DeepSpaceDB

Poznaj analizę dynamiki transkrypcji w jądrze półleżącym myszy po ekspozycji na kokainę. Ta metoda umożliwia badanie zmian ekspresji genów związanych z uzależnieniem.

Kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym

Przeglądaj więcej filmów