Kompleksowa analiza dynamiki transkrypcji z próbek mózgu po doświadczeniu behawioralnym
August 26th, 2014
Ten manuskrypt opisuje protokół, który stosuje kompleksowe profilowanie do analizy programów transkrypcyjnych indukowanych w określonych jądrach mózgowych gryzoni zgodnie z paradygmatami behawioralnymi. W niniejszym artykule podejście to zostało zilustrowane w kontekście profilowania genów indukowanych w jądrze półleżącym (NAc) myszy po ostrej ekspozycji na kokainę, z wykorzystaniem mikroprzepływowych macierzy qPCR.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie dynamiki transkrypcji i zdefiniowanych jąder mózgowych myszy po doświadczeniach behawioralnych. Osiąga się to poprzez uprzednie przyzwyczajenie zwierząt i zarejestrowanie ich aktywności lokomotorycznej po wstrzyknięciu soli fizjologicznej. Po przyzwyczajeniu aktywność lokomotoryczna jest rejestrowana po pojedynczej dawce kokainy, a następnie pobierane są próbki z jądra półleżącego i wykorzystywane do izolacji RNA i przygotowania CDNA.
Następnie przeprowadzana jest analiza QPCR w celu zbadania ekspresji genów indukowanej zachowaniem. Ostatecznie uzyskuje się wyniki, które pokazują dynamikę transkrypcji po doświadczeniu z kokainą Demonstrując protokół będzie dr Hatu, kierownik laboratorium, Dum Muer, absolwent z laboratorium i Duran, student studiów licencjackich z laboratorium przez trzy kolejne dni. Każda mysz jest przyzwyczajona do procedur obchodzenia się i wstrzykiwania, organizuje myszy w klatki przed rozpoczęciem eksperymentu, tak aby myszy nie były przenoszone między klatkami w przyszłości, a myszy nigdy nie były pozostawione w izolacji przez dłuższy czas.
Na 30 minut przed rozpoczęciem badania wszystkie klatki testowe powinny zostać przeniesione do pomieszczenia behawioralnego, aby umożliwić zwierzętom zaaklimatyzowanie się w środowisku. Natychmiast po wstrzyknięciu należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie 250 mikrolitrów soli fizjologicznej, umieścić mysz w komorze behawioralnej w celu monitorowania aktywności lokomotorycznej przez 15 minut. Mysz można było umieścić w komorze behawioralnej na 20 minut.
Aktywność monitorowana od drugiej do 17 minuty. Powtarzaj te czynności o tej samej porze dnia przez kolejne dwa dni. Czwartego dnia podaj pojedynczy zastrzyk kokainy lub soli fizjologicznej, w zależności od grupy, i natychmiast umieść mysz w komorze, aby monitorować lokalną aktywność motoryczną przez 20 minut w wybranych punktach czasowych po ekspozycji na kokainę, wyekstrahuj mózg i umieść go w lodowatym roztworze płynu mózgowo-rdzeniowego na jedną do dwóch minut, aby sschłodził się i stwardniał.
Po usunięciu móżdżku i odprowadzeniu nadmiaru płynu, przyklej mózg do stanu vibram z częścią rostralną skierowaną do góry. Napełnij komorę lodowatym płynem płynu mózgowo-rdzeniowego A i pokrój 200 mikronów, aż jądro półleżące zostanie wyraźnie zidentyfikowane. Zwróć szczególną uwagę na kształt ciała modzelowatego, położenie i kształt spoidła przedniego oraz komór podczas cięcia.
Po zidentyfikowaniu właściwego regionu pokrój dwa odcinki o wielkości 400 mikronów, z których jądro półleżące zostanie wycięte pod stereoskopem. Użyj cienkiego ostrza, aby wyciąć jądro półleżące z dala od plastrów. Cztery szybkie ruchy ostrza w odpowiednim obszarze powinny natychmiast odizolować odpowiednią tkankę.
Umieść izolowaną tkankę w 900 mikrolitrach odczynnika do lizy i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do ekstrakcji RNA, aby rozpocząć rozmrażanie probówek w temperaturze 37 stopni Celsjusza i homogenizację. Używając igły o rozmiarze 25, pierwsze kilka rund może być trudne i wymagać dociśnięcia tkanki do ścianki rurki w celu homogenizacji jej na małe kawałki. Aby zapewnić prawidłową homogenizację, odpipetuj lizat na mini kolumnę wirową niszczarki kaya i odwiruj.
Odpipetować lizat do nowej probówki mikrowirówki i wyekstrahować RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Po oczyszczeniu RNA przeprowadza się odwrotną transkrypcję do CDNA, a także specyficzną dla celu amplifikację wstępną próbek za pomocą starterów skierowanych przeciwko grupie genów wybranych do analizy. Procedury te są opisane w wersji tekstowej protokołu.
Komercyjne chipy mikroprzepływowe do kompleksowej analizy QPCR są dostępne w rozmiarach 48 na 48. Format, umożliwiający analizę 48 próbek za pomocą 48 zestawów sond lub w formacie 96 na 96, w którym 96 próbek jest analizowanych za pomocą 96 sond. W większości przypadków wybór chipa zależy przede wszystkim od liczby analizowanych próbek.
Najpierw przygotuj mieszankę próbek zgodnie z chipem wybranym do eksperymentu. Należy zachować ostrożność podczas pipetowania odczynnika do ładowania próbki barwnika wiążącego 20 XDNA. Mieszać roztwory mieszaniny próbek przez co najmniej 20 sekund i odwirowywać przez co najmniej 30 sekund.
Przygotowane reakcje mogą być przechowywane przez krótki czas w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż chip będzie gotowy do załadowania. Następnie przygotuj mieszaninę testową, dokładnie wymieszaj mieszaninę próbek i odwiruj, aby odwirować wszystkie składniki. Jak pokazano wcześniej, układ IFC z dynamiczną matrycą ma wloty dla próbek i testów, a także określone wloty dla płynu z przewodu kontrolnego używanego do zwiększania ciśnienia w komorach mikroprzepływowych.
Najpierw wstrzyknij płyn z przewodu kontrolnego do każdego akumulatora na chipie. Następnie zalej chip, umieszczając go w kontrolerze IFC i uruchamiając odpowiedni skrypt. Po zakończeniu skryptu wyjmij zalany chip ze sterownika IFC i odpipetuj pięć mikrolitrów każdego testu.
Wymieszaj na frytce. Dodaj pięć mikrolitrów każdej mieszanki próbek do ich wlotów i zwróć chip do kontrolera IFC za pomocą oprogramowania kontrolera IFC. Uruchom skrypt, aby załadować próbki i testy do chipa.
Po zakończeniu skryptu load mix wyjmij załadowany chip z kontrolera IFC. Następnie załaduj chip do termocyklera i utwórz nowy przebieg chipa, który obejmuje analizę krzywej topnienia. Korzystając z oprogramowania termocyklera, upewnij się, że komory reakcyjne są prawidłowo rozpoznawane i pozwalają na przebieg reakcji do końca.
Wzrost aktywności lokomotorycznej był widoczny po pojedynczym ostrym wstrzyknięciu kokainy. W tym przekroju koronalnym grube białe linie zaznaczyły położenie nacięć wykonanych w celu wyznaczenia granic jądra półleżącego. Podczas preparacji krzywe amplifikacji starterów skierowane przeciwko CFO i fosom B pokazują, że pary starterów amplifikują swój docelowy transkrypt z około 100% wydajnością.
Wyniki pokazują, że indukowana przez kokainę ekspresja CFO i fosu B w jądrze półleżącym była najwyższa jedną i dwie godziny po ekspozycji. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, w celu zidentyfikowania nowego, niescharakteryzowanego transkryptu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy rękopis opisuje protokół analizy programów transkrypcyjnych w określonych jądrach mózgu gryzoni po zastosowaniu paradygmatów behawioralnych. Podejście jest zilustrowane przez profilowanie genów indukowanych w jądrze nagromadzenia (NAc) myszy po ostrym ekspozycji na kokainę.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Profilowanie ekspresji genów
Tło
- Dynamika transkrypcyjna jest kluczowa dla zrozumienia reakcji mózgu na zachowanie.
- Jądro nagromadzenia jest kluczowym obszarem zaangażowanym w nagrodę i uzależnienie.
- Ekspozycja na kokainę zmienia ekspresję genów w mózgu.
- Mikrofluidyczne mikroarrays qPCR pozwalają na szczegółowe profilowanie genów.
Cel badania
- Badanie zmian transkrypcyjnych w jądrze nagromadzenia po ekspozycji na kokainę.
- Ustanowienie protokołu dla izolację RNA i analizy ekspresji genów.
- Zrozumienie wpływu zachowania na ekspresję genów u gryzoni.
Stosowane metody
- Przyzwyczajanie myszy do obsługi i wstrzykiwań fizjologicznego roztworu soli.
- Rejestrowanie aktywności lokomotorycznej po podaniu kokainy.
- Zbieranie próbek jądra nagromadzenia do izolacji RNA.
- Analiza QPCR w celu oceny zmian w ekspresji genów.
Główne wyniki
- Dynamika transkrypcyjna została zaobserwowana po ekspozycji na kokainę.
- Określone geny zostały zidentyfikowane jako indukowane w NAc.
- Protokół wykazał skuteczne profilowanie ekspresji genów.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia molekularnej podstawy uzależnienia.
Wnioski
- Badanie zapewnia solidny protokół do analizy ekspresji genów w odpowiedzi na stymulatory behawioralne.
- Wyniki zwiększają wiedzę na temat odpowiedzi transkrypcyjnych w badaniach nad uzależnieniem.
- To podejście może być zastosowane do innych paradygmatów behawioralnych w neuronauce.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to quantitatively assess transcriptional dynamics in defined brain regions following behavioral or pharmacological perturbations, supporting target validation in neuropsychiatric drug discovery. By providing reproducible, quantitative gene expression readouts from limited tissue samples, it enhances predictive confidence in early-stage mechanistic studies and informs go/no-go decisions for CNS-targeted therapeutics. The approach is particularly valuable for de-risking hypotheses related to addiction, reward pathways, and behavioral phenotypes prior to investment in lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional programs in nucleus accumbens to validate functional relevance of genes implicated in cocaine-induced behavioral responses.
- Operational Value: Supports robust target hypothesis testing using microfluidic qPCR to quantify gene expression changes with high sensitivity from limited brain tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream screening by establishing baseline transcriptional profiles following acute pharmacological challenge.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through standardized RNA isolation, reverse transcription, and microfluidic qPCR workflows applicable across multiple samples.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant transcriptional readouts in a well-established model of psychostimulant response, supporting biomarker alignment and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by delivering quantitative, multiplexed gene expression data suitable for cross-platform confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven target validation and assay development prior to lead identification efforts in CNS drug discovery programs.
- Discovery Biology: Enables mechanistic interrogation of transcriptional dynamics following behavioral experience, supporting pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Generates quantitative, multiplexed outputs that support assay readiness and reproducibility for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers normalized gene expression measurements from microfluidic qPCR arrays, enabling statistical comparison across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects acute behavioral responses to molecular signatures in reward circuitry, supporting translational validity in addiction models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable transcriptional profiling platform applicable across diverse behavioral paradigms and pharmacological challenges in neuroscience research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking behavioral phenotypes to defined transcriptional responses in key brain regions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of gene expression analysis through standardized microfluidic qPCR protocols suitable for multi-sample processing.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of CNS targets through mechanistic insight before costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by providing quantitative evidence of pathway engagement following pharmacological challenge.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroscience techniques including behavioral testing, brain dissection, and RNA handling.
- Depends on access to microfluidic qPCR platforms and associated instrumentation for high-throughput gene profiling.
- Necessitates standardized protocols for sample collection, RNA isolation, and cDNA synthesis to ensure cross-experiment consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different brain regions, species, or behavioral paradigms beyond cocaine-induced nucleus accumbens responses.
- Practical limitations include tissue yield constraints from small brain nuclei and the need for careful normalization to account for sample variability.
