Name: Aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Poznaj metodę aspiracji szpiku kostnego z kości udowej u żywych myszy. Technika umożliwia wielokrotne pobieranie próbek bez konieczności eutanazji zwierząt, co wspiera długoterminowe badania hematologiczne i przeszczepowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O.A.-W. jest wspierany przez NIH K08 Clinical Investigator Award (1K08CA160647-01), U.S. Department of Defense Postdoctoral Fellow Award in Bone Marrow Failure Research (W81XWH-12-1-0041), Josie Roberston Investigator Program, oraz Damon Runyon Clinical Investigator Award ze wsparciem Evan's Foundation.

Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. Aspiracja komórek szpiku kostnego (BM) z kości udowej
<ol>
	<li>Mysz, która będzie poddawana aspiracji szpiku kostnego kości udowej, należy znieczulić izofluranem (1-4%) podawanym za pomocą precyzyjnego waporyzatora. Głębokość znieczulenia powinna być monitorowana co 5-10 minut przez cały zabieg, obserwując, że nie ma zmian w częstości oddechów związanych z manipulacją chirurgiczną i/lub szczypaniem ucha, palców u nóg i ogona. Znieczulenie jest wywoływane izofluranem i utrzymywane przez cały zabieg z izofluranem. Prewencyjna dawka przedzabiegowa buprenorfiny w dawce 0,05-0,1 mg/kg mc. podawana podskórnie co 6-12 godzin może być stosowana w celu zapobiegania bólowi związanemu z zabiegiem jako uzupełnienie karprofenu.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy po indukcji znieczulenia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
	<li>Sierść jest starannie przycinana z obszaru skóry o około 150% większego niż obszar zamierzonego miejsca aspiracji. Luźne futro usuwa się wilgotnym gazikiem. Proszę trzymać mysz na podkładce z cyrkulującą ciepłą wodą lub innej bezpiecznej powierzchni kontrolowanej termostatycznie, aby zapobiec hipotermii podczas zabiegu.</li>
	<li>Zdezynfekuj całą nogę, w której znajduje się kość udowa, która zostanie poddana aspiracji, za pomocą trzech zestawów naprzemiennych peelingów (na przemian z powidonem (Betadine) lub chlorheksydyną (Nolvasan) i 70% alkoholem izopropylowym lub 70% gąbkami z gazy nasączonymi etanolem).</li>
	<li>Zwilż strzykawkę tuberkulinową o pojemności 0,5 ml (objętość: 0,5 cm³; rozstaw: 27,5 g) sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) przed zasysaniem BM. Napełnij strzykawkę 200-500 μl PBS i natychmiast wydal PBS. Powtórz tę procedurę 2-3 razy.</li>
	<li>Utrzymuj kość piszczelową zgiętą od kości udowej, popychając kość piszczelową palcem serdecznym lub piątym palcem. Upewnij się, że osiągnięto odpowiednią płaszczyznę znieczulania. Strzykawkę trzyma się kciukiem i palcem wskazującym. Pozwala to na odsłonięcie kłykci i ułatwia wprowadzenie igły. </li>
	<li>Po zwilżeniu strzykawki należy wprowadzić igłę przez ścięgno rzepki tak, aby igła była bezpiecznie osadzona między dwoma kłykciami kości udowej. Trzymając trzon blisko nasady kości udowej kciukiem i palcem wskazującym, igła jest łatwo wprowadzana do trzonu kości udowej.</li>
	<li>Obrócić igłę na zewnątrz i do góry, tak aby była równoległa do trzonu kości udowej. Działanie to ułatwia pobieranie zawartości szpiku kostnego z trzonu kości udowej.</li>
	<li>Obróć igłę zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, powoli wpychając ją do jamy szpiku udowego. Potwierdzić prawidłowe ułożenie igły, delikatnie przesuwając strzykawkę na boki.</li>
	<li>Delikatnie pociągnąć tłok igły do tyłu, wytwarzając podciśnienie, jednocześnie przesuwając igłę do przodu i do tyłu w jamie BM. Uwaga: Objętość zasysanego BM będzie wynosić około 5 μl, co zwykle odpowiada 0,4-0,8 x 106 komórek jednojądrzastych. Pomyślne aspiracje zostanie potwierdzone wizualnie przez pojawienie się krwi w górnej części igły w podstawie strzykawki. Jeśli w strzykawce nie widać krwi, prawdopodobnie w igle utknął mały fragment kości lub tkanki. Można go usunąć z igły, przesuwając tłok w górę i w dół w PBS (jest to jeden z powodów, dla których strzykawka powinna być wstępnie napełniona PBS przed zassaniem BM). Jeśli nie można usunąć tkanki ze strzykawki, należy użyć nowej igły i strzykawki (ponownie zwilżyć strzykawkę 200-500 μl PBS).</li>
	<li>Po pomyślnym odessaniu BM z kości udowej należy wyjąć igłę i strzykawkę z kości udowej i myszy.</li>
	<li>Przenieś zasysany BM do probówki do mikrofuge wstępnie napełnionej 500 μl PBS. W przypadku większości zastosowań komórki BM powinny być następnie przechowywane na lodzie do czasu dalszego przetwarzania, jeśli to możliwe.</li>
	<li>
	 Po zakończeniu zabiegu podać podskórnie środek przeciwbólowy z karprofenem w dawce 5 mg/kg. Następnie wyjmij mysz ze znieczulenia i umieść ją na rozgrzanej podkładce, aż do całkowitego wyzdrowienia. UWAGA: Po zabiegu aspiracji nie powinno wystąpić żadne komplikacje ani niepokój, jeśli zostanie on wykonany prawidłowo.
	</li>
	<li>
	 Przed powrotem myszy do pomieszczenia mieszkalnego upewnij się, że są w stanie poruszać się i docierać do jedzenia i wody. Obserwuj myszy pod kątem oznak niepokoju lub infekcji po zabiegu w ciągu najbliższych 24 godzin. Objawy obejmują: ciągłe krwawienie, niedokrwistość, letarg. Jeśli którykolwiek z tych objawów zostanie zauważony po zabiegu, zwierzę (zwierzęta) powinno zostać poddane eutanazji. Uwaga: Aspirację/pobieranie próbek BM można powtórzyć, ale powtórzoną procedurę należy wykonać na przeciwległej kości udowej, aby zapobiec powtarzającym się urazom tej samej nogi. Dostępnych jest niewiele informacji na temat częstotliwości, z jaką można wykonywać aspirację BM. Aspirację szpiku kostnego kości udowej powtarza się na ogół nie częściej niż co 2 tygodnie.
	</li>
</ol>
2. Ocena zawartości komórkowej w aspirowanych komórkach BM
<ol>
	<li>Komórki osadu pobrane z aspiracji BM i umieścić w probówce do mikrofuge przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC lub RT.</li>
	<li>Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu do lizy czerwonych krwinek ACK (bufor do lizy (bufor do lizy amon-chlorek-potas).</li>
	<li>Inkubować komórki w buforze do lizy krwinek czerwonych przez 10 minut, a następnie dodać 1 ml PBS i ponownie odwirowywać mieszaninę przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 oC lub RT. Uwaga: Osad z lizy krwinek czerwonych składa się teraz z komórek jednojądrzastych BM. Można je ponownie zawiesić w celu barwienia FACS, zliczania komórek, przeszczepu, analizy cytospinowej i / lub dowolnego innego zastosowania (tak jak użyto by komórek BM pobranych od ofiarowanych myszy).</li>
</ol>

<ol><li>Sundberg, R., Hodgson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspiration+of+bone+marrow+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Aspiration of bone marrow in laboratory animals.</a> Blood. 4, 557-561 (1949).</li>
<li>Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+technique+for+intrafemoral+injection+and+bone+marrow+sampling+in+mouse+transplant+models%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models.</a> Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).</li>
<li>Warner, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+cooperating+genetic+events+in+the+leukemic+transformation+of+normal+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells.</a> Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).</li>
<li>Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia-initiating+cells+in+human+T-lymphoblastic+leukemia+exhibit+glucocorticoid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance.</a> Blood. 116, 5268-5279 (2010).</li>
<li>Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+isolation%2C+and+stimulation+of+quiescent+primitive+leukemic+progenitor+cells+from+patients+with+acute+myeloid+leukemia+%28AML%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML).</a> Blood. 101, 3142-3149 (2003).</li>
<li>Nolta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gold+standard+improves%3A+a+better+assay+for+HSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The gold standard improves: a better assay for HSCs.</a> Blood. 106, 1141-1142 (2005).</li>
<li>Kiel, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121, 1109-1121 (2005).</li>
<li>Purton, L., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).</li>
<li>Dykstra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+propagation+of+distinct+hematopoietic+differentiation+programs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo.</a> Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).</li>
<li>Jordan, C., Lemischka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+systemic+analysis+of+long-term+hematopoiesis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse.</a> Genes & development. 4, 220-232 (1990).</li>
<li>Challen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt3a+is+essential+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Nature genetics. 44, 23-31 (2012).</li>
<li>Hess, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+based+on+CD133+and+high+aldehyde+dehydrogenase+activity+isolates+long-term+reconstituting+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells.</a> Blood. 107, 2162-2169 (2006).</li>
<li>Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+myeloerythroid+repopulation+after+intrafemoral+transplantation+of+NOD-SCID+mice+reveals+a+new+class+of+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells.</a> Nat Med. 9, 959-963 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Seryjna aspiracja BM jest rutynową procedurą o kluczowym znaczeniu dla klinicznego badania zaburzeń hematologicznych u ludzi. Bardzo cenna jest również możliwość przeprowadzenia analogicznego seryjnego pobierania próbek BM u myszy w celu scharakteryzowania składu komórkowego i składników BM podczas długotrwałych eksperymentów. Procedura ta jest przydatna do charakteryzowania HSPC bez poświęcania myszy, ale także do wykrywania obecności dodatkowych typów komórek w BM w przypadkach, gdy zawartość krwi obwodowej może nie od...

Wszystkie komórki krwi pochodzą z hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC). Procedury, które umożliwiają dostęp do szpiku kostnego (BM), miejsca występowania zdecydowanej większości HSC u myszy i ludzi, bez konieczności składania ofiar ze zwierząt, zapewniają zasoby do seryjnego monitorowania źródła hematopoezy. Ogólnym celem opisanej tutaj procedury jest dostarczenie szczegółowego protokołu pobierania próbek komórek BM z kości udowej żywych myszy, który zapewnia materiał reprezentatywny dla komórek, które zostałyby odzyskane przez konwencjonalne pobieranie komórek BM poprzez poświęcenie myszy. Przewagą tej procedury nad konwencjonalnym pobieraniem komórek BM jest to, że procedura ta nie wymaga poświęcania myszy, a zatem pozwala na podłużne badanie przedziału szpiku kostnego myszy w czasie. 
Chociaż ta procedura aspiracji szpiku kostnego była stosowana w wielu badaniach i opisana wcześniej (zobacz Sundberg et al. W przypadku przeglądu historycznego1), formalne procedury krok po kroku ilustrujące tę technikę nie zostały wcześniej opublikowane. Protokół ten umożliwia rutynowe seryjne pobieranie próbek BM do celów takich jak ocena wszczepienia do BM komórek egzogennie wprowadzonych do myszy (jak miałoby to miejsce w badaniach ksenoprzeszczepów na przykład2,3), analiza chimeryzmu w BM w celu porównania z krwią obwodową (gdzie wyniki niekoniecznie są zgodne), monitorowanie obfitości określonych typów komórek normalnie wzbogaconych w szpiku, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe, oraz pobieranie komórek BM do hodowli ex vivo i/lub przeszczepu. Ponadto ocena zawartości szpiku może być bardzo przydatna w mysich modelach choroby hematologicznej, ponieważ aspiracja jest pomocna w ocenie obciążenia chorobą hematologiczną w momentach, w których choroba może nie być widoczna we krwi obwodowej3-5. Ponadto technika ta może być wykorzystana do oceny odpowiedzi choroby hematologicznej szpiku kostnego na leki podawane w badaniach terapeutycznych. W związku z tym opisana tutaj procedura jest idealna dla badaczy chcących uzyskać dostęp do komórek krwiotwórczych szpiku kostnego od myszy do analizy cytologicznej, analizy cytometrii przepływowej, hodowli in vitro i / lub badań transplantacyjnych in vivo bez konieczności poświęcania lub szkodzenia myszom. 
Protokół pobierania próbek BM opisany tutaj jest dość podobny do techniki stosowanej do wstrzykiwania materiału bezpośrednio do jamy szpiku3,6. Kluczowa różnica polega na tym, że protokół ten szczegółowo opisuje procedurę usuwania komórek ze szpiku, w przeciwieństwie do wkraplania materiału bezpośrednio do przestrzeni jamy szpiku, jak ma to miejsce w przypadku wstrzyknięcia doudowego.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>ACK bufor do lizy</td><td>Domowej roboty</td><td></td><td>w 1 L. Dostosuj pH 7,2 ~ 7,4 i filtruj sterylnie za pomocą 0,22 &mu; m filtr próżniowy.</td></tr><tr><td>8,3 g Chlorek amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>1 g Wodorowęglan potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P184-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; l 0,5 M EDTA pH 8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Strzykawka tuberkulinowa 27,5 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitko komórkowe 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Attane</td><td>NDC: 66794-014-25</td><td></td></tr><tr><td>Igła z końcem</td><td>Stemcell Technologies</td><td>28110</td><td></td></tr><tr><td>Igła PrecisionGlide 23 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Strzykawka Luer-Lok 3 ml Becton</td><td>Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Płytka niepoddana hodowli tkankowej, 6 Studnia</td><td>Becton Dickinson</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml probówki&nbsp;</td><td>Barwienie Becton Dickinson</td><td>352054</td><td>FACS</td></tr><tr><td>12 x 75 mm 5 ml probówki z nasadką z sitkiem do komórek</td><td>Barwienie Becton Dickinson</td><td>352235</td><td>FACS</td></tr><tr><td>NK1.1 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108723</td><td></td></tr><tr><td>CD11b APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>101225</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103223</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>100222</tr><tr><td>Ly-6G i Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>Ter119 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116223</td><td></td></tr><tr><td>CD19 APC-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>302217</td><td></td></tr><tr><td>CD4 APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>317417</td><td></td></tr><tr><td>CD117 (c-KIT) PE</td><td>BioLegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6A/E (SCA-1) PE-Cy7</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>122513</tr><tr><td>CD34 APC</td><td>Biolegend</td><td>128612</td><td></td></tr><tr><td>CD16/32 e450</td><td>eBioscience</td><td>48-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (dichlorowodorek 4&,6-diamidyno-2-fenyloindolu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32670</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>STEMCELLTECHNOLOGIES</td><td>3434</td><td>Do hodowli metocelulozy</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Crescent Chemical Firma</td><td>C11045850</td><td>1 dawka (5mg/kg)&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy, LSRFortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puralube maść weterynaryjna (sterylna maść okulistyczna do wazeliny)</td><td>Dechra-US</td><td>17033-211-38</td><td></td></tr></tbody></table>

aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Seryjne pobieranie próbek składu komórkowego szpiku kostnego (BM) jest rutynową procedurą krytyczną dla hematologii klinicznej. Protokół ten opisuje szczegółową procedurę techniczną krok po kroku dla analogicznej procedury na żywych myszach, która pozwala na seryjną charakterystykę komórek obecnych w BM. Procedura ta ułatwia badania mające na celu wykrycie obecności egzogennie podawanych komórek w BM myszy, tak jak miałoby to miejsce na przykład w badaniach ksenoprzeszczepów. Co więcej, procedura ta pozwala na pobranie i scharakteryzowanie komórek wzbogaconych w BM, takich jak hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) bez poświęcania myszy. Biorąc pod uwagę, że skład komórkowy krwi obwodowej niekoniecznie odzwierciedla proporcje i typy komórek macierzystych i progenitorowych obecnych w szpiku, bardzo pomocne są procedury, które zapewniają dostęp do tego przedziału bez konieczności terminacji myszy. Zastosowanie aspiracji szpiku kostnego kości udowej przedstawiono tutaj do analizy cytologicznej komórek szpiku, charakterystyki cytometrii przepływowej hematopoetycznego przedziału macierzystego/progenitorowego oraz hodowli posortowanych HSPC uzyskanych przez aspirację BM kości udowej w porównaniu z konwencjonalnym pobraniem szpiku.

Do pobrania mononuklearnych komórek szpiku kostnego (BM) wykorzystano aspirację z kości udowej żywej myszy C57/B6, a następnie przeprowadzono konwencjonalny pobór szpiku z tej samej myszy po jej uśmierceniu. Komórki mononuklearne BM uzyskane dwiema metodami poddano następnie (1) analizie cytologicznej komórek BM, (2) oznaczeniu względnej częstości występowania krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych (HSPCs) oraz (3) hodowli ex vivo wyselekcjonowanych komórek HSPCs. W tym ostatnim eksperymencie komór...

Ten protokół opisuje procedurę seryjnego pobierania próbek szpiku kostnego kości udowej (BM) bez konieczności poświęcania myszy. Procedura ta ułatwia badania podłużne składu BM myszy w czasie i zapewnia szeregowy dostęp do komórek w BM do badań ex vivo i transplantacji.

Aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest bezpieczne aspiracja treści komórek krwiotwórczych szpiku kostnego z przestrzeni szpiku udowego żywej myszy. Osiąga się to poprzez uprzednie przepłukanie strzykawki tuberkulinowej roztworem PBS. W drugim kroku nogę myszy ustawia się ostrożnie pod kątem optymalnym do pobrania szpiku kostnego.Następnie komórki krwiotwórcze są aspirowane z jam szpiku udowego, a erytrocyty są usuwane. Ostatecznie pomyślne pobranie zawartości szpiku kostnego można zwizualizować za pomocą analizy cytometrycznej i cytologicznej. Procedurę zaprezentuje Rock Chung, bardzo utalentowany technik z naszego laboratorium.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalny pobiór szpiku kostnego, jest to, że pozwala ona na odzyskanie części komórek krwiotwórczych szpiku kostnego przy jednoczesnym pozostawieniu zwierzęcia przy życiu w celu dalszej obserwacji i analiz seryjnych. Po potwierdzeniu sedacji poprzez uciśnięcie palca, należy nałożyć maść oftalmiczną na oczy znieczulonej myszy, aby zapobiec wysychaniu rogówki, a następnie zgolić sierść z nogi w celu odsłonięcia skóry. Sterylne przygotowanie chirurgiczne skóry wykonuje się poprzez wyszorowanie obszaru odkażaczem z chloreksydyną, a następnie przemycie gazikiem nasączonym alkoholem.Proces ten powtarza się trzykrotnie, używając dla każdego zwierzęcia nowej, nieotwartej sterylnej strzykawki i igły. Należy potwierdzić, że osiągnięto odpowiednią głębokość znieczulenia. Następnie zwilża się strzykawkę tuberkulinową o pojemności 0,5 ml sterylnym PBS, po czym aspiruje się i natychmiast usuwa od 200 do 500 µl roztworu soli fizjologicznej dwa do trzech razy.Następnie za pomocą jednego z dwóch ostatnich palców jednej ręki delikatnie odgnij kość piszczelową od kości udowej, aby ułatwić odsłonięcie przestrzeni kłykciowej kości udowej i wprowadzenie igły. Teraz wprowadź igłę przez więzozrost rzepki tak, aby była ona stabilnie osadzona pomiędzy dwoma kłykciami kości udowej. Użyj kciuka i palca wskazującego drugiej ręki, aby przytrzymać trzon blisko nasady kości udowej, co umożliwi łatwe wprowadzenie igły do trzonu kości.Jeśli w strzykawce nie widać krwi, prawdopodobnie w igle utknął mały fragment kości lub tkanki. Można go usunąć, przesuwając tłok w górę i w dół w PBS. Jeśli nie uda się usunąć tkanki ze strzykawki, należy użyć nowej igły i strzykawki.Ponownie zwilż strzykawkę od 200 do 500 µL PBS. Następnie obracaj igłę w prawo i w lewo, dociskając ją do przestrzeni kłykciowej tak, aby była równoległa do trzonu kości udowej. Ma to ułatwić pobranie szpiku kostnego z trzonu kości udowej.Obracaj igłę zgodnie i przeciwnie z ruchem wskazówek zegara, powoli wprowadzając ją do jamistej części szpiku udowego. Potwierdź prawidłowe umiejscowienie igły, delikatnie poruszając strzykawką w kierunku bocznym. Następnie ostrożnie odciągnij tłok strzykawki, wytwarzając podciśnienie i jednocześnie przesuwając igłę w przód i w tył w obrębie jamy szpiku kostnego.Pomyślne aspirowanie zostanie potwierdzone pojawieniem się krwi w górnej części igły u nasady strzykawki. Po pomyślnym aspirowaniu szpiku kostnego z kości udowej, wyjmij igłę z kości i przenieś aspirat do probówki do mikrowirówki wypełnionej uprzednio 500 µL PBS w lodzie. Po podaniu leku przeciwbólowego pozwól myszy dojść do siebie pod lampą grzewczą przed powrotem zwierząt do klatek.Upewnij się, że myszy są w stanie się poruszać i mają dostęp do pokarmu oraz wody. Następnie umieść mysz z powrotem w klatce i obserwuj zwierzę przez kolejne 24 godziny pod kątem oznak stresu lub infekcji po zabiegu. W międzyczasie odwiruj komórki szpiku kostnego, ostrożnie odciągnij PBS i resuspenduj osad.Po 10 minutach w 500 µL buforu do lizy erytrocytów, przemyć komórki w 1 mL PBS. Osad zawiera mononuklearne komórki szpiku kostnego, które mogą zostać wykorzystane do analizy eksperymentalnej. Pierwsze rysunki ilustrują, że podobne typy i proporcje ogólnych populacji komórek oraz hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych można zaobserwować w analizach morfologicznych i cytometrycznych, stosując zarówno aspirację szpiku z kości udowej, jak i konwencjonalne pobieranie szpiku kostnego.Tutaj przedstawiono procentową zawartość subpopulacji komórek lineage-ujemnych, SKA1-dodatnich, c-kit-dodatnich oraz progenitorów mieloidalnych jako częstotliwość w odniesieniu do całkowitej liczby żywych komórek w trzech niezależnych aspiracjach oraz przy konwencjonalnym pobraniu szpiku. Dane te ujawniają spadek subpopulacji lineage-ujemnych, SKA1-dodatnich, c-kit-dodatnich oraz progenitorów mieloidalnych w szpiku pobranym drogą aspiracji z kości udowej w porównaniu z konwencjonalnym pobraniem szpiku. Różnica ta nie była istotna statystycznie dla danej populacji.Jednak sortowanie komórek lineage-ujemnych, ska1-dodatnich i c-kit-dodatnich, a następnie ich hodowla ex vivo w metylocelulozie, pozwala na uzyskanie liczby kolonii i typów komórek podobnych do tych otrzymywanych poprzez aspirację szpiku kostnego z kości udowej. Podobnie jak przy konwencjonalnym pobieraniu szpiku kostnego, typy kolonii zaobserwowane i zliczone w obu hodowlach obejmują jednostki tworzące kolonie granulocytów, erytrocytów, monocytów i megakariocytów, jednostki tworzące kolonie granulocytów i monocytów oraz jednostki tworzące sery erytroidalne (BFU-E). Technika ta, jeśli jest wykonywana prawidłowo zgodnie z opisaną procedurą, może zostać przeprowadzona w czasie 10 minut na mysz.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak jaki jest wpływ ksenoprzeszczepu ludzkich komórek krwiotwórczych u myszy z niedoborem odporności, można zastosować inne metody, np. wewnątrzszpikowe wstrzyknięcie do kości udowej.

femoral-bone-marrow-aspiration-in-live-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Punktacja rdzenia kostnego z kości udowej u żywych myszy

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do badania przerzutów nowotworowych do kości. W niniejszym protokole opiszemy dwie powszechne metody inokulacji guza w badaniach nad przerzutami do kości oraz krótko omówimy niektóre z analiz stosowanych do monitorowania i ilościowego określania tych modeli.

Modele przerzutów do kości

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolowania świeżego całego szpiku kostnego z tylnych kończyn myszy w celu zbadania całych wad BM u pacjentów z chorobami krwi, takimi jak białaczka.

Pobieranie szpiku kostnego z tylnej kończyny myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Model mysiego zamkniętego złamania kości udowej jest potężną platformą do badania gojenia złamań i nowatorskich strategii terapeutycznych przyspieszających regenerację kości. Celem tego protokołu chirurgicznego jest wygenerowanie jednostronnie zamkniętych złamań kości udowej u myszy za pomocą śródszpikowego pręta stalowego do stabilizacji kości udowej.

Generowanie zamkniętych złamań kości udowej u myszy: model do badania gojenia kości

Tutaj prezentujemy protokół przetwarzania świeżego szpiku kostnego (BM) wyizolowanego od myszy lub człowieka do wysokowymiarowej cytometrii masowej (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analizy komórek linii neutrofili.

Przygotowanie całego szpiku kostnego do analizy cytometrii masowej komórek z linii neutrofili

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Poznaj metodę aspiracji szpiku kostnego z kości udowej u żywych myszy. Technika umożliwia wielokrotne pobieranie próbek bez konieczności eutanazji zwierząt, co wspiera długoterminowe badania hematologiczne i przeszczepowe.

Aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy

Przeglądaj więcej filmów