Name: Protokół SIVQ-LCM dla instrumentu ArcturusXT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj technikę SIVQ-LCM do mikrodissekcji laserowej tkanek na urządzeniu ArcturusXT. Ta metoda łączy analizę obrazu SIVQ z LCM, umożliwiając szybką i precyzyjną izolację komórek do analizy molekularnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badanie było częściowo wspierane przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Opisany protokół został zastosowany zgodnie z zasadami NIH dotyczącymi korzystania z próbek tkanek ludzkich.
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem należy pobrać próbki tkanek ludzkich zgodnie z protokołami Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB).</li>
	<li>Wybierz rodzaj bloku tkankowego/komórkowego i odpowiednią metodę przetwarzania [zatopiona w formalinie parafina (FFPE), zamrożona lub utrwalona w parafinie utrwalonej etanolem (EFPE)]. Utrwalanie formaliny zapewnia optymalną histologię, a następnie utrwalanie etanolu i błyskawiczne zamrażanie. Jednak metody utrwalania i przetwarzania tkanek mogą wpływać na ilość i jakość DNA, RNA i białek w dalszej analizie molekularnej i powinny być brane pod uwagę.</li>
	<li>Wytnij sekcje bloku tkankowego/komórkowego na wybrany typ szkiełka (szkło, szkło membranowe lub membrana z metalową ramą). Analiza SIVQ działa równie dobrze na wszystkich trzech typach szkiełek. Należy pamiętać, że metoda pseudoszkiełka nakrywkowego (opisana poniżej) z ksylenami i etanolem nie może być wykonywana na szkiełkach membranowych z metalową ramą, ponieważ szkiełko musi być odwrócone na stoliku.</li>
	<li>Wybierz barwnik tkankowy na bazie substancji chemicznej lub IHC, aby zidentyfikować interesujące komórki na tle. Należy pamiętać, że metody barwienia mogą również wpływać na jakość i ilość DNA, RNA i białek w tkance. Przetestuj tkankę po barwieniu, aby ocenić wyjściową jakość biomolekuł przed przystąpieniem do protokołu. SIVQ-LCM wykonano na szkiełkach tkankowych/cytologicznych wybarwionych: immunohistochemią (IHC) za pomocą DAB15, immunofluorescencją, szybką czerwienią, czerwienią de novo, błękitem toluidynowym oraz hematosyliną i eozyną (H&E) (dane niepublikowane).</li>
</ol>
2. Obrazowanie próbek
<ol>
	<li>Załaduj szkiełka na zmotoryzowany stolik przyrządu do mikrodysekcji i uruchom odpowiednie oprogramowanie. Zaznacz pola wyboru, aby wyznaczyć pozycje załadowanych slajdów i upewnić się, że przechwycone pliki obrazów mają być zapisane w formacie jpeg.</li>
	<li>Zoptymalizuj jakość obrazu, dostosowując jasność i ostrość obrazu na ekranie za pomocą pokrętła ręcznego ustawiania ostrości lub oprogramowania przyrządu do sekcji.
	<ol>
		<li>Korzystając z przybornika obrazu w oprogramowaniu przyrządu do sekcji, ustaw odpowiednio jasność lampy i wzmocnienie kamery. Przykładowe wartości to jasność = 60 i wzmocnienie = 220, z dyfuzorem.</li>
		<li>Ustaw ostrość ręcznie lub za pomocą funkcji autofokusa w oprogramowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechwyć miniaturowy obraz przeglądowy slajdu, aby zapewnić mapę drogową procesu sekcji.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać optymalną jakość obrazu odkrytego szkiełka, należy użyć dyfuzora znajdującego się pod kondensatorem na instrumencie lub dodać niewielką ilość (~30 μl) etanolu lub ksylenów, aby poprawić wskaźnik trwałości (pseudoszkiełko nakrywkowe). Podczas używania ksylenów należy pamiętać, że są one toksyczne i należy stosować odpowiednie środki bezpieczeństwa, w tym używać dygestorium i ochronnego fartucha laboratoryjnego, okularów i rękawic.</li>
		<li>NIE umieszczaj nasadki LCM na szkiełku, dopóki roztwór etanolu lub ksylenów nie zostanie całkowicie usunięty lub polimer na nasadce zostanie zniekształcony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poruszaj się po slajdzie i rób obrazy obszarów do przeanalizowania w powiększeniu 10x, 20x lub 40x. W razie potrzeby popraw obraz za pomocą oprogramowania, takiego jak Autokorekta (w programie Microsoft Office Picture Manager), jak opisano wcześniej22. Obrazy muszą być zapisane w formacie jpeg, aby można je było ponownie zaimportować do oprogramowania do automatycznego wyboru.</li>
</ol>
3. Analiza algorytmiczna obrazu
<ol>
	<li>Przenieś przechwycone obrazy z instrumentu do mikrodysekcji do folderu SIVQ. Zainstaluj i otwórz pakiety oprogramowania ArcturusXT, AutoScan i SIVQ na komputerze podłączonym do instrumentu preparacyjnego. Aby uzyskać dostęp do oprogramowania SIVQ, skontaktuj się z dr Ulyssesem Balisem (ulysses@med.umich.edu).</li>
	<li>Otwórz SIVQ i załaduj przechwycony obraz (jpeg), który Cię interesuje.</li>
	<li>Przejdź do obszaru zainteresowania i/lub dostosuj rozmiar okien wyświetlacza (Viewport 5 i 6). W oprogramowaniu SIVQ Viewport 5 pokazuje obraz wstępnie przetworzony, a Viewport 6 pokazuje obraz po przetworzeniu16.</li>
	<li>Wybierz rozmiar wektora pierścienia i liczbę pierścieni, które mają być używane.</li>
	<li>Wybierz funkcję obrazu predykatu do przechwycenia, klikając ją prawym przyciskiem myszy w rzutni 6.</li>
	<li>Kliknij "skanuj", aby przeanalizować obraz.</li>
	<li>Dostosuj statystyczne prawdopodobieństwo dopasowania obrazu za pomocą dwóch przesuwanych pasków. Górny pasek dostosowuje ogólną specyficzność wektora i służy do wykluczania obszaru z początkowego skanowania (z czułością zdefiniowaną przez wybraną zmienną "Stat"), który może reprezentować nadmierny obszar uwzględniony. I odwrotnie, dolny suwak służy do zwiększenia czułości, po wykonaniu skanowania z zamiarem zwiększenia obszaru, który jest klasyfikowany jako dopasowanie. Obie te kontrolki suwaka wykorzystują zmienną "Stat" jako początkowy próg czułości linii bazowej.</li>
	<li>Aby zapisać obraz, kliknij "zapisz jako jpeg" (obraz jest teraz zapisany w folderze c:/vq_test</li>).
	<li>Przeanalizuj obraz za pomocą algorytmu. Wynikiem analizy algorytmu musi być obraz z adnotacjami, aby można go było użyć w SIVQ-LCM. Obecnie obecna wersja silnika SIVQ core engine jest w fazie testów beta z oczekiwaniem, że pełna wersja produkcyjna (dostępna w pierwszym kwartale 2014 r.) będzie zawierać pełny zestaw narzędzi do tworzenia oprogramowania (SDK) i interfejs programowania aplikacji (API) w celu uproszczonej integracji generowanych przez użytkownika filtrów przestrzennych i dalszych etapów przetwarzania danych przepływu pracy z silnikiem dopasowywania pierścieni rdzeniowych. Ten pakiet SDK będzie dystrybuowany wraz z kompletnym zestawem dokumentacji.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że mapa cieplna SIVQ została zmieniona na jednolity czerwony kolor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyeksportuj obraz. Konieczne jest ponowne osadzenie współrzędnych pozycyjnych na obrazie jpeg po analizie za pomocą edytora szesnastkowego w celu wklejenia nagłówka pliku z oryginalnego obrazu instrumentu do sekcji. Odpowiednie dane można znaleźć między znacznikiem "Początek obrazu" (0xFF, 0xD8) a pierwszym znacznikiem "Zdefiniuj tabelę kwantyzacji" (0xFF, 0xDB).</li>
</ol>
4. Mikrodysekcja
<ol>
	<li>Umieść nasadkę LCM na środku obszaru zainteresowania, w którym obrazy zostały przechwycone do analizy SIVQ.</li>
	<li>Kalibracja i kontrola jakości (QC) laserów UV/IR oraz optymalizacja parametrów, w tym mocy, czasu trwania, lokalizacji lasera i prędkości cięcia UV (zgodnie z zaleceniami producenta). Wykonaj te kalibracje przed ponownym zaimportowaniem analizowanego obrazu. </li>
	<li>Otwórz AutoScanXT (oprogramowanie do automatycznego wyboru) i zaimportuj analizowany obraz z folderu c:/vq_test</li>.
	<li>Przeszkol oprogramowanie do automatycznego doboru, aby rozpoznawało adnotację SIVQ i tworzyło mapę sekcji.
	<ol>
		<li>Aby utworzyć plik treningowy, wybierz cztery obszary zainteresowania (oznaczone "niebieskimi kółkami") na "czerwonej farbie" analizowanego obrazu SIVQ.</li>
		<li>Zaznacz obszary tła (oznaczone "czerwonymi kwadratami"), które nie mają być analizowane.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Analizuj", aby wygenerować plik treningowy, który można zapisać do kolejnych zastosowań. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj mikrodysekcję za pomocą odpowiednich laserów na podczerwień (IR) i/lub ultrafiolet (UV).
	<ol>
		<li>Skopiuj zaznaczone obszary na obraz "na żywo".</li>
		<li>W przyborniku "mikrodysekcja" wybierz odpowiednie przyciski przechwytywania podczerwieni lub cięcia UV.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu sekcji przenieś nasadkę LCM do stacji kontroli jakości i uchwyć obraz wypreparowanej tkanki/komórek. Innym podejściem jest umieszczenie nasadki na pustym obszarze zamka przed przeniesieniem go do stacji kontroli jakości, co pozwala użytkownikowi na robienie zdjęć w różnych powiększeniach.</li>
	<li>Uchwyć obraz obszaru zainteresowania tkanki po mikrodysekcji, aby dokładniej ocenić wydajność podnoszenia.</li>
	<li>Jeśli żądane komórki zostały pomyślnie wypreparowane, kliknij przycisk "obecny etap" w oprogramowaniu ArcturusXT i zdejmij nasadkę LCM, aby rozpocząć procedurę ekstrakcji molekularnej do dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li>
<li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li>
<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+Barrett%27s+esophagus%3A+laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors%3A+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).</li>
<li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components%3A+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).</li>
<li>Silvestri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+pathway+biomarker+analysis+of+human+cancer+reveals+requirement+for+upfront+cellular-enrichment+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).</li>
<li>Eberle, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoguided+laser+assisted+microdissection+techniques+for+DNA+methylation+analysis+of+archival+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics+%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medical+genomics%22%5BJournal%5D)">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC medical genomics. 4, 48(2011).</li>
<li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma%3A+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+medical+genomics%22%5BJournal%5D)">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC medical genomics. 2, 13(2009).</li>
<li>Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissected+mucosa+versus+whole+tissue+specimens+for+assessment+of+radiation-induced+dynamic+molecular+and+pathway+changes+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine.</a> PloS one. 8, e53711(2013).</li>
<li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li>
<li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIVQ-aided+laser+capture+microdissection%3A+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology+informatics%22%5BJournal%5D)">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19(2011).</li>
<li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+Invariant+Vector+Quantization%3A+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Inform%22%5BJournal%5D)">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13(2011).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+cellular+pathology%22%5BJournal%5D)">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Cell+Pathol+%28Amst%22%5BJournal%5D)">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB%3A+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37(2011).</li>
<li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cytol%22%5BJournal%5D)">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li>
<li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Microarrays+%28IMA%29%3A+Digital+Pathology%27s+Missing+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li>
<li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li>
</ol>

Michael R. Emmert-Buck jest wynalazcą patentów NIH obejmujących mikrodysekcję wychwytywania laserowego i otrzymuje płatności oparte na tantiemach za pośrednictwem Programu Transferu Technologii NIH.

Przedstawiamy protokół zastosowania SIVQ-LCM do mikrodysekcji komórek nabłonka wybarwionych immunologicznie z ludzkiej tkanki piersi FFPE. Zastosowanie algorytmu analizy obrazu, takiego jak SIVQ, skraca czas potrzebny na proces mikrodysekcji. Jest to potencjalnie ważny postęp w tej dziedzinie, ponieważ czas i wysiłek operatora jest zazwyczaj krokiem ograniczającym szybkość precyzyjnej sekcji komórek będących przedmiotem zainteresowania. W niniejszym protokole specjalnie dostosowaliśmy naszą procedurę do instrumentu Arctu...

Pierwotnie opracowana w połowie lat 90-tych, laserowa mikrodysekcja (LCM) umożliwia użytkownikowi precyzyjne uchwycenie określonych komórek lub obszarów komórkowych z histologicznego wycinka tkanki za pomocą wizualizacji mikroskopowej 1,2. Wiele badań porównujących analizę molekularną LCM z zeskrobinami tkanek ilustruje wartość metody3-12. Ponadto dostępne są trzy publikacje dotyczące protokołu wideo na temat tej technologii, które są dostępne do oglądania 13,14. Jednak pomimo swojej udowodnionej wartości, LCM może być żmudny i pracochłonny, gdy celem zainteresowania jest rozproszona populacja komórek w heterogenicznym przekroju tkanki lub gdy wymagana jest duża liczba komórek do określonych dalszych zastosowań, takich jak proteomika. Obciążenie spoczywające na operatorze skłoniło nas do opracowania półautomatycznego podejścia do preparacji LCM poprzez połączenie potężnego algorytmu analizy obrazu, który kieruje procesem LCM15.
We współpracy z Uniwersytetem Michigan, nasze laboratorium w NIH rozszerzyło wcześniej opracowany i zgłoszony algorytm przestrzennie niezmiennej kwantyzacji wektorów (SIVQ) w taki sposób, aby umożliwić półautomatyczną automatyzację procesu selekcji tkanek nieodłącznie związanego z kierowaną mikrodysekcją, udostępniając w ten sposób narzędzie z myślą o patologu lub naukowcu życiowym. Przestrzennie niezmienna kwantyzacja wektorowa (SIVQ) to algorytm, który pozwala użytkownikowi po prostu "kliknąć" na interesującą go cechę histologiczną, aby utworzyć wektor pierścieniowy (cechę obrazu predykatu), który można wykorzystać do przeszukania całego obrazu histologicznego, dostosowując próg statystyczny w razie potrzeby16-21. Wynikowa mapa cieplna wyświetla jakość dopasowań do początkowej funkcji obrazu predykatu, a następnie jest konwertowana na jednokolorową (czerwoną) mapę adnotacji, którą można zaimportować do instrumentu LCM. Zautomatyzowane oprogramowanie selekcyjne, AutoScanXT, jest następnie wykorzystywane do rysowania mapy na podstawie adnotacji SIVQ, która prowadzi do wychwytywania komórek docelowych z próbki tkanki. Szczegółowy protokół poniżej opisuje implementację SIVQ w procesie mikrodysekcji.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka szklane z dodatnio naładowanym ładunkiem</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951Plus-001</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny, odczynnik ACS, &ge; 98,5% ksylenów + etylobenzen&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>247642</td><td>UWAGA: PROSZĘ STOSOWAĆ ODPOWIEDNIE PROCEDURY BEZPIECZEŃSTWA.</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, U.S.P. 200 Proof, bezwodny</td><td>The Warner-Graham Company</td><td>6.505E+12</td><td>UWAGA: PROSZĘ STOSOWAĆ ODPOWIEDNIE PROCEDURY BEZPIECZEŃSTWA.</td></tr><tr><td>Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>ArcturusXT Laserowy instrument do mikrodysekcji</td><td>Technologie żywotności</td><td>ARCTURUSXT</td><td></td></tr><tr><td>AutoScanXT Software</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Opcjonalny program do analizy obrazu dla laserowego urządzenia do mikrodysekcji ArcturusXT. Jest to oprogramowanie wymagane dla SIVQ-LCM.</td></tr><tr><td>Przestrzennie niezmienna kwantyzacja wektorowa (SIVQ)</td><td>Uniwersytet Michigan</td><td></td><td>Ten pakiet narzędzi jest publicznie dostępny do współpracy akademickiej. W celu uzyskania dostępu do algorytmu SIVQ prosimy o kontakt z dr Ulyssesem Balisem [Ulysses@med.umich.edu]</td></tr></tbody></table>

protokół sivq-lcm dla instrumentu arcturusxt

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM to nowa metodologia, która automatyzuje i usprawnia bardziej tradycyjny, zależny od użytkownika proces laserowej sekcji. Ma ona na celu stworzenie zaawansowanej, szybko konfigurowalnej technologii platformy do analizy laserowej. W tym raporcie opisujemy integrację oprogramowania do analizy obrazów Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) z instrumentem ArcturusXT. System ArcturusXT zawiera zarówno laser na podczerwień (IR), jak i ultrafiolet (UV), co pozwala na preparowanie określonych komórek lub dużych obszarów. Głównym celem jest poprawa szybkości, dokładności i powtarzalności preparacji laserowej w celu zwiększenia przepustowości próbek. To nowatorskie podejście ułatwia mikrodysekcję zarówno tkanek zwierzęcych, jak i ludzkich w przepływach pracy badawczej i klinicznej.

Przekrój ludzkiej tkanki piersi utrwalonej w FFPE poddano immunohistochemicznemu barwieniu na cytokieratynę AE1/AE3 zgodnie ze standardowym protokołem IHC23. Po barwieniu preparat tkankowy umieszczono na stole ArcturusXT i rozpoczęto protokół SIVQ-LCM zgodnie z powyższym opisem. Ponieważ tkanka nie może zostać przykryta szkiełkiem przedmiotu przed mikrosekcją, komórki zabarwione IHC+ mogą być trudne do rozróżnienia wizualnie (Rysunek 1A). Aby zatem zapewnić lepsze dopasowanie indeksu i poprawi...

SIVQ-LCM to innowacyjne podejście, które wykorzystuje algorytm komputerowy, Przestrzennie Niezmienniczą Kwantyzację Wektorową (SIVQ), do sterowania procesem mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM). Przepływ pracy SIVQ-LCM znacznie poprawia szybkość i dokładność mikrodysekcji, dzięki czemu ma zastosowanie zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych.

Protokół SIVQ-LCM dla instrumentu ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie analizy obrazu opartej na przestrzennie niezmiennym kwantowaniu wektorowym (SIVQ) w połączeniu z laserową mikrodysekcją przechwytującą (LCM) w celu zidentyfikowania interesujących cech tkanki oraz szybkiego przeprowadzenia ukierunkowanej mikrodysekcji. Jest to realizowane poprzez uprzednie wykonanie obrazowania tkanki docelowej do analizy SIVQ. Następnie przeprowadzana jest analiza SIVQ, a uzyskane adnotacje SIVQ są importowane do urządzenia do mikrodysekcji w celu ich przetworzenia.Ostatecznie interesujące komórki mogą zostać wyizolowane za pomocą S-I-V-Q-L-C-M do dalszych analiz molekularnych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że S-I-V-Q-L-C-M usprawnia proces wyboru i mikrodysekcji dużych obszarów docelowych, co w przypadku tradycyjnych technik mikrodysekcji laserowej byłoby trudne i czasochłonne. Procedurę obrazowania wybranych próbek tkankowych zaprezentuje dr Avi Rosenberg, stażysta kliniczny w naszym laboratorium.Najpierw umieść preparaty na zmotoryzowanym stole instrumentu do mikrodysekcji i uruchom odpowiednie oprogramowanie. Następnie zaznacz właściwe pola wyboru, aby określić położenie umieszczonych preparatów, i upewnij się, że przechwycone pliki obrazów zostaną zapisane w formacie JPEG. Dostosuj jasność i ostrość obrazu na ekranie, aby zoptymalizować jego jakość.Następnie, korzystając z paska narzędzi inspekcji, wsuń dyfuzor, ustaw jasność lampy na 60 oraz wzmocnienie kamery na 20. W oknie podglądu kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać opcję zapamiętaj ustawienia i zapisz. Wykonaj zdjęcie podglądu preparatu w formie miniatury, aby stworzyć mapę procesu sekcji.Ustaw powiększenie i odszukaj obszar zainteresowania. Następnie wykonaj zdjęcie tego obszaru w celu przeprowadzenia analizy obrazów za pomocą algorytmu. Rozpocznij od przeniesienia obrazów do folderu SIVQ.Następnie otwórz program SIVQ i wczytaj przechwycony obraz, który jest przedmiotem analizy. Przejdź do obszaru zainteresowania i dostosuj rozmiar okien wyświetlania viewport five oraz six, nie zmieniając przy tym powiększenia obrazu. Następnie wybierz rozmiar wektora pierścienia oraz liczbę pierścieni, które zostaną wykorzystane w analizie.Kliknij prawym przyciskiem myszy na cechę obrazu predykatu, którą chcesz zarejestrować w oknie viewport six, wybierz heat map, a następnie kliknij scan to X, aby przeanalizować obraz. Następnie użyj górnego z dwóch poziomych suwaków, aby dostosować ogólną specyficzność wektora. Użyj dolnego suwaka, aby zwiększyć czułość po przeprowadzeniu skanowania.Aby zwiększyć obszar sklasyfikowany jako dopasowanie, odznacz pole wyboru mapy ciepła, aby upewnić się, że mapa ciepła SIVQ zmieniła kolor na jednolity czerwony, a następnie zwiększ rozmiar pędzla. Zapisz obraz, klikając przycisk zapisu zdjęcia. Następnie przekonwertuj plik wyjściowy BMP do formatu JPEG.Następnie za pomocą edytora szesnastkowego należy ponownie wpisać współrzędne pozycyjne znalezione pomiędzy markerem początku obrazu a pierwszym zdefiniowanym markerem tabeli kwantyzacji do nagłówka pliku JPEG z analizy końcowej, pochodzącego z oryginalnego obrazu z urządzenia do sekcji, przed rozpoczęciem mikrodysekcji. Umieść nasadkę do laserowej mikrodysekcji (LCM) w centrum obszaru zainteresowania, w którym wykonano obrazy do analizy SIVQ. Następnie, po skalibrowaniu laserów UV i podczerwonych, zoptymalizuj parametry, w tym czas trwania impulsu mocy, położenie laserów oraz prędkość cięcia UV.Następnie otwórz oprogramowanie do automatycznej selekcji i zaimportuj przeanalizowany obraz. Utwórz nowy plik analizy, aby przeszkolić oprogramowanie do automatycznej selekcji w rozpoznawaniu adnotacji SIVQ. Teraz zaznacz obszary tła, które są oznaczone niebieskimi kwadratami na przeanalizowanym obrazie SIVQ.Następnie wybierz obszary zainteresowania (ROI) zaznaczone czerwonymi okręgami i kliknij „learn”, aby wygenerować plik treningowy. Skopiuj zaznaczone obszary do obrazu na żywo. Aby rozpocząć mikrodysekcję, wybierz pasek narzędzi mikrodysekcji i wybierz odpowiednie przyciski rejestracji w podczerwieni lub cięcia UV.Po zakończeniu dyssekcji przenieś kapturek LCM do stacji kontroli jakości i wykonaj zdjęcie wyciętego preparatu. Na koniec, jeśli pożądane próbki zostały pomyślnie wycięte, kliknij przycisk prezentacji etapu i zdejmij kapturek LCM, aby rozpocząć procedurę ekstrakcji molekularnej do dalszych analiz. W tym reprezentatywnym eksperymencie przekrój ludzkiej tkanki piersi utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie poddano barwieniu immunocytochemicznemu na cytokeratynę AE1 oraz AE3 zgodnie ze standardowym protokołem immunohistochemii.Ponieważ tkanka ta nie może zostać przykryta szkiełkiem podstawowym w celu mikrodysekcji, wizualna ocena komórek barwionych immunohistochemicznie może być utrudniona. Aby zatem zapewnić lepsze dopasowanie współczynnika załamania światła i poprawić jakość obrazu, do skrawka tkanki dodano ksyleny, tworząc pseudo-szkiełko przykrywowe. Następnie wykonano obraz JPEG obszaru z pseudo-szkiełkiem przykrywowym i zaimportowano go do programu SIVQ w celu analizy algorytmicznej.Użytkownik wybrał cechę obrazu predykatowego w postaci ciemnobrązowego barwienia DAB, a następnie uruchomiono algorytm SIVQ w celu analizy obrazu. Mapa ciepła SIVQ została następnie przekształcona w czerwoną farbę rozpoznawaną przez oprogramowanie do automatycznej selekcji, po czym pozostawiono ksyleny do odparowania. Następnie mapa ciepła SIVQ została zaimportowana do oprogramowania do automatycznej selekcji.Na koniec zaznaczone komórki wycięto za pomocą lasera podczerwonego. Następnie nasadkę LCM przeniesiono do stacji kontroli jakości urządzenia do mikrodysekcji i poddano ocenie wizualnej w celu zweryfikowania sukcesu wycięcia. Przeanalizowano również pozostałą tkankę, a następnie ponownie zaimportowano mapę ciepła SIVQ.Aby dodatkowo potwierdzić wydajność mikrodysekcji, po opanowaniu techniki S-I-V-Q-L-C-M można ją przeprowadzić w ciągu kilku minut na jeden preparat, co pozwala na szybkie uzyskanie wzbogaconego materiału wejściowego dla różnych analitycznych technik następczych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wdrożyć S-I-V-Q-L-C-M do swojego procesu mikrodysekcji.

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj prezentujemy protokół do budowy szybkiego spektrometru Brillouina. Kaskadowe wirtualnie obrazowane etalony z matrycą fazową (VIPA) osiągają prędkość pomiaru ponad 1000 razy większą niż tradycyjne skaningowe spektrometry Fabry'ego-Perota. To ulepszenie zapewnia środki do analizy tkanek i biomateriałów metodą Brillouin przy niskich poziomach mocy in vivo.

Szybki spektrometr sub-GHz do analizy rozpraszania Brillouina

Ten artykuł zawiera szczegółowy przewodnik po montażu i obsłudze mikroskopu z oświetleniem strukturalnym działającym z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencyjnym (TIRF-SIM) do obrazowania dynamicznych procesów biologicznych z optyczną superrozdzielczością w wielu kolorach.

Przewodnik po oświetleniu strukturalnym Mikroskopia TIRF z dużą prędkością i wieloma kolorami

Widma rentgenowskie dostarczają wielu informacji na temat plazmy o wysokiej temperaturze. Niniejszy manuskrypt przedstawia działanie spektrometru rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości falowej, obrazującego przestrzennie, służącego do oglądania jonów wodoropodobnych i helopodobnych pierwiastków o średniej liczbie atomowej w plazmie tokamakowej.

Zastosowanie spektroskopii krystalicznej do obrazowania rentgenowskiego jako diagnostyki plazmy wysokotemperaturowej

Określenie struktury roztworu białka za pomocą rozpraszania promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem (SAXS) wymaga próbek monodyspersyjnych. W tym miejscu przedstawiamy dwie możliwości zapewnienia minimalnych opóźnień między przygotowaniem próbki a akwizycją danych: chromatografia wykluczania wielkości online (SEC) i chromatografia jonowymienna online (IEC).

Wykluczenie według wielkości i chromatografia jonowymienna online na linii badawczej SAXS

Opisano szczegóły generowania i optymalizacji sygnału, pomiaru, akwizycji danych i obsługi danych dla femtosekundowego, czasowo rozdzielczego, stymulowanego spektrometrem Ramana w bliskiej podczerwieni. Jako reprezentatywne zastosowanie pokazano badanie Ramana stymulowane bliską podczerwienią dynamiki stanu wzbudzonego β-karotenu w toluenie.

Ultraszybkie, czasowo-rozdzielcze, stymulowane bliską podczerwienią pomiary ramanowskie funkcjonalnych układów π-sprzężonych

Przedstawiamy ogólny zarys metod mikroanalizy ilościowej do szacowania zajętości zanieczyszczeń i ich stanów chemicznych, wykorzystując zjawiska kanalizacji elektronów w warunkach padającego kołysania wiązką elektronów, które niezawodnie wydobywają informacje o gatunkach mniejszościowych, pierwiastkach lekkich, wolnych miejscach tlenu i innych defektach punktowych/liniowych/płaskich.

Ilościowa analiza miejsc atomowych funkcjonalnych domieszek/defektów punktowych w materiałach krystalicznych za pomocą mikroanalizy wzmocnionej kanałem elektronowym

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Spektrometria ruchliwości jonów (IMS) jest interesującym uzupełnieniem spektrometrii mas do charakterystyki biomolekuł, szczególnie dlatego, że jest wrażliwa na izomerię. Protokół ten opisuje tandemowy eksperyment IMS (IMS/IMS), który pozwala na izolację cząsteczki i wygenerowanie profili ruchliwości jej fragmentów.

Wykorzystanie spektrometru cyklicznej ruchliwości jonów do eksperymentów z ruchliwością jonów w tandemie

Ten artykuł bezpośrednio porównuje rozdzielczość, czułość i kontrasty obrazowania stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) i spójnego rozpraszania anty-Stokesa Ramana (CARS) zintegrowanych w tej samej platformie mikroskopowej. Wyniki pokazują, że CARS ma lepszą rozdzielczość przestrzenną, SRS daje lepsze kontrasty i rozdzielczość spektralną, a obie metody mają podobną czułość.

Bezpośrednie porównanie hiperspektralnie stymulowanego rozpraszania Ramana i koherentnej mikroskopii rozpraszania Ramana antystokesa do obrazowania chemicznego

Tutaj używamy stabilizatora polimerowego do przygotowania zawiesin struktur metaloorganicznych (MOF), które wykazują znacznie zmniejszone rozproszenie w swoich widmach absorpcji w stanie podstawowym i przejściowym. W przypadku tych zawieszeń MOF, protokół zawiera różne wytyczne do spektroskopowego charakteryzowania MOF w celu uzyskania danych możliwych do interpretacji.

Przewodnik techniczny dotyczący wykonywania pomiarów spektroskopowych na strukturach metaloorganicznych

Poznaj technikę SIVQ-LCM do mikrodissekcji laserowej tkanek na urządzeniu ArcturusXT. Ta metoda łączy analizę obrazu SIVQ z LCM, umożliwiając szybką i precyzyjną izolację komórek do analizy molekularnej.

Protokół SIVQ-LCM dla instrumentu ArcturusXT

Przeglądaj więcej filmów