Protokół SIVQ-LCM dla instrumentu ArcturusXT
23 lipca 2014
SIVQ-LCM to innowacyjne podejście, które wykorzystuje algorytm komputerowy, Przestrzennie Niezmienniczą Kwantyzację Wektorową (SIVQ), do sterowania procesem mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM). Przepływ pracy SIVQ-LCM znacznie poprawia szybkość i dokładność mikrodysekcji, dzięki czemu ma zastosowanie zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie niezmienniczej przestrzennie, kwantyzacji wektorowej lub analizy obrazu SIVQ w połączeniu z laserowym przechwytywaniem MICRODISSECTION lub LCM w celu zidentyfikowania interesujących cech tkanki i szybkiego przeprowadzenia ukierunkowanej mikrodysekcji. W tym celu należy najpierw wykonać obrazy tkanki docelowej dla SIVQ. Następnie przeprowadzana jest analiza SIVQ, a adnotacja SIVQ jest importowana do urządzenia do mikrodysekcji w celu przetworzenia.
Ostatecznie interesujące komórki można wyizolować za pomocą S-I-V-Q-L-C-M w celu dalszej analizy molekularnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że S-I-V-Q-L-C-M usprawnia proces selekcji i mikropreparowania dużych obszarów docelowych, które w przeciwnym razie byłyby trudne i czasochłonne przy użyciu tradycyjnych technik mikropreparacji laserowej. Procedurę zademonstruje dr Avi Rosenberg, pracownik kliniczny w naszym laboratorium, aby zobrazować interesujące próbki tkanek.
Najpierw załaduj szkiełka na zmotoryzowany stolik przyrządu do mikrodysekcji i uruchom odpowiednie oprogramowanie. Następnie zaznacz odpowiednie pola wyboru, aby wyznaczyć pozycje załadowanych slajdów i upewnij się, że przechwycone pliki obrazów zostaną zapisane w formacie JPEG. Dostosuj jasność i ostrość obrazu na ekranie, aby zoptymalizować jakość obrazu.
Następnie, korzystając z przybornika do inspekcji, obróć dyfuzor i ustaw jasność lampy na 60 i wzmocnienie kamery na dwa 20. W oknie przeglądu kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać, zapamiętać ustawienia i zapisać. Przechwyć miniaturowy obraz przeglądowy slajdu, aby zapewnić mapę drogową procesu sekcji.
Dostosuj powiększenie i znajdź obszar zainteresowania. Następnie uchwyć obraz obszaru w celu analizy algorytmicznej przechwyconych obrazów. Zacznij od przeniesienia obrazów do folderu SIVQ.
Następnie otwórz SIVQ i załaduj przechwycony obraz, który Cię interesuje. Przejdź do obszaru zainteresowania i dostosuj rozmiar okien wyświetlania w pięciu i sześciu oknach ekranu bez dostosowywania powiększenia obrazu. Następnie wybierz rozmiar wektora pierścienia i liczbę pierścieni, które mają być używane do analizy.
Kliknij prawym przyciskiem myszy funkcję obrazu predykatu, która ma zostać przechwycona w oknie rzutni szóstej, wybierz mapę cieplną, a następnie kliknij przycisk Skanuj do X, aby przeanalizować obraz. Następnie użyj górnego z dwóch poziomych prętów przesuwnych, aby dostosować ogólną specyficzność wektora. Użyj dolnego paska, aby zwiększyć czułość po wykonaniu skóry.
Aby zwiększyć obszar sklasyfikowany jako pasujący, odznacz pole radiowe mapy cieplnej, aby upewnić się, że mapa cieplna SIVQ została zmieniona na jednolity czerwony kolor i zwiększyć rozmiar farby. Zapisz obraz, klikając przycisk Zapisz obraz. Następnie przekonwertuj dane wyjściowe BMP na format pliku JPEG.
Następnie użyj edytora szesnastkowego, aby ponownie wprowadzić współrzędne pozycyjne znalezione między początkiem znacznika obrazu a pierwszym zdefiniowanym znacznikiem tabeli kwantyzacji do nagłówka pliku JPEG po analizie z oryginalnego obrazu instrumentu do preparacji przed rozpoczęciem mikrosekcji. Umieść nasadkę MICRODISSECTION lub LCM do przechwytywania laserowego w środku obszaru zainteresowania, w którym obrazy zostały przechwycone do analizy SIVQ. Następnie, po kalibracji laserów UV i podczerwieni, zoptymalizuj parametry, w tym czas trwania mocy, lokalizacje lasera i prędkość cięcia UV.
Następnie otwórz oprogramowanie do automatycznego wyboru i zaimportuj analizowany obraz. Utwórz nowy plik analizy, aby przeszkolić oprogramowanie do automatycznego wyboru w rozpoznawaniu adnotacji SIVQ. Teraz wybierz obszary tła, które są oznaczone niebieskimi kwadratami analizowanego obrazu SIVQ.
Następnie wybierz obszary zainteresowania lub R OIS oznaczone czerwonymi kółkami i kliknij przycisk dowiedz się, aby wygenerować plik treningowy. Skopiuj zaznaczone obszary do obrazu na żywo. Aby rozpocząć mikrodysekcję, wybierz zestaw narzędzi do mikrodysekcji i wybierz odpowiednie przyciski przechwytywania w podczerwieni lub cięcia UV.
Po zakończeniu sekcji przenieś nasadkę LCM do stacji kontroli jakości i zrób zdjęcie wypreparowanej próbki. Na koniec, jeśli żądane próbki zostały pomyślnie wypreparowane, kliknij przycisk obecnego etapu i zdejmij nasadkę LCM, aby rozpocząć procedurę ekstrakcji molekularnej do dalszej analizy. W tym reprezentatywnym eksperymencie wycinek tkanki ludzkiej piersi zatopiony w parafinie utrwalonej w formalinie był barwnikiem immunologicznym dla cytokeratyny AE jeden, AE 3 przy użyciu standardowego protokołu immunohistochemicznego.
Ponieważ tkanki tej nie można przykryć w celu mikrodysekcji, immunohistochemiczne wybarwione komórki mogą być trudne do wizualnego docenienia. W związku z tym, aby zapewnić lepsze dopasowanie indeksu i lepszy obraz, ksyleny zostały dodane do sekcji tkanki, aby utworzyć pseudo szkiełko nakrywkowe. Następnie przechwycono obraz JPEG obszaru poślizgu pseudo okładki i zaimportowano go do SIVQ w celu analizy algorytmu.
Użytkownik wybrał cechę obrazu predykatu zaobserwowaną jako ciemnobrązowa plama DAB i zainicjowano algorytm SIVQ do analizy obrazu. Mapa cieplna SIVQ została następnie przekształcona w czerwoną farbę, która jest rozpoznawana przez oprogramowanie do automatycznego doboru, a ksyleny pozwolono im odparować. Mapa cieplna SIVQ została następnie zaimportowana do oprogramowania do automatycznego doboru.
Na koniec podświetlone komórki zostały wypreparowane za pomocą lasera na podczerwień. Nasadka LCM została następnie przeniesiona do stacji kontroli jakości przyrządu do mikrodysekcji i poddana kontroli wizualnej w celu oceny powodzenia sekcji. Pozostała tkanka została również sprawdzona, a mapa cieplna SIVQ została ponownie zaimportowana.
Aby jeszcze bardziej potwierdzić skuteczność mikrodysekcji, po opanowaniu S-I-V-Q-L-C-M można szybko wykonać w ciągu kilku minut na szkiełko, zapewniając wzbogacone dane wejściowe dla różnych dalszych technik analitycznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wdrożyć S-I-V-Q-L-C-M do swojego przepływu pracy w zakresie mikrodysekcji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
SIVQ-LCM to nowatorska technika integrująca przestrzennie niezmienną kwantyzację wektorową (SIVQ) z mikrodysekcją laserową (LCM) w celu zwiększenia wydajności mikrodysekcji tkanek. Metoda ta umożliwia szybką i precyzyjną izolację komórek do analizy molekularnej, co czyni ją wartościową zarówno w zastosowaniach badawczych, jak i klinicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Techniki mikrodyssekcji
Wstęp
- Analiza obrazów SIVQ usprawnia identyfikację cech tkanki.
- Tradycyjne metody LCM mogą być czasochłonne i wymagające.
- Połączenie SIVQ z LCM usprawnia proces mikrodysekcji.
- Technika ta ma zastosowanie w różnych ustawieniach naukowych i klinicznych.
Cel badania
- Wykorzystanie SIVQ w celu usprawnienia mikrodysekcji tkanek.
- Zwiększenie szybkości i dokładności izolacji wybranych komórek.
- Ułatwienie późniejszych analiz molekularnych wysekcjonowanych komórek.
Zastosowane metody
- Przechwytywanie obrazów tkanki docelowej do analizy SIVQ.
- Importowanie adnotacji SIVQ do urządzenia do mikrosekcji.
- Kierowana mikrosekcja zidentyfikowanych cech tkanki.
- Izolacja komórek do dalszych badań molekularnych.
Główne wyniki
- SIVQ-LCM znacząco skraca czas wymagany do przeprowadzenia mikrosekcji.
- Poprawiona dokładność w wyborze dużych obszarów docelowych.
- Ułatwia efektywną izolację komórek do analizy.
- Zademonstrowane przez dr. Avi Rosenberga w warunkach laboratoryjnych.
Wnioski
- SIVQ-LCM stanowi znaczący postęp w technikach mikrodysekcji.
- Metoda ta zwiększa zarówno możliwości badawcze, jak i zastosowania kliniczne.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zakres jej wykorzystania w różnych dziedzinach badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Przełożenie na praktykę przemysłową
SIVQ-LCM integruje zaawansowaną analizę obrazu z zautomatyzowaną mikrodysekcją laserową, umożliwiając szybką, powtarzalną i wysokoprzepustową izolację specyficznych populacji komórek z tkanek złożonych. Możliwość ta eliminuje kluczowe wąskie gardła w przygotowaniu próbek do profilowania molekularnego, wspierając rzetelną walidację celów oraz późniejsze odkrywanie biomarkerów. Automatyzacja i precyzja platformy zwiększają pewność prognostyczną oraz efektywność operacyjną w procesach badawczych i translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną izolację komórek zdefiniowanych fenotypowo w celu ich charakterystyki molekularnej.
- Zmniejsza zmienność zależną od użytkownika, wspierając powtarzalne badania walidacji celu.
- Przyspiesza analizę heterogeniczności tkanek oraz zaangażowania szlaków sygnałowych w oparciu o postawione hipotezy.
Przesiewy i opracowanie testu
- Zapewnia zestandaryzowane, opisane próbki tkanek do opracowywania i optymalizacji testów.
- Umożliwia powtarzalny dobór próbek wejściowych dla ilościowych analiz typu downstream.
- Wspiera skalowalną preparatykę zwalidowanego materiału biologicznego dla procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia wzbogacanie populacji komórek istotnych dla choroby na potrzeby translacyjnych badań nad biomarkerami.
- Zapewnia ciągłość procesu od analizy tkanki do przedklinicznej walidacji molekularnej.
- Wspiera optymalizację ryzyka poprzez poprawę jakości próbek i niezawodności danych.
Integracja potoku i przepływu pracy
SIVQ-LCM znajduje się na styku obrazowania tkanek, adnotacji cech i zautomatyzowanej mikrosekcji, łącząc wczesne etapy odkryć z procesami badawczymi w obszarze medycyny translacyjnej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie ukierunkowanej izolacji komórek.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, opisanych próbek gotowych do analizy ilościowej i testów assay.
- Analityka: Zapewnia wysokiej jakości materiał wejściowy do profilowania molekularnego i badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Wspiera odkrywanie i walidację biomarkerów poprzez izolację klinicznie istotnych typów komórek.
- Zastosowania instytucjonalne: Oferuje konfigurowalną i skalowalną platformę, którą można dostosować do różnych typów tkanek i potrzeb badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach opartych na tkankach.
- Wartość operacyjna: Usprawnia przygotowanie próbek dzięki automatyzacji, standaryzacji i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez zwiększenie niezawodności danych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój programów odkrywczych i translacyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie patologii cyfrowej, analizy obrazu oraz obsługi aparatury do mikrodysekcji laserowej.
- Wymaga zaawansowanej infrastruktury obrazowej oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego do adnotacji SIVQ.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów obsługi próbek i adnotacji między zespołami.
- Metoda jest dostosowalna zarówno do tkanek zwierzęcych, jak i ludzkich, jednak może wymagać optymalizacji protokołu dla konkretnych typów próbek.
- Optymalna wydajność jest zależna od jakości przygotowania tkanek i obrazowania.
