Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja organizmów Gram-ujemnych bezpośrednio z bulionu z posiewów krwi przy użyciu technologii Maloffa, w tym celu pięć mililitrów dodatniego bulionu z posiewu krwi przenosi się do probówki separującej surowicę i odwirowuje. Po wirowaniu bakterie zawierające warstwę płynu są przenoszone do mikroprobówki wirówkowej, a następnie odwirowywane z niską prędkością. Supernatant jest następnie przenoszony do nowej mikroprobówki wirówkowej i odwirowywany z dużą prędkością.

Powstały osad jest ponownie zawieszany w kwasie mrówkowym i analizowany przez maldi w celu zidentyfikowania obecnych gatunków bakterii. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjna hodowla, jest wcześniejsza identyfikacja bakterii Gram-ujemnych. Implikacje tej techniki rozciągają się na mikrobiologię kliniczną, ponieważ rozpoznanie bakteriemii wpływa na wybór środka przeciwdrobnoustrojowego przepisanego przez lekarza.

Tę procedurę zademonstruje Leonardo Bascu, który jest jednym z techników w naszym dziale, który regularnie wykonuje tę procedurę. Butelki z tlenowymi lub beztlenowymi posiewami krwi pobrane według uznania personelu klinicznego, zwykle w przypadku choroby przebiegającej z gorączką, są inkubowane w zautomatyzowanych maszynach, które stale monitorują rozwój bakterii. Gdy pojawią się dowody na wzrost w butelce z posiewem krwi, maszyna zidentyfikuje sygnalizowaną butelkę.

Procedurę tę należy rozpocząć od wyjęcia z inkubatora butelki z sygnalizowanym posiewem krwi. Umieść go w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Przygotuj barwienie metodą Grama z sygnalizowanego bulionu z hodowli krwi zgodnie z lokalnymi protokołami instytucjonalnymi i zbadaj je pod mikroskopem, jeśli zidentyfikowano organizmy Gram-ujemne.

Przetwarzaj bulion kulturowy zgodnie z metodą opisaną tutaj. W przypadku zidentyfikowania organizmów Gram-dodatnich można zastosować alternatywną szybką metodę molekularną. Odwróć butelkę z kulturą krwi dwa do trzech razy, aby wymieszać.

Następnie w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Podłącz 10-mililitrową strzykawkę do bezpiecznego urządzenia do transferu krwi. Podłącz urządzenie do przenoszenia krwi do butelki z posiewem krwi i pobrać pięć mililitrów bulionu do transferu strzykawki.

Zasysany bulion z hodowli krwi odwirować do probówki separującej surowicę w ilości 1 250 razy G przez 15 minut w celu usunięcia czerwonych krwinek. Po wirowaniu posiew krwi z butelek tlenowych wykazuje wyraźne oddzielenie czerwonych krwinek od dna probówki, przy czym interfejs płynu żelowego pojawia się jako nieprzezroczysty biały kolor. W przeciwieństwie do tego, posiew krwi z litycznego beztlenowego posiewu krwi pojawia się jako głęboki czerwony kolor na granicy faz płynu żelowego.

Ponieważ zlizowane składniki krwinek czerwonych pozostają zawieszone w supernatancie dla dowolnego typu aspiratu i wyrzuć supernatant za pomocą sterylnej pipety do przenoszenia, uważając, aby pozostawić około jednego mililitra kożucha bezpośrednio nad granicą faz płynu żelowego. Następnie, za pomocą sterylnej pipety, delikatnie wymieszaj ostatni mililitr płynu w kożuchie powyżej granicy faz żelu, a następnie przenieś całą objętość do mikroprobówki wirówkowej. Wiruj nową probówkę z prędkością 288 razy G przez 30 sekund za pomocą plastikowej jednorazowej pipety transferowej o pojemności jednego mililitra.

Przenieść supernatant do nowej probówki z mikrowirówką i wyrzucić probówkę z osadem. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby uniknąć przenoszenia granulki. Jest to szczególnie ważne w próbkach beztlenowych posiewów krwi, ponieważ supinat pozostaje pigmentowany, a osad nie zawsze jest wyraźnie widoczny.

Odwirować próbkę w temperaturze 18 407 razy G przez jedną minutę, a następnie za pomocą pipety do przenoszenia z cienką końcówką, nasycić i wyrzucić supernatant, aby pozostawić jak najmniej pozostałości cieczy bez naruszania osadu. Dodaj jeden mililitr sterylnego DNA i wody wolnej od RNA i pipetuj w górę iw dół, aby ponownie zawiesić pozostałą wirówkę do peletów. Roztwór zawieszony w stężeniu 18 407 razy G przez jedną minutę.

Po odwirowaniu należy użyć pipety z cienką końcówką, aby odessać i wyrzucić supernatant. Ponownie, uważając, aby usunąć jak najwięcej płynu. Zawiesić osad w 10 mikrolitrach 70% kwasu mrówkowego.

W przypadku dużych granulek może być konieczne zwiększenie objętości kwasu mrówkowego o 50 do 100%Używając dobrze wymieszać pipetę, aby zapewnić jednorodny roztwór, w razie potrzeby użyj końcówki pipety, aby fizycznie rozbić osad. Otrzymany roztwór zawiera skoncentrowane bakterie wyizolowane z bulionu z hodowli krwi, który jest stosunkowo wolny od komórek ludzkich i hodowli krwi Żywice w butelkach Za pomocą pipety zaszczepić, czystą płytkę docelową maldi TOF z dwoma mikrolitrami przygotowanej zawiesiny na miejsce docelowe. Przygotuj trzy lokalizacje docelowe dla każdej próbki, aby przezwyciężyć sporadyczny problem nieudanych odczytów.

Umieść płytkę na krawędzi dygestoria, aby zmaksymalizować przepływ powietrza przez nią, tak aby szybko wyschła, pokryj każde wysuszone miejsce jednym mikrolitrem roztworu matrycowego. Poczekaj, aż maldi do wyschnięcia na płycie celowniczej na krawędzi dygestorium. Tak jak poprzednio, upewnij się, że jednorodny preparat wypełnia każde z docelowych miejsc na płytce.

Włóż płytkę docelową do spektrometru masowego Maloffa. Upewnij się, że płyta jest równo z płytami sprężynowymi. Nie wkładaj płytki celowniczej, dopóki wszystkie miejsca docelowe nie wyschną.

Sprawdź gumową uszczelkę, aby upewnić się, że jest wolna od kłaczków, kurzu i włosów. Pozwoli to na wytworzenie wymaganych warunków próżni. Następnie zamknij pokrywę sceny maloff, a następnie naciśnij przycisk in-out z przodu instrumentu.

Pokrywa zablokuje się i powstanie próżnia. Otwórz oprogramowanie maldi typ i flex control w oprogramowaniu typ. Z menu rozwijanego zatytułowanego plik wybierz pozycję Nowa klasyfikacja, nazwij projekt, a następnie wybierz pozycję nowy.

Wybierz pozycję Dalej. Aby zakończyć konfigurację w oknie oprogramowania do sterowania elastycznością, zidentyfikuj grafikę na ekranie płyty celowniczej, przytrzymując wciśnięty lewy przycisk myszy. Najedź myszką na zaszczepione miejsca i zaznacz miejsca docelowe, które są używane.

Użyj prawego przycisku myszy, aby kliknąć w dowolnym miejscu na wybranych pozycjach docelowych, a następnie wybierz dodaj anality z menu rozwijanego. Dla każdego z miejsc docelowych dodaj szczegóły identyfikacyjne posiewu krwi do kolumny ID i kliknij przycisk Dalej. Po zakończeniu wybierz bazę danych widm taksonomii komercyjnej i wybierz następne laboratoria, które mogą korzystać z dodatkowych wewnętrznych lub komercyjnych baz danych w celu zwiększenia liczby widm referencyjnych, kliknij przycisk Zakończ, a MALDI TOF MS rozpocznie generowanie widm.

Czasami wyższe wyniki maldi do można osiągnąć, wykorzystując ręczną akwizycję maldi do widm w oprogramowaniu do sterowania flexem. Po uzyskaniu widm i zakończeniu analizy w oprogramowaniu do stereotypizacji wybierz przycisk plusa obok identyfikacji gatunku. Aby rozwinąć listę identyfikacyjną dla każdego celu, przeanalizuj pięć pierwszych identyfikacji, zwracając uwagę, czy pięć pierwszych jest podobnych.

Jeśli pięć pierwszych gatunków jest niezgodnych z wynikami większymi lub równymi 1,7 dla tego samego miejsca docelowego, może być obecna mieszanka gatunków. Należy pamiętać, że technologia OV ma słabą czułość wykrywania gatunków mieszanych. Gdy wynik większy lub równy 2,0 zostanie odnotowany dla najwyższego dopasowania w miejscu docelowym, należy podać gatunek, w którym najwyższy wynik w miejscu docelowym jest większy lub równy 1,7, ale mniejszy niż 2,0, zgłaszając gen.

Tylko wtedy, gdy dodatkowe kryteria pięciu najważniejszych identyfikacji są zgodne, należy zgłosić się na poziomie gatunku. Gdy wszystkie widma są kompletne, naciśnij przycisk wjazdu-wyjścia na MALDI, aby obrabiać, otwórz gniazdo płytki docelowej i wyjmij płytkę. Jeśli używasz płytki docelowej maldi TOF wielokrotnego użytku, użyj alkoholu do oczyszczenia wszystkich miejsc docelowych i przechowuj maldi na płytce w temperaturze pokojowej, gdy jest czysty i suchy, aby zidentyfikować bakterie Gram-ujemne z bulionu z hodowli krwi, zastosowano cykle wirowania w celu zagęszczenia i wyizolowania bakterii, które następnie przeanalizowano za pomocą spektroskopii mas MALDI TOF.

Jak opisano w tym artykule wideo, pokazane tutaj są widma wygenerowane przez MALDI TOF MS dla eureka coli z wynikiem logarytmicznym 1,86. Jeden po prawej stronie to pierwsze pięć dopasowań zidentyfikowanych przez oprogramowanie do pisania. Należy zauważyć, że gatunek ten jest konsekwentnie zgłaszany jako re coli z wynikiem 1,861.

Ponieważ pięć pierwszych dopasowań to E coli, identyfikacja jest uważana za wiarygodną na poziomie gatunku. Widma generowane przez MALDI do MS dla Pseudomonas aerogen są pokazane tutaj. Wynik logarytmiczny wynosi 2,216 po prawej stronie, to pierwsze pięć dopasowań zidentyfikowanych przez oprogramowanie do pisania.

Należy zauważyć, że gatunek ten jest konsekwentnie opisywany jako Pseudomonas aerogen z wysokim wynikiem 2,216. Identyfikacja jest uważana za wiarygodną na poziomie gatunku. Widma wygenerowane przez MALDI do MS dla mieszanego bulionu z kultur krwi zawierającego esia coli i SIO marsen, pokazano tutaj po prawej stronie, są pierwsze pięć dopasowań przez oprogramowanie do pisania, które zgłasza zarówno Reiki coli, jak i SIO marsan.

W pierwszej piątce dopasowane widma. Ten mieszany gen jest identyfikowany tylko w około jednej trzeciej mieszanych kultur bulionowych. Poniższa tabela podsumowuje wcześniej opublikowane wyniki badania weryfikacyjnego tej metody, w którym 91,8% bulionów monomikrobiologicznych osiągnęło maldi do wyniku poniżej 1,7 przy 100% i 97% zgodności odpowiednio z geniuszem i gatunkiem.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak przygotować butelkę do hodowli krwi sygnałowej do identyfikacji za pomocą maldi toff. Postępując zgodnie z tą metodą, możemy użyć tego samego osadu przygotowanego do identyfikacji bakterii, aby przygotować bardziej ustandaryzowaną lornetkę do automatycznego badania wrażliwości. Na przykład technika ta pozwala laboratoriom na wczesne diagnozowanie lekarzy, co może mieć wpływ na leczenie.

Nie zapominaj, że praca z butelkami do hodowli krwi może być niebezpieczna, a środki ostrożności, w tym szafka bezpieczeństwa biologicznego, powinny być zawsze używane podczas manipulowania butelkami do hodowli krwi.