Name: Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: Poznaj szybką identyfikację bakterii Gram-ujemnych z bulionu posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF. Ta metoda umożliwia wcześniejsze rozpoznanie gatunku z 97% zgodnością, wspierając szybsze decyzje terapeutyczne w mikrobiologii klinicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Buliony z hodowli krwi oznaczone jako "pozytywne"
<ol>
	<li>Wyjąć butelkę z sygnalizowanym posiewem krwi z komory inkubacji do ciągłego monitorowania i umieścić ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Uwaga: Butelki mogą zawierać niebezpieczne mikroorganizmy i należy przestrzegać uniwersalnych środków ostrożności. Ze względu na ryzyko wystąpienia zakaźnych aerozoli podczas pobierania próbek, wszystkie procedury pobierania próbek muszą być wykonywane w komorze z przepływem laminarnym klasy bezpieczeństwa biologicznego II.</li>
</ol>
2. Gram Staina jest przygotowana
<ol>
	<li>Przygotuj barwnik Grama z sygnalizowanego bulionu z hodowli krwi zgodnie z lokalnymi protokołami instytucjonalnymi. Uwaga: Po zidentyfikowaniu organizmów Gram-ujemnych pod mikroskopem bulion z posiewów krwi jest przetwarzany zgodnie z następującą metodą. Po zidentyfikowaniu organizmów Gram-dodatnich do bulionu stosuje się alternatywną metodę molekularną ukierunkowaną na identyfikację genetyczną i markery oporności (nieomówione w tym artykule)13.</li>
</ol>
3. Przeniesienie oznaczonego bulionu z posiewu krwi do probówki separującej surowicę
<ol>
	<li>Delikatnie wymieszaj butelkę z kulturą krwi, odwracając 2-3 razy.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy podłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml do bezpiecznego urządzenia do transferu krwi.</li>
	<li>Podłączyć urządzenie do pobierania krwi do butelki z posiewem krwi i pobrać 5 ml bulionu do strzykawki. Przenieś zasysany bulion BC do probówki separującej surowicę.</li>
</ol>
4. Stężenie bulionu z kultur krwi
<ol>
	<li>Odwirować probówkę separacyjną surowicy o stężeniu 1 250 x g przez 15 minut, co powoduje usunięcie dużej ilości czerwonych krwinek.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić supernatant za pomocą sterylnej pipety do przenoszenia, uważając, aby pozostawić około 1 ml kożucha bezpośrednio nad powierzchnią fazową żel/płyn. Uwaga: Butelki tlenowe wykazują wyraźne oddzielenie czerwonych krwinek do dna probówki, a interfejs żel/płyn ma nieprzezroczysty biały kolor. W przeciwieństwie do tego, po nałożeniu na lityczny beztlenowy bulion z posiewów krwi, interfejs żel/płyn wydaje się mieć głęboki czerwony kolor ze względu na lizowane składniki czerwonych krwinek pozostające zawieszone w supernatancie.</li>
</ol>
5. Powtórz kroki mycia wirowania
<ol>
	<li>Delikatnie wymieszaj sterylną pipetą ostatni 1 ml płynu z kożuchem nad powierzchnią fazową żelu, a następnie przenieś całą objętość do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odwirować nową probówkę o sile 288 x g przez 30 sekund.</li>
	<li>Przenieść supernatant za pomocą plastikowej jednorazowej pipety transferowej o pojemności 1 ml do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wyrzucić probówkę z osadem. Uwaga: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby zachować ostrożność, aby uniknąć przeniesienia granulatu. Jest to szczególnie ważne w przypadku próbki przetwarzanej z beztlenowej butelki BC, ponieważ supernatant pozostaje pigmentowany, a osad nie zawsze jest wyraźnie widoczny</li>.
</ol>
6. Liza komórek resztkowych
<ol>
	<li>Odwirować próbkę o stężeniu 18,407 x g przez 1 minutę, a następnie odessać (i wyrzucić) supernatant za pomocą pipety transferowej z cienką końcówką, aby pozostawić jak najmniej pozostałości cieczy bez naruszania osadu.</li>
	<li>Zawiesić pozostały osad w 1 ml sterylnej wody wolnej od DNAzy i RNAzy, pipetując w górę i w dół. Uwaga: Niektórzy autorzy opisywali stosowanie roztworów alkoholu zamiast sterylnej wody w celu ponownego zawieszenia granulki, co sprawia, że bakterie stają się niezdolne do życia.</li>
	<li>Odwirować roztwór zawieszony o stężeniu 18,407 x g przez 1 min.</li>
</ol>
7. Ekstrakcja białek bakteryjnych
<ol>
	<li>Odessać i wyrzucić supernatant, ponownie używając pipety z cienką końcówką, upewniając się, że usunięto jak najwięcej płynu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 10 μl kwasu mrówkowego (70% v/v). Uwaga: Kwas mrówkowy może wpływać na organizm, jeśli jest wdychany lub ma kontakt ze skórą. Podczas przygotowywania roztworów lub manipulowania nimi zaleca się, aby personel oprócz środków ochrony osobistej korzystał z dygestoria.</li>
	<li>Dobrze wymieszać za pomocą pipety, aby uzyskać jednorodny roztwór do ponownego zawieszenia. Użycie końcówki pipety do fizycznego rozbicia osadu może być konieczne, aby zapewnić bardziej jednorodny roztwór.</li>
</ol>
8. Przygotowanie tarczy celowniczej MALDI-TOF
<ol>
	<li>Zaszczepić czystą płytkę tarczową MALDI-TOF 2 μl przygotowanej zawiesiny na punkt docelowy. Przygotuj 3 lokalizacje docelowe dla każdej próbki, aby przezwyciężyć sporadyczny problem nieudanych odczytów.</li>
	<li>Pozostaw tarczę celowniczą MALDI-TOF do wyschnięcia. Szybkość suszenia można zwiększyć, umieszczając płytę na krawędzi dygestoria, aby zmaksymalizować przepływ powietrza przez płytę.</li>
	<li>Każde wysuszone miejsce pokryć 1 μl roztworu matrycowego (10 mg/ml kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego (HCCA), 50% acetonitrylu, 2,5% kwasu trifluorooctowego). Uwaga: Roztwór Matrix może wpływać na organizm w przypadku jego wdychania lub kontaktu ze skórą. Podczas przygotowywania roztworów lub manipulowania nimi zaleca się, aby personel oprócz środków ochrony osobistej korzystał z dygestoria.</li>
	<li>Poczekaj, aż tarcza celownicza MALDI-TOF wyschnie na krawędzi dygestoria, jak opisano powyżej. Upewnij się, że jednorodny preparat wypełnia każde z docelowych miejsc na płytce.</li>
</ol>
9. Umieść tabliczkę docelową MALDI-TOF w spektrometrze mas
<ol>
	<li>Włóż płytkę celowniczą MALDI-TOF do spektrometru mas MALDI-TOF. Upewnij się, że płyta jest osadzona równo z płytami sprężynowymi. Uwaga: nie wkładaj tarczy celowniczej, dopóki wszystkie punkty docelowe nie wyschną.</li>
	<li>Upewnij się, że gumowa uszczelka jest oczyszczona z kłaczków, kurzu i włosów, aby umożliwić stworzenie wymaganych warunków próżni.</li>
	<li>Zamknij MALDI-TOF stage pokrywa, a następnie naciśnij przycisk "in/out" z przodu instrumentu. Pokrywa zostanie teraz zablokowana i umożliwi wytworzenie niezbędnego podciśnienia.</li>
</ol>
10. Akwizycja widm MALDI-TOF MS
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie MALDI Biotyping and FlexControl.</li>
	<li>W oprogramowaniu do pisania wybierz "nowa klasyfikacja" z menu rozwijanego zatytułowanego "plik". Nazwij projekt, a następnie wybierz "nowy". Wybierz "Dalej", aby zakończyć konfigurację w oprogramowaniu do pisania.</li>
	<li>W oknie Control software (Oprogramowanie sterujące) zidentyfikuj grafikę na ekranie tarczy celowniczej. Podświetl miejsca docelowe MALDI-TOF, które są używane, przesuwając kursor myszy nad zaszczepionymi miejscami, przytrzymując lewy przycisk myszy.</li>
	<li>Użyj prawego przycisku myszy, aby kliknąć w dowolnym miejscu na wybrane pozycje docelowe, a następnie wybierz "dodaj anality" z menu rozwijanego.</li>
	<li>Dodaj szczegóły identyfikacyjne posiewu krwi do kolumny "ID" dla każdego z docelowych miejsc i kliknij "dalej" po zakończeniu.</li>
	<li>Wybierz komercyjną bazę danych widm "taksonomii" i wybierz "dalej". Uwaga: Laboratoria mogą korzystać z dodatkowych wewnętrznych lub komercyjnych baz danych w celu zwiększenia liczby widm referencyjnych.</li>
	<li>Kliknij "zakończ", a MALDI-TOF MS rozpocznie generowanie widm. Uwaga: Ustawienia MALDI-TOF były zgodne z ustawieniami producenta (liniowy tryb dodatni, częstotliwość lasera 60 Hz, napięcie przyspieszenia 20 kV, napięcie IS2 16,7 kV, opóźnienie ekstrakcji 170 nsek i zakres 2,000-20,137 m/z).</li>
	<li>Jeśli oprogramowanie MALDI Control nie wygeneruje pików, można przeprowadzić ręczną akwizycję widm (metoda nie została opisana).</li>
</ol>
11. Interpretacja wyników MALDI-TOF MS po analizie
<ol>
	<li>Po uzyskaniu widm i zakończeniu analizy wybierz przycisk "+" obok identyfikacji gatunku w oprogramowaniu do pisania, aby rozwinąć listę identyfikacji dla każdego celu.</li>
	<li>Przestudiuj 5 najpopularniejszych identyfikacji, zwracając uwagę, czy 5 najlepszych jest podobnych. Niezgodne 5 najlepszych rodzajów z wynikami ≥1,7 tego samego miejsca docelowego zwiększyło możliwość mieszanych bulionów. Uwaga: Technologia MALDI-TOF ma słabą czułość wykrywania mieszanych bulionów. Na przykład, gdy bulion zawiera gatunki mieszane, można określić wysoki wynik ufności tylko dla jednego z gatunków mieszanych.</li>
	<li>Gdy wynik ≥ 2,0 zostanie odnotowany za najwyższe dopasowanie w miejscu docelowym, należy podać gatunek.</li>
	<li>Gdy najwyższy wynik w miejscu docelowym wynosi ≥1,7, ale < 2,0, należy podać tylko rodzaje. Jeśli dodatkowe kryteria 5 najlepszych identyfikacji są zgodne, należy zgłosić się na poziomie gatunku.</li>
</ol>
12. Demontaż tarczy celowniczej MALDI-TOF
<ol>
	<li>Gdy wszystkie widma są kompletne, naciśnij przycisk "in/out" na maszynie MALDI-TOF.</li>
	<li>Otwórz pojemnik na tabliczkę celowniczą MALDI-TOF i wyjmij tabliczkę celowniczą MALDI-TOF.</li>
	<li>Jeśli używasz tarczy celowniczej MALDI-TOF wielokrotnego użytku, wyczyść wszystkie miejsca docelowe alkoholem i przechowuj płytkę MALDI-TOF w temperaturze pokojowej, gdy będzie czysta i sucha.</li>
</ol>

<ol><li>Bearman, G. M., Wenzel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteremias%3A+a+leading+cause+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Med.+Res%22%5BJournal%5D)">Bacteremias: a leading cause of death.</a> Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).</li>
<li>Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+benefit+of+appropriate+empirical+antibiotic+treatment+in+patients+with+bloodstream+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection.</a> J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+hypotension+before+initiation+of+effective+antimicrobial+therapy+is+the+critical+determinant+of+survival+in+human+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock.</a> Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).</li>
<li>Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+treatment+of+bloodstream+infection%3A+laboratory+reporting+and+antimicrobial+management%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).</li>
<li>Clerc, O., Prod'hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+on+the+Clinical+Management+of+Patients+With+Gram-negative+Bacteremia%3A+A+Prospective+Observational+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study.</a> Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).</li>
<li>Dekker, J. P., Branda, J. A. MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).</li>
<li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+revolution+in+bacteriology%3A+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).</li>
<li>Neville, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry+following+introduction+for+routine+laboratory+bacterial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).</li>
<li>Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+in+positive+blood+culture+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).</li>
<li>March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+centrifugation+protocol+and+validation+criterion+for+enhancing+mass+spectrometry+%28MALDI-TOF%29+results+in+microbial+identification+using+blood+culture+growth+bottles%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).</li>
<li>Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+bacteria+from+positive+blood+culture+bottles+by+use+of+matrix-assisted+laser+desorption-ionization+time+of+flight+mass+spectrometry+fingerprinting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).</li>
<li>Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+Gram-negative+organisms+from+blood+culture+bottles+using+a+modified+extraction+method+and+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).</li>
<li>Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+Gram-positive+pathogens+and+their+resistance+genes+from+positive+blood+culture+broth+using+a+multiplex+tandem+RT-PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay.</a> J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).</li>
<li>Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+preparatory+methods+for+detection+of+bacteremia+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).</li>
<li>Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+bacteria+from+charcoal-containing+blood+culture+bottles+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionisation+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).</li>
<li>Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+an+in-house+method+and+the+commercial+Sepsityper%E2%84%A2+kit+for+bacterial+identification+directly+from+positive+blood+culture+broths+by+matrix-assisted+laser+desorption-ionisation+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).</li>
<li>Moussaoui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry+identifies+90%25+of+bacteria+directly+from+blood+culture+vials%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials.</a> Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).</li>
<li>Novel,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((improved+sample+preparation+for+rapid%2C+direct+identification+from+positive+blood+cultures+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+%28MALDI-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry.</a> J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).</li>
<li>Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+of+Bacteria+and+Yeasts+from+Positive-Blood-Culture+Bottles+by+Using+a+Lysis-Filtration+Method+and+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrum+Analysis+with+the+SARAMIS+Database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database.</a> J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podczas stosowania MALDI-TOF MS do bulionu z posiewów krwi ważne jest, aby etapy po odwirowaniu były wykonywane z wystarczającą ostrożnością, aby nie mieszać ponownie oddzielonych składników. Szczególnie ważne jest usunięcie składników posiewów krwi i ludzkich białek komórkowych, w tym hemoglobiny, które mogą wytwarzać kolce zakłócające widma MALDI-TOF.
Chociaż producenci stwardnienia rozsianego zalecają obniżenie wyniku ≥2,0 dla gatunków i ≥1,7 dla identyfikacji rodzaju, inne raporty sugerują...

Pacjenci z infekcją krwi (BSI) spowodowaną bakteriami nadal mają wysoką śmiertelność wewnątrzszpitalną, wahającą się od 6 do 48%1. Podanie odpowiedniego antybiotyku empirycznego sprzyja przeżyciu, a w podgrupie pacjentów z ciężką sepsą każda godzina opóźnienia w odpowiedniej terapii koreluje ze zmniejszonym przeżyciem2,3. W związku z tym kluczowym celem laboratorium klinicznego jest szybkie wykrywanie, identyfikowanie i informowanie o obecności bakterii w posiewach krwi w celu podejmowania świadomych decyzji klinicznych. Wykazano, że laboratorium mikrobiologiczne ma największy wpływ na terapię przeciwdrobnoustrojową w momencie zgłaszania barwienia metodą Grama4, a ostatnio badanie obserwacyjne wykazało, że spektrometria mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF MS) wykonywana bezpośrednio na bulionach z posiewów krwi wpływa na przepisywanie w ponad jednej trzeciej BSI wywołanych przez bakterie Gram-ujemne5.
Komercyjny rozwój MALDI-TOF MS doprowadził do powstania skutecznego narzędzia laboratoryjnego do identyfikacji mikroorganizmów6,7. Technologia ta jest obecnie dobrze znana i została zintegrowana z wieloma laboratoriami w celu szybkiej i dokładnej identyfikacji mikroorganizmów wyizolowanych na pożywkach stałych6,8. Bezpośrednie zastosowanie MALDI-TOF MS do bulionu z posiewów krwi (BC), które zasygnalizowały "pozytywny" dla mikroorganizmów, przemawia zarówno do klinicystów, jak i kierowników laboratoriów ze względu na możliwość uzyskania wcześniejszej identyfikacji mikroorganizmów przy niskich kosztach.
Kliniczna użyteczność bezpośredniego zastosowania MALDI-TOF MS do bulionu z hodowli krwi została ograniczona przez szeroki zakres czułości obserwowanych w porównaniu ze standardowymi metodami identyfikacji opartymi na kulturach fenotypowych, z raportami o udanej identyfikacji bakterii Gram-ujemnych w zakresie 47-98,9%9-11. Różnice w wrażliwości prawdopodobnie dotyczą składu bulionu BC, początkowego stężenia bakterii, różnic w metodach przygotowania próbek, a także szeregu organizmów Gram-ujemnych napotkanych w badanych populacjach9. W porównaniu z innymi opublikowanymi protokołami, przedstawiona tutaj metoda pozwala uniknąć użycia etanolu, chlorku amonu lub dodatkowego (niematrycowego) acetonitrylu. W rezultacie osad bakteryjny pozostanie żywotny (aż do momentu ekstrakcji białka), co pozwoli na zastosowanie potencjalnych metod badania wrażliwości fenotypowej bezpośrednio do tych organizmów w bulionie. Ponadto wykazano, że przedstawiona metoda jest niedroga, niezawodna i szybka, a identyfikacja bakterii jest dostępna w ciągu 25 minut od uzyskania wyników barwienia metodą Grama w posiewie krwi, przy minimalnym czasie pracy12.
Ta metoda to prosty wewnętrzny protokół spin-lizy, wykorzystujący ekstrakcję kwasu mrówkowego stosowaną bezpośrednio do dodatnich bulionów z hodowli krwi w celu identyfikacji bakterii Gram-ujemnych za pomocą technologii MALDI-TOF MS.

<table><tbody><tr><td>BACTEC Plus Aerobic/F Średni</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone</td><td>442192</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Lytic/10 Anaerob/F Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone</td><td>442265</td><td></td></tr><tr><td>BACTEC Peds Plus Medium</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone</td><td>442194</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer - Urządzenie do transferu krwi</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>364880</td><td>Jednorazowe urządzenie do pobierania próbek zmniejszające ryzyko zranienia igłą</td></tr><tr><td>Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plus</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>367954</td><td>Strzykawka z rurką separującą do serum</td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone</td><td>302143</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Samco, USA</td><td>222-20S</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa (z cienką końcówką)</td><td>Samco, USA</td><td>232-20S</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek (2,0 ml)</td><td>Eppendorf, Hamburg, Niemcy</td><td>0030.120.094</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda (wolna od DNAzy i RNAzy)</td><td>Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór matrycowy&nbsp;</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>285074</td><td>10 mg/ml kwasu &alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowego, 50% acetonitrylu, 2,5% kwasu trifluorooctowego</td></tr><tr><td>Stacjonarny microflex LT MALDI-TOF MS</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td></td><td>Z wykorzystaniem oprogramowania BioTyper 3.1 (Build 65) i FlexControl 3.3 (Build 99)</td></tr></tbody></table>

szybka identyfikacja bakterii gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas maldi-tof

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Ważną rolą klinicznego laboratorium mikrobiologicznego jest zapewnienie szybkiej identyfikacji bakterii powodujących infekcję krwi. Tradycyjna identyfikacja wymaga subkultury sygnalizowanego bulionu z hodowli krwi, z identyfikacją dostępną dopiero po osiągnięciu dojrzałości kolonii na stałym agarze . MALDI-TOF MS jest niezawodną, szybką metodą identyfikacji większości klinicznie istotnych bakterii po zastosowaniu do kolonii na pożywkach stałych. Zastosowanie MALDI-TOF MS bezpośrednio w bulionie z posiewów krwi jest atrakcyjnym podejściem, ponieważ może przyspieszyć identyfikację gatunkową bakterii i poprawić postępowanie kliniczne. Jednak ważnym problemem, który należy pokonać, jest wstępne usunięcie przeszkadzających żywic, białek i hemoglobiny zawartych w próbkach posiewów krwi, które, jeśli nie zostaną usunięte, zakłócają widma SM i mogą skutkować niewystarczającymi lub niskimi wynikami identyfikacji dyskryminacji. Ponadto konieczna jest koncentracja bakterii w celu wytworzenia widm o wystarczającej jakości. Przedstawiona metoda opisuje zagęszczanie, oczyszczanie i ekstrakcję bakterii Gram-ujemnych pozwalających na wczesną identyfikację bakterii z sygnalizowanego bulionu z posiewu krwi.

Wygenerowane widma MALDI-TOF MS są porównywane ze zintegrowaną bazą danych widm referencyjnych. Przypisywana jest wartość punktowa w skali logarytmicznej określająca pewność dopasowania izolatu testowego do izolatów w bazie referencyjnej, przy czym zaleca się wartość score ≥1.7 dla prawdopodnej identyfikacji na poziomie rodzaju (Rycina 1) oraz ≥2.0 dla prawdopodobnej identyfikacji na poziomie gatunku (Rycina 2). Wynik należy raportować na poziomie gatunku, gdy score ≥1.7, a pierwsze 5 id...

Zastosowanie spektrometrii mas (MS) z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) bezpośrednio do bulionu z hodowli krwi przyspiesza identyfikację bakterii. Przedstawiona metoda jest szybką i wiarygodną metodą identyfikacji bakterii Gram-ujemnych bezpośrednio z bulionu z posiewów krwi.

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja organizmów gram-ujemnych bezpośrednio z pożywki posiewu krwi z wykorzystaniem technologii Maloff. W tym celu 5 mL dodatniej pożywki posiewu krwi przenosi się do probówki z żelem rozdzielającym i poddaje wirowaniu. Po wirowaniu warstwę cieczy zawierającą bakterie przenosi się do probówki do mikrowirówki, a następnie wiruje z niską prędkością. Następnie nadsącz przenosi się do nowej probówki do mikrowirówki i wiruje z wysoką prędkością.Otrzymany osad resuspendsuje się w kwasie mrówkowym i analizuje za pomocą metody MALDI w celu identyfikacji obecnych gatunków bakterii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak tradycyjne posiewy, jest wcześniejsza identyfikacja bakterii gram-ujemnych. Znaczenie tej techniki rozciąga się na mikrobiologię kliniczną, ponieważ diagnoza bakteriemii wpływa na wybór leku przeciwdrobnoustrojowego przepisanego przez lekarza.Procedurę tę zaprezentuje Leonardo Bascu, jeden z techników w naszym dziale, który regularnie ją wykonuje. Butelki do posiewów krwi w warunkach tlenowych lub beztlenowych, pobrane zgodnie z decyzją personelu klinicznego, zazwyczaj w przypadku gorączki, są inku

rapid-identification-gram-negative-bacteria-from-blood-culture-broth

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych z bułki kultury krwi za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF

Szybki preparat bakteryjny z dodatniego posiewu krwi może być użyty jako próbka do zastosowań takich jak identyfikacja za pomocą MALDI-TOF, barwienie metodą Grama, testowanie wrażliwości na antybiotyki i test oparty na PCR. Wyniki mogą być szybko przekazywane klinicystom w celu poprawy wyników leczenia pacjentów cierpiących na infekcje krwi.

Przygotowanie osadu do hodowli krwi w celu szybkiej identyfikacji bakterii i badania wrażliwości na antybiotyki

Ta praca szczegółowo opisuje procedury szybkiej identyfikacji bakterii za pomocą MALDI-TOF MS. Procedury identyfikacji obejmują akwizycję widma, budowę bazy danych i analizy następcze. Przedstawiono dwie metody identyfikacji: opartą na współczynniku podobieństwa i metodę opartą na biomarkerach.

Wykorzystanie spektrometrii mas MALDI-TOF i niestandardowej bazy danych do scharakteryzowania bakterii występujących w unikalnym środowisku jaskiniowym (Kartchner Caverns, AZ, USA)

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą spektrometria mas lotu (MALDI-TOF MS) oraz techniki molekularne (sekwencjonowanie genów 16S rRNA) pozwalają na identyfikację rzadkich patogenów bakteryjnych w rutynowej diagnostyce. Celem tego protokołu jest połączenie obu technik, co prowadzi do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych.

Identyfikacja rzadkich patogenów bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA i MALDI-TOF MS

Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) została użyta do typowania zbioru izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu w porównaniu do typowania sekwencji wielolocus (MLST).

Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)

IDBac to open-source'owy potok bioinformatyczny oparty na spektrometrii mas, który integruje dane zarówno z nienaruszonych białek, jak i wyspecjalizowanych widm metabolitów, zebrane na materiale komórkowym zeskrobanym z kolonii bakteryjnych. Procedura ta pozwala naukowcom szybko zorganizować setki lub tysiące kolonii bakteryjnych w przypuszczalne grupy taksonomiczne i dalej je różnicować w oparciu o wyspecjalizowaną produkcję metabolitów.

Wykorzystanie potoku IDBac MALDI TOF-MS o otwartym kodzie źródłowym do analizy białek mikrobiologicznych i specjalistycznych danych metabolitowych

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Nowatorska metoda przygotowania próbek została zademonstrowana do analizy makrokolonii bakteryjnych na bazie agaru za pomocą matrycowej desorpcji/jonizacji laserowej spektrometrii mas.

Badanie współpracy mikrobiologicznej poprzez obrazową analizę spektrometrii mas kolonii bakteryjnych hodowanych na agarze i w tkance podczas infekcji

EUCAST opracował protokół bezpośredniego testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AST) dla automatycznych hodowli krwi. Jednak jego zależność od identyfikacji mikrobiologicznej opartej na spektrometrii mas można wyeliminować, stosując protokół bezpośredniego przygotowania inokulum w zautomatyzowanym systemie identyfikacji drobnoustrojów. Takie podejście może dostarczyć raporty AST w ciągu 24 godzin od pobrania próbki.

Bezpośrednia identyfikacja mikrobiologiczna przy użyciu zautomatyzowanego systemu identyfikacji drobnoustrojów w celu ułatwienia metody EUCAST RAST bez spektrometrii mas

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Szybki protokół bezpośredniej identyfikacji Enterococcus faecalis oraz innych gatunków Enterococcus z dodatniej posiewu krwi z wykorzystaniem testu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ z użyciem kwasów nukleinowych peptydowych (PNA FISH).

Procedura trwająca 1,5 godziny służąca do identyfikacji gatunków Enterococcus bezpośrednio z posiewów krwi

Poznaj szybką identyfikację bakterii Gram-ujemnych z bulionu posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF. Ta metoda umożliwia wcześniejsze rozpoznanie gatunku z 97% zgodnością, wspierając szybsze decyzje terapeutyczne w mikrobiologii klinicznej.

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

Przeglądaj więcej filmów