Name: Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku. Technika ta umożliwia szczegółowe obserwacje dynamiki białek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Alengo Nyamay'antu i dr Ilse Timmerman za ich porady dotyczące opakowań lentiwirusowych. Praca ta jest wspierana przez American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.

<ol><li>Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+the+preparation+of+homogeneous+cultures+of+isolated+heart+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells.</a> Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).</li>
<li>Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+allylamine+and+acrolein+in+cultured+myocytes+and+fibroblasts+from+neonatal+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart.</a> Toxicology. 56, 107-117 (1989).</li>
<li>MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+plasminogen+activator+activity+from+neonatal+rat+heart+cells+is+regulated+by+hormones+and+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).</li>
<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).</li>
<li>Kaestner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+genetic+manipulation+of+adult+cardiac+myocytes+for+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging.</a> J Vis Exp. 31 (31), (2009).</li>
<li>Xu, X., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+adult+rat+heart+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of adult rat heart myocytes.</a> J Vis Exp. 28 (28), (2009).</li>
<li>Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+isolation+procedure+for+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+biochemistry+and+biophysics%22%5BJournal%5D)">An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes.</a> Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).</li>
<li>Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+primary+culture+of+cardiomyocyte+from+neonatal+mice.+In+vitro+cellular+%26+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Animal%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology.</a> Animal. 44, 45-50 (2008).</li>
<li>Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Neonatal+Mouse+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. 79 (79), (2013).</li>
<li>Kass-Eisler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+adenovirus-mediated+gene+delivery+to+rat+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).</li>
<li>Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+heart+gene+delivery+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">The evolution of heart gene delivery vectors.</a> The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).</li>
<li>Metzger, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMetzger%2C+JM+%22Cardiac+Cell+and+Gene+Transfer%3A+Principles%2C+Protocols%2C+and+Applications%22">Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2003).</li>
<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272, 263-267 (1996).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+delivery+of+genes+into+neonatal+and+adult+ventricular+cardiac+myocytes+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+research+in+cardiology%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo.</a> Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).</li>
<li>Bonci, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced%27+generation+lentiviruses+as+efficient+vectors+for+cardiomyocyte+gene+transduction+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Advanced' generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo.</a> Gene therapy. 10, 630-636 (2003).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FGF+system+has+a+key+role+in+regulating+vascular+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The FGF system has a key role in regulating vascular integrity.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).</li>
<li>Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy+--+a+cutting-edge+tool+for+imaging+of+membrane+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+structure+and+function%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic.</a> Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).</li>
<li>Adams, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-speed+multispectral+spinning-disk+confocal+microscope+system+for+fluorescent+speckle+microscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%22%5BJournal%5D)">A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells.</a> Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).</li>
<li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+microscopy+systems.+Cold+Spring+Harbor+protocols%29%5BTitle%5D)+AND+%222010%2C+pdb+top88%2C+doi%3A10.1101%2Fpdb.top88%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols).</a> 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43, 25-30 (2007).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Wang, X., McManus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Lentivirus production.</a> J Vis Exp. 32 (32), (2009).</li>
<li>Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+lentiviral+vectors+for+transducing+cells+from+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system.</a> J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).</li>
<li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+and+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, (2002).</li>
<li>Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+chloroquine+in+gene+transfer+into+a+human+hepatoma+cell+line+by+DNA%2Flactosylated+polylysine+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes.</a> Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).</li>
<li>McSharry, J., Benzinger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+purification+of+vesicular+stomatitis+virus+by+polyethylene+glycol+%27precipitation%27%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol 'precipitation'.</a> Virology. 40, 745-746 (1970).</li>
<li>Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monte+Carlo+simulation+of+the+Spearman-Kaerber+TCID50%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical%22%5BJournal%5D)">Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50.</a> Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).</li>
<li>Kaerber, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaerber%2C+G+%22Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+In%3A+Beitrag+zur+kollektiven+Behandlung+pharmakologischer+Reihenversuche.+162%22">Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162</a>. , Springer. Berlin, 480–483. (1931).</li>
<li>Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+FGF+signaling+is+required+for+Cx43+phosphorylation+and+cardiac+gap+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance.</a> Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).</li>
<li>Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+form+of+fibroblast+growth+factor+receptor+1+inhibits+signal+transduction+by+multiple+types+of+fibroblast+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor.</a> The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).</li>
<li>Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transformation+by+fibroblast+growth+factors+can+be+suppressed+by+truncated+fibroblast+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors.</a> Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-dependent+regulation+of+VEGF+receptor+2+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice.</a> The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).</li>
<li>Bazan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+assessment+in+enzymatically+isolated+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+reviews%22%5BJournal%5D)">Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes.</a> Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).</li>
<li>Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+adult+cardiac+myocytes+maintain+protein+synthetic+capacity+of+intact+adult+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts.</a> The American journal of physiology. , 264-573 (1993).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kardiomiocyty pierwotne wyizolowane od nowonarodzonych szczurów od dawna są wykorzystywane do badania funkcji kardiomiocytów in vitro. Protokół ten opisuje metodę izolacji kardiomiocytów noworodków od młodych szczurów przy użyciu dwuetapowej metody trawienia enzymatycznego, najpierw trawienia trypsyną O/N w temperaturze 4 °C, a następnie oczyszczonej kolagenazy. Jedną z zalet stosowania etapu oczyszczonej kolagenazy jest to, że ten sam gatunek enzymu jest używany do wszystkich izolacji. Tak więc jakość i ilość i...

Pierwotne kardiomiocyty noworodków szczurów od dawna są używane do badania funkcji kardiomiocytów in vitro1. Łatwo je odizolować od szczeniąt szczurów za pomocą kilku dobrze znanych metod2-4. Najczęstsza metoda wykorzystuje kolagenazę lub trypinę do trawienia tkanki łącznej serca przed izolacją komórek. Naukowcy opracowali również metody izolowania kardiomiocytów od dorosłych gryzoniw wieku 5-8 lat, a także od nowonarodzonych myszy9,10.
Ten protokół opisuje metodę izolowania kardiomiocytów od nowonarodzonych szczurzych szczeniąt, wykorzystując dwuetapową procedurę trawienia enzymatycznego. Trypsynę najpierw stosuje się O/N w temperaturze 4 °C, a następnie oczyszczoną kolagenazę w temperaturze 37 °C. Inkubacja tkanki serca z trypsyną O/N w temperaturze 4 °C zmniejsza liczbę etapów niezbędnych do pobrania komórek w porównaniu z metodami wykorzystującymi sekwencyjne inkubacje w ciepłym roztworze enzymu2. Ponadto, dzięki zastosowaniu oczyszczonej kolagenazy zamiast surowych enzymów, można wyeliminować zmienność między partiami, zapewniając w ten sposób lepszą odtwarzalność.
Badania funkcjonalne konkretnego białka często wykorzystują system ekspresji białek przy użyciu adenowirusa11-13 i/lub lentiwirusa14-16. [UWAGA OSTRZEGAWCZA] Produkcja i manipulacja wirusem powinny być przeprowadzane zgodnie z wytycznymi NIH.
Adenowirus nie integruje się z genomem gospodarza. Ma bardzo wysoką skuteczność transdukcji w większości typów komórek, w tym w komórkach dzielących się i niedzielących się, a także w komórkach pierwotnych i ustalonych liniach komórkowych. To sprawia, że adenowirus jest wiarygodnym wektorem ekspresji genów. Wysoki poziom białka kodowanego przez wektor adenowirusa rozwija się w ciągu 48 godzin po transdukcji i może utrzymywać się przez kilka tygodni17. Jednak jedną z wad stosowania adenowirusa do ekspresji białek jest to, że opracowanie rekombinowanego adenowirusa jest zarówno skomplikowane, jak i czasochłonne. Ta wada wyjaśnia częściowo, dlaczego wielu badaczy zwraca się do lentiwirusów w celu rekombinowanej ekspresji genów. W przeciwieństwie do konstruktów adenowirusowych, generowanie konstruktu lentiwirusowego jest szybkie i łatwe. Chociaż lentiwirusy mają na ogół niższą skuteczność transdukcji niż adenowirusy, zarówno w komórkach dzielących się, jak i niedzielących się, integrują się z genomem gospodarza. W związku z tym ekspresja transdukowanego genu jest bardziej stabilna w przypadku lentiwirusów niż w przypadku adenowirusów.
Ze względu na postęp technologiczny w dziedzinie mikroskopii, znacznie łatwiej jest uchwycić obrazy żywych komórek wyrażających rekombinowane białka. Dzieje się tak nawet przy szybkościach akwizycji wideo. Dzięki temu badacz może określić, w jaki sposób poszczególne zmiany w białku będącym przedmiotem zainteresowania wpływają funkcjonalnie na komórkę w czasie rzeczywistym. Konfokalny mikroskop z wirującym dyskiem ma kilka kluczowych cech, które sprawiają, że jest to optymalna technika obrazowania żywych komórek18,19. Wirujący dysk Yokogawa pozwala na znacznie szybszą akwizycję obrazu, przy jednoczesnym wykorzystaniu znacznie mniejszej mocy lasera niż punktowe skaningowe mikroskopy konfokalne. Obie te szczególne cechy wynikają z obracającego się dysku, który zawiera liczne otwory konfokalne, przez które laser przechodzi jednocześnie do próbek. Podczas akwizycji sam dysk obraca się szybko i nieprzerwanie18-20. Dzięki zastosowaniu systemu autofokusa mikroskopu stabilna ostrość jest utrzymywana przez długi czas. Dzięki temu naukowcy mogą wykonywać dobrze wyostrzone obrazy żywych komórek. Pozyskane obrazy są odtwarzane jako plik filmowy. Obrazy są analizowane za pomocą oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ21,22, FIJI23 lub innego dostępnego na rynku oprogramowania.

<table><tbody><tr><td>1 Nożyczki do dekapitacji</td><td>Autoklaw WPI</td><td>501749</td><td>przed użyciem</td></tr><tr><td>1 Cienkie nożyczki do izolacji serca i siekania</td><td>Autoklaw WPI</td><td>14393</td><td>przed użyciem</td></tr><tr><td>2 Kleszczyki drobnoziarniste (Dumont nr 5)</td><td>Autoklaw</td> <td>Sigma</td><td>F6521</td> przed użyciem</tr><tr><td>3 Sterylizowane naczynia plastikowe 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Do izolacji serca</td></tr><tr><td>3,5 cm Szklane dno Naczynia hodowlane</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>Do końcowego posiewu kardiomiocytów do przyszłego obrazowania żywych komórek. Mikro-Naczynia firmy ibidi są akceptowalną alternatywą.</td></tr><tr><td>3,5 cm Naczynia hodowlane ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.17-14-C</td><td>Do TIRF lub obrazu o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Roztwór etanolu, 70% (v/v) w wodzie</td><td>Sigma</td><td>E7148</td><td></td></tr><tr><td>2% Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>1 Sterylizowane plastikowe naczynie 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Do trypsynizacji</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Dwie 10 cm plastikowe naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td>Do wyboru</td></tr><tr><td>Autopipeta</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-300</td><td>Do rozcierania</td></tr><tr><td>Licznik</td><td></td><td></td><td></td>komórek</tr><tr><td>Celometr, automatyczny licznik komórek</td><td>nexcelom</td><td></td><td>Do sprawdzania i liczenia komórek</td></tr><tr><td>Mikroskop i hematocytometr</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Aby sprawdzić i policzyć komórki</td></tr><tr><td>Niebieski roztwór trypanu, 0,4%</td> <td>invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna inkubacyjna</td><td>Sigma</td><td>Z673129</td><td>Aby wstrząsnąć tkanką serca kolagenazą w temperaturze 37 & stopni; C przy 170-200 obr./min</td></tr><tr><td>10 mg/ml roztwór BrdU</td><td>BD Pharmingen</td><td>550891</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, invitrogen o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>41965039</td><td>Wymieszaj podłoże zgodnie z protokołem i podgrzej przed użyciem</td></tr><tr><td>MEM</td><td>invitrogen</td><td>31095029</td><td>Wymieszaj podłoże zgodnie z protokołem i ogrzej przed użyciem</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 j./ml)&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sekcja 2 Transdukcja</td><td></td><td></td><td></td>lentiwirusowa</tr><tr><td>3 Plazmidy</td><td></td><td></td><td></td>pakujące</tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Addgene</td><td>12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Addgene</td><td>12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Wektor przenoszenia lentiwirusa, pLVX-IRES-Puro</td><td>Clontech</td><td>632183</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (pożywka bez surowicy)</td> <td>invitrogen</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td>do transfekcji</tr><tr><td>polietylenoimina" Max", (MW 40 000) - liniowy PEI o wysokiej sile działania (odpowiednik Mw 25 000 w wolnej formie podstawowej)&nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>24765-2</td><td>Można go zastąpić X-tremeGENE 9 firmy Roche</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365779001</td><td>zastąpić PEI jako odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Chlorochina</td><td>Sigma</td><td>C6628</td><td>Rozpuść się w wodzie i przygotuj 100 mM roztwór podstawowy. Zahamowanie zakwaszenia endosomalnego można osiągnąć za pomocą 10-100 &mu; M Chlorochina.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka Luer-Lok, sterylizowana</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtry</td><td>Sigma</td><td>F8677</td><td>Używaj wyłącznie filtrów z octanu celulozy lub polieterosulfonu (PES) (o niskim poziomie wiązania białek). Nie używaj filtrów nitrocelulozowych. Nitroceluloza wiąże białka powierzchniowe na otoczce lentiwirusowej i niszczy wirusa.</td></tr><tr><td>Bromek heksadimetryny</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>Rozpuść w wodzie i przygotuj 8 mg / ml roztworu podstawowego, a następnie przefiltruj go w celu sterylizacji.</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 6,000</td><td>Sigma</td><td>81260</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Sekcja 3 Transdukcja</td><td></td><td></td><td></td>adenowirusowa</tr><tr><td>Komórki HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Około 10 cm szalki do hodowli komórkowych</td><td>Sigma</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa mikropłytka z pokrywką, płaskie dno, hodowla tkankowa, sterylna</td><td>BD Falcon</td><td>353072</td><td>Do miareczkowania</td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa, 10-100 &mu; l, 8-kanałowy</td><td>eppendorf</td><td>3122 000.035</td><td></td></tr><tr><td>Sekcja 4 Obrazowanie</td><td></td><td></td><td></td>żywych komórek</tr><tr><td>Wirujący dysk mikroskop konfokalny</td><td>PerkinElmer</td><td>L7267000</td><td></td></tr><tr><td>Komora z kontrolowaną temperaturą Dowolna</td><td>marka</td><td></td><td>Aby utrzymać temperaturę na poziomie 37 & stopni; C</td></tr><tr><td>A System środowiskowy CO2</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td>Opcjonalnie w celu utrzymania optymalnego stężenia CO2</sub</td></tr><tr><td>> CO2 Niezależna pożywka, bez invitrogenu glutaminy</td><td></td><td>18045-054&nbsp; &nbsp;</td><td>Do długiego obrazowania poklatkowego</td></tr><tr><td>DMEM, wysoki poziom glukozy, HEPES, bez czerwieni fenolowej</td><td>invitrogen</td><td>21063-029</td><td>Do długotrwałego obrazowania poklatkowego</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Pierwotne kardiomiocyty noworodków szczurów są przydatne w podstawowych badaniach układu krążenia in vitro, ponieważ można je łatwo wyizolować w dużej liczbie podczas jednej procedury. Ze względu na postęp w technologii mikroskopowej, stosunkowo łatwo jest uchwycić obrazy żywych komórek w celu zbadania zdarzeń komórkowych w czasie rzeczywistym, przy minimalnych obawach dotyczących fototoksyczności komórek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykonywać obrazy poklatkowe żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów za pomocą konfokalnego mikroskopu z wirującym dyskiem po transdukcji lentiwirusowej i adenowirusowej w celu modulacji właściwości komórki. Zastosowanie dwóch różnych typów wirusów ułatwia osiągnięcie odpowiedniej szybkości transdukcji i poziomów ekspresji dla dwóch różnych genów. Dobrze wyostrzone obrazy żywych komórek można uzyskać za pomocą systemu autofokusa mikroskopu, który utrzymuje stabilną ostrość przez długi czas. Stosując tę metodę, można analizować funkcje egzogennie modyfikowanych białek ulegających ekspresji w hodowanych komórkach pierwotnych. Dodatkowo system ten może być wykorzystany do badania funkcji genów poprzez wykorzystanie siRNA, a także modulatorów chemicznych.

Aby zilustrować tę technikę, w celu ekspresji białek znakowanych EGFP (enhanced green fluorescent protein) w komórkach wykorzystano lentiwirus kodujący Cx43 (Connexin43) znakowany EGFP lub zmutowaną formę Cx43 32, natomiast do wyłączenia sygnalizacji FGF w komórkach użyto adenowirusa kodującego FGFR1DN (fibroblast growth factor receptor 1 dominant negative) 33-35. Trzy dni po izolacji kardiomiocytów, wyizolowane komórki poddano transdukcji lentiwirusem w celu ekspresji białek znakowanych EGFP. Nastę...

Ten protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek przy użyciu pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji lentiwirusowej i adenowirusowej za pomocą konfokalnej mikroskopii wirującego dysku. Umożliwia to szczegółowe obserwacje procesów komórkowych w żywych kardiomiocytach.

Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie obrazów time-lapse pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczura po transdukcji lentiwirusowej i adenowirusowej z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii z dyskiem obrotowym. Cel ten osiąga się poprzez uprzednie wyizolowanie kardiomiocytów z szczeniąt szczura i wysianie komórek na szalkach z szklanym dnem. Kolejnym krokiem jest przeprowadzenie transdukcji kardiomiocytów lentiwirusem niosącym znakowany EGFP białko Conexion 43, a następnie transdukcja adenowirusem niosącym dominujący negatywny fgfr.Ostatnim krokiem jest wykonanie obrazowania time-lapse z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii z dyskiem obrotowym. W efekcie można uzyskać film stworzony z serii obrazów time-lapse. Przedstawia on rozkład białka z tagiem EGFP, wyrażanego przez geny lentiwirusowe w żywych pierwotnych kardiomiocytach w zmienionych warunkach komórkowych, wywołanych przez białko dominant-negative fgfr one wyrażane przez adenowirusa.Jedną z głównych zalet tej techniki jest możliwość obrazowania timelapse żywych komórek przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym w wybranych warunkach, po ekspresji genu indukowanej przez adenowirusy lub opracowaną tr

live-cell-imaging-primary-rat-neonatal-cardiomyocytes-following

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie żywych komórek pierwotnych neonatalnych kardiomiocytów szczurów po przeprowadzeniu transdukcji adenowirusowej i lentywirusowej za pomocą konfokalnej mikroskopii krążkowej

Kardiomiocyty dorosłych są komórkami pierwotnymi, które można wyizolować z serc zwierząt i hodować przez kilka dni. W tym okresie hodowli można zastosować adenowirusowy transfer genów w celu ekspresji genetycznie kodowanych biosensorów (GEB) lub fluorescencyjnych białek fuzyjnych. Obie metody umożliwiają badania komórkowe z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Izolacja i manipulacja genetyczna kardiomiocytów dorosłych do obrazowania konfokalnego

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Izolacja kardiomiocytów noworodków szczurów jest czasochłonną i nieprzewidywalną procedurą.  W badaniu opisano metody kriokonserwacji i rozmrażania kardiomiocytów nowonarodzonych szczurów, które pozwalają na bardziej efektywne wykorzystanie komórek. Rozmrożone NRCM mogą być używane do różnych eksperymentów bez konieczności każdorazowego wykonywania izolacji.

Izolacja i kriokonserwacja nowonarodzonych kardiomiocytów szczurów

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Ten manuskrypt opisuje krok po kroku protokół generowania i kwantyfikacji różnych przeprogramowanych podtypów serca przy użyciu retrowirusowego dostarczania Gata4, Hand2, Mef2c i Tbx5 za pośrednictwem retrowirusa.

Ocena podtypów kardiomiocytów po przeprogramowaniu fibroblastów embrionalnych myszy za pośrednictwem czynnika transkrypcyjnego

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Przedstawiono zestaw protokołów, które opisują pomiar funkcji skurczu za pomocą wykrywania długości sarkomeru wraz z pomiarem przejściowym wapnia (Ca2+) w izolowanych miocytach szczurów. Uwzględniono również zastosowanie tego podejścia w badaniach na zwierzęcych modelach niewydolności serca.

Analiza dysfunkcji kurczliwości serca i stanów przejściowych Ca2+ w miocytach gryzoni

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku. Technika ta umożliwia szczegółowe obserwacje dynamiki białek w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie żywych komórek pierwotnych kardiomiocytów noworodków szczurów po transdukcji adenowirusowej i lentiwirusowej przy użyciu konfokalnej mikroskopii wirującego dysku

Przeglądaj więcej filmów