Name: Izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę Langendorffa do pomiaru funkcji serca dużych zwierząt ex vivo. Technika umożliwia zbieranie danych klinicznych przy unikaniu zakłóceń immunologicznych w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nie ma żadnych potwierdzeń.

1. Budowa aparatu Langendorffa (Zobacz Rysunek 1)
<ol>
	<li>Za pomocą rurki 3/8" podłącz zbiornik serca do zbiornika krwi.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że ta rurka przechodzi przez pompę rolkową. UWAGA: Może to wymagać użycia dwóch łączników rurowych 3/8" do 1/4" w celu utworzenia kawałka rurki 1/4" do przejścia przez pompę rolkową.</li>
		<li>Podłącz zbiornik krwi do grzałki/oksygenatora za pomocą rurki 3/8".</li>
		<li>Użyj rurki 3/8", aby podłączyć grzałkę/natleniacz do złącza Y.</li>
		<li>Podłącz jedno ramię złącza Y do pompy odśrodkowej, a następnie podłącz pompę odśrodkową do drugiego złącza Y (wszystkie z rurką 3/8").</li>
		<li>Przymocuj kawałek rurki 3/8" mocującej zawór hemostazy do ramienia skierowanego do góry, który będzie służył zarówno jako pułapka bąbelkowa, jak i środek do włożenia przetwornika ciśnienia.</li>
		<li>Przymocuj kawałek rurki 3/8" do ramienia skierowanego w dół. Ta część przyczepi się do kaniuli aortalnej (tj. linii obciążenia następczego).</li>
		<li>Podłącz drugie ramię łącznika Y do dopływu komory obciążenia wstępnego za pomocą rurki 3/8". Upewnij się, że ta rurka przechodzi przez drugą pompę rolkową. </li>
		<li>Podłącz nadmiar rurki 3/8" do odpływu tej komory. Ta część zostanie przymocowana do lewego przedsionka (tj. linii napięcia wstępnego).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz zbiornik tlenu i urządzenie grzewcze do grzałki/natleniacza.</li>
	<li>Zacisnąć przewód biegnący od łącznika Y do komory obciążenia wstępnego, ponieważ przewód ten nie będzie używany, dopóki serce nie zostanie przełączone w tryb pracy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie cewnika ciśnieniowo-objętościowego
<ol>
	<li>W łaźni wodnej o temperaturze 37 °C ogrzej butelkę roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Zanurzyć cewnik konduktancyjny PV i przetwornik ciśnienia w ciepłym roztworze soli fizjologicznej na co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Włącz systemy akwizycji danych, pozwalając obu rozgrzać się przez co najmniej 30 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie aparatu Langendorffa
<ol>
	<li>Włączyć zbiornik tlenu, aparat grzewczy, pompę rolkową łączącą dwa zbiorniki i pompę odśrodkową. Aparat grzewczy powinien być ustawiony na temperaturę ciała zwierzęcia (~36 °C).</li>
	<li>Umyj krew zgodnie z instrukcjami producenta. Wolniejsze prędkości prania są zalecane w celu dokładniejszego usunięcia produktów przemiany materii z krwi (np. nadmiaru elektrolitów, lizowanego materiału komórkowego).</li>
	<li>Po umyciu krwi sprawdź poziom hematokrytu przed hemodilucją.</li>
	<li>Umyte czerwone krwinki rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej do uzyskania pożądanego stężenia hematokrytu (zalecane: 20-25%) i dodać do aparatu Langendorffa.</li>
	<li>Dostosuj prędkości obu pomp, aby rozpocząć przepływ krwi przez system (z wyłączeniem komory obciążenia wstępnego).</li>
	<li>Sprawdzić pH i elektrolity w mieszaninie krwi i dostosować do zastosowanych gatunków do stanu fizjologicznego. UWAGA: Aby zapobiec szkodliwemu napływowi wapnia po reperfuzji, poziom wapnia w aparacie Langendorffa powinien być początkowo utrzymywany na niskim poziomie (0,3-0,5 mmol/l).
	<ol>
		<li>Jeśli występuje spadek hematokrytu przy jednoczesnym wzroście potasu, sprawdź dehydrogenazę mleczanową i hemoglobinę wolną od osocza, aby wykluczyć hemolizę.</li>
		<li>W przypadku wystąpienia hemolizy upewnij się, że wszystkie połączenia są szczelne i nie ma obszarów oczywistego prześwietlania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz cewnik Millar do szczeliny ciśnienia wtórnego systemu PowerLab.</li>
	<li>Skalibruj przetwornik ciśnienia zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
4. Przygotowanie serca do podłączenia do aparatu Langendorffa
UWAGA: Prawidłowo zatrzymane serce powinno być używane do wszelkich dużych eksperymentów na zwierzętach z udziałem izolowanego układu serca. Brak zatrzymania krążenia może uszkodzić serce tak, że nie będzie ono w stanie wykonać mierzalnej pracy. Celsior, czyli roztwór o niskiej zawartości potasu University of Wisconsin (UW) jest zalecany, ponieważ te roztwory są nie tylko podobne do tych stosowanych klinicznie, Ale niski poziom potasu w roztworze pomaga zapobiegać hiperkaliemii podczas obwodu. Objętość roztworu kardioplegicznego będzie zależeć od wielkości serca, przy czym 1 litr wystarczy na serca świń.
<ol>
	<li>Szybko wyjmij serce z pojemnika do przechowywania, wylej dowolny roztwór do przechowywania w komorach, osusz i zważ.</li>
	<li>Aby pomóc w utrzymaniu niskiej temperatury mięśnia sercowego do czasu, gdy serce będzie gotowe na Langendorffa, umieść serce z powrotem w pojemniku do przechowywania i ustaw je tak, aby aorta była skierowana do góry.</li>
	<li>Włóż kaniulę 3/8" do aorty i zabezpiecz opaską zaciskową.</li>
</ol>
5. Dołączanie serca do Langendorffa
<ol>
	<li>Zmniejsz pompę odśrodkową do powolnej strużki.</li>
	<li>Wlej krew do aorty, aż zostanie wypełniona krwią i całkowicie odpowietrzena.</li>
	<li>Ostrożnie przymocuj kaniulę aorty do rurki aortalnej w Langendorffie. Zanotuj czas mocowania.</li>
	<li>Wprowadzić skalibrowany przetwornik ciśnienia przez zawór hemostazy [DS1] do aorty natywnej.</li>
	<li>Rozpocznij pomiary ciśnienia i dostosuj prędkość pompy odśrodkowej, aż do uzyskania żądanego ciśnienia reperfuzji. UWAGA: Ciśnienie może się zmieniać wraz ze zmianą oporu wieńcowego. Dlatego należy uważnie monitorować ciśnienie w aorcie, szczególnie podczas początkowej reperfuzji.</li>
	<li>Wzrost temperatury na urządzeniu grzewczym Temperaturę wewnątrz mięśnia sercowego mierzy się na poziomie 37 °C. UWAGA: Nastąpi opóźnienie między dostosowaniem urządzenia grzewczego a zmianami temperatury wewnątrz mięśnia sercowego. Dlatego zmiany temperatury powinny być dokonywane stopniowo.</li>
	<li>Pobrać próbkę wyjściową (T = 0) ze zbiornika krwi żylnej w celu zmierzenia pH, elektrolitów i innych pomiarów biochemicznych.</li>
	<li>Wprowadź sondę temperatury do przegrody i monitoruj temperaturę mięśnia sercowego. Zmniejszyć temperaturę urządzenia grzewczego, jeśli temperatura mięśnia sercowego wzrośnie powyżej 39 °C.</li>
	<li>Pobieraj próbki krwi co 15 minut, dostosowując parametry fizjologiczne zgodnie z potrzebami eksperymentu.
	<ol>
		<li>Dodawać około 1 mmol wapnia do roztworu krwi co 5 minut, upewniając się, że wapń jonowy wynosi > 0,8 mmol/l przed rozpoczęciem trybu pracy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wprowadzanie serca w tryb pracy
<ol>
	<li>Wprowadzić kaniulę o odpowiedniej wielkości do lewego przedsionka/żyły płucnej. Można to zrobić za pomocą szwu ze sznurka do torebki lub opaski zaciskowej, w zależności od potrzeb.</li>
	<li>Zamknij wszelkie otwory w lewym przedsionku, które mogą przeciekać, takie jak inne źródła żył płucnych, za pomocą szwu lub zszywek w razie potrzeby.</li>
	<li>Wyreguluj wysokość komory napięcia wstępnego tak, aby wysokość kolumny dawała żądane ciśnienie napięcia wstępnego. UWAGA: Zakładając, że gęstość mieszaniny krew/krystaloid jest równa gęstości wody, 1 mmHg = 1,36 cm odległości od zastawki aortalnej do górnej granicy poziomu krwi w zbiorniku obciążenia wstępnego (np. 15 mmHg = 20,4 cm).</li>
	<li>Odblokuj rurkę prowadzącą do komory obciążenia wstępnego i powoli uruchom pompę rolkową obciążenia wstępnego, pozwalając komorze obciążenia wstępnego i rurkom ładowania wstępnego całkowicie napełnić się krwią.</li>
	<li>Po całkowitym odpowietrzeniu rurki z obciążeniem wstępnym powoli napełnij lewe przedsionek i kaniulę krwią.</li>
	<li>Nie dopuszczając do przedostania się powietrza do systemu, podłącz rurkę z obciążeniem wstępnym do lewej kaniuli przedsionkowej.</li>
</ol>
7. Uzyskiwanie zapisów ciśnienia komorowego i objętości (PV)
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi kalibracji ciśnienia i kuwety Rho dla systemów akwizycji danych.</li>
	<li>Umieść szew sznurkowy za pomocą szwu polipropylenowego 3-0 na wierzchołku lewej komory (LV).</li>
	<li>Za pomocą igły 16 G wykonaj nacięcie w sznurku torebki.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik konduktancyjny PV do nacięcia wierzchołkowego. UWAGA: Idealne umiejscowienie cewnika będzie zależało od tego, czy wszystkie elektrody czujnikowe znajdują się w lewej wysokości, a dwie elektrody wzbudzające na zewnątrz lewej wysokości. Upewnij się, że wybrano zwierzę i cewnik o odpowiedniej wielkości (patrz Dyskusja).</li>
	<li>Naciśnij przycisk "Start" w prawym górnym rogu, aby rozpocząć nagrywanie danych i określić, ile segmentów głośności jest aktywnych.
	<ol>
		<li>Jeśli wszystkie segmenty nie są aktywne, wyreguluj położenie cewnika, aż wszystkie segmenty będą aktywne. UWAGA: Lekkie skręcenie cewnika może być konieczne w celu optymalizacji morfologii pętli</li>
		<li>Jeśli nie można uzyskać sygnałów we wszystkich segmentach, dostosuj położenie elektrod wzbudzających i elektrod czujnikowych zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po uzyskaniu żądanej konfiguracji postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi kalibracji objętości i alfa.</li>
	<li>Używając prawidłowo skalibrowanego cewnika, uzyskaj co najmniej 30 sekund podstawowych danych dotyczących ciśnienia i objętości. UWAGA: Te pętle ciśnienie-objętość zapewnią zależne od objętości pomiary czynności serca (np. rzut serca, objętość wyrzutowa).
	<ol>
		<li>Po uzyskaniu wystarczającej liczby pętli przejdź do następnego kroku bez zatrzymywania zapisu danych, aby uzyskać dane dotyczące ciśnienia i objętości okluzji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powoli zatkaj rurkę napięcia wstępnego za pomocą rurki clamp. UWAGA: Pętle ciśnienia i objętości powinny zacząć się zmniejszać i przesuwać w dół i w lewo. Nazywa się to "zejściem w dół".
	<ol>
		<li>Uzyskaj 10-15 sekund zejścia w dół, a następnie zwolnij rurkę clamp, aby umożliwić ponowne wejście obciążenia wstępnego do lewego przedsionka. UWAGA: Te pętle ciśnienie-objętość zapewnią niezależne od objętości pomiary czynności serca (np. praca z udarem przy wstępnym obciążeniu, koniec zależności ciśnienie skurczowe od objętości).</li>
		<li>Zatrzymaj nagrywanie danych, naciskając przycisk "Zatrzymaj" w prawym górnym rogu ekranu.</li>
		<li>Odczekaj co najmniej 5 minut przed powtórzeniem okluzji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki 7.7 i 7.8, aby uzyskać powtórzone pomiary.</li>
</ol>

<ol><li>Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 55, 113-126 (2007).</li>
<li>Cheung, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-2+contributes+to+ischemia-reperfusion+injury+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-2 contributes to ischemia-reperfusion injury in the heart.</a> Circulation. 101, 1833-1839 (2000).</li>
<li>Ytrehus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ischemic+heart--experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%3A+the+Official+Journal+of+the+Italian+Pharmacological+Society%22%5BJournal%5D)">The ischemic heart--experimental models.</a> Pharmacological Research: the Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 42, 193-203 (2000).</li>
<li>Ferdinandy, P., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide%2C+superoxide%2C+and+peroxynitrite+in+myocardial+ischaemia-reperfusion+injury+and+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite in myocardial ischaemia-reperfusion injury and preconditioning.</a> British Journal of Pharmacology. 138, 532-543 (2003).</li>
<li>Ohno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+cryopreserved+muscle+cells+in+dilated+cardiomyopathy%3A+effects+on+left+ventricular+geometry+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of cryopreserved muscle cells in dilated cardiomyopathy: effects on left ventricular geometry and function.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 126, 1537-1548 (2003).</li>
<li>Hamlin, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+of+isolated+perfused+guinea+pig+heart+to+test+for+drug-induced+lengthening+of+QTc%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity of isolated perfused guinea pig heart to test for drug-induced lengthening of QTc.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, 15-23 (2004).</li>
<li>Lee, M. S., Lill, M., Makkar, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+transplantation+in+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell transplantation in myocardial infarction.</a> Reviews in Cardiovascular Medicine. 5, 82-98 (2004).</li>
<li>Ryugo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+protective+effect+of+human+recombinant+hepatocyte+growth+factor+for+prolonged+heart+graft+preservation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Myocardial protective effect of human recombinant hepatocyte growth factor for prolonged heart graft preservation in rats.</a> Transplantation. 78, 1153-1158 (2004).</li>
<li>Valentin, J. P., Hoffmann, P., De Clerck, F., Hammond, T. G., Hondeghem, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+predictive+value+of+the+Langendorff+heart+model+%28Screenit+system%29+in+assessing+the+proarrhythmic+potential+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Review of the predictive value of the Langendorff heart model (Screenit system) in assessing the proarrhythmic potential of drugs.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, 171-181 (2004).</li>
<li>Southworth, R., Blackburn, S. C., Davey, K. A., Sharland, G. K., Garlick, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+low+oxygen-carrying+capacity+of+Krebs+buffer+causes+a+doubling+in+ventricular+wall+thickness+in+the+isolated+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The low oxygen-carrying capacity of Krebs buffer causes a doubling in ventricular wall thickness in the isolated heart.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 83, 174-182 (2005).</li>
<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+heart+perfusion%3A+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 940-950 (2011).</li>
<li>Hearse, D. J., Sutherland, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+for+the+study+of+cardiovascular+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%3A+the+Official+Journal+of+the+Italian+Pharmacological+Society%22%5BJournal%5D)">Experimental models for the study of cardiovascular function and disease.</a> Pharmacological Research: the Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 41, 597-603 (2000).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%3A+the+Official+Journal+of+the+Italian+Pharmacological+Society%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research: the Official Journal of the Italian Pharmacological Society. 41, 613-627 (2000).</li>
<li>Hill, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of human hearts.</a> Ann Thorac Surg. 79, 168-177 (2005).</li>
<li>Colah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+of+the+swine+heart+as+a+method+for+pre-transplant+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Perfusion%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion of the swine heart as a method for pre-transplant assessment.</a> Perfusion. 27, 408-413 (2012).</li>
<li>Ozeki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+preservation+using+continuous+ex+vivo+perfusion+improves+viability+and+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+J%22%5BJournal%5D)">Heart preservation using continuous ex vivo perfusion improves viability and functional recovery.</a> Circ J. 71, 153-159 (2007).</li>
<li>Garbade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+metabolic%2C+and+morphological+aspects+of+continuous%2C+normothermic+heart+preservation%3A+effects+of+different+preparation+and+perfusion+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional, metabolic, and morphological aspects of continuous, normothermic heart preservation: effects of different preparation and perfusion techniques.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. 15, 275-283 (2009).</li>
<li>Poston, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+donor+heart+outcome+after+prolonged+storage+with+endothelial+function+analysis+and+continuous+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimizing donor heart outcome after prolonged storage with endothelial function analysis and continuous perfusion.</a> Ann Thorac Surg. 78, 1362-1370 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Izolowany aparat perfuzyjny serca Langendorffa i działający model serca doprowadziły do jednych z najbardziej fundamentalnych odkryć w fizjologii, patologii i farmakologii serca. Wszechstronność tego modelu pozwala na jego stosowanie z różnymi gatunkami w różnych warunkach normalnych i patologicznych1-18. Jednak izolowany model serca nie jest powszechnie stosowany w przypadku dużych ssaków, zwłaszcza serc ludzkich, częściowo ze względu na zwiększoną złożoność zarówno projektowania aparatury, jak i gromadzenia danych. W związku z tym przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół demonstruje próbę poprawy tych złożoności, która skutkuje stosunkowo powtarzalnym sposobem badania izolowanych serc świń.
Kluczowym elementem naszej instalacji jest zastąpienie komory podatności tętniczej/obciążenia wtórnego pompą odśrodkową. Ta wymiana pozwala na lepszą kontrolę ciśnienia perfuzji wieńcowej i obciążenia następczego odpowiednio w trybie Langendorffa i pracy serca, co pozwala na łatwe dostosowanie tej konfiguracji do serc o różnych rozmiarach i gatunkach. Na przykład w tym projekcie serca świń są reperfowane przy 40-45 mmHg, podczas gdy ludzkie serca są reperfowane przy 60-65 mmHg. Ta zmiana ciśnienia odbywa się po prostu poprzez regulację ustawień pompy odśrodkowej; Żaden element systemu nie musi być fizycznie dostosowywany. Co więcej, umieszczenie przetwornika ciśnienia w korzeniu aorty w celu monitorowania ciśnienia w korzeniu umożliwia łatwe przejście między stałym przepływem a stałym ciśnieniem w trybie Langendorffa. Chociaż ta zmiana usuwa klasyczną komorę zgodności, pompa odśrodkowa, umożliwiając dwukierunkowy przepływ w oparciu o gradient ciśnienia, może służyć jako komora zgodności. Przy skurczu i wyrzuconej objętości wyrzutowej przepływ wsteczny przez pompę służy do zmniejszenia ciśnienia obciążenia następczego, replikując elastyczność aorty.
Ważna jest również otwarta konstrukcja tego aparatu. Umieszczenie serca w otwartej przestrzeni, zamiast w półzamkniętej komorze lub lejku, pozwala na łatwiejsze oprzyrządowanie do pomiarów ciśnienia i objętości. Otwarta konstrukcja umożliwia zastosowanie nacięcia przezwierzchołkowego w celu umieszczenia cewnika LV, unikając dostępu przezzastawkowego. Dostęp przezpęcherzykowy jest trudniejszy technicznie i zwykle wymaga fluoroskopii w celu prawidłowego umieszczenia. Co więcej, takie podejście może również wywołać niewydolność zastawek. Stosując podejście przezwierzchołkowe, bezpiecznie i łatwo umieszczamy cewnik w lewej komorze, eliminując jednocześnie dodatkowe koszty i niedogodności związane z fluoroskopią. Otwarta konstrukcja zapewnia również łatwy dostęp do echokardiografii i zbierania ścieków, co jeszcze bardziej rozszerza parametry funkcjonalne i biochemiczne, które można ocenić podczas korzystania z tego systemu.
Otwarta konstrukcja, choć ułatwia gromadzenie danych, utrudnia regulację temperatury mięśnia sercowego. Utrzymanie temperatury fizjologicznej jest jednym ze znanych problemów z Langendorffem lub pracującym układem serca1,3,11,13. System Langendorffa zazwyczaj zawiera komorę termiczną, która pomaga utrzymać odpowiednią temperaturę, ale komora ta utrudnia również wprowadzenie cewnika ciśnieniowo-objętościowego komorowego. Aby rozwiązać problem gorszej regulacji temperatury w konstrukcji otwartej, za zbiornikiem umieszczono natleniacz/wymiennik ciepła. Minimalna przestrzeń między wymiennikiem ciepła a kaniulą aorty zmniejsza straty ciepła, a sonda temperatury mięśnia sercowego zapewnia normotermię. Zastosowanie rurek z płaszczem lub zewnętrznych źródeł ciepła może być również wykorzystane do pomocy w kontroli temperatury.
Kolejnym unikalnym elementem tego protokołu jest płukanie autologicznej krwi badanej świni i odtworzenie jej w roztworze soli fizjologicznej. Chociaż stosowanie perfuzatów krwi pełnej lub czerwonych krwinek wzmocnionych krystaloidowymi nie jest rzadkością, wiąże się z problemami. Pierwsza z nich zwykle wymaga zwierzęcia dawcy, co wiąże się ze znacznymi kosztami eksperymentu, podczas gdy druga może mieć problemy z immunogennością, ponieważ zwykle pochodzi z krwi bydlęcej1,11-13. Myjąc oryginalną krew świni, protokół wymaga tylko jednego zwierzęcia, a problemy z immunogennością są eliminowane. Ponadto proces mycia usuwa większość elektrolitów, co oznacza, że można nimi łatwo manipulować zgodnie z parametrami eksperymentalnymi. Wreszcie, użycie jednostki do konserwacji krwi usuwa większość białek we krwi, co jest zarówno zaletą, jak i wadą tego procesu. Zaletą jest to, że wszelkie białka krzepnięcia i immunologiczne/zakaźne są usuwane, co zmniejsza prawdopodobieństwo powstania zakrzepów lub zanieczyszczenia. Wadą jest to, że mieszanina ta ma niskie ciśnienie onkotyczne, co może prowadzić do obrzęku mięśnia sercowego i ewentualnie utraty funkcji serca w miarę upływu czasu. Problem ten można jednak rozwiązać poprzez dodanie albuminy lub innego koloidu.
Upewnienie się, że zwierzę i cewnik zostały dobrane w odpowiedniej wielkości, jest równie ważne, jak użycie prawidłowo działającego aparatu sercowego. Idealnie byłoby, gdyby cewnik został umieszczony ze wszystkimi elektrodami czujnikowymi wewnątrz przestrzeni komorowej, a dwie elektrody wzbudzające (tj. najbardziej proksymalne elektrody) na zewnątrz przestrzeni komorowej. Jeśli jama komorowa zwierzęcia jest zbyt mała lub odstępy między elektrodami są zbyt duże, wszystkie segmenty nie zmieszczą się w przestrzeni LV. Podczas gdy położenie elektrod wzbudzających można regulować, mała wnęka niskiego napięcia może również powodować zginanie lub zakrzywianie cewnika, co utrudnia gromadzenie danych. Dlatego do analizy funkcjonalnej serc dużych zwierząt zaleca się wielkość zwierzęcia wynoszącą co najmniej 60 kg. W przypadku zwierzęcia tej wielkości odstęp między elektrodami wynoszący 7 mm zwykle pozwala na całkowite wprowadzenie cewnika.
Podsumowując, manuskrypt ten opisuje izolowany działający system serca, który upraszcza regulację ciśnienia perfuzji, gromadzenie danych i ogólny projekt, jednocześnie utrudniając kontrolę temperatury. Miejmy nadzieję, że te modyfikacje izolowanego pracującego serca pozwolą na jego zwiększone zastosowanie w sercach dużych ssaków, w tym ludzi, pogłębiając naszą wiedzę na temat patologii serca i umożliwiając odkrycie bardziej istotnych klinicznie opcji leczenia.

Duża część naszego zrozumienia podstawowej biologii i fizjologii serca pochodzi z eksperymentów, które wykorzystywały izolowane, perfundowane wstecznie serce Langendorffa i izolowane działające systemy serca. Te eksperymentalne systemy są nadal szeroko stosowane w celu poszerzenia naszej wiedzy sercowo-naczyniowej na ważne tematy, w tym uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne2, kondycjonowanie wstępne4, terapia komórkowa uszkodzonego mięśnia sercowego5,7, wpływ leków na serce6,9 oraz techniki zachowania alloprzeszczepu serca8,15-18.
Chociaż oba izolowane systemy serca mogą być używane u dowolnych gatunków ssaków, są one głównie używane u małych ssaków, takich jak świnka morska, szczur czy królik3,12,13. Większe modele zwierzęce, takie jak świnie i ludzie, dostarczają bardziej istotnych klinicznie danych, ale są rzadziej stosowane ze względu na wyższe koszty, większą zmienność biologiczną, większe objętości roztworów perfuzyjnych krwi i większe elementy wyposażenia1,12-15. Ponadto zbieranie danych jest trudniejsze, zwłaszcza w przypadku izolowanych pracujących serc1,3,12-15. W wyniku tej złożoności klinicznie istotne izolowane modele serca są rzadko stosowane, co poważnie utrudnia postęp badań translacyjnych nad układem sercowo-naczyniowym.
W próbie rozwiązania tych zawiłości, odizolowane przygotowanie pracy serca zostało zmodyfikowane, aby stworzyć system, który można łatwo dostosować do serc różnych gatunków, w tym człowieka, w warunkach stałego ciśnienia lub stałego przepływu Langendorffa. Komora podatności na obciążenie następcze została zastąpiona pompą odśrodkową, aby uprościć proces regulacji ciśnienia perfuzji w trybie Langendorffa i obciążenia następczego w trybie pracy. Zamiast zamkniętego zbiornika z płaszczem do przechowywania serca, system ten wykorzystuje otwartą komorę, aby ułatwić gromadzenie danych, umożliwiając zastosowanie podejścia przezwierzchołkowego do cewnikowania przewodnictwa. Co więcej, ta otwarta konstrukcja umożliwia dostęp do echokardiograficznej oceny serca, co jeszcze bardziej poszerza parametry fizjologiczne, które można zmierzyć podczas tych eksperymentów. Miejmy nadzieję, że te ulepszenia zachęcą innych do korzystania z tego systemu w badaniach translacyjnych na dużych zwierzętach.

<table><tbody><tr><td>PowerLab 16/35 z przyrządami LabChart Pro</td><td>ADInstruments</td><td>PL3516/P</td><td></td></tr><tr><td>MPVS Ultra Pressure-Volume Unit</td><td>ADInstruments</td><td>880-0168</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik Ventri-Cather (5F, 12E, 7 mm, DField, prosty, 122 cm)</td>Cewnik ciśnieniowy <td>Millar</td><td>VENTRI-CATH-507s</td><td></td></tr><tr><td>(3.5F, Pojedynczy, Prosty, 100 cm, NY, Nienaprawialny)</td><td>Millar</td><td>SPR-524</td><td></td></tr><tr><td>Przedłużacz PV (10 stóp)</td><td>ADInstruments</td><td>CEC-10PV</td><td></td></tr><tr><td>interfejsu cewnika (10 stóp)</td><td>ADInstruments</td><td>PEC-10D</td><td></td></tr><tr><td>Rho Kuweta kalibracyjna</td><td>ADInstruments</td><td>910-1060</td><td></td></tr><tr><td>MPVS Ultra BNC Cable Pack</td><td>ADInstruments</td><td>880-0172</td><td></td></tr><tr><td>System autotransfuzji</td><td>Sorin</td><td>7320000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw misek z niskim Objętość (135 ml) Misa wirówki</td><td>Sorin</td><td>7135100</td><td></td></tr><tr><td>Dotleniacz/Wymiennik ciepła</td><td>Terumo</td><td>3CXSX18RX</td><td></td></tr><tr><td>Sonda przepływu okołonaczyniowego</td><td>Systemy transsoniczne</td><td>Seria PAU</td><td>Rozmiar sondy przepływu zależy od wielkości zwierzęcia; dla świni o wadze 60 kg zaleca się sondę 20 lub 24 mm</td></tr><tr><td>Moduł przepływomierza okołonaczyniowego</td><td>Systemy transsoniczne</td><td>TS420</td><td></td></tr><tr><td>Czujnik temperatury mięśnia sercowego</td><td>Smiths Medical</td><td>MTS-40015</td><td></td></tr><tr><td>16 G 1" Igła zwykła</td><td>BD Inc.</td><td></td><td></td>305197</tr><tr><td>4-0 szew polipropylenowy (dwuramienny)</td><td>Ethicon</td><td>8526H</td><td>Do ściegów torebkowo-sznurkowych</td></tr><tr><td>2-0 szew polipropylenowy (jednoramienny)</td><td>Ethicon</td><td>8833H</td><td></td></tr><tr><td>Opaski kablowe</td><td>ULINE</td><td>S-1021</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet do opasek kablowych</td><td>ULINE</td><td>H-241</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta, elastyczna rurka PVC</td><td>VWR International</td><td>89068</td><td>Średnica wewnętrzna zależy od używanych kaniul, pomp i innego sprzętu; Najczęściej używane rurki 1/4", 3/8"&nbsp;</td></tr><tr><td>Złączki do rur prostych</td><td>VWR International</td><td>46600</td><td></td></tr><tr><td>Łączniki rurowe w kształcie litery Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>6152</td><td></td></tr><tr><td>Pułapka bąbelkowa z płaszczem</td><td>Radnoti</td><td>14040</td><td>Do komory napięcia wstępnego</td></tr><tr><td>Pompa odśrodkowa</td><td>Maquet</td><td>70105</td><td>Pompa odśrodkowa i pompy rolkowe zostały uzyskane z oddziału perfuzji po zastosowaniu klinicznym.</td></tr><tr><td>Pompy rolkowe</td><td>Maquet</td><td>HL-20</td><td></td></tr><tr><td>Zawór hemostazy</td><td>Merit Medical</td><td>MAP150</td><td></td></tr><tr><td>Analizator parametrów krytycznych Laboratorium</td><td>oprzyrządowania 570001000</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych

An Isolated Working Heart System for Large Animal Models

Od czasu jego wprowadzenia pod koniecXIX wieku, izolowany aparat perfuzyjny Langendorffa i późniejszy rozwój działającego modelu serca były nieocenionymi narzędziami do badania funkcji układu krążenia i chorób1-15. Chociaż preparat serca Langendorffa może być stosowany do każdego serca ssaków, większość badań z udziałem tego aparatu wykorzystuje małe modele zwierzęce (np. myszy, szczura i królika) ze względu na zwiększoną złożoność systemów dla większych ssaków1,3,11. Jedną z głównych trudności jest zapewnienie stałego ciśnienia perfuzji wieńcowej w różnych rozmiarach serca – jest to kluczowy element każdego eksperymentu z wykorzystaniem tego urządzenia1,11. Zastępując klasyczną hydrostatyczną kolumnę obciążenia wtórnego pompą odśrodkową, opisany poniżej aparat roboczy Langendorffa pozwala na łatwą regulację i ścisłą regulację ciśnienia perfuzji, co oznacza, że ta sama konfiguracja może być stosowana dla różnych gatunków lub rozmiarów serc. Co więcej, ta konfiguracja może również płynnie przełączać się między stałym ciśnieniem a stałym przepływem podczas reperfuzji, w zależności od preferencji użytkownika. Otwarty charakter tej konfiguracji, pomimo tego, że regulacja temperatury jest trudniejsza niż w przypadku innych konstrukcji, pozwala na łatwe gromadzenie danych dotyczących ciśnienia i objętości ścieków.

Rycina 1 przedstawia schemat obwodu, w tym sugerowane rozmieszczenie cewników. Ważne elementy tego układu obejmują: zastosowanie pompy odśrodkowej do kontroli obciążenia następczego; umieszczenie cewnika ciśnieniowego (ciemnoniebieska linia) w pierścieniu aorty w celu monitorowania ciśnienia perfuzji oraz transapikalne wprowadzenie cewnika ciśnienie-objętość (PV, jasnoniebieska linia). Choć połączenia na rysunku wydają się być bezpośrednie, zaleca się stosowanie łączników w kształcie litery „Y”, szczególnie dla linii obciążenia wstępnego.
Rysunek 2 przedstawia dane uzyskane z przetwornika ciśnienia umieszczonego w zastawce aorty serca świni podczas reperfuzji w obiegu, które utrzymują się na stałym poziomie 40-42 mmHg przez ponad 20 min. Zmiany oporu naczyniowego w tętnicach wieńcowych mogą powodować wahania ciśnienia perfuzji (Rysunek 3). Odchylenia te mogą być niewielkie i stopniowe, stabilizując się z czasem (Rysunek 3a). Jednak w niektórych przypadkach zmiany te mogą być gwałtowne i wymagać regulacji przepływu pompy odśrodkowej w celu utrzymania pożądanego ciśnienia reperfuzji (Rysunek 3b). Ze względu na możliwość wystąpienia takich zmian, konieczne jest monitorowanie ciśnienia w zastawce aorty podczas reperfuzji.
Dzięki zastosowaniu transapikalnego nacięcia kłutego można łatwo uzyskać dane ciśnienie-objętość w izolowanym układzie serca. W tym doświadczeniu wykorzystano serce świńskie, które było przechowywane w zimnym (4 °C) roztworze konserwującym przez 2 hr. Po początkowym wprowadzeniu cewnika PV pętle były słabej jakości (Ryc. 4a), z licznymi obszarami nakładania się i brakiem wyraźnych komponentów cyklu serca. Jednak po minimalnej manipulacji cewnikiem wewnątrz komory morfologia pętli uległa znacznej poprawie (Ryc. 4b), co umożliwiło dokonanie pomiarów.
Pomimo optymalizacji pozycji cewnika, pętle uzyskane w układzie ex vivo (Rycina 5, górny rząd) mogą mieć inną morfologię niż pętle in vivo (Rycina 5, dolny rząd). Zmiany morfologii pętli wynikają prawdopodobnie z innej orientacji serca w układzie w porównaniu do zwierzęcia w pozycji na plecach, a także z braku połączeń anatomicznych występujących u żywego zwierzęcia (takich jak osierdzie). Ponadto zastosowanie elektrod stymulujących w celu regulacji częstości akcji serca (zalecane miejsce mocowania: przegroda międzykomorowa) wprowadza zewnętrzny prąd elektryczny, co prowadzi do wystąpienia skoków widocznych w prawym dolnym fragmencie pętli ex vivo. Jednak dopóki pętle te nadal zawierają komponenty cyklu serca, mogą one dostarczać interpretowalnych danych. W Tabeli 1 wymieniono liczne parametry funkcjonalne uzyskane z tych pętli ciśnienie-objętość przy użyciu cewnika PV. Przechowywanie statyczne w niskiej temperaturze prawdopodobnie spowodowało pewne uszkodzenia wewnętrzne serca, co pomaga wyjaśnić niektóre zmiany w wartościach uzyskanych w układzie w porównaniu z pomiarami in vivo. Część zmienności w obrębie zmiennych zależnych od obciążenia wynika również z prawdopodobnych różnic w obciążeniu wstępnym między układem a żywym zwierzęciem.
<img alt="Schemat układu krążenia; pompa odśrodkowa, oksygenator, komora preload dla badania hemodynamicznego." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat aparatury.
<img alt="Wykres wahań ciśnienia; czas względem ciśnienia (mmHg); analiza danych monitorowania fizjologicznego." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywne pomiary ciśnienia w akarcie aorty podczas reperfuzji.
<img alt="Wykresy fluktuacji ciśnienia; A. stopniowy spadek/wzrost, B. nagły spadek/skok; analiza ciśnienia w funkcji czasu." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przykłady zmian ciśnienia w pierścieniu aorty, które mogą wystąpić podczas reperfuzji. Zmiany te mogą mieć charakter stopniowy i samokorygujący się (A) lub gwałtowny, wymagający zmiany ustawień pompy odśrodkowej (B).
<img alt="Pętle ciśnienie-objętość LV, analiza wykresów, badania sercowo-naczyniowe, badanie funkcji serca." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Pętle ciśnienie-objętość uzyskane bezpośrednio po wprowadzeniu cewnika przez wierzchołek serca (A) oraz po niewielkiej manipulacji cewnikiem (B). Należy zwrócić uwagę na poprawę morfologii pętli, w wyniku której wyeliminowano ich krzyżowanie się, a elementy cyklu serca stały się rozpoznawalne. Skoki w prawym dolnym fragmencie obu zestawów pętli wynikają ze stosowania stymulatora, który wprowadza zewnętrzny sygnał elektryczny.
<img alt="Wykresy pętli ciśnienie-objętość; linia bazowa i okluzja; analiza wydajności serca w obwodzie a in vivo." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671fig5highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywne pomiary ciśnienia i objętości wykonane w obwodzie ex vivo (górny rząd) oraz pomiary in vivo (dolny rząd) dla porównania. Ponownie, w prawym dolnym rogu obu zestawów pętli ex vivo widoczne są impulsy stymulatora.
<img alt="Tabela parametrów funkcji serca porównująca warunki in vivo i w obiegu." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51671/51671table1.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Parametry funkcjonalne uzyskane dla serca świni in vivo (lewa kolumna) oraz na aparacie do pracującego serca po 2 hr przechowywania na zimno (prawa kolumna). CO: rzut serca; Ea: elastancja tętnicza; EDPVR: końcoworozkurczowa zależność ciśnienie-objętość; EDV: końcoworozkurczowa objętość; ESPVR: końcowoskurczowa zależność ciśnienie-objętość; PRSW: praca udarowa rekrutowalna przez obciążenie wstępne; PVA: pole ciśnienie-objętość; SV: objętość wyrzutowa; SW: praca udarowa.

Większość badań z udziałem aparatu Langendorffa wykorzystuje małe modele zwierzęce ze względu na zwiększoną złożoność systemów dla większych ssaków. Opisujemy system Langendorffa dla dużych modeli zwierzęcych, który pozwala na zastosowanie go u różnych gatunków, w tym ludzi, i stosunkowo łatwe pozyskiwanie danych.

Izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych

Since its introduction in the late 19th century, the Langendorff isolated heart perfusion apparatus, and the subsequent development of the working heart ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar funkcji serca dużych zwierząt w układzie ex vivo. Jest to realizowane poprzez wstępne złożenie aparatury do pracy serca. W drugim kroku krew jest płukana i odtwarzana z użyciem soli fizjologicznej, a w ostatnim kroku optymalizuje się poziom elektrolitów.Serce zostaje przymocowane w sposób odwzorowujący parametry hemodynamiczne in vivo. Ostatecznie, do pomiarów ilościowych funkcji komory można wykorzystać cewnik konduktancji wprowadzony do komory. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie modeli małych zwierząt, jest uzyskanie danych o znaczeniu klinicznym przy jednoczesnym uniknięciu czynników zakłócających o charakterze immunologicznym, które występują podczas transplantacji u dużych zwierząt.Aby zbudować aparat Langora, należy rozpocząć od połączenia zbiornika serca ze zbiornikiem krwi za pomocą drenu o średnicy 3/8 cala, upewniając się, że dren przechodzi przez pompę perystaltyczną. Następnie połącz zbiornik krwi z grzewczym natleniaczem za pomocą kolejnego drenu o średnicy 3/8 cala, a następnie podłącz natleniacz do złączki w kształcie litery Y. Jedno ramię złączki Y podłącz do pompy odśrodkowej.Następnie podłącz pompę odśrodkową do drugiego łącznika Y, aby stworzyć pułapkę pęcherzykową oraz punkt wprowadzenia przetwornika ciśnienia. Przymocuj fragment rurki o średnicy 3/8 cala, aby zabezpieczyć zawór hemostatyczny na ramieniu skierowanym do góry. Następnie przymocuj fragment rurki o średnicy 3/8 cala do ramienia skierowanego w dół i podłącz drugie ramię łącznika Y do wlotu komory preload.Należy upewnić się, że ta rurka przechodzi przez drugą pompę perystaltyczną. Najpierw podłącz linię wstępnego napełniania do części odpływowej komory wstępnego napełniania. Zostanie ona ostatecznie połączona z lewym przedsionkiem.Podłącz dodatkowy przewód o średnicy trzech ósmych cala do odpływu tej komory, a następnie podłącz butlę z tlenem i urządzenie grzewcze do utleniacza z podgrzewaniem. Na koniec zaklemuj linię prowadzącą od łącznika Y do komory wstępnego obciążenia, ponieważ linia ta nie będzie używana aż do momentu przełączenia serca w tryb pracy. Teraz włącz urządzenie grzewcze butli z tlenem, pompę perystaltyczną łączącą dwa zbiorniki oraz pompę odśrodkową i przemyj krew zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie zrekonstytuuj przemyte erytrocyty za pomocą soli fizjologicznej do pożądanej wartości hematokrytu. Dodaj rozcieńczoną krew do aparatury Langora i sprawdź poziom hematokrytu. Dostosuj prędkości obu pomp, aby rozpocząć przepływ krwi przez system, z wyłączeniem komory wstępnej.Sprawdź pH oraz poziom elektrolitów w mieszaninie krwi i dostosuj je do wartości fizjologicznych dla użytego gatunku, aby zapobiec szkodliwemu napływowi wapnia podczas reperfuzji. Początkowo utrzymuj poziom wapnia w aparacie Langendorffa na poziomie od 0,3 do 0,5 mmol/L. Po skalibrowaniu aparatu Langendorffa szybko wyjmij odpowiednio odpoczyte serce z pojemnika do przechowywania.Wylać roztwór do przechowywania z komór. Osuszyć tkankę i ją zważyć. Następnie umieścić serce z powrotem w pojemniku do przechowywania, orientując je tak, aby aorta była skierowana ku górze, co pomoże utrzymać niską temperaturę mięśnia sercowego.Następnie wprowadź kaniulę o średnicy trzech ósmych cala do aorty i zabezpiecz ją opaską zaciskową. Zmniejsz wydajność pompy odśrodkowej do powolnego strumienia i wlewaj krew do aorty, aż zostanie ona całkowicie wypełniona. Gdy aorta będzie pełna krwi, ostrożnie podłącz kaniulę aortalną do przewodu aortalnego w urządzeniu L endorf, odnotowując godzinę podłączenia.Następnie wprowadź skalibrowany przetwornik ciśnienia przez zawór hemostatyczny do aorty natywnej. Rozpocznij pomiary ciśnienia i reguluj prędkość pompy odśrodkowej, aż do osiągnięcia pożądanego ciśnienia reperfuzji. Ściśle monitoruj ciśnienie w aorcie, zwłaszcza podczas początkowej reperfuzji, i stopniowo zwiększaj temperaturę w urządzeniu do ogrzewania, aż temperatura wewnątrzmięśniowa osiągnie 37 °C.Pobierz próbkę kontrolną w punkcie zero z rezerwuaru krwi żylnej w celu pomiaru pH, elektrolitów oraz innych parametrów biochemicznych. Następnie wprowadź sondę temperatury do przegrody i monitoruj temperaturę mięśnia sercowego. Pobieraj próbki krwi co 15 minut, dostosowując parametry fizjologiczne zgodnie z wymaganiami eksperymentu i dodając około jednego milimola wapnia do roztworu krwi co pięć minut.Należy upewnić się, że stężenie wapnia zjonizowanego przekracza 0,8 mmol/l przed uruchomieniem trybu pracy. Po przełączeniu serca w tryb pracy, należy zastosować szew z nici polipropylenowej 3-0, aby wykonać szew pierścieniowy w wierzchołku lewej komory. Następnie należy użyć igły 16G, aby wykonać nacięcie w obrębie szwu pierścieniowego.Wprowadź cewnik do pomiaru konduktancji objętościowej i ciśnienia przez nacięcie w okolicy wierzchołka. Sprawdź wyjściowe dane, aby ustalić, ile segmentów objętościowych jest aktywnych. Jeśli nie wszystkie segmenty są aktywne, koryguj położenie cewnika aż do momentu ich aktywacji; konieczne może być lekkie skręcenie cewnika w celu optymalizacji morfologii pętli.Następnie, używając odpowiednio skalibrowanego cewnika, należy zebrać dane dotyczące ciśnienia i objętości w stanie spoczynkowym przez co najmniej 30 sekund, aby określić pomiary funkcji serca zależne od objętości. Po uzyskaniu wystarczającej liczby pętli, należy użyć zacisku do rurek, aby powoli zamknąć rurkę powrotnego wypełnienia (preload). Pętle ciśnienie-objętość powinny zacząć się zmniejszać i przesuwać w dół oraz w lewo.Procedurę tę nazywa się walk down. Po uzyskaniu od 10 do 15 sekund danych z walk down, zwolnij zacisk rurki, aby umożliwić powrót obciążenia wstępnego do lewego przedsionka i uzyskać pomiary funkcji serca niezależne od objętości. Na koniec kliknij przycisk zatrzymania, aby zakończyć zbieranie danych w celu uzyskania pomiarów powtórzonych.Po pięciu minutach powtórz procedurę. Począwszy od etapu okluzji, zmiany oporu wieńcowego mogą powodować wahania ciśnienia perfuzyjnego. Odchylenia te mogą być niewielkie i z czasem samoistnie się wyrównywać.W niektórych przypadkach jednak zmienności te mogą być gwałtowne i wymagać regulacji przepływu przez pompę odśrodkową, aby utrzymać pożądane ciśnienie reperfuzyjne. W tym doświadczeniu, po początkowym wprowadzeniu cewnika pomiaru objętości i ciśnienia do serca świni, które było przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, pętle były słabej jakości, z licznymi obszarami nakładania się linii i brakiem rozpoznawalnych komponentów cyklu sercowego. Jednakże, po minimalnej manipulacji cewnikiem w obrębie komory, morfologia pętli uległa znacznemu poprawieniu, co pozwoliło na uzyskanie pomiarów dzięki optymalizacji pozycji cewnika.Pętle uzyskane w obiegu ex vivo mogą mieć inną morfologię niż pętle in vivo, co prawdopodobnie wynika z innej orientacji serca w obiegu w porównaniu z zwierzęciem w pozycji tyłem oraz z braku przyczepów anatomicznych występujących u żywego zwierzęcia. Ponadto zastosowanie elektrod stymulujących w celu regulacji częstotliwości pracy serca wprowadza zewnętrzny prąd elektryczny, co prowadzi do powstania skoku widocznego w prawym dolnym fragmencie pętli ex vivo. Niemniej jednak, dopóki pętle te nadal wykazują komponenty cyklu sercowego, mogą one nadal dostarczać interpretowalnych danych.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak elektrokardiografia i echokardiografia, aby zbadać pozostałe właściwości fizyczne serca, w tym przewodnictwo.

an-isolated-working-heart-system-for-large-animal-models

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

System izolowanych pracujących serc dla dużych modeli zwierząt

Celem jest monitorowanie stanu redoks mitochondriów w izolowanych sercach w kontekście fizjologicznych ciśnień obciążenia wstępnego i następczego. Przedstawiono biventrykularny model pracującego serca królika. Do monitorowania stanu redoks mitochondriów w tkance epikardialnej wykorzystano obrazowanie fluorescencyjne NADH o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

Izolowane modele pracującego serca mogą być używane do pomiaru wpływu warunków obciążenia, tętna i leków na wydajność mięśnia sercowego i zużycie tlenu. Opisano metody przygotowania modelu pracy lewego serca gryzonia, który pozwala na badanie wydolności skurczowej i rozkurczowej oraz zużycia tlenu w różnych warunkach.

Model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu

Normothermic ex situ heart perfusion (ESHP), utrzymuje serce w bijącym, półfizjologicznym stanie. W przypadku wykonywania w trybie roboczym ESHP daje możliwość przeprowadzenia zaawansowanych ocen funkcji serca dawcy i żywotności narządów. W tym miejscu opisujemy naszą metodę oceny wydolności mięśnia sercowego podczas ESHP.

Normothermiczna perfuzja serca ex situ w trybie pracy: ocena czynności serca i metabolizmu

Tutaj opisujemy przedkliniczny model ortotopowego przeszczepu serca na dużych zwierzętach (świniach), który został mocno ugruntowany i wykorzystany do zbadania nowych strategii kardioprotekcyjnych.

Przedkliniczny model ortotopowego przeszczepiania serca od świń

Ten protokół pokazuje proste i elastyczne podejście do oceny nowych czynników kondycjonujących lub strategii zwiększających wykonalność dawstwa serca po śmierci krążeniowej.

Przedkliniczny model dawstwa serca po śmierci krążeniowej

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Ten artykuł przedstawia skuteczną metodę przeprowadzenia niedokrwienia mięśnia sercowego i następującej po nim przewlekłej reperfuzji u szczurów przy użyciu minimalnie inwazyjnego podejścia. Ponadto funkcję hemodynamiczną lewej komory szczurów ocenia się za pomocą echokardiografii i izolowanych metod pracy serca.

Półminimalnie inwazyjna metoda indukcji zawału mięśnia sercowego u szczurów i ocena czynności serca przez izolowany działający układ serca

Terapia genowa mięśnia sercowego w chorobie niedokrwiennej serca jest bardzo obiecująca dla przyszłych terapii. W tym miejscu przedstawiamy duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w niedokrwiennym sercu.

Duży model zwierzęcy do oceny skuteczności terapii genowej w chorobie niedokrwiennej serca

Ze względu na skomplikowaną anatomię, konsekwentnie powtarzalny protokół sekcji i pobierania próbek sercowych może być trudny do wdrożenia. W niniejszym manuskrypcji przedstawiono kluczowe elementy niektórych standardowych protokołów rozwarstwiania serca, podkreślając zarówno ogólne podejścia do badania, jak i miejsca pobierania próbek powszechnie stosowane w badaniu histopatologicznym.

Techniki preparacji i histologiczne pobieranie próbek serca w dużych modelach zwierzęcych pod kątem chorób sercowo-naczyniowych

Protokół opisuje model dawstwa dużych zwierząt (świń) po śmierci krążeniowej, po którym następuje normotermiczna perfuzja regionalna klatki piersiowej i brzucha, która ściśle symuluje scenariusz kliniczny w transplantacji serca i może potencjalnie ułatwić badania i strategie terapeutyczne.

Wielkozwierzęcy model dawstwa po śmierci krążeniowej i regionalnej perfuzji normomicznej do oceny serca

Ten protokół opisuje minimalnie inwazyjną procedurę chirurgiczną dla wstępującego pasma aorty u świń.

Małoinwazyjny model zwężenia zastawki aortalnej u świń

Poznaj metodę Langendorffa do pomiaru funkcji serca dużych zwierząt ex vivo. Technika umożliwia zbieranie danych klinicznych przy unikaniu zakłóceń immunologicznych w kontrolowanych warunkach.

Izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych

Przeglądaj więcej filmów