Izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar funkcji serca dużych zwierząt w układzie ex vivo. Jest to realizowane poprzez wstępne złożenie aparatury do pracy serca. W drugim kroku krew jest płukana i odtwarzana z użyciem soli fizjologicznej, a w ostatnim kroku optymalizuje się poziom elektrolitów.

Serce zostaje przymocowane w sposób odwzorowujący parametry hemodynamiczne in vivo. Ostatecznie, do pomiarów ilościowych funkcji komory można wykorzystać cewnik konduktancji wprowadzony do komory. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wykorzystanie modeli małych zwierząt, jest uzyskanie danych o znaczeniu klinicznym przy jednoczesnym uniknięciu czynników zakłócających o charakterze immunologicznym, które występują podczas transplantacji u dużych zwierząt.

Aby zbudować aparat Langora, należy rozpocząć od połączenia zbiornika serca ze zbiornikiem krwi za pomocą drenu o średnicy 3/8 cala, upewniając się, że dren przechodzi przez pompę perystaltyczną. Następnie połącz zbiornik krwi z grzewczym natleniaczem za pomocą kolejnego drenu o średnicy 3/8 cala, a następnie podłącz natleniacz do złączki w kształcie litery Y. Jedno ramię złączki Y podłącz do pompy odśrodkowej.

Następnie podłącz pompę odśrodkową do drugiego łącznika Y, aby stworzyć pułapkę pęcherzykową oraz punkt wprowadzenia przetwornika ciśnienia. Przymocuj fragment rurki o średnicy 3/8 cala, aby zabezpieczyć zawór hemostatyczny na ramieniu skierowanym do góry. Następnie przymocuj fragment rurki o średnicy 3/8 cala do ramienia skierowanego w dół i podłącz drugie ramię łącznika Y do wlotu komory preload.

Należy upewnić się, że ta rurka przechodzi przez drugą pompę perystaltyczną. Najpierw podłącz linię wstępnego napełniania do części odpływowej komory wstępnego napełniania. Zostanie ona ostatecznie połączona z lewym przedsionkiem.

Podłącz dodatkowy przewód o średnicy trzech ósmych cala do odpływu tej komory, a następnie podłącz butlę z tlenem i urządzenie grzewcze do utleniacza z podgrzewaniem. Na koniec zaklemuj linię prowadzącą od łącznika Y do komory wstępnego obciążenia, ponieważ linia ta nie będzie używana aż do momentu przełączenia serca w tryb pracy. Teraz włącz urządzenie grzewcze butli z tlenem, pompę perystaltyczną łączącą dwa zbiorniki oraz pompę odśrodkową i przemyj krew zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie zrekonstytuuj przemyte erytrocyty za pomocą soli fizjologicznej do pożądanej wartości hematokrytu. Dodaj rozcieńczoną krew do aparatury Langora i sprawdź poziom hematokrytu. Dostosuj prędkości obu pomp, aby rozpocząć przepływ krwi przez system, z wyłączeniem komory wstępnej.

Sprawdź pH oraz poziom elektrolitów w mieszaninie krwi i dostosuj je do wartości fizjologicznych dla użytego gatunku, aby zapobiec szkodliwemu napływowi wapnia podczas reperfuzji. Początkowo utrzymuj poziom wapnia w aparacie Langendorffa na poziomie od 0,3 do 0,5 mmol/L. Po skalibrowaniu aparatu Langendorffa szybko wyjmij odpowiednio odpoczyte serce z pojemnika do przechowywania.

Wylać roztwór do przechowywania z komór. Osuszyć tkankę i ją zważyć. Następnie umieścić serce z powrotem w pojemniku do przechowywania, orientując je tak, aby aorta była skierowana ku górze, co pomoże utrzymać niską temperaturę mięśnia sercowego.

Następnie wprowadź kaniulę o średnicy trzech ósmych cala do aorty i zabezpiecz ją opaską zaciskową. Zmniejsz wydajność pompy odśrodkowej do powolnego strumienia i wlewaj krew do aorty, aż zostanie ona całkowicie wypełniona. Gdy aorta będzie pełna krwi, ostrożnie podłącz kaniulę aortalną do przewodu aortalnego w urządzeniu L endorf, odnotowując godzinę podłączenia.

Następnie wprowadź skalibrowany przetwornik ciśnienia przez zawór hemostatyczny do aorty natywnej. Rozpocznij pomiary ciśnienia i reguluj prędkość pompy odśrodkowej, aż do osiągnięcia pożądanego ciśnienia reperfuzji. Ściśle monitoruj ciśnienie w aorcie, zwłaszcza podczas początkowej reperfuzji, i stopniowo zwiększaj temperaturę w urządzeniu do ogrzewania, aż temperatura wewnątrzmięśniowa osiągnie 37 °C.

Pobierz próbkę kontrolną w punkcie zero z rezerwuaru krwi żylnej w celu pomiaru pH, elektrolitów oraz innych parametrów biochemicznych. Następnie wprowadź sondę temperatury do przegrody i monitoruj temperaturę mięśnia sercowego. Pobieraj próbki krwi co 15 minut, dostosowując parametry fizjologiczne zgodnie z wymaganiami eksperymentu i dodając około jednego milimola wapnia do roztworu krwi co pięć minut.

Należy upewnić się, że stężenie wapnia zjonizowanego przekracza 0,8 mmol/l przed uruchomieniem trybu pracy. Po przełączeniu serca w tryb pracy, należy zastosować szew z nici polipropylenowej 3-0, aby wykonać szew pierścieniowy w wierzchołku lewej komory. Następnie należy użyć igły 16G, aby wykonać nacięcie w obrębie szwu pierścieniowego.

Wprowadź cewnik do pomiaru konduktancji objętościowej i ciśnienia przez nacięcie w okolicy wierzchołka. Sprawdź wyjściowe dane, aby ustalić, ile segmentów objętościowych jest aktywnych. Jeśli nie wszystkie segmenty są aktywne, koryguj położenie cewnika aż do momentu ich aktywacji; konieczne może być lekkie skręcenie cewnika w celu optymalizacji morfologii pętli.

Następnie, używając odpowiednio skalibrowanego cewnika, należy zebrać dane dotyczące ciśnienia i objętości w stanie spoczynkowym przez co najmniej 30 sekund, aby określić pomiary funkcji serca zależne od objętości. Po uzyskaniu wystarczającej liczby pętli, należy użyć zacisku do rurek, aby powoli zamknąć rurkę powrotnego wypełnienia (preload). Pętle ciśnienie-objętość powinny zacząć się zmniejszać i przesuwać w dół oraz w lewo.

Procedurę tę nazywa się walk down. Po uzyskaniu od 10 do 15 sekund danych z walk down, zwolnij zacisk rurki, aby umożliwić powrót obciążenia wstępnego do lewego przedsionka i uzyskać pomiary funkcji serca niezależne od objętości. Na koniec kliknij przycisk zatrzymania, aby zakończyć zbieranie danych w celu uzyskania pomiarów powtórzonych.

Po pięciu minutach powtórz procedurę. Począwszy od etapu okluzji, zmiany oporu wieńcowego mogą powodować wahania ciśnienia perfuzyjnego. Odchylenia te mogą być niewielkie i z czasem samoistnie się wyrównywać.

W niektórych przypadkach jednak zmienności te mogą być gwałtowne i wymagać regulacji przepływu przez pompę odśrodkową, aby utrzymać pożądane ciśnienie reperfuzyjne. W tym doświadczeniu, po początkowym wprowadzeniu cewnika pomiaru objętości i ciśnienia do serca świni, które było przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny, pętle były słabej jakości, z licznymi obszarami nakładania się linii i brakiem rozpoznawalnych komponentów cyklu sercowego. Jednakże, po minimalnej manipulacji cewnikiem w obrębie komory, morfologia pętli uległa znacznemu poprawieniu, co pozwoliło na uzyskanie pomiarów dzięki optymalizacji pozycji cewnika.

Pętle uzyskane w obiegu ex vivo mogą mieć inną morfologię niż pętle in vivo, co prawdopodobnie wynika z innej orientacji serca w obiegu w porównaniu z zwierzęciem w pozycji tyłem oraz z braku przyczepów anatomicznych występujących u żywego zwierzęcia. Ponadto zastosowanie elektrod stymulujących w celu regulacji częstotliwości pracy serca wprowadza zewnętrzny prąd elektryczny, co prowadzi do powstania skoku widocznego w prawym dolnym fragmencie pętli ex vivo. Niemniej jednak, dopóki pętle te nadal wykazują komponenty cyklu sercowego, mogą one nadal dostarczać interpretowalnych danych.

Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak elektrokardiografia i echokardiografia, aby zbadać pozostałe właściwości fizyczne serca, w tym przewodnictwo.