Name: Wpływ produktów z męskich gruczołów dodatkowych na składanie jaj u ślimaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 19 s
Description: Poznaj metodę badania wpływu białek płynu nasiennego na składanie jaj u ślimaków Lymnaea stagnalis. Protokół obejmuje izolację osobników, inseminację sztuczną i analizę behawioralną w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy M.R. Helmusowi za podkład głosowy, C.M. Popelierowi, S. Ypenburgowi i C. Levesque za pomoc techniczną. Badania te są wspierane finansowo przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO), Królewską Holenderską Akademię Sztuki i Nauki (KNAW) oraz Japońską Organizację Usług Studenckich (JASSO). Publikacja została wsparta grantem Open Access przyznanym przez NWO dla JMK.

1. Obiekt hodowlany
<ol>
	<li>Uzyskać dorosłe próbki Lymnaea stagnalis (L.) z hodowli laboratoryjnej, takiej jak ta na Uniwersytecie VU.</li>
	<li>Utrzymywać wodę o niskiej zawartości miedzi na poziomie 20 °C zarówno w obiekcie hodowlanym (), jak i w zbiornikach doświadczalnych, które mają ciągłą wymianę wody.</li>
	<li>Ustaw cykl jasny/ciemny na 12 godzin: 12 godzin.</li>
	<li>Do hodowli karm dorosłe ślimaki sałatą wolną od pestycydów ad libitum, młode młode osobniki karm płatkami TetraPhyll (pokarm dla ryb). Utrzymuj ślimaki w oddzielnych zbiornikach w zależności od ich wieku, zaczynając od mas jajowych, które są składane w ciągu 24 godzin.</li>
	<li>Po usunięciu ślimaków ze zbiorników hodowlanych nie są one zwracane, aby uniknąć skutków przetrzymywania w nieco innych warunkach, a także zapobiec pseudoreplikacji.</li>
</ol>
2. Sekcja
<ol>
	<li>Izoluj ślimaki przez 1 tydzień i karm je ad libitum, aby upewnić się, że mają pełne zapasy nasienia i płynu nasiennego.</li>
	<li>Przygotuj mikroskop stereoskopowy, płytkę separacyjną z szpilkami, małe nożyczki chirurgiczne, grube i cienkie kleszcze, strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną roztworem 50 mM MgCl2, igły do wstrzykiwań (0,3 mm x 13 mm) i kilka ręczników papierowych.</li>
	<li>Poddaj ślimaka eutanazji przez wstrzyknięcie roztworu MgCl2 (zwykle 3 ml lub więcej w przypadku dorosłych ślimaków o długości skorupy 31,6 ± 2,1 mm i mokrej masie 2,89 ± 0,55 g). Wbić się w stopę igłą do wstrzykiwań pod kątem 45° i wstrzykiwać, delikatnie naciskając, w sposób ciągły, aż ślimak rozluźni się i pozostanie rozciągnięty (w ciągu kilku sekund). Wyjąć igłę do wstrzykiwań i sprawdzić, czy ślimak został poddany eutanazji (na przykład sprawdzając, czy nie ma odruchu wycofania macki).</li>
	<li>Ostrożnie usuń skorupę zgodnie z jej krzywizną za pomocą grubych kleszczy. W połowie delikatnie odłącz mięsień kolumienkowy od skorupy, zeskrobując kleszczami. Delikatnie wykręć ślimaka z muszli, podążając za kierunkiem nawijania muszli.</li>
	<li>Umieść ślimaka na płytce preparacyjnej i przypnij tylny koniec stopy. Następnie umieść szpilkę w głowie i napnij ślimaka, aby ułatwić sekcję.</li>
	<li>Zlokalizuj żeńskie gonopory, które później będą punktem odniesienia do sekcji.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek chirurgicznych i cienkich kleszczy wykonaj pierwsze nacięcie, tuż pod krawędzią płaszcza i przetnij w kierunku żeńskiego gonoporu. Gdy jedno z ostrzy nożyczek zostanie wepchnięte pod ścianę ciała, podnieś je lekko, aby upewnić się, że przecięta została tylko ściana ciała, a nie żaden z narządów wewnętrznych. Kontynuuj cięcie powyżej gonoporu w kierunku głowy i tnij w linii prostej.</li>
	<li>Zlokalizuj gruczoł krokowy (tylny) i pęcherzyki nasienne (przedni). Dokładnie je rozbioruj i trzymaj na lodzie. Użyj ich do przygotowania roztworów testowych zawierających płyn nasienny i/lub plemniki. Jako podłoże nośnikowe należy stosować fizjologiczną sól fizjologiczną Lymnaea (5,83 mmol/L CaCl2·2H2O, 3,76 mmol/L MgCl2·6H2O, 42,69 mmol/L NaCl, 37,53 mmol/L KCl).</li>
	<li>Zbierz płyn nasienny, który jest obecny w świetle gruczołu krokowego, a także plemniki z pęcherzyków nasiennych. Następnie zawiesić oba w soli fizjologicznej w oddzielnych fiolkach, delikatnie odciągając ich zawartość i usuwając tkankę narządu za pomocą kleszczy. Trzymaj na lodzie i zużyj tego samego dnia. Później wymieszaj te zawiesiny, aby stworzyć różne roztwory lecznicze.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie dopochwowe
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem procedury iniekcji dopochwowej należy przygotować silikonową otoczkę (dopasowaną do końcówki otoczki), strzykawki 1 mm, silikonową rurkę o średnicy 1 mm i średnicy 1 mm, stępione igły iniekcyjne (0,3 mm x 13 mm), grube kleszczyki i taką samą strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną roztworem 50 mM MgCl2 wyposażoną w ostrą igłę do wstrzykiwań.</li>
	<li>Zebrać plemniki, potrzebne do dodania do płynu nasiennego (lub pojedynczych białek płynu nasiennego) w niektórych zabiegach; biologicznie istotna dawka równa się 1/3 gruczołu krokowego i pęcherzyka nasiennego na wstrzyknięcie. 
	UWAGA: W sekcji reprezentatywnych wyników (ryc. 1) przedstawiono wyniki eksperymentu z trzema różnymi metodami leczenia: kontrolą (podłoże nośnikowe, tj. sól fizjologiczna), samą owipostatyną (jednym ze zidentyfikowanych białek płynu nasiennego) i owipostatyną w towarzystwie plemników. Ponadto, aby oszacować biologicznie istotną dawkę u innych gatunków, należy określić różnicę w masie gruczołu krokowego osobników, które niedawno się kojarzyły, i osobników, które pozostały w izolacji płciowej16.</li>
	<li>Przygotować strzykawki o pojemności 1 ml dla każdego z przygotowanych roztworów testowych. Napełnić każdą strzykawkę jednym roztworem i upewnić się, że w środku nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Na każdej strzykawce należy umieścić igłę do wstrzykiwań.</li>
	<li>Do wstrzykiwań należy użyć silikonowej rurki o średnicy 1 mm i minimalnej długości 10 cm.</li>
	<li>Ostrożnie nasunąć silikonową rurkę na igłę do wstrzykiwań, uważając, aby nie przebić rurki, a następnie usunąć powietrze z rurki, delikatnie wywierając nacisk na strzykawkę.</li>
	<li>Znieczulić ślimaka, postępując zgodnie z tym samym protokołem, co w ppkt 2.3. Tym razem należy upewnić się, że nie wstrzykujesz więcej niż 2-3 ml 50 mM MgCl2.</li>
	<li>Połóż ślimaka w foremce muszlowej, aby utrzymać go w stabilnej pozycji.</li>
	<li>Zlokalizuj samicę gonopora, która jest wyraźnie widoczna jako biała plama po prawej stronie zwierzęcia, przed prawą macką i samcem gonopora (ta lokalizacja dotyczy również innych gatunków ślimaków słodkowodnych). Upewnij się, że masz niezakłócony dostęp.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków przytrzymaj koniec rurki silikonowej i delikatnie włóż około 2-4 mm rurki silikonowej do żeńskiego gonopory.</li>
	<li>Ostrożnie docisnąć strzykawkę i wstrzyknąć 0,03 ml roztworu testowego. Odczekaj pół minuty, aby ciśnienie w rurce rozprzestrzeniło się do przewodu pokarmowego kobiety przed wyjęciem rurki.</li>
	<li>Ślimak poddany działaniu środka należy umieścić z powrotem w pojemniku izolacyjnym, gdzie można go monitorować, i pozwolić mu dojść do siebie po sedacji w zbiorniku doświadczalnym.</li>
</ol>
4. Test biologiczny
<ol>
	<li>Oznacz każdego ślimaka w celu identyfikacji i zmierz długość jego muszli. Ten ostatni jest dobrym wskaźnikiem wielkości, co jest istotne przy ilościowym określaniu wydajności reprodukcyjnej.</li>
	<li>Trzymaj każdego ślimaka oddzielnie w pojemniku o pojemności 460 ml, który jest perforowany, aby umożliwić wymianę wody w zbiorniku eksperymentalnym. Ważne jest, aby wszystkie pojemniki ustawić we właściwej orientacji, z perforacją w kierunku przepływu wody, aby umożliwić sprawną wymianę wody.</li>
	<li>Podczas testu biologicznego regularnie karm ślimaki standardową ilością sałaty. Użyj okrągłego, metalowego dziurkacza do krojenia sałaty. W tym protokole używane są krążki sałaty o długości 19,6cm2, co w przybliżeniu odpowiada ilości, jaką maksymalnie mogą zjeść w ciągu jednego dnia.</li>
	<li>Zbierz masę jajową za pomocą płaskiej strony szpatułki i zeskrob masę jajeczną ze ścianki pojemnika. Użyj strony łyżki, aby zebrać masę jajeczną. 
	UWAGA: Nieprzezroczyste masy jajowe, które właśnie zostały złożone, nie mogą być używane do skanowania (stają się przezroczyste w ciągu kilku godzin po złożeniu). W przypadku gatunku modelowego w tym protokole, Lymnaea stagnalis, codziennie sprawdzaj masę jaj, ponieważ produkują one 2-3 masy jaj tygodniowo. Może się to różnić u innych gatunków.</li>
	<li>Zeskanuj zebrane masy jajowe cyfrowo, za pomocą komputera (laptopa) zawierającego sterownik skanera, skanera płaskiego, standardowej skali milimetrowej, szpatułki, płytek transferowych i płytek szklanych.</li>
	<li>Umieść każdą masę jajeczną na płytkach do przenoszenia i powtarzaj, aż talerze będą pełne. Następnie wytrzyj masy jajowe do sucha na ręczniku papierowym i przenieś je na szklane płytki w tej samej kolejności, co na płytkach transferowych.</li>
	<li>Odwróć każdą płytkę do góry nogami (masy jaj przykleją się do szklanej płytki) i ostrożnie umieść ją na skanerze płaskim, tuż pod skalą milimetrową. Zastosuj lekki nacisk, aby spłaszczyć masy jajowe, co spowoduje równomierne rozprowadzenie jaj, tak aby wszystkie były widoczne w tej samej płaszczyźnie ostrości. Dopasuj płytki za pomocą znormalizowanej ilości taśmy wokół dwóch krawędzi, aby upewnić się, że wszystkie jajka są równomiernie spłaszczone.</li>
	<li>Dostosuj ustawienia skanera. Ważne jest, aby ustawić rozdzielczość do maksimum, wykonać podgląd skanu, przyciąć obszar roboczy oraz dostosować jasność i kontrast. Zeskanuj masy jajowe.</li>
	<li>Umieść każdą masę jajową w oddzielnie oznakowanej szklanej fiolce o pojemności 20 ml w celu dalszego rozwoju i wylęgu.</li>
	<li>Odświeżaj wodę w fiolkach wylęgowych co drugi dzień, aby była odpowiednio natleniona. Zrób to zgodnie z liczbą i wielkością piskląt w następującej kolejności: dekantacja/wylanie (brak piskląt), przelanie (początek wyklucia) i odciągnięcie wody pipetą (wiele piskląt).</li>
</ol>
5. Mierzenie i liczenie jaj
<ol>
	<li>Zainstaluj bezpłatnie dostępne oprogramowanie do analizy obrazu ImageJ (NIH, USA) i wtyczkę licznika komórek.</li>
	<li>Otwórz ImageJ, a także program arkusza kalkulacyjnego, do którego chcesz przenieść dane. Następnie otwórz zeskanowany obraz mas jajowych w ImageJ.</li>
	<li>Ustaw skalę za pomocą narzędzia do powiększania, aby przejść do skali milimetrowej. Powiększ i dostosuj okno o 1 mm, aby wypełnić ekran. Narysuj linię za pomocą narzędzia Linia między dwiema liniami wskazującymi 1 mm. Przejdź do pozycji Analizuj i Ustaw skalę. W menu podręcznym pojawi się opcja zmierzonej długości, dostosuj Znana odległość do 1 i jednostkę długości na mm. Zaznacz pole Globalne i zamknij okno.</li>
	<li>Ustaw preferowane wymiary (długość, szerokość, obwód), przechodząc do opcji Analizuj, a ustaw pomiary, wybierając opcję Obszar i Średnica Fereta (długość i szerokość). Kliknij przycisk OK, aby potwierdzić i kontynuować analizę obrazu.</li>
	<li>Aby zmierzyć jaja, powiększ jajko o pierwszej masie jajowej, którą należy zmierzyć. Zalecany jest zoom 800%. Następnie, za pomocą narzędzia eliptycznego, narysuj owal dokładnie wokół jajka, naciśnij ctrl+D, aby narysować obwód na obrazie (aby zapobiec dwukrotnemu mierzeniu tego samego jajka). Następnie naciśnij ctrl+M, aby zapisać miarę właściwości owalu (długość, szerokość, obwód); Otworzy się wyskakujący ekran z wyświetlaniem Measurements. 
	UWAGA: Stosowanie narzędzia eliptycznego do mierzenia jaj nie dotyczy wszystkich gatunków. W przypadku gatunków o jajach o niejednorodnym kształcie należy zamiast tego użyć selekcji odręcznej.</li>
	<li>Zmierz tyle jaj, ile to konieczne, a następnie zapisz miary jako .xls arkuszu. Opcjonalnie skopiuj dane bezpośrednio do arkusza.</li>
	<li>Następnie policz jajka w masie jajecznej, korzystając z okienka licznika i ręcznie wprowadź liczby do arkusza.</li>
	<li>Alternatywnie, policz poszczególne jaja na masę jaj za pomocą wtyczki licznika komórek. W tym celu przejdź do Wtyczki, a następnie Analizuj i wybierz Licznik komórek. Pojawi się okno licznika komórek, zaznacz pole "zachowaj oryginał" i naciśnij "zainicjuj". Pojawi się nowe okno licznika, wybierz narzędzie krzyżyk z paska narzędzi i wybierz typ licznika z menu licznika komórek. Policz poszczególne jaja, klikając je w oknie licznika komórek. Obserwuj łączną liczbę obok typu licznika w menu licznika komórek. Skopiuj tę liczbę ręcznie do arkusza kalkulacyjnego lub uzyskaj wyniki, naciskając przycisk Wyniki.</li>
	<li>Policz wiele mas jaj w jednym zliczaniu, dodając typy liczników, jeśli to konieczne.</li>
</ol>

<ol><li>Mann, T., Lutwak-Mann, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMann%2C+T+%22Male+reproductive+function+and+semen%22">Male reproductive function and semen</a>. , Springer-Verlag. (1981).</li>
<li>Arnqvist, G., Rowe, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArnqvist%2C+G+%22Sexual+Conflict%22">Sexual Conflict</a>. , Princeton University Press. Princeton, New Jersey. (2005).</li>
<li>Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBirkhead%2C+TR+%22Sperm+Biology%2C+an+Evolutionary+Approach%22">Sperm Biology, an Evolutionary Approach</a>. , Elsevier. (2008).</li>
<li>Koene, J. M., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allohormones%22%3A+A+class+of+bioactive+substances+favoured+by+sexual+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%22%5BJournal%5D)">Allohormones": A class of bioactive substances favoured by sexual selection.</a> Journal of Comparative Physiology A. 187 (5), 323-326 (2001).</li>
<li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biological Reviews. 45 (4), 525-567 (1970).</li>
<li>Perry, J. C., Sirot, L., Wigby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+seminal+symphony%3A+how+to+compose+an+ejaculate%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The seminal symphony: how to compose an ejaculate.</a> Trends in Ecology & Evolution. 28 (7), 414-422 (2013).</li>
<li>Baldini, F., Gabrieli, P., Rogers, D. W., Catteruccia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+composition+of+male+accessory+gland+secretions+in+Anopheles+gambiae%3A+a+comparison+with+other+insect+vectors+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Function and composition of male accessory gland secretions in Anopheles gambiae: a comparison with other insect vectors of infectious diseases.</a> Pathogens and Global Health. 106 (2), 82-93 (2012).</li>
<li>Xu, J., Baulding, J., Palli, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+Tribolium+castaneum+seminal+fluid+proteins%3A+identification+of+an+angiotensin-converting+enzyme+as+a+key+player+in+regulation+of+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics of Tribolium castaneum seminal fluid proteins: identification of an angiotensin-converting enzyme as a key player in regulation of reproduction.</a> Journal of Proteomics. 78, 83-93 (2013).</li>
<li>Jarne, P., Auld, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+mix+it+up+too%3A+The+distribution+of+self-fertilization+among+hermaphroditic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Animals mix it up too: The distribution of self-fertilization among hermaphroditic animals.</a> Evolution. 60 (9), 1816-1824 (2006).</li>
<li>Nakadera, Y., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+strategies+in+hermaphroditic+gastropods%3A+conceptual+and+empirical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Reproductive strategies in hermaphroditic gastropods: conceptual and empirical approaches.</a> Canadian Journal of Zoology. 91 (6), 367-381 (2013).</li>
<li>Chase, R., Blanchard, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+snail%E2%80%99s+love-dart+delivers+mucus+to+increase+paternity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%22%5BJournal%5D)">The snail’s love-dart delivers mucus to increase paternity.</a> Proceedings of the Royal Society of London B. 273 (1593), 1471-1475 (2006).</li>
<li>Koene, J. M., Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+reproductive+system+of+the+snail+Helix+aspersa+caused+by+mucus+from+the+love+dart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Changes in the reproductive system of the snail Helix aspersa caused by mucus from the love dart.</a> Journal of Experimental Biology. 201 (15), 2313-2319 (1998).</li>
<li>Van Duivenboden, Y. A., Pieneman, A. W., Ter Maat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+mating+suppresses+fecundity+in+the+hermaphrodite+freshwater+snail+Lymnaea+stagnalis%3A+a+laboratory+study%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Multiple mating suppresses fecundity in the hermaphrodite freshwater snail Lymnaea stagnalis: a laboratory study.</a> Animal Behaviour. 33, 1184-1191 (1985).</li>
<li>Koene, J. M., Brouwer, A., Hoffer, J. N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+egg+laying+caused+by+a+male+accessory+gland+product+opens+the+possibility+for+sexual+conflict+in+a+simultaneous+hermaphrodite%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Biology%22%5BJournal%5D)">Reduced egg laying caused by a male accessory gland product opens the possibility for sexual conflict in a simultaneous hermaphrodite.</a> Animal Biology. 59 (1), 435-448 (2009).</li>
<li>Hoffer, J. N. A., Schwegler, D., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mating+rate+influences+female+reproductive+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite%2C+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Mating rate influences female reproductive investment in a simultaneous hermaphrodite, Lymnaea stagnalis.</a> Animal Behaviour. 84 (3), 523-529 (2012).</li>
<li>Koene, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+accessory+gland+protein+reduces+egg+laying+in+a+simultaneous+hermaphrodite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Male accessory gland protein reduces egg laying in a simultaneous hermaphrodite.</a> PLoS ONE. (5), (2010).</li>
<li>Nakadera, Y., Swart, E. M., Hoffer, J. N. A., Den Boon, O., Ellers, J., Koene, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receipt+of+seminal+fluid+proteins+causes+reduction+of+male+investment+in+a+simultaneous+hermaphrodite%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Receipt of seminal fluid proteins causes reduction of male investment in a simultaneous hermaphrodite.</a> Current Biology. 24, 1-4 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony protokół pokazuje, w jaki sposób pobrać płyn nasienny i jak to przetestować w sposób biologicznie miarodajny. Chociaż ta procedura jest pokazana przy użyciu ekstraktu z gruczołu krokowego, działanie pojedynczego oczyszczonego białka płynu nasiennego można również przetestować zgodnie z tą samą procedurą. Oczywiście, w takich badaniach zawsze kluczowe jest uwzględnienie odpowiednich kontroli (zabiegów pozorowanych), aby upewnić się, że procedura i/lub podłoże nośne nie wpływają na parametry w pytaniach14,16. Stosując tę metodę, wykazano już, że istnieje pojedyncze białko płynu nasiennego, a mianowicie Jajodatyna, która pośredniczy w zmniejszeniu nieśności jaj14,16. Białko to, wytwarzane w gruczole krokowym i przenoszone podczas krycia wraz z plemnikami, stanowi pierwszy w pełni scharakteryzowany składnik płynu nasiennego w jednoczesnym hermafrodycie i jak dotąd nie wykazuje żadnego podobieństwa do znanych białek.
Odkrycie, że owipostatyna zmniejsza produkcję masy jajowej u biorcy, potwierdza wcześniejsze prace wskazujące, że substancje zawarte w nasieniu mogą wpływać na składanie jaj13-15. Przenosząc biologicznie istotne ilości (patrz 3.216), można przekonująco wykazać, że to białko płynu nasiennego, a nie obecność samych plemników, pośredniczy w obserwowanym zmniejszeniu składania jaj (ryc. 1). Biorąc pod uwagę, że wielokrotne otrzymywanie płynu nasiennego poprzez naturalne kojarzenie zwiększa inwestycję na jajo15, obecnie bardzo istotne staje się ilościowe określenie innych parametrów składania jaj. Przedstawiony protokół przewiduje obecnie niezbędne do tego metody. Chociaż nie stwierdzono wpływu owipostatyny na powodzenie wylęgu jaj złożonych przez biorcę16, mogą istnieć inne białka płynu nasiennego, które działają w zgodzie z tym białkiem. W związku z tym parametry, które należy określić ilościowo w tym kontekście - obok częstotliwości składania jaj i liczby jaj - obejmują wielkość jaj, czas wylęgu, rozwój piskląt i wielkość piskląt. Ponadto możliwe jest przyjrzenie się wpływowi na inne procesy żeńskie niż składanie jaj, takie jak przechowywanie i wykorzystanie nasienia, a także alokacja zasobów rozrodczych w kierunku funkcji żeńskiej i męskiej14,17. Nie ulega wątpliwości, że przedstawiona metoda odgrywa zasadniczą rolę w rozwiązywaniu tych problemów następczych, zarówno w przypadku Lymnaea stagnalis , jak i innych ślimaków słodkowodnych.
Podsumowując, eksperymenty z wykorzystaniem tego protokołu pokazują, że przenoszone białka płynu nasiennego wpływają na wydajność rozrodczą samic biorcy w tych jednoczesnych hermafrodytach. Biorąc pod uwagę, że niewiele badań dotyczyło tego problemu, prawdopodobnie jest to znacznie bardziej powszechne w wewnętrznym zapładnianiu hermafrodytów, niż jest to obecnie odzwierciedlone w literaturze naukowej. Zwłaszcza, gdy zdamy sobie sprawę, że wykazano, iż prekopulacyjny wybór partnera i konkurencja plemników odgrywają ważną rolę w tych hermafrodytach14, co podkreśla potencjał takich męskich białek gruczołów dodatkowych do selekcji płciowej w tym systemie. Wreszcie, badania te pomagają wesprzeć rozwijający się pogląd, że białka płynu nasiennego mają takie samo znaczenie dla jednoczesnych hermafrodytów, jak dla gatunków o różnej płci.

Po przeniesieniu, plemnikom zazwyczaj towarzyszy płyn nasienny wytwarzany przez męskie gruczoły dodatkowe. Podczas gdy niektóre składniki ejakulatu odgrywają rolę w odżywianiu i aktywacji plemników1, inne wpływają na fizjologię kobiety w celu zwiększenia powodzenia zapłodnienia dawcynasienia 2-4. Takie efekty są szczególnie selekcjonowane, poprzez dobór płciowy, gdy gatunek jest bardzo rozwiązły i ma efektywne magazynowanie plemników i trawienie plemników. W takich warunkach dawcy nasienia intensywnie konkurują o zapłodnienie komórek jajowych5. Chociaż istnieje wiele dowodów korelacyjnych na znaczenie substancji płynnych w nasieniu dla powodzenia zapłodnienia u mężczyzn, bezpośrednie dowody są rzadsze i niewiele badań zagłębiło się w szczegóły zmian fizjologicznych i / lub zaangażowanych substancji6.
U gatunków o odrębnej płci (tj. samce i samice; gonochoryści) istnieje kilka dobrze zbadanych gatunków modelowych, jeśli chodzi o skład płynu nasiennego i ich skutki. Przykładami są muszka owocowa Drosophila melanogaster6, komar malarii Anopheles gambiae7 i chrząszcz mączny Tribolium castaneum8. Takie badania płynów nasiennych są znacznie rzadsze, jeśli chodzi o gatunki, które są jednocześnie hermafrodytyczne (tj. osobniki są funkcjonalnie męskie i żeńskie w tym samym czasie), mimo że ten sposób rozmnażania jest powszechny w całym królestwiezwierząt. Najbardziej godnym uwagi hermafrodytycznym przykładem przeniesienia substancji gruczołu dodatkowego jest prawdopodobnie strzelanie do tak zwanych strzałek miłosnych u ślimaków lądowych2,10, gdzie substancja jest przenoszona przez dawcę nasienia poprzez iniekcję podskórną11,12, tj. nie wraz z plemnikami. Istnieje jednak wiele jednoczesnych hermafrodytów, które przenoszą produkty męskich gruczołów akcesoryjnych wraz z plemnikami, takich jak zastosowany tutaj gatunek modelowy, wielki ślimak stawowy Lymnaea stagnalis. Wcześniejsze badania wykazały już, że otrzymanie płynu nasiennego wpływa na wydajność reprodukcyjną samic tego gatunku13-15, a kilka z zaangażowanych białek płynu nasiennego zostało zidentyfikowanych16,17.
Ogólnym celem tego protokołu, który jest rozszerzeniem metod opisanych w Koene et al16, jest przetestowanie wpływu białek płynu nasiennego na różne parametry składania jaj u ślimaków. Osiąga się to poprzez rozwarstwienie gruczołu krokowego (tj. męskiego gruczołu dodatkowego wytwarzającego płyn nasienny) izolowanych płciowo ślimaków dawców ze standaryzowanej hodowli laboratoryjnej. Po drugie, nasienie dawcy jest pobierane z pęcherzyków nasiennych i sporządzane są różne roztwory lecznicze. Następnie ślimaki testowe są znieczulane i wstrzykiwane dopochwowo roztwór testowy (na przykład sam ekstrakt z gruczołu krokowego, ekstrakt z gruczołu krokowego z nasieniem, samo nasienie, samo podłoże nośnikowe). Te testowe ślimaki są następnie monitorowane przez kolejne dni lub tygodnie, w standardowych warunkach, w celu zarejestrowania składania jaj. Masy jajowe są zbierane, skanowane cyfrowo w celu zliczenia i zmierzenia różnych parametrów, a następnie umieszczane w indywidualnych fiolkach do wylęgu. Po około dwóch tygodniach pisklęta są liczone i skanowane cyfrowo. Wszystkie skany, zarówno masy jaj, jak i piskląt, są następnie analizowane za pomocą bezpłatnego pakietu oprogramowania do analizy obrazu.
Do tego protokołu używany jest laboratoryjny szczep wielkiego ślimaka stawowego, Lymnaea stagnalis, który jest hodowany na Uniwersytecie VU w Amsterdamie. Gatunek ten służy jako system modelowy do badania pytań dotyczących doboru płciowego i rozmnażania u hermafrodytów. Stosunkowo duże rozmiary zwierzęcia sprawiają, że doświadczalnie jest ono bardzo dostępne. Ponadto, ponieważ jest używany jako gatunek modelowy w wielu dyscyplinach biologicznych, wiemy już dużo o podstawowej biologii tych zwierząt. Metoda ta pomoże w badaniu pytań dotyczących procesów doboru płciowego, w których pośredniczą białka płynu nasiennego. Ponadto, ponieważ są to jednoczesne hermafrodyty, możliwe jest ustalenie, czy takie białka działają w podobny i/lub różny sposób, jak u gatunków, w których płcie są rozdzielone16,17.

<table><tbody><tr><td>Płatki pokarmowe dla ryb</td><td>TetraPhyll</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Małe nożyczki chirurgiczne</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze gruboziarniste i drobne</td><td></td> Strzykawka <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>WPI<td>10 ml</td></tr><tr><td>Igły iniekcyjne (0,3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM MgCl2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5,83 mmol/L CaCl2&#183; 2H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,76 mmol/L MgCl2&#183; 6H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>42,69 mmol/L NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37,53 mmol/L KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuskładnikowe</td><td></td><td></td><td></td>strzykawki</tr><tr><td>Silicon</td><td>Sylgard</td><td></td><td></td></tr> 1 mm <tr><td>Rurka silikonowa (średnica 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>igły iniekcyjne (0,3 mm x 13 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td><td>Eppendorff</td><td></td><td></td></tr><tr><td>460 ml Pojemniki</td><td></td><td></td><td></td>perforowane</tr><tr><td>Metalowy dziurkacz do liści (19,6 cm2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka/łyżka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Laptop) komputer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner</td><td></td><td></td><td></td>płaski</tr><tr><td>Skala</td> <td>milimetrowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki przenoszące</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki szklane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td></td><td></td><td></td> 20 ml</tr></tbody></table>

wpływ produktów z męskich gruczołów dodatkowych na składanie jaj u ślimaków

Effect of Male Accessory Gland Products on Egg Laying in Gastropod Molluscs

Podczas wewnętrznego zapładniania zwierząt, płyn nasienny jest zwykle dodawany do plemników, tworząc razem nasienie lub ejakulat. Oprócz odżywiania i aktywacji plemników, składniki płynu nasiennego mogą również wpływać na fizjologię kobiety, zwiększając sukces zapłodnienia dawcy nasienia. Podczas gdy wiele badań wykazało takie efekty u gatunków o różnych płciach, niewiele badań dotyczyło tego u zwierząt hermafrodytycznych jednocześnie. Ten protokół wideo przedstawia metodę badania wpływu płynu nasiennego na ślimaki, wykorzystując jednocześnie hermafrodytycznego ślimaka słodkowodnego, wielkiego ślimaka stawowego Lymnaea stagnalis, jako organizm modelowy. Podczas gdy procedura jest pokazana przy użyciu kompletnych ekstraktów z gruczołu krokowego, poszczególne składniki (tj. białka, peptydy i inne związki) płynu nasiennego można przetestować w ten sam sposób. Wpływ przyjmowania składników ejakulatu na składanie jaj można określić ilościowo pod względem częstotliwości składania jaj i bardziej subtelnych szacunków wydajności reprodukcyjnej samic, takich jak liczba jaj w każdej masie jajowej. Wyniki pokazują, że białka płynu nasiennego wpływają na wydajność reprodukcyjną samic w tym jednoczesnym hermafrodycie, co podkreśla ich znaczenie dla doboru płciowego.

Rysunek 1 przedstawia procent zwierząt składających jaja po wstrzyknięciu do pochwy substancji kontrolnej (soli fizjologicznej), owipostatyny lub owipostatyny wraz z plemnikami. N = 15 dla każdej grupy badawczej; szczegóły i statystyki znajdują się w pracy Koene et al.16 (Źródło: Rysunek 3 z publikacji Koene et al. 2010, PLoS ONE).
<img alt="Wykres słupkowy procentu składania jaj; grupy badawcze: Kontrola, Owipostatyna, Owipostatyna + plemniki." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51698/51698fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wpływ owipostatyny na produkcję mas jajowych u Lymnaea stagnalis. Wykres przedstawia procent zwierząt składających jaja po wewnątrzpochwowych zastrzykach substancji kontrolnej (soli fizjologicznej), owipostatyny lub owipostatyny wraz z plemnikami. N=15 dla każdej grupy; szczegóły i statystyki znajdują się w pracy Koene et al. 2010. Przedruk za zgodą Koene et al. 2010 PLoS ONE 5: e10117.

Ten protokół wideo demonstruje metodę badania wpływu płynu nasiennego na ślimaki, przy użyciu hermafrodytycznego ślimaka słodkowodnego Lymnaea stagnalis.

Wpływ produktów z męskich gruczołów dodatkowych na składanie jaj u ślimaków

In internally fertilizing animals, seminal fluid is usually added to the spermatozoa, together forming the semen or ejaculate. Besides nourishing and ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest scharakteryzowanie wpływu białek płynu nasiennego na zachowanie związane ze składaniem jaj u gatunku hermafrodyty symultanicznego. Cel ten jest realizowany poprzez najpierw wyizolowanie osobników z ustandaryzowanej hodowli laboratoryjnej, a następnie przeprowadzenie sekcji organów docelowych. W drugim etapie pobierane są plemniki i przygotowywany jest roztwór do traktowania.Następnie ślimaki są poddawane sztucznemu zapłodnieniu. Potem zostają umieszczone w teście biologicznym. W standardowych warunkach masy jaj są zbierane, skanowane i umieszczane w oddzielnych pojemnikach BS w celu wylęgu.Po kilku tygodniach przeliczono i zeskanowano nowo wyklute osobniki, po czym wszystkie zdjęcia można przeanalizować przy użyciu bezpłatnego oprogramowania. Niniejszy protokół może pomóc w odpowiedzi na pytania dotyczące procesów selekcji płciowej zapośredniczonej przez białka płynu nasiennego. Ponieważ w tym przypadku badamy hermafrodytów jednoczesnych, możemy również ocenić, czy procesy te przebiegają w sposób podobny czy odmienny od tych występujących u gatunków z rozdzielną płcią.W tym protokole wykorzystaliśmy gatunek *H. manicatus*, który utrzymujemy na Uniwersytecie VU w Amsterdamie. Gatunku tego używamy do badania kwestii związanych z doborem płciowym i reprodukcją. W przypadku hermafrodytów, ze względu na stosunkowo duże rozmiary ciała, jest on bardzo przystępny pod kątem eksperymentalnym.Ponadto, ponieważ gatunek ten jest wykorzystywany w wielu różnych dyscyplinach biologicznych jako gatunek modelowy, dysponujemy szeroką wiedzą na temat podstawowej biologii tych zwierząt. Nazywam się Yumi. Jestem doktorantką w Katedrze Nauk Ekologicznych.W pełnym zakresie uniwersyteckim zaprezentuję następujące protokoły. Zacznijmy. Aby przeprowadzić wiarygodną analizę biologiczną, najczęściej stosuje się hodowlę laboratoryjną w celu wykluczenia zmiennych zakłócających.Woda o niskiej zawartości miedzi jest utrzymywana w temperaturze 20 °C, a cykl światła i ciemności wynosi 12 na 12 godzin. Na Uniwersytecie VU hodowla laboratoryjna jest utrzymywana w zbiornikach w obiekcie hodowlanym z ciągłą wymianą wody. W warunkach standardowych dorosłe ślimaki są karmione sałatą ad libitum i rozdzielane zgodnie z ich grupą wiekową.Po usunięciu ślimaków z hodowli zostaną one uznane za zużyte i nie mogą wrócić do zbiorników hodowlanych. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować stereomikroskop, płytkę sekcyjną z pinezkami, małe nożyce chirurgiczne, pęsetę, strzykawkę wypełnioną roztworem chlorku magnezu oraz ręczniki papierowe. Aby poddać ślimaka eutnazji, należy wprowadzić igłę wstrzykiwującą w stopę pod kątem 45 stopni i delikatnie, w sposób ciągły wywierać nacisk, aż ślimak się rozluźni i pozostanie w pozycji rozciągniętej. Następnie należy wyjąć igłę i upewnić się, że ślimak został poddany eutnazji.Następnie, za pomocą pincety ostrożnie usuń muszlę. Podążając za jej krzywizną do połowy, delikatnie oddziel mięsieńtrakcyjny od muszli. Następnie, zgodnie z kierunkiem skrętu muszli, delikatnie wykręć ślimaka z jego skorupy.Ślimak został teraz usunięty z muszli, którą można odrzucić. Następnie umieść ślimaka na płytce do sekcji i przymocuj szpilką tylną część stopy. Następnie przymocuj szpilką głowę.Napięty ślimak należy przymocować szpilką do płytki. Teraz ślimak jest przygotowany do sekcji. Włącz oświetlenie stereomikroskopu i dokonaj odpowiedniej regulacji urządzenia.Przed wykonaniem pierwszego nacięcia ważne jest zlokalizowanie żejskiego syfonu. Będzie on służył później jako punkt odniesienia. Wykonaj pierwsze nacięcie tuż pod krawędzią płaszcza i tnij w kierunku żejskiego syfonu.Wykonaj nacięcie wokół otworu moczowego w kierunku głowy. Należy przeciąć wyłącznie skórę, uważając, aby nie uszkodzić żadnych narządów, prowadząc cięcie w linii prostej. W ramach niniejszego badania wyizolujemy gruczoł przedstawy oraz pęcherzyki nasienne w celu pobrania odpowiednio płynu nasiennego i plemników.Należy pamiętać, że w celu uzyskania pełnych zapasów plemników i płynu nasiennego, ślimaki powinny być izolowane przez jeden tydzień i karmione ad libitum. Procedura sekcji jest taka sama, jak wyjaśniono wcześniej. Pęcherzyki nasienne znajdują się w tylnej części ciała zwierzęcia.Następnie gruczoł przed prostatą zostanie zawieszony w soli fizjologicznej i umieszczony w lodzie. W późniejszym etapie zostaną one wymieszane z roztworami traktującymi.Przed wstrzyknięciem dopochwowym zebrane plemniki zostaną dodane do płynu nasiennego lub poszczególnych białek w odpowiedniej dawce. Do tej techniki sztucznego zapłodnienia będzie potrzebna strzykawka o objętości jednego mililitra zawierająca roztwór testowy; do strzykawki należy dopasować igłę wstrzykującą, upewniając się, że w strzykawce nie znajdują się pęcherzyki powietrza. Do wstrzyknięcia należy ostrożnie użyć rurki silikonowej. Nasuń rurkę silikonową na igłę wstrzykującą.Należy upewnić się, że rurka została przebita, a następnie usunąć z niej powietrze. Przed wstrzyknięciem ślimak musi zostać znieczulony. Należy w tym celu zastosować protokół opisany w rozdziale drugim.Ślimak otrzyma dawkę od 2 do 3 ml 50 µM chlorku magnezu. Gdy ślimak zostanie odpowiednio uspokojony i rozluźniony, należy umieścić go w formie, aby zapewnić stabilną pozycję. Następnie, chwytając koniec rurki silikonowej za pomocą precyzyjnych pęsety, należy go delikatnie wprowadzić do otworu żeńskiego.Następnie delikatnie uciśnij strzykawkę i ostrożnie wstrzyknij wyznaczoną objętość roztworu testowego. Odczekaj pół minuty, aż ciśnienie w rurce rozprzestrzeni się w organach żeńskich. Po tym czasie ostrożnie wyjmij rurkę i umieść ślimaka we właściwym dla niego pojemniku.Po zakończeniu procesu sztucznego zapłodnienia ślimaki mogą zostać przeniesione do zbiorników eksperymentalnych, co pozwala na rozpoczęcie bioanalizy. Ślimaki wybudzą się z sedacji po kilku godzinach. Bioanalizy.W przypadku doboru płciowego eksperymenty zazwyczaj trwają dwa tygodnie przed rozpoczęciem biosa. Ważne jest, aby umieścić wszystkie osobniki w osobnych pojemnikach i je oznakować. Następnie należy zmierzyć długość muszli każdego ślimaka.Jest to dobry wskaźnik ich wielkości, która może wpływać na zachowanie seksualne. Następnie ślimaki przenosi się do zbiornika eksperymentalnego. Zbiornik ten posiada takie same standardowe warunki, jak laboratorium hodowlane.Zgodnie z omówieniem w rozdziale pierwszym, ważne jest odpowiednie zorientowanie pojemników tak, aby otwory znajdowały się zgodnie z kierunkiem przepływu wody w zbiorniku. Podczas biotestów ślimaki muszą być regularnie karmione. Standardową ilość krążków sałaty wycina się za pomocą metalowego dziurkacza.Odpowiednią dawką są dwie tarczki co drugi dzień. W przypadku gatunku modelowego, lumia stauss, ślimaki należy sprawdzać pod kątem obecności mas jaj co drugi dzień. Zebrane masy jaj zostaną poddane pomiarom.Do skanowania jaj będą potrzebne: laptop z zainstalowanym sterownikiem skanera, skaner płaski, standardowa skala milimetrowa, łyżka do przenoszenia mas jajowych oraz płytki szklane do przyłożenia na wierzch mas jajowych. Najpierw za pomocą łyżki zeskrob masy jajowe ze ścianek pojemnika. Masy jajowe, które są nieprzezroczyste, zostały złożone przed chwilą i nie mogą być wykorzystane.Podczas tego etapu pomiaru należy umieścić masy jaj na płytkach transferowych i powtarzać te kroki, aż płytki zostaną wypełnione. Następnie przenieść masy jaj na płytki szklane w tej samej kolejności, co na płytkach transferowych. Masy jaj przykleją się do płytki szklanej; należy ją odwrócić i ostrożnie położyć na skanerze płaskim bezpośrednio pod skalą.Następnie należy przyłożyć nacisk do płytek, aby spłaszczyć masy jaj. Dzięki temu wszystkie jaja zostaną wyrównane, co zapewni jednakową jakość ich skanowania. Przed rozpoczęciem skanowania zaleca się dostosowanie ustawień w celu uzyskania najlepszego rezultatu.Podczas skanowania ważne jest ustawienie maksymalnej rozdzielczości w celu wykonania skanu podglądu, co pozwoli na późniejsze przycięcie obszaru roboczego, a następnie dostosowanie jasności i kontrastu przed wykonaniem skanu końcowego. Po skanowaniu masy jaj zostaną umieszczone w osobnych, oznakowanych probówkach w celu ich dojrzewania i wylęgu. W probówkach tych woda jest odświeżana co drugi dzień, aby utrzymać odpowiedni poziom tlenu.W miarę wykluwania się kolejnych ślimaków należy zastosować różne techniki odświeżania wody. Najlepsza kolejność to początkowo dolewanie lub przelewanie, a później odsysanie wody pipetą. Aby zapisać dane oraz zdjęcie z programu ImageJ, należy najpierw użyć narzędzia powiększania, aby przejść do skali milimetrowej.Przybliż obraz i dostosuj okno tak, aby 1 mm wypełnił ekran. Za pomocą narzędzia linii narysuj odcinek pomiędzy dwiema liniami wskaźnikowymi. Następnie przejdź do Analyze, a potem wybierz Set Scale.W menu wyskakującym zobaczysz opcję Measured length; zmień known distance na 1, a unit of na millimeters. Zaznacz pole global i zamknij okno. Po ustawieniu skali możemy przybliżyć obraz w kierunku pierwszych mas jaj aż do 800%. Użyj narzędzia eliptycznego, aby obrysować obwód jaj.Naciśnij D, aby narysować obwód. Pomoże to uniknąć dwukrotnego pomiaru tego samego jaja. Naciśnij M, aby zmierzyć obwód.Po zebraniu odpowiedniej ilości danych pojawi się okno. Dane z tego okna można zapisać jako plik Excel. Można je również skopiować bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego.Jeśli preferowane pomiary nie wyświetlają się w oknie wyskakującym, można to dostosować i przeanalizować. Ustawienia pomiarów oraz przeliczanie poszczególnych jaj w obrębie mas jaj można również przeprowadzić za pomocą wtyczki cell counter. Przejdź do sekcji plugins.Następnie przeanalizuj i wybierz licznik komórek. Pojawi się okno licznika komórek. Zaznacz pole „keep original” i naciśnij przycisk „initialize”.Pojawiło się nowe okno licznika. Wybierz z paska narzędzi narzędzie krzyżyka. Następnie wybierz typ licznika w menu licznika komórek.Kliknięcie w oknie licznika komórek spowoduje policzenie jaj. Całkowita liczba znajduje się obok typu licznika w menu licznika komórek. Za pomocą licznika komórek można policzyć wiele mas jaj.W razie potrzeby można dodawać i usuwać typy liczników. Tę liczbę należy skopiować ręcznie do arkusza kalkulacyjnego lub nacisnąć przycisk wyników, aby pojawiło się okno wyświetlające wszystkie rezultaty. Za pomocą tej metody pokazaliśmy, jak pobierać białka z płynu nasiennego oraz jak badać je w sposób istotny.Wykazaliśmy to, wykorzystując całkowity ekstrakt z gruczołu prostaty, jednak poszczególne białka płynu nasiennego mogą być oczywiście testowane w ten sam sposób. Ponadto możliwe jest badanie innych procesów oraz składania jaj. Wyniki naszych eksperymentów wykazały, że istnieje jedno białko płynu nasiennego zwane awio-statiną, które pośredniczy w redukcji składania jaj.Dodatkowo stwierdzamy, że przeniesienie płynu nasiennego zwiększa rozmiar lub posty. Statin jest pierwszym w pełni scharakteryzowanym białkiem płynu nasiennego u hermafrodyty symultanicznego. Choć efekty działania płynu nasiennego często opisywano u gatunków o rozdzielnych płciach, nasze wyniki podkreślają, że płyny nasienne są równie istotne u hermafrodytów.

effect-male-accessory-gland-products-on-egg-laying-gastropod

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wpływ produktów męskich gruczołów akcesorycznych na składanie jaj u ślimaków

Jaja Xenopus laevis w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukowania składania jaj, ich zbierania i usuwania otoczki galaretowatej, a także sortowania jaj w celu usunięcia osobników uszkodzonych.

Pozyskiwanie komórek jajowych od samic Xenopus laevis

Komórki jajowe oraz otaczające je powłoki pozakomórkowe często uwalniają peptydy, białka i małe cząsteczki, które komunikują się z plemnikami, by prowadzić je do jaja, wspomagając tym samym zapłodnienie. Wykorzystując plemniki żaby, opisujemy i porównujemy dwie klasy testów służących do wykrywania chemotaksji plemników – testy akumulacji plemników oraz testy śledzenia trajektorii plemników.

Dwa rodzaje testów do wykrywania chemoatrakcji plemników żaby

Ten film opisuje sekcję gruczołów dodatkowych od samców much i pokazuje przykład, w którym izolowany gruczoł zostanie zdysocjowany na zawiesinę pojedynczej komórki.

Drosophila Rozwarstwienie męskiego gruczołu dodatkowego: metoda izolowania komórek wtórnych

C. elegans podczas składania jaj może dostarczyć ważnych informacji w badaniach rozwojowych, reprodukcyjnych i anatomicznych. Ten film przedstawia ważne etapy testu składania jaj i pokazuje próbkę eksperymentu, w którym lek jest testowany pod kątem toksyczności reprodukcyjnej.

Test składania jaj: metoda ilościowego określania zachowania C. elegans podczas składania jaj

Wywołane przez rybołówstwo zmiany w eksploatowanych połowach skorupiaków, takie jak amerykańskie połowy homarów, mogą potencjalnie wpłynąć na ich dynamikę reprodukcyjną, prowadząc do zmniejszenia sukcesu godowego. Celem tego badania było opracowanie nieinwazyjnej metody ustalania sukcesu godowego samic homarów, które mogą być fizjologicznie lub funkcjonalnie dojrzałe.

Nieinwazyjna metoda określania in situ udanego krycia u samic homarów amerykańskich (Homarus americanus)

Ten protokół opisuje test o wysokiej przepustowości do testowania preferencji składania jaj przez Drosophila melanogaster w rozdzielczości pojedynczego zwierzęcia.  Ten test zapewnia prostą, wydajną i skalowalną platformę do identyfikacji genów i składników obwodów, które kontrolują prosty proces podejmowania decyzji.

Wysokoprzepustowy test do badania preferencji składania jaj u poszczególnych Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom zestawu metod do wysokoprzepustowej dekapsulacji zarodków i larw Lymnaea stagnalis w ramach przygotowań do hybrydyzacji in situ całego wierzchowca oraz do późniejszych zabiegów przed i po hybrydyzacji.

Cała metoda hybrydyzacji in situ dla ślimaka Lymnaea stagnalis

Ochrona małży słodkowodnych zależy od monitorowania wzorców i procesów reprodukcyjnych gatunków. Badanie to standaryzuje nieśmiertelny protokół pobierania próbek zawartości skrzeli, charakteryzowania rozwoju larwalnego i zapewnienia cyfrowego repozytorium zebranych danych. Ten pakiet protokołów i baz danych będzie ważnym narzędziem dla badaczy małży w odbudowie zagrożonych gatunków.

Standaryzacja nieletalnej metody charakterystyki stanu rozrodczego i rozwoju larwalnego małży słodkowodnych (Bivalvia: Unionida)

Ten artykuł opisuje prostą metodę izolowania zewnętrznych i wewnętrznych podwarstw perywitelinowych jaj kurzych przy jednoczesnej minimalizacji zmian strukturalnych i optymalizacji solubilizacji białek w każdej podwarstwie do analiz proteomicznych.

Mechaniczna separacja i solubilizacja białek zewnętrznych i wewnętrznych podwarstw perywiteliny z jaj kurzych

Gdy transformujący czynnik wzrostu ß białka prekursorowe rodziny są ektopowo wyrażane w zarodkach Xenopus laevis, ulegają one dimeryzacji, rozszczepianiu i są wydzielane do blastocoele, który zaczyna się w późnym stadium blastuli do wczesnego stadium gastruli. Opisano metodę zasysania produktów rozszczepienia z jamy blastocoele do analizy immunoblot.

Analiza produktów rozpadu rodziny transformujących czynników wzrostu wydzielanych do blastocoele zarodków Xenopus laevis

Na znieczulonych samicach krabów przeprowadzono dwa protokoły ablacji gałki ocznej (tj. kauteryzacja i styl podejścia chirurgiczne). Ablacja gałek ocznych krabów błotnych przyspieszyła dojrzewanie jajników, nie zmniejszając przy tym przeżywalności.

Ablacja gałek ocznych w celu zwiększenia dojrzewania jajników u krabów błotnych

Poznaj metodę badania wpływu białek płynu nasiennego na składanie jaj u ślimaków Lymnaea stagnalis. Protokół obejmuje izolację osobników, inseminację sztuczną i analizę behawioralną w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Wpływ produktów z męskich gruczołów dodatkowych na składanie jaj u ślimaków

Przeglądaj więcej filmów