Name: Protokół zakażenia Caenorhabditis elegans Salmonellą typhimurium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Poznaj protokół zakażenia Caenorhabditis elegans Salmonellą typhimurium z wykorzystaniem RNAi do badania interakcji gospodarz-patogen. Ta metoda pozwala identyfikować kluczowe geny ochronne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Diane Baronas-Lowell za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta była wspierana przez FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant oraz stypendium na starzenie się od Ellison Medical Foundation dla K.J.

1. XLD (Xyloza Lizyna Desoksycholan) Płytki agarowe
agar XLD jest selektywnym podłożem do hodowli Salmonelli, która pojawia się jako czarne kolonie na płytkach agarowych XLD. Jeśli jednak nie ma obaw o zanieczyszczenie, można zastąpić zwykłą płytę LB.
<ol>
	<li>Odważyć 5,5 g agaru XLD i ponownie zawiesić w 5 ml wody dejonizowanej.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj, aż cały agar będzie mokry. Dodaj 95 ml wody dejonizowanej, aż wszystkie grudki znikną, a podłoże zostanie całkowicie ponownie zawieszone.</li>
	<li>Zagotuj pożywkę do całkowitego rozpuszczenia (nie sterylizuj w autoklawie).</li>
	<li>Schłodzić podłoże w temperaturze pokojowej do 50 °C.</li>
	<li>Wlać 25 ml agaru do każdej płytki o wymiarach 95 x 15 mm (średnica x wysokość) (płytki uszczelnione Parafilmem można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca).</li>
</ol>
2. Pożywka dla nicieni (NGM) Płytki do karmienia RNAi
Przygotowanie płytek NGM C. elegans zostało opisane wcześniej19. Tutaj pokrótce opisano procedurę dodawania antybiotyku ampicyliny i induktora chemicznego RNAi izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do pożywki NGM w celu wytworzenia płytek zasilających RNAi.
<ol>
	<li>Rozpuść 3 g NaCl i 2,5 g peptonu Bacto w 1 l wody dejonizowanej.</li>
	<li>Dodać 17 g agaru Bacto do podłoża</li>.
	<li>Autoklawować pożywkę przez 45 minut i schłodzić ją do temperatury 50 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Dodać następujące roztwory: 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w 95% etanolu), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 i 25 ml 1 M buforu fosforanu potasu (pH 6,0). Dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Dodać 1 ml 1 M IPTG i 500 μl ampicyliny (100 mg/ml w sterylnej wodzie).</li>
	<li>Dobrze wymieszać roztwór i wlać go do płytek Petriego o wymiarach 60 x 15 mm (średnica x wysokość) za pomocą przystawki do pipetowania i pipety serologicznej o pojemności 25 ml zgodnie ze sterylnymi procedurami. Napełnij każdą płytkę 12 ml agaru. Talerze można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca.</li>
</ol>
3. Przygotuj zwierzęta leczone RNAi do infekcji
Niezbędny gen autofagii bec-1 jest używany jako przykład do zbadania funkcji genu gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą. Procedury doświadczalne przedstawiono na rysunku 1 i w tabeli 1. Poniżej przedstawiono protokół przygotowania zwierząt leczonych RNAi do zakażenia, przy czym dzień każdego etapu doświadczalnego podano w nawiasach.
<ol>
	<li>Zaszczepić bec-1 RNAi żywiące się i kontrolować bakterie żywiące się pustym wektorem L4440 RNAi, umieszczając płatek zamrożonych bakterii o temperaturze -80 °C w 2 ml pożywki LB uzupełnionej 100 mg / ml ampicyliny (Dzień 1). Powtarzaj ten krok raz w tygodniu podczas całego eksperymentu, aby uzyskać świeże bakterie RNAi. Przechowywać kulturę w lodówce o temperaturze 4 °C, gdy nie jest używana.</li>
	<li>Wysiewaj 100 ml nocnej kultury bakteryjnej RNAi na płytkach RNAi. Przygotuj trzy płytki bec-1 RNAi i trzy kontrolne puste płytki wektorowe RNAi. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc (dzień 2).</li>
	<li>Wyjąć płytki RNAi z inkubatora o temperaturze 37 °C i pozostawić je do ostygnięcia do temperatury pokojowej na stole laboratoryjnym. Podnieś dobrze odżywione hermafrodyty L4 typu dzikiego N2 i przenieś je do bec-1 RNAi i kontroluj puste płytki RNAi wektora. Umieść trzy robaki na każdej płytce na trzech płytkach. Tego samego dnia należy przygotować płytki RNAi zgodnie z opisem w kroku 3.2 (Dzień 3).</li>
	<li>Inkubować płytki RNAi z robakami w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez 36-40 godzin i przenieść robaki na świeże odpowiadające im płytki RNAi przygotowane w kroku 3.3. Po przeniesieniu robaków inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 20 °C przez 64 godziny (dzień 4).</li>
</ol>
4. Przygotuj Salmonellę na infekcję
<ol>
	<li>Zamrożony bulion w temperaturze -80 °C rozprowadzić na 1 płytce agarowej XLD i inkubować szalkę w temperaturze 37 °C przez noc (dzień 5).</li>
	<li>Wybrać dobrze wyizolowaną kolonię czarnej Salmonelli i zaszczepić ją w 2 ml pożywki LB w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez noc (dzień 6).</li>
	<li>Wysiewaj 80 ml nocnej kultury Salmonelli na 1 C. elegans 60 x 15 mm (średnica x wysokość) płytce agarowej NGM i przygotuj w sumie 6 płytek. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Kultura bakteryjna powinna wyschnąć i uformować trawnik na talerzu (dzień 7).</li>
</ol>
5. Zakażenie robaków leczonych RNAi Salmonellą
<ol>
	<li>Przenieś hermafrodyty L4 N2 potraktowane bec-1 RNAi i kontroluj puste hermafrodyty L4 N2 potraktowane RNAi (potomstwo robaków ustawionych w kroku 3) na płytki Salmonelli. Umieść 40 robaków na talerzu na 3 talerzach dla każdej grupy. Inkubować płytki robaka w temperaturze 20 °C przez 48 godzin (dzień 7).</li>
	<li>Przygotować jeden zestaw świeżych płytek RNAi zgodnie z opisem w krokach 3.1 i 3.2 (dzień 7 i dzień 8).</li>
	<li>Po 48 godzinach zakażenia przenieść robaki zakażone Salmonellą na odpowiednie płytki RNAi przygotowane w kroku 5.2 i inkubować w temperaturze 20 °C (dzień 9).</li>
</ol>
6. Test przeżycia
<ol>
	<li>Codziennie oceniaj przeżywalność robaków i przenoś robaki na świeże odpowiednie płytki RNAi w czasie składania jaj. Przygotować zestaw świeżych płytek RNAi przed każdym przeniesieniem robaka, jak opisano w krokach 3.1 i 3.2. Delikatnie dotknij korpusu ślimaka (głowa, środkowa część i ogon) spłaszczonym drutem platynowym na końcu. Robak jest oceniany jako martwy, jeśli nie zaobserwuje się żadnego ruchu ciała robaka.</li>
	<li>Oceniaj przeżywalność robaków codziennie lub co drugi dzień i przenoś robaki na świeże odpowiednie płytki RNAi dwa razy w tygodniu po tym, jak robaki przestaną składać jaja.</li>
	<li>Po tym, jak wszystkie robaki umrą, zbierz dane dotyczące przeżycia z potrójnych płytek w jeden zestaw danych. Wprowadź dane dotyczące przeżycia każdej grupy do odpowiedniego oprogramowania statystycznego, takiego jak GraphPad Prism, aby wygenerować krzywe przeżycia i przeprowadzić analizę przeżycia Kaplana-Meiera. Cały eksperyment powtarza się co najmniej raz, aby potwierdzić wniosek.</li>
</ol>

<ol><li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22C.+elegans+II%22">C. elegans II</a>. , (1997).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+host+for+the+study+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+an+emerging+genetic+model+for+the+study+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity.</a> Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).</li>
<li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).</li>
<li>Ford, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+descriptive+study+of+human+Salmonella+serotype+typhimurium+infections+reported+in+Ontario+from+1990+to+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997.</a> Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).</li>
<li>Voetsch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoodNet+estimate+of+the+burden+of+illness+caused+by+nontyphoidal+Salmonella+infections+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States.</a> Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).</li>
<li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li>
<li>Alegado, R. A., Tan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antimicrobial+peptides+contributes+to+persistence+of+Salmonella+typhimurium+in+the+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine.</a> Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).</li>
<li>Jia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+protect+against+Salmonella+typhimurium+infection+and+mediate+insulin+signaling-regulated+pathogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).</li>
<li>Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans-based+screen+identifies+Salmonella+virulence+factors+required+for+conserved+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions.</a> Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).</li>
<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2, 1-10 (2001).</li>
<li>Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA-mediated+interference+feeding+strategy+to+screen+for+genes+involved+in+body+size+regulation+in+the+nematode+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li>
<li>Fraser, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+online+review+of+C+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+mediated+by+ced-3+and+ced-4+protects+Caenorhabditis+elegans+from+Salmonella+typhimurium-mediated+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).</li>
<li>Melendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+are+essential+for+dauer+development+and+lifespan+extension+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans.</a> Science. 301, 1387-1391 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

C. elegans jest prostym genetycznym organizmem modelowym, który zjada bakterie jako źródło składników odżywczych. W ten sposób łatwo jest zastąpić normalny pokarm bakteryjny patogenem jelitowym, aby zbadać interakcje między C. elegans a wybranym patogenem. W niniejszym artykule opisano protokół łączący zakażenie Salmonellą i leczenie żywieniem C . elegans RNAi w celu zbadania roli genów gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą . Poprzednie protokoły infekcji narażały r...

Wolno żyjący nicień glebowy Caenorhabditis elegans jest prostym i genetycznie podatnym organizmem modelowym używanym do badania wielu zagadnień biologicznych. C. elegans występuje głównie jako samozapładniające się hermafrodyty. Samce są spontanicznie generowane przez brak dysjunkcji chromosomu X podczas gametogenezy1,2. W obecności obfitości pożywienia C. elegans stale rozwija się przez cztery stadia larwalne do osobnika dorosłego. Temperatura wpływa również na rozwój C. elegans; Szybszy rozwój obserwuje się w wyższych temperaturach. W laboratorium C. elegans jest hodowany w standardowej temperaturze 20 °C na płytkach agarowych z wysiewaną bakterią Escherichia coli (szczep OP50) jako pokarmem1,2.
W ostatniej dekadzie C. elegans pojawił się jako organizm bezkręgowy do badania interakcji gospodarz-patogen3-5. W naturze C. elegans zjada bakterie jako źródło składników odżywczych1,2. Jego normalny bakteryjny pokarm laboratoryjny, OP50, można łatwo zastąpić innymi patogenami w celu zbadania interakcji między C. elegans a dowolnym wybranym patogenem. W tych warunkach jelito jest głównym miejscem infekcji. Rzeczywiście, wykazano, że szeroka gama patogenów bakteryjnych śmiertelnie infekuje C. elegans3-5.
Gram-ujemna bakteria Salmonella jest patogenem przewodu pokarmowego, który powoduje choroby przenoszone przez żywność u ludzi na całym świecie6,7. C. elegans jest dobrym modelowym żywicielem dla Salmonella typhimurium, ponieważ bakteria ta replikuje się i wykazuje uporczywe infekcje jelitowe8-10. C. elegans wykorzystano do identyfikacji zarówno nowych, jak i wcześniej znanych czynników wirulencji Salmonelli 11. Co ciekawe, układ odpornościowy C. elegans skutecznie ogranicza replikację Salmonelli. Wcześniej donoszono, że hamowanie genów autofagii powoduje zwiększoną replikację Salmonelli u C. elegans, co skutkuje przedwczesną śmiercią zakażonych robaków10. Makroautofagia (zwana tutaj autofagią) to dynamiczny proces polegający na przegrupowaniu błon subkomórkowych w celu sekwestracji cytoplazmy i organelli w celu dostarczenia do lizosomu w celu degradacji12. Doniesiono, że autofagia ogranicza replikację Salmonelli u C. elegans i ssaków10,13.
Genom C. elegans był pierwszym wielokomórkowym genomem eukariotycznym zsekwencjonowanym; reaguje na leczenie RNAi14-16. Co więcej, RNAi może być skutecznie podawane poprzez poddawanie robaków działaniu bakterii zawierających dwuniciowy RNA docelowego genu, znanego jako karmienie RNAi16,17. Biblioteki odżywiania całego genomu RNAi zostały wygenerowane do badań przesiewowych RNAi całego genomu16,18. W tym przypadku protokół zakażenia Salmonellą jest połączony z karmieniem RNAi, aby umożliwić testowanie genów C. elegans pod kątem ich zdolności do ochrony przed zakażeniem Salmonellą.

<table><tbody><tr><td>LB Bulion</td><td>Fisher</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>Agar XLD</td><td>EMD Chemicals</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td></td><td>Fisher BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr> szalka <tr><td>Petriego 95 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 x 15 mm&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna Falcon</td><td>Fisher</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Express Pipet-Aid</td><td>Inkubator</td> do wytrząsania Fisher <td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000&nbsp;</td><td>Inkubator Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół zakażenia caenorhabditis elegans salmonellą typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

W ostatniej dekadzie, C. elegans pojawił się jako organizm bezkręgowy do badania interakcji między gospodarzami a patogenami, w tym obrony gospodarza przed bakterią Gram-ujemną Salmonella typhimurium. Salmonella powoduje trwałe zakażenie w jelicie C. elegans i powoduje przedwczesną śmierć zakażonych zwierząt. U C. elegans zidentyfikowano szereg mechanizmów odpornościowych w celu obrony przed zakażeniami Salmonellą. Wykazano, że autofagia, ewolucyjnie zachowany szlak degradacji lizosomalnej, ogranicza replikację Salmonelli u C. elegans i ssaków. Tutaj opisano protokół zakażenia C. elegans Salmonellą typhimurium, w którym robaki są narażone na Salmonellę przez ograniczony czas, podobnie jak w przypadku zakażenia Salmonellą u ludzi. Zakażenie Salmonellą znacznie skraca żywotność C. elegans. Używając jako przykładu niezbędnego genu autofagii bec-1, połączyliśmy tę metodę infekcji z podejściem do żywienia C. elegans RNAi i pokazaliśmy, że ten protokół można wykorzystać do zbadania funkcji genów gospodarza C. elegans w obronie przed zakażeniem Salmonellą. Ponieważ dostępne są biblioteki RNAi całego genomu C. elegans, protokół ten umożliwia kompleksowe badanie przesiewowe genów C. elegans, które chronią przed Salmonellą i innymi patogenami jelitowymi, przy użyciu bibliotek RNAi całego genomu.

W temperaturze 20 °C mediana czasu przeżycia nicieni N2 typu dzikiego wynosi 17 dni (Rycina 2A oraz Tabela 2). Infekcja Salmonella znacząco skraca medianę czasu przeżycia nicieni N2 do 10,5 dnia (p = 0,0002, test log-rank) (Rycina 2A).
Jeśli gen C. elegans odgrywa istotną rolę w obronie przed infekcją Salmonella, można przewidywać, że jego zahamowanie spowoduje podatność na infekcję Salmonella. W rzeczywisto...

C. elegans pojawił się jako nowy model genetyczny do badania interakcji gospodarz-patogen. Tutaj opisujemy protokół zakażenia C. elegans Salmonellą typhimurium w połączeniu z techniką interferencji dwuniciowego RNAi w celu zbadania roli genów gospodarza w obronie przed zakażeniem Salmonellą.

Protokół zakażenia Caenorhabditis elegans Salmonellą typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Ogólnym celem tej procedury jest zakażenie nicieni C. elegans bakteriami Salmonella w celu zbadania interakcji między gospodarzem a patogenem. Jest to realizowane poprzez wstępne zahamowanie ekspresji genu gospodarza za pomocą RNAi. Drugim krokiem procedury jest zakażenie robaków poddanych traktowaniu RNAi bakteriami Salmonella.Infekcję zatrzymuje się poprzez przeniesienie zainfekowanych nicieni na płytki z pokarmem rna, które nie są patogenne. Końcowym etapem jest odnotowanie przeżywalności zainfekowanych nicieni. Na podstawie tych danych oblicza się przeżywalność, co w ostateczności pozwala zidentyfikować geny niezbędne do ochrony przed salmonella.Procedurę zademonstruje Julie John, technik laboratoryjny. Rozpocznij od przygotowania niezbędnych płytek hodowlanych. Najpierw przygotuj płytki z agarem XLD.Są one selektywne dla bakterii z rodzaju Salmonella, które na tych płytkach pojawiają się jako czarne kolonie. Przed wymieszaniem z pełną objętością wody należy upewnić się, że agar XLD został resuspendowany w wodzie w stężeniu jeden gram na mililitr. Nie autoklawować.Ten agar został podgrzany na płycie grzejnej. Przystąp do przygotowania płytek XLD o średnicy 95 milimetrów, wlewając 25 mililitrów agaru na każdą płytkę. Aby przygotować pożywki NGM z RNAi, tworząc tak zwane płytki RNAi, należy zastosować standardowe metody: krótko opisując, do medium po autoklawowaniu dodaje się ampicylinę oraz chemiczny induktor RNAi, IPTG.Po ostygnięciu nałożyć do płytek o średnicy 60 milimetrów po 12 mililitrów agaru; płytki można przechowywać do miesiąca w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed użyciem. W pierwszej kolejności inkubuje się je z bakteriami. W tym przykładzie gen Beck 1 jest genem docelowym, ponieważ jest on niezbędny do obrony przed salmonellą.Rozpocznij od przygotowania kultur RNAi oraz kontrolnych. Dodaj płatek zamrożonych bakterii z przechowywania w temperaturze -80 °C do 2 mL lb z ampicyliną. Bakterie powinny albo wykazuje ekspresję RNAi, albo nie, w przypadku tych drugich zawierając pusty wektor.Przenieś te dwie kultury do inkubatora i inkubuj je przez noc. Powinno to być wykonywane co tydzień, aby bakterie były zawsze dostępne następnego dnia. Zaszczep 100 µL kultury na płytkach RNA eye.Przygotuj co najmniej trzy płyty każdego typu dla grupy eksperymentalnej oraz kontrolnej. Inkubuj płyty w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia doprowadź płyty do temperatury pokojowej.Następnie przenieś dobrze odżywione hermafrodyty szczepu dzikiego N2 w stadium L4 na płytki. Wystarczy trzy nicienie na płytkę. Płytki należy inkubować w temperaturze 20°C tego samego dnia.Przygotuj kolejne płytki RNAi z hodowlą bakterii. Po 36 do 40 godzinach w temperaturze 20 stopni Celsjusza przenieś nicienie z pierwszych płytek RNAi na nowe płytki RNAi. Następnie inkubuj je ponownie w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez kolejne 64 godziny.Zacznij od wyseiania szczepu salmonelli z zamrażarki o temperaturze -80 °C na płytkę XLD. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia wybierz z płytki izolowaną czarną kolonię i zaszczep ją do 2 ml pożywki LB.Pozostaw próbkę do inkubacji z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 37 °C do następnego ranka. Użytkuj zaszczepione podłoże LB do zasiałem na sześciu płytkach NGM. Nanieś 80 µL na każdą płytkę; po sześciu godzinach w temperaturze pokojowej kultura bakteryjna powinna wyschnąć i utworzyć trawnik na płytkach NGM.Następnie przenieś robaki traktowane RNAi oraz robaki z grupy kontrolnej na sześć płytek. Umieść po 40 robaków na każdej płytce i inkubuj je w temperaturze 20 °C przez 48 godzin. Od tego momentu codziennie przygotowuj nowe płytki do RNAi.Dzięki temu będą one gotowe w ciągu dwóch dni i w każdym kolejnym dniu do przeprowadzenia testu przeżywalności. Po 48 godzinach przenieś zainfekowane nicienie z powrotem na świeżo przygotowane płytki RNAi lub płytki kontrolne z pustym wektorem. Następnie umieszczaj płytki w inkubatorze w temperaturze 20 °C każdego dnia, mniej więcej w czasie składania jaj.Oceń przeżywalność nicieni i przenieś osobniki, które przeżyły, na świeże płytki RNA z oczkami w celu oceny przeżywalności. Delikatnie dotknij nicienia spłaszczonym drutem platynowym. Brak reakcji oznacza śmierć nicienia.W okresie składania jaj należy zidentyfikować nicienie, a następnie przeprowadzić higienizację wewnętrzną. Nicienie te powinny zostać usunięte w odpowiednim czasie.Dane byłyby znacznie bardziej uporządkowane, gdyby ten białkowy zespół nicieni został wyraźnie uznany za nicienie eksperymentalne. Gdy nicienie przestaną składać jaja, wystarczy przenosić je na świeże płytki RNAi dwa razy w tygodniu. Po obumarciu populacji należy połączyć uzyskane dane i nanieść ich przeżywalność na krzywe Kaplana-Meiera.Niezależnie od wyciągniętych wniosków, należy przeprowadzić eksperyment co najmniej dwukrotnie w celu potwierdzenia wyników. W temperaturze 20 °C mediana długości życia nicieni N two typu dzikiego wynosi 17 dni. Infekcja Salmonella znacząco skraca medianę długości życia nicieni N two do 10,5 dnia, zgodnie z oczekiwaniami po zastosowaniu RNAi przeciwko Beck one.Zmniejszona przeżywalność po infekcji salmonellą. Średnia długość życia spadła z 10,5 do dziewięciu dni, a maksymalna długość życia była również znacznie krótsza. Wyniki te potwierdzają rolę Beck 1 w obronie sea elegance przed infekcją.Zwierzęta poddane działaniu RNAi przeciwko genowi Beck one, ale nie zarażone salmonellą. Nie odnotowano istotnych zmian w długości życia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu przeprowadzenia podejścia RNA oraz protokołu zakażania w celu zbadania roli genu gospodarza w obronie przed infekcją salmonellą.

a-protocol-to-infect-caenorhabditis-elegans-with-salmonella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Protokół infekcji Caenorhabditis elegans przez Salmonella typhimurium

Źródło: Chen, Y. i inni. Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje test przeżycia z użyciem C. elegans do modelowania patogenezy Aeromonas , gdzie doustne spożycie bakterii prowadzi do infekcji i śmiertelności jelit, umożliwiając ilościową ocenę zjadliwości bakterii w żywym systemie gospodarza.

Modelowanie patogenezy aeromonasów u C. elegans za pomocą testu przetrwania

Sorter robaków ułatwia badania genetyczne u Caenorhabditis elegans, sortując robaki według ekspresji fluorescencyjnych reporterów. W tym miejscu opisujemy nowe zastosowanie: sortowanie według kolonizacji przez patogen wykazujący ekspresję GFP i wykorzystujemy je do zbadania słabo poznanej roli rozpoznawania patogenu w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej.

Automatyczna separacja C. elegans skolonizowanych przez patogen bakteryjny

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Danio rerio) stają się powszechnie używanym modelem zwierzęcym kręgowców do kolonizacji i patogenezy mikrobiologicznej. Protokół ten opisuje zastosowanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego. P. caudatum łatwo internalizuje bakterie i jest wchłaniany przez larwy danio pręgowanego poprzez naturalne zachowania żerowania.

Wykorzystanie pierwotniaka Paramecium caudatum jako nośnika infekcji przenoszonych przez żywność u larw danio pręgowanego

Ten protokół opisuje mysi model zwłóknienia jelit wywołanego przez Salmonellę, który przypomina kluczowe patologiczne cechy choroby Leśniowskiego-Crohna, w tym przezścienne zapalenie i zwłóknienie. Metoda ta może być stosowana do oceny czynników gospodarza, które zmieniają wyniki zwłóknienia przy użyciu zmutowanych myszy utrzymywanych na tle genetycznym C57Bl/6.

Przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem Salmonellą

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Poznaj protokół zakażenia Caenorhabditis elegans Salmonellą typhimurium z wykorzystaniem RNAi do badania interakcji gospodarz-patogen. Ta metoda pozwala identyfikować kluczowe geny ochronne.

Protokół zakażenia Caenorhabditis elegans Salmonellą typhimurium

Przeglądaj więcej filmów