Name: Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj metodę produkcji haploidalnych zarodków Danio rerio przez zapłodnienie in vitro z wykorzystaniem naswietlania UV. Technika umożliwia efektywne badania genetyczne wczesnego embriogenezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została wsparta funduszami dla RAW z następujących źródeł: NIH przyznaje K01 DK083512, DP2 OD008470 i R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award #5-FY12-75; pozyskanie funduszy z University of Notre Dame College of Science i Wydziału Nauk Biologicznych; oraz hojny dar dla Uniwersytetu Notre Dame od Elizabeth i Michaela Gallagherów w imieniu rodziny Gallagherów na wspieranie badań nad komórkami macierzystymi. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy pracownikom Wydziału Nauk Biologicznych za ich wsparcie oraz Centrum Badań nad Danio Pręgowanym w Notre Dame za ich wyjątkowe poświęcenie w opiece i dobrostanie naszej kolonii danio pręgowanego. Dziękujemy G.F. Gerlachowi za wykonanie zdjęć zamieszczonych na rysunku 4. Na koniec dziękujemy wszystkim członkom naszego laboratorium badawczego za ich komentarze, dyskusje i spostrzeżenia na temat tej pracy.

UWAGA: Procedury pracy z embrionami danio pręgowanego opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Notre Dame. UWAGA: Chociaż poniższy protokół zapewnia demonstrację izolacji plemników, która obejmuje eutanazję samców, plemniki mogą być pobierane z porów narządów płciowych znieczulonych żywych samców danio pręgowanego przy użyciu delikatnego ucisku brzusznego i mikrokapilary do pobierania nasienia17,18. Wyciskanie żywych samców wymaga użycia kilku samców w celu zebrania równoważnej ilości nasienia, jaką można uzyskać od jednego mężczyzny poddanego eutanazji17,18. Jednak samce, które zostały poddane wyciskaniu, pozostają całkiem zdrowe i mogą być wykorzystywane do naturalnych kryć lub późniejszych procedur in vitro 17. Tam, gdzie to możliwe, wybrane procedury powinny minimalizować niepotrzebne poświęcanie ryb.
1. Przygotowanie roztworów i komór godowych danio pręgowanego
<ol>
	<li>Przygotować roztwory podstawowe Hanka (#1, 2, 4, 6) i roztwór premiksów Hanka (patrz tabela materiałów)19, a następnie umieścić w autoklawie i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wybierz żądaną liczbę dorosłych samic danio pręgowanego do zbierania haploidalnych lęgów. UWAGA: Opierając się na doświadczeniu, przy użyciu zmutagenizowanego F1 składającego się z wsobnego szczepu zebry z Tybingi, około 50% dojrzałych płciowo samic było średnio "ściskanych" po zalaniu ich przez umieszczenie w klatce godowej na noc z samcem – tj. sprzęgło uzyskano w procesie ściskania – a większość tych lęgów (w zakresie od 70 do 90%) wytwarzała żywotne haploidy. Dzięki dwóm naukowcom wykonującym preparat haploidalny, około 80 dorosłych samic zebry F1 może zostać ściśniętych w ciągu jednego ranka. Aby obliczyć odczynniki potrzebne do eksperymentu haploidalnego, należy wziąć pod uwagę zarówno szybkość ściskania pokolenia F1, jak i liczbę badaczy dostępnych do przeprowadzenia eksperymentu. Należy pamiętać, że liczba samic, które wyprodukują wysokiej jakości haploidalne lęgi, jest niezwykle zmienna, a różnice obserwuje się między samicami danio pręgowanego o różnych szczepach, wieku i diecie pokarmowej15.</li>
	<li>Przygotuj klatki godowe, umieszczając każdą dorosłą samicę danio pręgowanego z dorosłym samcem danio pręgowanego w komorze z wodą systemową, tak aby były oddzielone przegrodą na noc. UWAGA: Samice muszą być wystawione na kontakt z samcem przez noc, aby przygotować je do tarła poprzez ściskanie.</li>
</ol>
2. Sekcja jąder
<ol>
	<li>Przygotuj świeży roztwór podstawowy Hank's Stock #6, dodając 0,35 g wodorowęglanu sodu do 10 ml wody destylowanej. Dobrze wymieszaj, aby rozpuścić proszek wodorowęglanu sodu.</li>
	<li>Połącz następujące elementy w probówce na lodzie, aby uzyskać zbuforowany końcowy roztwór roboczy Hanka dla plemników: 9,9 ml Hanks Premix I ze 100 μl roztworu podstawowego #6.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj, a następnie podajcie 500 μl końcowego roztworu roboczego Hanka do probówki mikrowirówkowej i umieścimy na lodzie. UWAGA: Każda porcja o pojemności 500 μl zostanie wykorzystana do przygotowania nasienia z jąder 4-5 samców danio pręgowanego.</li>
	<li>Wybierz spośród 4-5 samców danio pręgowanego do każdego zbioru nasienia. UWAGA: Spowoduje to zebranie wystarczającej ilości plemników, które można zebrać, przetworzyć i przechowywać w jednej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, którą można wykorzystać do zapłodnienia około 15 haploidalnych lęgów. Należy wybrać dodatkowe kohorty samców w celu przygotowania dodatkowych probówek w zależności od skali eksperymentu. Jeśli wybrane samce danio pręgowanego są małe lub rozwarstwienie jąder jest niekompletne, zazwyczaj potrzebnych będzie 5 samców.</li>
	<li>Poddaj eutanazji każdego samca za pomocą siatki, aby delikatnie przenieść rybę do naczynia zawierającego 0,2% tricainy na około 5-6 minut w temperaturze pokojowej. UWAGA: Uważaj, aby upewnić się, że samiec został prawidłowo uśpiony przed rozpoczęciem sekcji. Zazwyczaj należy odczekać kilka (2-3) minut, po tym jak skrzela ryby przestaną się poruszać, a ryba przestanie reagować na dotyk.</li>
	<li>Delikatnie podnieś samca plastikową łyżką i ostrożnie osusz go z płynu. Następnie usuń głowę samca ostrymi nożyczkami, a następnie wytnij nacięcie wzdłuż brzusznej linii środkowej. UWAGA: Usunięcie całego nadmiaru płynu z ryb jest niezbędne, aby zapobiec wywołaniu aktywacji plemników.</li>
	<li>Usuń jelito i związane z nim narządy jelitowe z jamy brzusznej za pomocą cienkich kleszczy i umieść w pojemniku na zagrożenie biologiczne w celu usunięcia.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczyków, aby usunąć jądra, które znajdują się wzdłuż grzbietowej ściany ciała, po bokach pęcherza pławnego i mają biały, nieprzezroczysty wygląd, gdy są oglądane pod mikroskopem stereoskopowym. UWAGA: Utrzymanie jąder w stanie nienaruszonym może pomóc w zapobieganiu narażeniu plemników na płyny ustrojowe na bazie wody, a tym samym zapobiec przedwczesnej aktywacji.</li>
	<li>Umieść jądra w roztworze nasienia na lodzie i trzymaj probówkę na lodzie, podczas gdy inne jądra są preparowane. Powtarzaj kroki 2.6-2.9, aż wszystkie samce zostaną wypreparowane.</li>
	<li>Umieścić tusze i wszelkie pozostałe tkanki zwierzęce w pojemniku stanowiącym zagrożenie biologiczne w celu właściwego usunięcia przez instytucję.</li>
</ol>
3. Inaktywacja plemników UV
<ol>
	<li>Homogenizuj jądra, delikatnie mieląc probówkę do mikrowirówek sterylnym tłuczkiem do mikroprobówek.</li>
	<li>Przenieść supernatant na małą szalkę Petriego lub szkiełko zegarkowe na lodzie. UWAGA: Nie przenoś resztek tkanek wraz z roztworem sklarowanego nad osadem. Spowoduje to powstanie cieni i zagrozi inaktywacji plemników promieniowaniem UV.</li>
	<li>Przepłukać probówkę nasieniem 300-400 μl dodatkowego roztworu roboczego Hank's Final (przygotowanego w kroku 2.2 i przechowywanego na lodzie) i dodać ten supernatant do małej szalki Petriego lub szkła zegarkowego w kroku 3.2.</li>
	<li>Wystaw naczynie na działanie promieniowania UV z lampy stołowej (254 nm) łącznie przez 2 minuty w odległości od źródła lampy około 15 cali (38.1 cm). UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas pracy z lampą UV i noś osłonę twarzy lub inne środki ochrony osobistej oczu.</li>
	<li>Włóż naczynie z powrotem do wiadra z lodem, a następnie przenieś inaktywowane promieniami UV plemniki do świeżej probówki do mikrowirówki i przechowuj próbkę na lodzie. UWAGA: W tym momencie będzie około 800 μl plemników inaktywowanych promieniami UV do zapłodnienia haploidalnego sprzęgła. Plemniki powinny być trzymane na lodzie przez cały czas spędzony na ściskaniu samic. Nasienie w zimnym Hank's może być używane do 6 godzin bez pogorszenia wyniku zapłodnienia. Co ciekawe, inni badacze donieśli, że plemniki w zimnym Hank's są żywotne od kilku godzin do kilku dni.</li>
</ol>
4. Pobieranie jaj od dorosłej samicy danio pręgowanego i zapłodnienie in vitro lęgu
<ol>
	<li>Przygotować kąpiel trikainową do znieczulenia, łącząc 20 ml 0,2% bulionu trikainowego z 80 ml wody z systemu rybnego.</li>
	<li>Wybierz samicę do pobrania jaj, używając siatki, aby delikatnie umieścić ją w naczyniu z tricainą.</li>
	<li>Odczekaj 2-3 minuty, aż samica zostanie znieczulona i przestanie reagować na dotyk. UWAGA: Jeśli samica drga lub wywołuje inne ruchy, daj jej dodatkowy czas na poddanie się znieczuleniu.</li>
	<li>Użyj plastikowej łyżki, aby delikatnie podnieść samicę, dekantując roztwór przed umieszczeniem samicy na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu. UWAGA: Uważaj, aby nie pozostawić dodatkowego roztworu na samicy, ponieważ płyn wywoła aktywację komórki jajowej przed dodaniem plemników.</li>
	<li>Umieść samicę na szkiełku na czystej szalce Petriego i wizualizuj jej brzuch pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Delikatnie głaszcz brzuch samicy przez około 10-20 sekund, używając jednego lub dwóch palców jednej ręki, aby wycisnąć jaja z jej brzucha, w międzyczasie podtrzymując plecy samicy, umieszczając jeden lub dwa palce drugiej ręki tuż za ścianą grzbietu ciała. UWAGA: Po głaskaniu brzucha samicy jaja powinny bardzo łatwo wyjść. Jeśli jaja nie pojawiają się łatwo, nie zaleca się "mocniejszego naciskania" i wymuszania jaj od samicy. Oznacza to, że jaja nie są obecne i/lub nie są gotowe do zapłodnienia, a dalsze parcie wiąże się ze znacznym ryzykiem uszkodzenia samicy (np. opróżnienia pęcherza pławnego lub spowodowania innych śmiertelnych obrażeń wewnętrznych). Jeśli samica zostanie ściśnięta, ale nie dostarczy żadnych jaj lub nie złoży ich niewiele, należy zwrócić samicę do obiektu dla zwierząt. Po 1-2 tygodniach odpoczynku sparuj samicę z samcem w celu naturalnego krycia, aby usunąć resztki jaj. Segreguj samice, które łączą się w pary w sposób naturalny, w zbiorniku na kolejne 1-2 tygodnie odpoczynku przed próbą drugiego ściśnięcia. Alternatywnie samice mogą być odpoczywane przez 4 tygodnie, w tym czasie można je przygotować do naturalnych kryć15.</li>
	<li>Użyj cienkiej sondy lub małej szpatułki, aby wyjąć jaja spod powierzchni samicy i/lub jej brzucha.</li>
	<li>Delikatnie podnieś samicę i umieść ją z powrotem w odpowiednio oznakowanym zbiorniku izolacyjnym zawierającym wodę z systemu rybnego.</li>
	<li>Dodać 50 μl roztworu plemników inaktywowanego promieniami UV do gniazda jaj i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, w tym czasie przymocuj odpowiednią etykietę do naczynia, aby śledzić je numerem przypisanym do rodzica płci żeńskiej.</li>
	<li>Dodać 1 ml E3 do jaj i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.</li>
	<li>Dodać wystarczającą ilość roztworu E3 do napełnienia naczynia do połowy i umieścić zarodki w temperaturze 28 °C w celu późniejszej inkubacji. UWAGA: Dodanie penicyliny/streptomycyny (1% (v/v) roztworu pen-strep zawierającego 5000 jednostek penicyliny i 5 mg streptomycyny na ml)19 do E3 może pomóc w ogólnym stanie zdrowia haploidalnych zarodków.</li>
</ol>
5. Obserwacja i obchodzenie się z haploidalnymi zarodkami
<ol>
	<li>Po 4-8 godzinach wyjmij niezapłodnione zarodki z naczynia i umyj pozostałe zarodki, zastępując pożywkę zarodkową E3 świeżym roztworem E3. UWAGA: Niezapłodnione zarodki będą miały biały, nieprzezroczysty wygląd lub mogą mieć przezroczysty wygląd ze zniekształconą pojedynczą komórką.</li>
	<li>Inkubuj do pożądanego punktu czasowego, a następnie wykorzystaj w żądanym teście przesiewowym lub innych zastosowaniach badawczych.</li>
</ol>

<ol><li>Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate%2C+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-26 (1996).</li>
<li>Driever, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+mutations+affecting+embryogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish.</a> Development. 123, 37-43 (1996).</li>
<li>Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+make+a+big+splash%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Zebrafish make a big splash.</a> Cell. 87, 969-977 (1996).</li>
<li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+insertional+mutagenesis+screen+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish.</a> Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).</li>
<li>Bradford, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFIN%3A+enhancements+and+updates+to+the+zebrafish+model+organism+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ZFIN: enhancements and updates to the zebrafish model organism database.</a> Nucleic Acids Res. 39, (2011).</li>
<li>Bowen, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mapping+and+cloning+of+mutations+in+zebrafish+by+low-coverage+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Efficient mapping and cloning of mutations in zebrafish by low-coverage whole-genome sequencing.</a> Genetics. 190, 1017-1024 (2012).</li>
<li>Leshchiner, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+mapping+and+identification+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Mutation mapping and identification by whole-genome sequencing.</a> Genome Res. 22, 1541-1548 (2012).</li>
<li>Obholzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+positional+cloning+of+zebrafish+mutations+by+linkage+and+homozygosity+mapping+using+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid positional cloning of zebrafish mutations by linkage and homozygosity mapping using whole-genome sequencing.</a> Development. 139, 4280-4290 (2012).</li>
<li>Voz, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+homozygosity+mapping+and+identification+of+a+zebrafish+ENU-induced+mutation+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fast homozygosity mapping and identification of a zebrafish ENU-induced mutation by whole-genome sequencing.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Walker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haploid+screens+and+gamma+ray+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Haploid screens and gamma ray mutagenesis.</a> Meth Cell Biol. 60, 43-70 (1999).</li>
<li>Steisinger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li>
<li>Westerfield, M. Chapter 2, Embryo Production by in vitro fertilization.”. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book+4th+ed%22">The Zebrafish Book 4th ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).</li>
<li>Walker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+gynogenetic+diploid+zebrafish+by+early+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Making gynogenetic diploid zebrafish by early pressure.</a> (28), (2009).</li>
<li>Westerfield, M. Chapter 10: Recipes.”. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book+4th+ed%22">The Zebrafish Book 4th ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene, USA. (2000).</li>
<li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+medaka+fish+haploid+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of medaka fish haploid embryonic stem cells.</a> Science. 326, 430-433 (2009).</li>
<li>Yi, M., Hong, N., Hong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+haploid+embryonic+stem+cell+cultures+in+medaka+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of haploid embryonic stem cell cultures in medaka fish.</a> Nat Protoc. 5, 1418-1430 (2010).</li>
<li>Layton, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLayton%2C+JE+%22Undertaking+a+successful+gynogenetic+haploid+screen+in+zebrafish.%E2%80%9D+Zebrafish%2C+Methods+and+Protocols.+1st+ed%22">Undertaking a successful gynogenetic haploid screen in zebrafish.” Zebrafish, Methods and Protocols. 1st ed</a>. , Humana Press. (2009).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badania przesiewowe haploidalne są przydatną techniką odkrywania niezbędnych genów niezbędnych we wczesnych stadiach rozwoju. Co więcej, hodowla komórek haploidalnych od ryb medaka została wykorzystana do wyizolowania linii komórkowych podobnych do ES, które mają liczne zastosowania badawcze i potencjał, wykazując, że komórki haploidalne mogą stanowić cenne miejsce dla innych typów badań genetycznych kręgowców w przyszłości20,21. Protokół ten zapewnia demonstrację metod związanych z produkcją haploidalnych zarodków danio pręgowanego poprzez zapłodnienie in vitro plemnikami inaktywowanymi promieniami UV. Metodologia ta może być wykorzystana do przeprowadzenia przesiewowych badań haploidalnych z mutagenizowanymi rybami F1, które można wykonać przy użyciu szczepów typu dzikiego, transgenicznego lub zmutowanego do badań przesiewowych wzmacniacza/supresora.
Chociaż czas badań przesiewowych przy użyciu strategii haploidalnej jest znacznie skrócony w porównaniu z badaniami przesiewowymi diploidalnymi, to jednak zajmie to kilka miesięcy. Jak opisaliśmy wcześniej, istnieje wiele korzyści, które wynikają z przeprowadzenia badania przesiewowego przy użyciu schematu haploidalnego, z których wszystkie mogą pomóc w wniesieniu nowego wkładu do obecnej wiedzy na temat dowolnej liczby zdarzeń rozwojowych. Metodologia badań haploidalnych jest bardziej skuteczna w identyfikacji recesywnych zmutowanych alleli niż badania przesiewowe oparte na diploidalnych ze względu na redukcję czasu, przestrzeni i liczby potrzebnych ryb. Istnieje jednak kilka pułapek związanych z haploidalnym ekranem. Badanie haploidalne może zidentyfikować mutanty tylko w genach, które są aktywne w ciągu pierwszych kilku dni rozwoju, ponieważ zarodek może przetrwać tylko przez ograniczony czas z haploidalnym genomem. Geny, które ulegają ekspresji w późniejszym okresie rozwoju, musiałyby zostać zidentyfikowane inną metodą, taką jak diploidalne badanie przesiewowe. Ponadto niektóre narządy nie rozwijają się prawidłowo w organizmie haploidalnym. Mogą wystąpić nieprawidłowości anatomiczne lub opóźniony czas rozwoju, co może spowodować, że mutacja zostanie pominięta przez technikę badań haploidalnych. Ponadto niektóre szczepy ryb nie rozwijają się tak dobrze w stanie haploidalnym15. Haploidy można podzielić na kategorie według serii ocen dobrych, pośrednich i słabych cech embrionalnych, przy czym zarodki A są najbardziej normalne, B oznaczają zarodki z wadami osi, ale wyraźną głową i ogonem, a C/D oznaczają zarodki o cechach nierozpoznawalnych (masy komórek na kulkach żółtkowych)15,17. Proporcje zarodków w tych kategoriach różnią się w zależności od szczepu danio pręgowanego, przy czym zwiększona liczba haploidów lepszej jakości jest bardziej rozpowszechniona w szczególności w tle genetycznym15,17. Ze względu na te czynniki konieczne jest znalezienie odpowiedniego szczepu danio pręgowanego do przeprowadzenia mutagenezy i kolejnych krzyżówek. W naszych ostatnich doświadczeniach szczep Tübingen typu dzikiego wytwarzał żywotne haploidy do badań przesiewowych (jak pokazano na rysunkach 3 i 4), chociaż historycznie badacze danio pręgowanego wykorzystywali szczepy AB lub AB* do eksperymentów haploidalnych15.
Oprócz tych wyżej wymienionych wyzwań, nie wszystkie dorosłe samice danio pręgowanego wytworzą lęg po wykonaniu techniki ściskania. Na przykład, podczas pracy z samicami szczepu Tübingen zmutagenizowanego ENU, około połowa wszystkich samic wytworzyła lęg po ściśnięciu, a pewna część z nich (zwykle 10-30%) była złej jakości zarodków lub nie mogła zostać zapłodniona. Tak więc, aby przeprowadzić badanie przesiewowe haploidalne, należy zaplanować hodowlę co najmniej dwa razy więcej ryb niż potrzeba do przesiewania pożądanej liczby genomów (każda samica reprezentuje jeden przebadany genom). Niezależnie od tych rozważań, korzyści płynące z haploidalnej metody badań przesiewowych w celu pokrycia dużej liczby genomów bez ogromnego obiektu dla zwierząt są rzeczywiście dość znaczące, jeśli test jest podatny na stan haploidalny. Należy jednak również zauważyć, że dalsze badania mutacji zidentyfikowanej w haploidalnym lęgu są w pełni zależne od pomyślnego wyhodowania krzyżówki od samicy założycielki. Podobnie jak w przypadku każdego sita, "trafienia" początkowo zidentyfikowane w procesie przesiewowym muszą zostać ponownie zidentyfikowane w stanie diploidalnym.
Pomimo pułapek związanych z używaniem ekranu haploidalnego, okazał się on bardzo skuteczny w identyfikacji mutantów, które zostały dogłębnie przeanalizowane z wnikliwymi korzyściami dla dziedziny naukowej15. Badania przesiewowe haploidalne mogą być stosowane w celu zbadania innych słabo poznanych procesów rozwoju kręgowców. Wykorzystanie haploidów do ekranów wzmacniających i supresorowych jest jednym ze sposobów uzyskania lepszego wglądu w aktywność i sieć regulacyjną interesującego genu. Technika badań przesiewowych haploidalnych może być również wykorzystana do identyfikacji wzmacniaczy i supresorów mutantów, które zostały już wyizolowane za pomocą metod takich jak mutageneza chemiczna lub insercyjna lub podejścia genetyki odwrotnej, takie jak TILLING lub TALENs. Krótko mówiąc, wcześniej wyizolowany mutant może być mutagenizowany za pomocą ENU i badany pod kątem wzmacniaczy lub supresorów oryginalnego zmutowanego fenotypu. Mutant musi być w stanie osiągnąć dorosłe stadium, więc konieczne jest posiadanie heterozygotycznego zwierzęcia lub słabej homozygotycznej zmutowanej ryby, aby wykonać to badanie, jednak ostatnie postępy w transgenezie pozwoliły naukowcom ominąć ten problem. Nauczenie się, jak manipulować szlakami w rozwoju, może prowadzić do wielu ekscytujących możliwości, w tym perspektywy niepokojących ścieżek leczenia stanów chorobowych.

Podstawowe procesy, które kierują rozwojem kręgowców, są zasadniczo zachowane1. Skutecznym sposobem identyfikacji genów odgrywających istotną rolę w rozwoju jest wyizolowanie dziedzicznych mutacji, które prowadzą do defektów fenotypowych w procesie będącym przedmiotem zainteresowania. Danio pręgowany, Danio rerio, jest małym słodkowodnym gatunkiem teleostowym należącym do rodziny ryb Cyprinidae, który w ciągu ostatnich kilku dziesięcioleci stał się szeroko stosowanym organizmem modelowym w genetyce rozwoju kręgowców2. Jaja danio pręgowanego są nawożone zewnętrznie, co umożliwia dostęp do zygoty od początku zapłodnienia3. Co więcej, wczesny zarodek jest optycznie przezroczysty, co umożliwia wizualizację rozwoju za pomocą prostego mikroskopu stereoskopowego3. Ontogeneza danio pręgowanego jest szybka, a procesy rozszczepienia, gastrulacji i organogenezy wielu struktur, takich jak serce i nerki, w dużej mierze kończą się w ciągu pierwszego dnia rozwoju3. Czas od stadium larwalnego do dojrzałości płciowej trwa 2-3 miesiące, a dorosłe osobniki to małe kręgowce o długości około 3-4 cm, więc wiele ryb można utrzymać na minimalnej przestrzeni2. Ponadto dorosłe rybki danio pręgowanego mają wysoką płodność, a każda ryba jest w stanie wyprodukować kilkaset zarodków tygodniowo2. Te cechy sprawiły, że danio pręgowany jest podatny na badania genetyczne do przodu i do tyłu. Danio pręgowany charakteryzuje się wysokim stopniem ochrony anatomii, biologii komórki i fizjologii z bardziej zaawansowanymi gatunkami kręgowców, takimi jak ssaki2,4. W rzeczywistości niedawna analiza sekwencji wykazała, że genom danio pręgowanego zawiera homologi do prawie 70% ludzkichgenów5. Ochrona ta umożliwiła naukowcom wykorzystanie danio pręgowanego jako modelu dla wielu chorób człowieka, w tym zarówno chorób embrionalnych, jak i dorosłych2,4. Podsumowując, czynniki te sprawiły, że danio pręgowany jest doskonałym systemem do badań przesiewowych mających na celu identyfikację genów, które są niezbędne dla prawidłowej ontogenezy kręgowców.
Przeprowadzono wiele badań przesiewowych na dużą skalę u danio pręgowanego, które zidentyfikowały kilka tysięcy mutacji w genach rozwojowych6-8. Dorosły samiec danio pręgowanego jest podatny na mutagenezę, a zmiany chromosomowe mogą być generowane ze stosunkowo dużą częstotliwością przy użyciu mutagenu chemicznego mutagenu etylonitromocznika (ENU)6,7 lub retrowirusowej mutagenezy insercyjnej9. Do tej pory stworzono ponad 9000 dziedzicznych mutacji, w tym geny, które wpływają na praktycznie wszystkie aspekty embriogenezy. Społeczność danio pręgowanego utworzyła scentralizowany bank tych mutantów w Międzynarodowym Centrum Zasobów Danio Pręgowanego (lub ZIRC)10, które zebrało około 5000 zmutowanych i transgenicznych alleli z całego świata. Wiele z tych mutacji zostało przeanalizowanych i sklonowanych, dostarczając naukowcom z różnych dyscyplin biologicznych cennych informacji, które zostały wykorzystane do wyodrębnienia wielu szlaków komórkowych i fizjologicznych dzięki wglądom pochodzącym z eksperymentów z danio pręgowanym.
Chociaż badania przesiewowe zidentyfikowały imponującą liczbę ważnych genów, wiele jeszcze nie zostało docenione na temat genetycznych sieci regulacyjnych, które pośredniczą w niezliczonych procesach. Wiele przeprowadzonych do tej pory badań przesiewowych nie osiągnęło saturacji, a zatem zarówno postępowe, jak i odwrotne badania genetyczne pozostały kamieniem węgielnym do identyfikacji i analizy mechanizmów embriogenezy. Chociaż istnieje wiele informacji, które można uzyskać z dowolnej pojedynczej linii mutantów danio pręgowanego, głównym czynnikiem ograniczającym w tej dziedzinie był historycznie czasochłonny wysiłek związany z klonowaniem pozycyjnym. Z tego powodu tożsamość wielu chemicznie wywołanych mutacji pozostała tajemnicą. Jednak wraz z niedawnym pojawieniem się metod sekwencjonowania całego genomu, które ułatwiają szybkie klonowanie11-14, niezwykle skuteczna identyfikacja mutacji genetycznych jest obecnie możliwa.
Prototypowy ekran przedni u danio pręgowanego to diploidalny ekran, który może zidentyfikować mutacje recesywne w ciągu trzech pokoleń6,7 (Rysunek 1, lewa kolumna). Technika ta polega na generowaniu mutacji w komórkach rozrodczych samca rodzicielskiego (P), a następnie kojarzeniu tego samca z samicą typu dzikiego. Każde z potomstwa pierwszego pokolenia (F1) z tego krycia będzie miało jedną lub więcej unikalnych mutacji ze względu na wkład chromosomalny zmutowanego genomu ojcowskiego. Potomstwo F1 jest hodowane i krzyżowane z dzikimi typami w celu stworzenia rodzin F2. W rodzinie F2 rodzeństwo będzie albo typem dzikim, albo heterozygotycznym nosicielami i jest krzyżowane losowo w celu wygenerowania lęgów F3, które są analizowane pod kątem interesującego fenotypu. Lęgi F3 heterozygotycznych nosicieli będą zawierały 25% ryb typu dzikiego, 50% heterozygotycznych i 25% homozygotycznych zmutowanych. Ten wielopokoleniowy schemat badań przesiewowych jest skuteczny, jednak jedną z głównych wad tego podejścia jest czas potrzebny na przygotowanie się do badania: w grę wchodzi co najmniej 1 rok samej hodowli ryb, ponieważ każde pokolenie potrzebuje około 3 miesięcy, aby osiągnąć dojrzałość płciową. Inne ograniczenia tego typu ekranu diploidalnego to praca, przestrzeń i koszt zakwaterowania tych pokoleń.
Ekran haploidalny jest jedną z alternatyw, która może być wykorzystana do identyfikacji, a następnie wyizolowania mutacji recesywnych przy użyciu podobnych strategii mutagenezy15 (Rysunek 1, prawa kolumna). Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego została po raz pierwszy opisana ponad 30 lattemu16, a zdolność normalnie diploidalnego danio pręgowanego do rozwoju przez kilka dni z haploidalną ploidalnością chromosomalną została wykorzystana w licznych badaniach genetycznych od tego czasu. Główną zaletą haploidalnego badania przesiewowego jest to, że metoda ta nie obejmuje hodowli rodzin F2 w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku recesywnych zmutowanych alleli. Zamiast tego samice pokolenia F1 są oceniane pod kątem heterozygotyczności mutacji recesywnych w procesie będącym przedmiotem zainteresowania, badając ich potomstwo F2 w stanie haploidalnym (ryc. 1, prawa kolumna). Ogólnie rzecz biorąc, kroki do uzyskania haploidalnych zarodków są stosunkowo proste (ryc. 2). Po przygotowaniu roztworów niezbędnych do obchodzenia się z nasieniami, jaja są pozyskiwane od samic pokolenia F1 poprzez ręczną manipulację w celu wyciśnięcia (lub "wyciśnięcia") jaj z brzucha. Po uzyskaniu komórek jajowych są one zapładniane in vitro poprzez wystawienie na działanie plemników inaktywowanych ultrafioletem (UV). Plemniki inaktywowane promieniowaniem UV nie są w stanie dostarczyć żywotnego DNA do komórki jajowej ze względu na fakt, że promieniowanie UV o krótkiej długości fali sieciuje ojcowskie DNA. Jednak plemniki są nadal zdolne do wywoływania aktywności komórki jajowej i zdarzeń związanych z rozwojem jarzmowym. Po aktywacji metabolicznej komórka jajowa zakończy mejozę II i będzie się rozwijać z tylko jedną zdeponowaną przez matkę kopią każdego chromosomu. Ze względu na tę ploidię 1N zarodek podlega konsekwencjom rozwojowym recesywnego zmutowanego allelu, jeśli jest on obecny na chromosomie matki. Tak więc każde haploidalne sprzęgło F2 będzie zawierało 50% zarodków typu dzikiego i 50% zmutowanych, jeśli matka jest heterozygotycznym nosicielem w pełni penetrującego allelu recesywnego. Taki rozkład genotypów embrionalnych umożliwia względną łatwość oceny lęgu pod kątem obecności zmutowanego fenotypu (fenotypów) będącego przedmiotem zainteresowania. Jeśli taki fenotyp zostanie wykryty, samica założyciela pokolenia F1 jest następnie krzyżowana z samcami danio pręgowanego typu dzikiego, aby stworzyć i wyhodować bardziej heterozygotycznych nosicieli. Ponieważ nie jest konieczne wychowywanie wielu pokoleń w celu przeprowadzenia badania, badacz może zaoszczędzić znaczną ilość czasu, pracy i miejsca w akwarium, ale nadal ma możliwość zbadania znacznej liczby genomów w oparciu o liczbę badanych samic F1. W związku z tym badania haploidalne są szczególnie wykonalne w przypadku małych laboratoriów lub projektów inicjowanych przy braku znacznych funduszy.
Istnieje jednak kilka ograniczeń i wad związanych z używaniem haploidów. Po pierwsze, haploidalne zarodki danio pręgowanego żyją tylko kilka dni i zwykle umierają między 3 a 5 dniem po zapłodnieniu (dpf)15. Haploidalne zarodki danio pręgowanego można odróżnić od diploidów na podstawie kilku cech, z których najważniejszą jest krótkie i krępe ciało, które jednak ma normalną liczbę segmentów somitu15,17. Wraz z postępem rozwoju mózg wykazuje zwiększoną śmierć komórek, a krążenie jest słabe, co zwykle wiąże się z gromadzeniem się krwi przez 2-3 dpf i obrzękiem15,17. Co więcej, haploidy nie są w stanie napompować pęcherza pławnego15,17. Niezależnie od tych różnic morfologicznych powstaje większość głównych narządów i tkanek, w tym serce, oko i struna grzbietowa15,17. Jedną z cech zauważalnych w haploidalnych lęgach jest to, że zawierają one szereg fenotypów pod względem odmian wadliwych zarodków – cecha obserwowana w przypadku szczepów danio pręgowanego. W związku z tym należy sprawdzić, czy tkanka (tkanki) i punkt czasowy zainteresowania wykazują w miarę normalny rozwój w haploidalnym szczepie typu dzikiego, a zatem mają potencjał do oceny pod kątem wad genetycznych w badaniu przesiewowym lub innym projekcie badawczym.
Pomimo tych wyzwań, z powodzeniem wdrożono badania przesiewowe haploidalne w celu identyfikacji genów niezbędnych do wczesnych procesów rozwojowych u danio pręgowanego, a protokoły haploidalne są dobrze ugruntowanymi zasobami w społeczności od wielu lat15-19. Ostatnio proces generowania haploidalnych zarodków ryb został wykorzystany przez naukowców do stworzenia haploidalnych embrionalnych komórek macierzystych (ES) z ryb medaka20,21. Po wyprodukowaniu haploidalnych zarodków medaka in vitro, zarodki wykorzystano do uzyskania pierwotnych kultur komórkowych, które pasażowano przez około 15 tygodni, a następnie przez kolejne 5-8 tygodni w celu wygenerowania czystych klonów komórek haploidalnych o właściwościach komórek ES15-19. Generacja haploidalnych linii komórkowych ES ryb daje szerokie nadzieje na przyszłość w zakresie analizy recesywnych fenotypów w liniach komórkowych kręgowców i stanowi nowe podejście do analizy genetycznej w nadchodzących latach. W związku z tym generowanie haploidalnych zarodków ryb ma coraz większe zastosowanie w społeczności badaczy biomedycznych. Ten artykuł wideo zawiera wizualną demonstrację etapów związanych z wytwarzaniem haploidalnych zarodków zebry danio pręgowanego in vitro przy użyciu plemników inaktywowanych promieniami UV w oparciu o ustalone protokoły15-19,22.

<table><tbody><tr><td>Roztwór podstawowy Hanka #1</td><td></td><td></td><td>8,0 g NaCl, 0,4 g KCl w 100 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy Hanka #2</td><td></td><td></td><td>0,358 g Na2HPO4 bezwodny; 0,60 g K2H2PO4 w 100 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy Hanka #4</td><td></td><td></td><td>0,72 g CaCl2 w 50 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Roztwór podstawowy Hanka #5</td><td></td><td></td><td>1,23 g MgSO4-7H2O w 50 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Hank's Premix</td><td></td><td></td><td>Połącz w następującej kolejności: (1) 10,0 ml HS#1, (2) 1,0 ml HS#2, (3) 1,0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1,0 ml HS#5. Przechowuj wszystkie roztwory HS i premiksy w temperaturze 4 &#176;C.</td></tr><tr><td>Hank's Stock Solution #6</td><td></td><td></td><td>0,35 g NaHCO3 w 10,0 ml ddH2O; przygotować świeże w dniu użycia.</td></tr><tr><td>Końcowe roztwór</td><td></td><td></td> roboczy <td>Hanka Połącz 9,9 ml Hank's Premix z 0,1 ml HS Stock #6</td></tr><tr><td>Lampa stołowa UV serii XX</td><td>UVP</td><td>95-0042-05</td><td>Model XX-15S Lampa stołowa</td></tr><tr><td>XX Stojak stołowy (regulowany)</td><td>UVP</td><td>18-0062-01</td><td>Model XX-15 Stojak</td></tr><tr><td>Naczynie do inkubacji zarodków</td><td>Sokół</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 w wodzie destylowanej. Uzupełnij błękitem metylenowym (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) w celu zahamowania zanieczyszczeń.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczyć 50 X E3 w wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ645; </td><td></td>SMZ1000</tr></tbody></table>

produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

Danio pręgowany stał się głównym modelem kręgowców, który jest istotny dla wielu dyscyplin badań naukowych. Danio pręgowany szczególnie dobrze nadaje się do zaawansowanej analizy genetycznej procesów rozwojowych ze względu na ich zewnętrzne zapłodnienie, wielkość embrionalną, szybką ontogenezę i przejrzystość optyczną – konstelację cech, które umożliwiają bezpośrednią obserwację zdarzeń od gastrulacji do organogenezy za pomocą podstawowego mikroskopu stereoskopowego. Co więcej, zarodki danio pręgowanego mogą przetrwać kilka dni w stanie haploidalnym. Wytwarzanie haploidalnych zarodków in vitro jest potężnym narzędziem do analizy mutacji, ponieważ umożliwia identyfikację recesywnych zmutowanych alleli obecnych u kobiet nosicieli pierwszego pokolenia (F1) po mutagenezie w pokoleniu rodzicielskim (P). Takie podejście eliminuje konieczność wychowywania wielu pokoleń (F2, F3 itp.), co wiąże się z hodowlą zmutowanych rodzin, oszczędzając w ten sposób czas badacza, a także zmniejszając zapotrzebowanie na miejsce w kolonii danio pręgowanego, pracę i koszty hodowli. Chociaż danio pręgowany był używany do przeprowadzania badań przesiewowych do przodu przez ostatnie kilkadziesiąt lat, nastąpił stały rozwój narzędzi transgenicznych i edycji genomu. Narzędzia te oferują obecnie mnóstwo sposobów tworzenia zniuansowanych testów dla badań przesiewowych nowej generacji, które można wykorzystać do dalszej analizy sieci regulacyjnych genów, które napędzają ontogenezę kręgowców. Tutaj opisujemy, jak przygotować haploidalne zarodki danio pręgowanego. Protokół ten może zostać wdrożony w nowatorskich przyszłych haploidalnych badaniach przesiewowych, takich jak ekrany wzmacniające i supresorowe, w celu zbadania mechanizmów rozwoju szerokiej liczby procesów i tkanek, które tworzą się we wczesnych stadiach embrionalnych.

Produkcję embrionów haploidalnych można zastosować w celu identyfikacji mutacji recesywnych w generacji F2, gdy haploidy pochodzą z dojrzałych samic zebrafish będących potomstwem rodziców poddanych mutagenezie (Rycina 1). Pozwala to na oszczędność czasu i miejsca w porównaniu do tradycyjnego przesiewu diploidalnego, w którym badacze muszą hodować rodziny F2, których diploidalne potomstwo jest następnie oceniane pod kątem interesujących fenotypów (Rycina 1).
Główne etapy protokołu opisanego w krokach 1-5 powyżej w celu uzyskania haploidalnych embrionów zebrafish poprzez zapłodnienie in vitro zostały przedstawione w formie schematu blokowego (Rysunek 2). Etapy te obejmują przygotowanie roztworów i priming samic poprzez ekspozycję na hormony męskie w zbiornikach do rozrodu (Dzień 1), następnie pozyskanie plemników i komórek jajowych oraz zapłodnienie in vitro (Dzień 2), a na koniec hodowlę osobników haploidalnych (Dni 3-5) (Rysunek 2). W połączeniu z przesiewem genetycznym typowa procedura mutagenezy u zebrafish obejmuje wcześniejszą ekspozycję dorosłych samców zebrafish typu dzikiego na mutagen (np. na mutagen chemiczny taki jak ENU, choć można zastosować inne procedury, np. mutagenezę opartą na retrowirusach, która ułatwia również klonowanie defektu chromosomalnego), a następnie krzyżowanie z samicami typu dzikiego w celu uzyskania zmutagenezowanej generacji F1. Takie przygotowania wymagają kilku miesięcy pracy (około 6 miesięcy), bazując na czasie generacji potrzebnym do wyhodowania osobników typu dzikiego, przeprowadzenia mutagenezy i wyhodowania kolejnej zmutagenezowanej generacji F115,17,22.
Kolejnym istotnym punktem do rozważenia przy wykorzystaniu haploidów do przesiewu jest wybór szczepu rybek danio (*zebrafish*). Szczep AB* (AB star) stał się powszechnie znany z wytwarzania embrionów haploidalnych o lepszych ogólnych charakterystykach i stanie zdrowia niż inne szczepy15. Jednakże w pochodnym szczepie z Tübingen hodowanym w naszym laboratorium zaobserwowaliśmy ostatnio cechy embriologiczne, które umożliwiły przeprowadzenie skutecznych przesiewów w kierunku anomalii rozwojowych układu nerkowego (G. Gerlach i R. Wingert, nieopublikowane). Dorosłe samce szczepu Tübingen zostały poddane mutagenezie za pomocą serii trzech zabiegów z użyciem ENU, a następnie skrzyżowano je z samicami typu dzikiego szczepu Tübingen w celu wygenerowania pokolenia F1 do przesiewu. Samice F1 zostały poddane wyciskaniu w celu uzyskania jaj, a te jaja F2 zapłodniono plemnikami inaktywowanymi promieniami UV. W porównaniu do diploidowych zniesień uzyskanych z naturalnych kopul rodziców typu dzikiego szczepu Tübingen (Rysunek 3A), embriony w tych haploidalnych zniesieniach szczepu Tübingen wykazywały krótszy, krępy tułów charakterystyczny dla stanu haploidalnego (Rysunki 3B,C). Co więcej, zniesienia haploidalne zazwyczaj składają się z rodzeństwa embrionów wykazujących szereg wad, co również zaobserwowaliśmy (Rysunki 3B,C), a co jak wiadomo różni się w zależności od szczepu, jak omówiono poniżej15,17.
Poprzednie badania ustanowiły kanoniczną skalę stopniowania, odpowiadającą stopniom od A do D, w celu kategoryzacji zakresu defektów fenotypowych haploidów15,17; dodatkowo haploidy określano również przymiotnikami takimi jak: wysokiej, średniej i niskiej jakości22. Haploidy stopnia A, odpowiadające haploidom wysokiej jakości, mają najbardziej prawidłowy wygląd, z krótkim i krępym ciałem, lecz ogólnie wykazują morfologię zbliżoną do diploidów15,17,22 (porównaj rodzeństwo diploidalne (d) z rodzeństwem haploidalnym stopnia A (oznaczonym jako A), Rycina 3B). Embriony haploidalne stopnia A wykazują również umiarkowany obrzęk osierdzia, który jest typową cechą rozwoju haploidalnych rybek danio15,17,22 (Rycina 3B). W porównaniu do haploidów stopnia A, embriony haploidalne średniej jakości lub tak zwane stopnia B (oznaczone jako B, Ryciny 3B,C) charakteryzują się dalszym skróceniem lub zagięciem/skręceniem tułowia, choć cechy głowy i ogona są wyraźnie rozróżnialne15,17,22. Wreszcie, haploidy stopnia C lub niskiej jakości (wymieniane w niektórych źródłach jako C/D)15,17,22 są ekstremalnie zdeformowane i prezentują się jako zdezorganizowana masa komórek związana z kulką żółtka (oznaczone jako C, Rycina 3C). Nawet w obrębie tego samego szczepu, obsady haploidalne różnią się w rozkładzie obserwowanych fenotypów A, B i C. Na przykład, obsada haploidalna od jednej samicy z linii Tübingen wykazała ogólnie lepszy rozwój, z przewagą potomstwa haploidalnego stopnia A i B (Rycina 3B) w porównaniu do haploidów uzyskanych od drugiej samicy linii Tübingen, której obsada składała się z licznych potomków haploidalnych stopnia C, a także fenotypów haploidalnych A i B (Rycina 3C). Podobna zmienność stopni embrionów haploidalnych w obrębie szczepu była wcześniej obserwowana również u ryb szczepów AB i AB*15.
Pomimo tych różnic morfologicznych, organogeneza wielu struktur przebiega stosunkowo prawidłowo w zarodku haploidalnym. Chociaż mają one krótszy tułów, rozwój organów takich jak oczy i serce jest stosunkowo podobny do rozwoju zarodków diploidalnych typu dzikiego, a ocenie mogą zostać poddane również typy komórek, takie jak komórki pigmentowe (melanofory i ksantofory)15. Ponadto niedawno udokumentowaliśmy, że przymierka, czyli nerka embrionalna, rozwija się do 1 dnia po zapłodnieniu u haploidalnych osobników typu dzikiego, podobnie jak u diploidalnych osobników typu dzikiego. Dowodem na to jest wzorzec typów komórek przymierki, który wykazuje prototypowy podział na segmenty (Rysunek 4). Co więcej, fenotyp mutacji recesywnych zmieniających rozwój przymierki, takich jak mutacja lib redukująca produkcję kwasu retinowego, wykazuje podobny wzorzec w stanie haploidalnym w porównaniu do stanu diploidalnego (Rysunek 4)23,24. Obserwacja ta jest zgodna z wynikami innych mutacji recesywnych, które prowadzą do podobnych fenotypów zarówno w warunkach haploidalnych, jak i diploidalnych, choć nie zawsze jest tak w przypadku wszystkich mutacji, co należy mieć na uwadze podczas oceny tego rodzaju strategii przesiewowej15.
W organizmach haploidalnych szereg tkanek i narządów jest zazwyczaj nieprawidłowych. Na przykład osobniki haploidalne wykazują wady krążenia, często objawiające się zastojem krwi, co może ograniczać możliwość badania niektórych aspektów waskulogenezy15. Dodatkowo zauważono, że w stanie haploidalnym mogą występować nieprawidłowości w rozwoju ucha, co pozwala na ocenę mutacji całkowicie zapobiegających formowaniu się pęcherzyka słuchowego, ale nie takich, które wpływają na subtelne procesy związane z morfogenezą tej struktury15. Kolejnym przykładem jest nieprawidłowa morfogeneza mózgu w stanie haploidalnym, co ogranicza zastosowanie przesiewów haploidalnych w identyfikacji niezbędnych szlaków rozwoju mózgu15. Mimo tych ograniczeń, nasza analiza rozwoju nerek w stanie haploidalnym (Rysunek 4) włącza ten narząd do listy „przesiewowych” struktur embrionalnych. Wynik ten podkreśla, że metodologia przesiewu haploidalnego może być wykorzystana do analizy komponentów genetycznych wzorca progenitorów nerkowych i potwierdza tezę, że pomysłowe podejścia do przesiewów mogą ominąć ograniczenia ontogenezy embrionów haploidalnych, aby odkryć cenne, nowe modele mutantów do badania rozwoju kręgowców15.
<img alt="Schemat screeningu genetycznego rybek danio; analiza diploidalna/haploidalna dziedziczenia fenotypu mutantów." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat strategii screeningu diploidalnego i haploidalnego w modelu rybek danio. Po przeprowadzeniu mutagenezy pokolenia rodzicielskiego, pokolenie F1 może być hodowane i wykorzystywane albo do wytworzenia rodzin mutantów F2, które służą do screeningu pokolenia F3 w stanie diploidalnym (po lewej), albo poddane bezpośredniemu screeningowi w strategii haploidalnej (po prawej). W screeningu haploidalnym do zbierania haploidalnych cew F2 na potrzeby analizy genetycznej wykorzystuje się dojrzełe płciowo samice pokolenia F1. Heterozygotyczne samice-nosiciele są identyfikowane, gdy około połowa haploidów F2 wykazuje fenotyp mutanta (czerwone embriony) w porównaniu z haploidalnymi rodzeństwem typu dzikiego (żółte embriony).
<img alt="Schemat produkcji zarodków haploidalnych; metoda zapłodnienia in vitro u rybek danio." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat produkcji zarodków haploidalnych. Główne etapy zapłodnienia in vitro w celu uzyskania zarodków haploidalnych przedstawiono w formie schematu zadań wykonywanych w Dniu 1 (różowe pola) w celu przygotowania roztworów plemników oraz wstępnego przygotowania dorosłych samic rybek danio, zadań wykonywanych w Dniu 2 (pomarańczowe pola) obejmujących pobranie i inaktywację plemników promieniowaniem UV, pobranie jajeczek, zapłodnienie jajeczek inaktywowanymi plemnikami w celu wytworzenia haploidalnych zarodków, a następnie reanimację samicy, oraz wreszcie zadań wykonywanych w kolejnych Dniach 3-5 (żółte pole), kiedy lęgi są inkubowane do pożąnego punktu czasowego w celu obserwacji i analizy.
<img alt="Etapy rozwoju zarodka ryby danio pręgowanej, oznakowane komórki; analiza mikroskopowa do celów badawczych." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig3highres.jpg" width="300" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Porównanie diploidowych i haploidalnych zarodków ryby danio pręgowanej szczepu Tübingen. A) Diploidalne zarodki typu dzikiego uzyskano poprzez naturalne tarło, a następnie inkubowano do około 30 hpf. B, C) Haploidalne zarodki typu dzikiego uzyskano poprzez zapłodnienie in vitro partii jaj pochodzących od mutagenizowanych samic generacji F1 przy użyciu plemników inaktywowanych promieniami UV, a następnie inkubowano do około 30 hpf. Haploidy wykazywały szereg nieprawidłowości w rozwoju w porównaniu z diploidalnymi zarodkami typu dzikiego (czarne groty strzałek, d oznacza diploida). Stosunkowo normalne haploidy miały skrócone, bardziej krępe ciało, analogiczne do schematu stopniowania haploidy A15 (czerwone groty strzałek, oznaczone A), natomiast haploidy z poważnymi wadami wykazywały silnie skróconą oś ciała (fioletowe groty strzałek, oznaczone B), co odpowiada stopniowi B, a wreszcie stopniowi C (niebieskie groty strzałek, oznaczone C) na podstawie opublikowanych opisów15. Wszystkie zarodki sfotografowano na żywo przy powiększeniu 2,5X.
<img alt="Porównanie ekspresji genów typu dzikiego i zmutowanych na schematach przekroju nerki zebrafish." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51708/51708fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Wzorzec rozwojowy typów komórek tworzących embrionalny organ nerki – pronefros u haploidalnych zebrafish szczepu Tübingen. Haploidalne typy dzikie wykazały prawidłowy wzorzec typów komórek w strukturze embrionalnej nerki (górny rząd). Embrionalna nerka składa się z pary podzielonych na segmenty jednostek funkcjonalnych znanych jako nefrony. Segmentowy wzorzec poszczególnych typów komórek obecnych w nefronach można zwizualizować na podstawie wzorca ekspresji transkryptów genów w hybrydyzacji in situ całych preparatów, które są unikalne dla zróżnicowanych typów komórek nefronu, w tym podocytów (P) znakowanych przez wt1b i nephrin, proksymalnego kanalików krętych (PCT) znakowanych przez slc20a1a, proksymalnych kanalików prostych (PST) znakowanych przez trpm7, wczesnego odcinka dystalnego (DE) znakowanego przez slc12a1 oraz późnego odcinka dystalnego (DL) znakowanego przez slc12a3. Embriony haploidalne z mutacją lib (dolny rząd) wykazują zredukowaną liczbę podocytów, PCT oraz brak PST, wraz z rozszerzonym segmentem DE i DL, podobnie jak diploidalne embriony lib18. Embriony zostały sfotografowane z widoku grzbietowego, z stroną przednią po lewej, przy powiększeniu 10X.

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie haploidalnych embrionów danio pręgowanego poprzez zapłodnienie in vitro. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie dojrzałych plemników od dorosłych samców danio pręgowanego, a następnie przeprowadzenie naświetlania ultrafioletowego w celu dezaktywacji genomów ojcowskich obecnych w próbkach plemników. Drugim krokiem jest wyizolowanie niezapłodnionych komórek jajowych od dorosłej samicy danio pręgowanego.Następnie XR zapłodniono próbką plemników inaktywowanych promieniami UV. Ostatnim krokiem jest hodowla haploidalnego lęgu do czasu przeprowadzenia analizy rozwojowej, takiej jak ocena morfologiczna lub analiza ekspresji genów z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ całego preparatu (whole mount C two hybridization). Główną zaletą stosowania haploidowych embrionów zebrafish jest to, że technika ta umożliwia efektywne badania genetyki w przód (forward genetic screens) przy wykorzystaniu mniejszej liczby pokoleń, co pozwala zaoszczędzić czas i miejsce dla zwierząt.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na fundamentalne pytania z dziedziny biologii rozwoju, takie jak identyfikacja genów niezbędnych do formowania nerek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ pozyskiwanie gamet z rybek danio może wiązać się z wyzwaniami technicznymi. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ pomoże badaczom nauczyć się, w jaki sposób obchodzić się z dorosłymi rybkami danio w celu pobrania dojrzałych gamet.W celu rozpoczęcia przygotuj roztwory zapasowe Hank'a oraz gotowy roztwór Hank'a. Następnie wybierz odpowiednią liczbę dorosłych samic danio pręgowanego do pobrania haplo- clutches. Po ich wyborze przygotuj klatki do rozrodu, umieszczając każdą dorosłą samicę danio pręgowanego z dorosłym samcem w komorze z wodą systemową w taki sposób, aby przez noc byli oddzieleni przegrodą.Najpierw należy przygotować świeży roztwór zapasowy Hank nr 6, dodając 0,35 g wodorowęglanu sodu do 10 ml wody destylowanej. Wymieszać dokładnie do całkowitego rozpuszczenia. Następnie w probówce na lodzie przygotować końcowy roztwór roboczy buforu Hanksa.Po wymieszaniu przygotować aliquoty o objętości 500 µL w probówkach do mikrocentryfugi i umieścić je w lodzie, aby zebrać wystarczającą ilość plemników do zapłodnienia. Do każdego zbioru nasienia wybrać od czterech do pięciu samców danio pręgowanego. Po uśmierceniu zwierząt należy ostrożnie osuszyć samce z nadmiaru cieczy, aby zapobiec przedwczesnej aktywacji plemników.Po odcięciu głowy i oczyszczeniu jamy brzusznej należy zlokalizować jądra wzdłuż grzbietowej ściany ciała, bocznie od pęcherza pławnego. W badaniu pod tym stereomikroskopem mają one biały, nieprzezroczysty wygląd. Po ich zlokalizowaniu należy użyć precyzyjnej pęsety, aby usunąć jądra, dbając o to, by pozostały one nienaruszone.Umieść jądra w roztworze do nasienia i przechowuj na lodzie. Powtarzaj te kroki, aż wszystkie samce zostaną poddane sekcji. Po zebraniu wszystkich próbek zhomogenizuj jądra, delikatnie rozcierając tkankę sterylnym tłuczkiem do mikroprobówek.Przenieś nadsącz do małej szalki Petriego umieszczonej na lodzie. Unikaj przenoszenia resztek tkankowych wraz z roztworem nadsączu, ponieważ mogą one tworzyć cienie i zakłócać aktywację plemników za pomocą promieniowania UV.Przepłucz probówkę od 300 do 400 µL dodatkowego roboczego roztworu spinalnego Hanksa, a uzyskany naddatek z płukania przenieś do małej szalki Petriego. Następnie naświetlaj szalkę promieniowaniem UV z lampy laboratoryjnej przez łącznie dwie minuty w odległości 15 cali od źródła. Umieść szalkę z powrotem w naczyniu z lodem, a następnie przenieś inaktywowaną promieniowaniem UV spermę do nowej probówki do mikrocentryfugi przechowywanej w lodzie.Zacznij od potwierdzenia głębokości znieczulenia u samic wybranych do pobrania. Po znieczuleniu ostrożnie usuń nadmiar roztworu, aby uniknąć wywołania aktywacji jaj. Przed dodaniem plemników umieść samicę na boku w czystej szalce Petriego i obejrzyj jej brzuch pod mikroskopem stereoskopowym, podtrzymując grzbiet samicy poprzez umieszczenie jednego lub dwóch palców jednej ręki za grzbietową ścianą ciała.Delikatnie gładź brzuch przez około 10 do 20 sekund, używając jednego lub dwóch palców drugiej ręki, aby wycisnąć jaja z jamy brzusznej. Jaja powinny wysunąć się bardzo łatwo podczas gładzenia brzucha samicy. Jeśli jaja nie wychodzą z łatwością, nie zaleca się silniejszego nacisku i wymuszania ich wydalenia, ponieważ może to zaszkodzić samicy.Po ekstrakcji należy użyć cienkiej sondy lub małej szpatułki, aby odsunąć X od samicy. Delikatnie unieść samicę i przenieść ją do odpowiednio oznakowanego zbiornika izolacyjnego zawierającego wodę z systemu akwariowego. Następnie dodać 50 µL roztworu plemników inaktywowanych UV do clutches jaj i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 sekund.W tym czasie naklej na szalkę odpowiednią etykietę, aby zidentyfikować ją numerem przypisanym do samicy rodzicielskiej. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu E3 do jaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Na koniec dolej odpowiednią ilość roztworu E3, aby wypełnić szalkę do połowy, i umieść embriony w temperaturze 28 °C w celu dalszej inkubacji.Po upływie od czterech do ośmiu godzin należy wyjąć szalkę i usunąć wszystkie niezapłodnione embriony. Niezapłodnione embriony mogą mieć biały, nieprzezroczysty wygląd lub być przezroczyste z jedną, zdeformowaną komórką. Następnie pozostałe embriony należy wypłukać, zastępując pożywkę dla embrionów E three świeżym roztworem E three.Zarodki inkubuje się następnie do pożądanego czasu lub momentu zainteresowania, po czym można je wykorzystać w różnych zastosowaniach badawczych. Na tym obrazie przedstawiono diploidalne zarodki typu dzikiego, uzyskane w drodze naturalnego tarła, a następnie inkubowane do około 30 HPF. Tutaj zarodki haplo zostały uzyskane poprzez zapłodnienie in vitro i wykazują szereg nieprawidłowości w rozwoju.Haploidy o stosunkowo normalnej budowie charakteryzowały się skróconym, bardziej krępym ciałem, analogicznie do schematu stopniowania haploid typu A, natomiast haploidy z rażącymi abnormalities wykazywały silnie skróconą oś ciała odpowiadającą stopniowi B. Wreszcie stopień C reprezentuje niską jakość. Haploidy typu dzikiego wykazywały normalny wzorzec struktury embrionalnej nerki w porównaniu do mutantów diploidalnych. Segmentowy wzorzec dyskretnych typów komórek jest wizualizowany poprzez celowanie w transkrypty genów unikalne dla zróżnicowanych typów komórek nefronu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak wytwarzać haploidalne zarodki danio pręgowanego za pomocą zapłodnienia in vitro. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby delikatnie obchodzić się z dorosłymi osobnikami danio pręgowanego, szczególnie podczas pobierania ikry od samic. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak hybrydyzacja whole-mount C2, w celu oceny rozwoju typów komórek, takich jak segmenty pronara.Należy pamiętać, że praca z źródłami promieniowania ultrafioletowego może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie ochrony oczu.

production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja zarodków haploidalnych rybki Danio przez in vitro zapłodnienie

Jest to protokół wysokoprzepustowej krio konserwacji plemników rybek zebrafish. Plemniki krio konserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% podczas późniejszego zapłodnienia in vitro i pozostają stabilne przez wiele lat.

Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Jest to metoda generowania gynogenetycznych diploidalnych embrionów danio przeżębnika (embrionów, których jedynym wkładem genetycznym jest materiał macierzysty), poprzez blokowanie drugiego podziału mejozy bezpośrednio po zapłodnieniu plemnikami inaktywowanymi światłem ultrafioletowym. Embriony EP nie są w pełni homozygotyczne ze względu na rekombinację podczas pierwszego podziału mejozy, są jednak homozygotyczne we wszystkich loci, które nie zostały oddzielone od centromeru w wyniku...

Wytwarzanie gynogenetycznych diploidalnych danio pręgowanych za pomocą wczesnego wywierania nacisku

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Ten protokół zawiera instrukcję krok po kroku, jak generować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego o różnym pochodzeniu genetycznym. W połączeniu z niezrównanymi możliwościami obrazowania zarodka danio pręgowanego, metoda ta zapewnia wyjątkowo potężny środek do badania funkcji autonomicznych i nieautonomicznych komórek dla genów kandydujących na badanie.

Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Zmodyfikowany protokół manipulacji ploidalnością wykorzystuje szok cieplny do wywołania jednocyklowego zatrzymania cytokinezy we wczesnym zarodku. Protokół ten został zademonstrowany w przypadku danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych gatunków.

Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Manipulacje embriologiczne, takie jak eksterminacja i przeszczepianie komórek, są ważnymi narzędziami do badania wczesnego rozwoju. Protokół ten opisuje proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania do wykonywania tych manipulacji w zarodkach danio pręgowanego.

Proste i skuteczne urządzenie do przeszczepiania zarodków danio pręgowanego

W tym protokole, technologia przetwarzania oleju baraniego w Epimedii folium (EF) została zoptymalizowana poprzez zastosowanie eksperymentalnej metodologii projektowania i odpowiedzi Box-Behnken, a wpływ prymitywnego i zoptymalizowanego EF ekstrahowanego wodą na rozwój embrionalny danio pręgowanego został wstępnie zbadany.

Optymalizacja technologii przetwarzania oleju baraniego Epimedii folium i badanie jego wpływu na rozwój embrionalny danio pręgowanego

Protokół ten opisuje tanią metodę mikroskopii świetlnej do oceny morfologii i funkcji serca w embrionach danio pręgowanych, umożliwiającą powtarzalną ocenę rozwojowej kardiotoksyczności bez potrzeby stosowania zaawansowanych systemów obrazowania.

Funkcjonalne obrazowanie serca w zarodkach danio dano za pomocą standardowej mikroskopii i analizy wideo: zastosowania w badaniach środowiskowych i biomedycznych

Poznaj metodę produkcji haploidalnych zarodków Danio rerio przez zapłodnienie in vitro z wykorzystaniem naswietlania UV. Technika umożliwia efektywne badania genetyczne wczesnego embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Przeglądaj więcej filmów