Name: Katalizator RNA jako reporter do badań przesiewowych leków przeciwko edycji RNA w trypanosomach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj szybką metodę fluorescencyjną do badania edycji RNA w mitochondriach Trypanosoma brucei. Technika FRET z rywozymem młotkowym umożliwia przesiewowe wykrywanie inhibitorów kompleksu editosomowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Najmeh Nikpour i Fiona Alum dostarczyły sugestii i zredagowały ten rękopis. Wydział Biochemii Uniwersytetu McGill wsparł HM i VM w ramach inicjatywy szkoleniowej CIHR w zakresie biologii chemicznej. Praca ta była wspierana przez grant Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) 119464 (dla R. S.).

Poniższy protokół opisuje procedurę przeprowadzania testu edycji RNA opartego na fluorescencji. Test można przeprowadzić w pojedynczej probówce PCR, płytkach 96-dołkowych lub 384-dołkowych, w zależności od zakresu eksperymentu. Następnie sygnał fluorescencyjny może być odczytany na odpowiednim systemie detekcji PCR w czasie rzeczywistym. Test tutaj jest opisany w kontekście płytek 384-dołkowych.
1. Hodowla komórek T. brucei
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę wzrostową dla komórek procyklicznych T. brucei. Na 1 l podłoża:
	<ol>
		<li>Rozpuścić 25,4 g proszku SDM-79 w 800 ml miliQ wody.</li>
		<li>Dodać 2 gNaHCO3 i pH do 7,3 z 10 M NaOH.</li>
		<li>Dodaj wodę nanoczystą do końcowej objętości 900 ml, wysterylizuj filtr.</li>
		<li>Dodać płodową surowicę bydlęcą (FBS), roztwór penicyliny-streptomycyny i heminę (2,5 mg/ml) do końcowych stężeń odpowiednio 10% (v/v), 100 U/ml i 7,5 mg/l.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hoduj 300 ml komórek T. brucei 1.7A typu dzikiego (forma procykliczna) w temperaturze 28 °C, wstrząsając z prędkością 70 obr./min do gęstości 1,5 x 107 komórek/ml. UWAGA: Powinno to wytworzyć 3 ml aktywnego editosomu z ~0,5 mg białka całkowitego, wystarczającego na 600 reakcji edycji.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć osad 50 ml schłodzonego buforu PBSG (10 mM Na2HPO4, 10 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl i 6 mM glukozy) i ponownie odwirować komórki przez odwirowanie przy 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Izolacja surowych mitochondriów
UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aby zachować aktywność edytosomu.
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić zebrane komórki w 30 ml buforu DTE (1 mM Tris-HCl pH 8,0 i 1 mM EDTA). Użyj 40 ml sterylnego homogenizatora Dounce (wstępnie schłodzonego), aby naruszyć błonę komórkową, głaszcząc co najmniej 10 razy w górę iw dół po lodzie.</li>
	<li>Natychmiast dodać 4,3 ml 60% sacharozy (w/v; tj. 1,75 M) do homogenatu do końcowego stężenia 0,25 M. Wirować przy 15 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby preferencyjnie obniżyć mitochondria.</li>
	<li>Zawiesić osad mitochondrialny w 4,6 ml buforu STM (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sacharozy i 2 mM MgCl2). Dodać 13,8 μl 0,1 M CaCl2 i 4 μl DNazy I wolnej od RNaz do końcowych stężeń odpowiednio 0,3 mM i 9 U/ml. Inkubować mieszaninę przez 1 godzinę na lodzie.</li>
	<li>Dodać 4,6 ml buforu STE (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM sacharozy i 2 mM EDTA) w celu dezaktywacji DNazy I. Wirówkę przy 15 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 400 μl buforu do lizy (10 mM Tris-HCl pH 7,2, 10 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1 μg/ml pepstatyny, 1 mM DTT i 1x kompletny inhibitor proteazy wolny od EDTA) i przenieść do probówki do mikrofuge.</li>
	<li>Dodać 10% Triton X-100 do końcowego stężenia 1% i inkubować lizat przez 15 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze probówkowym.</li>
	<li>Oczyścić lizat mitochondrialny przez dwukrotne odwirowanie w temperaturze 17 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, za każdym razem zachowując oczyszczony supernatant.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie edytosomów
<ol>
	<li>Wlej 10 ml 10%-30% (v/v) liniowego gradientu glicerolu (Tabela 1) do probówki ultrawirówkowej za pomocą 2x bufora gradientowego HHE (40 mM HEPES pH 7,9, 20 mM Mg(OAc)2, 100 mM KCl i 2 mM EDTA) i ekspresu gradientowego, postępując zgodnie z instrukcją obsługi.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć 500 μl roztworu z górnej części gradientu glicerolu i delikatnie załadować 500 μl oczyszczonego lizatu mitochondrialnego. Wirować z prędkością 178 000 x g przez 6 godzin w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki.</li>
	<li>Zebrać 500 μl frakcji sekwencyjnie od góry do dołu gradientu w temperaturze 4 °C. Następnie zamroź frakcje za pomocą ciekłego azotu i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie RNA
<ol>
	<li>Wyżarzać odpowiednią matrycę DNA zawierającą sekwencję komplementarną do sekwencji promotora T7 (Tabela 2) za pomocą oligonukleotydu promotora T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3') w stosunku molowym 1:1 przez ogrzewanie w temperaturze 90 °C przez 3 minuty i chłodzenie w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>Transkrybuj RNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro, postępując zgodnie z instrukcją obsługi.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję transkrypcji, dodając równą objętość 7 M barwnika mocznikowego (7 M mocznika, 0,05% ksylenu cynolu i 0,05% błękitu bromofenolowego). Stosować na filtrze sterylizowanym 9% denaturującym żelem poliakrylamidowym (9% akrylamid, 7 M mocznik, 1x TBE) .</li>
	<li>Użyj cieniowania ultrafioletowego (UV) za pomocą krótkofalowej lampy UV, aby zlokalizować i wyciąć odpowiednie RNA. Umieść wycięty kawałek żelu w probówce do mikrofucji i dodaj 400 μl żelowego buforu elucyjnego (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA i 0,25% SDS). Elute przez noc w RT na rotatorze rurowym.</li>
	<li>Wytrącić eluowany RNA, dodając 1 ml zimnego 100% etanolu i inkubując w temperaturze -80 °C przez 30 minut lub -20 °C przez noc.</li>
	<li>Wirować przy 16 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, aby rozdrobnić RNA.</li>
	<li>Umyj granulat 1 ml 75% etanolu. Wirować przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ponownie zawiesić odpowiednio osad RNA w wodzie wolnej od RNazy, aby osiągnąć pożądane stężenia, jak pokazano w Tabeli 2.</li>
</ol>
5. Test edycji RNA oparty na fluorescencji
<ol>
	<li>Dla pojedynczej reakcji połączyć 1 pmol (1 μl) preA6Rbz i 2,5 pmol (1 μl) gA6Rbz (stosunek molowy 1:2,5) w probówce do mikrofuge, inkubować w temperaturze 70 °C przez 3 minuty i pozostawić w temperaturze RT przez co najmniej 10 minut.</li>
	<li>W międzyczasie przygotować mieszaninę wzorcową, korzystając z tabeli 3, bez preA6Rbz i gA6Rbz, do reakcji edycji zawierającej 1x bufor HHE (25 mM HEPES pH 7,9, 10 mM Mg(OAc)2, 50 mM KCl i 10 mM EDTA), 1 mM ATP, 5 mM CaCl2, 16 ng/μl RNA drożdży Torula, 0,1% Triton X-100, i oczyszczony editosom.</li>
	<li>Dodaj wyżarzone preA6Rbz i gA6Rbz, aby zakończyć miks główny.</li>
	<li>Dozować 18 μl mieszanki wzorcowej (tabela 3) do studzienek zawierających 2 μl wody wolnej od RNaz (studzienki bez związków) lub 2 μl 200 μM związków chemicznych i umieścić próbki kontrolne na płytce zgodnie z rysunkiem 5.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelniacza do płyt i obróć płytkę w dół, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Inkubować w temperaturze 28 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Dodać 25 pmol (2 μl) konkurenta gA6Rbz do każdej studzienki. Umieść świeży uszczelniacz, odkręć płytkę i umieść ją na maszynie do PCR w czasie rzeczywistym. Zaprogramuj następujący eksperyment: 
	Krok 1: 85 °C przez 5 min; Krok 2: 24 °C przez 10 min; Krok 3: Zatrzymaj się.</li>
	<li>Dodać 15 pmol (1 μl) podłoża FRET do każdej studzienki do końcowej objętości 23 μl. Uszczelnić płytkę świeżym uszczelniaczem. Szybko obróć płytkę i umieść ją z powrotem na maszynie do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Zaprogramuj nowy eksperyment, wykonując następujące czynności: 
	Krok 1: 37 °C przez 1 min; Krok 2: Przeczytaj; Krok 3: Przejdź do kroku 1, 40 razy; Krok 4: Zatrzymaj się.</li>
	<li>Ustaw płytkę, zaznaczając wszystkie studzienki, które wymagają odczytu i wybierz filtr FAM. Wprowadź objętość jako 23 μl i rozpocznij bieg.</li>
	<li>Oblicz nachylenie wartości uzyskanych z każdego dołka/próbki, aby uzyskać pomiar kinetyczny, wykreślając nachylenia na wykresie słupkowym do analizy. UWAGA: Odczyt kinetyczny poprawia stosunek sygnału do szumu między próbką a tłem; ponieważ próbka tła miałaby nachylenie bliskie zeru. Odczyt punktu końcowego ma wyższy szum tła.</li>
</ol>

<ol><li>Benne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcript+of+the+frameshifted+coxII+gene+from+trypanosome+mitochondria+contains+four+nucleotides+that+are+not+encoded+in+the+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA.</a> Cell. 46, 819-826 (1986).</li>
<li>Hajduk, S., Ochsenreiter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+in+kinetoplastids%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">RNA editing in kinetoplastids.</a> RNA biology. 7, 229-236 (2010).</li>
<li>Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine+insertion%2Fdeletion+editing+in+trypanosomes%3A+a+playground+for+RNA-guided+information+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+interdisciplinary+reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer.</a> Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).</li>
<li>Seiwert, S. D., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing%3A+transfer+of+genetic+information+from+gRNA+to+precursor+mRNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro.</a> Science. 266, 114-117 (1994).</li>
<li>Weng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+RNA-binding+complex+from+mitochondria+of+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular%22%5BJournal%5D)">Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids.</a> Molecular. 32, 198-209 (2008).</li>
<li>Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TbRGG1%2C+an+essential+protein+involved+in+kinetoplastid+RNA+metabolism+that+is+associated+with+a+novel+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex.</a> RNA. 14, 970-980 (2008).</li>
<li>Ammerman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+trypanosome+RNA+editing+accessory+complex%2C+MRB1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).</li>
<li>Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+the+RNA+editing+complex+in+Trypanosoma+brucei+requires+band+III+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein.</a> Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).</li>
<li>Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+in+Trypanosoma+brucei+requires+three+different+editosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes.</a> Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).</li>
<li>Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+RNA+editing+complex%3A+band+II+is+structurally+critical+and+maintains+band+V+ligase%2C+which+is+nonessential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential.</a> Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).</li>
<li>Schnaufer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+ligase+essential+for+RNA+editing+and+survival+of+the+bloodstream+form+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei.</a> Science. 291, 2159-2162 (2001).</li>
<li>Tarun, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KREPA6+is+an+RNA-binding+protein+essential+for+editosome+integrity+and+survival+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei.</a> RNA. 14, 347-358 (2008).</li>
<li>Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+trypanosomiases+and+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis.</a> Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).</li>
<li>Denise, H., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+mode+of+action+of+drugs+used+against+sleeping+sickness%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness.</a> Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).</li>
<li>Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+uridylate+deletion+in+vitro+suggests+a+mechanism+for+kinetoplastid+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing.</a> Cell. 84, 831-841 (1996).</li>
<li>Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridylate+addition+and+RNA+ligation+contribute+to+the+specificity+of+kinetoplastid+insertion+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing.</a> Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).</li>
<li>Igo, R. P. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+uridylate-specific+exoribonuclease+activity+in+Trypanosoma+brucei+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing.</a> Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).</li>
<li>Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hammerhead+ribozyme+substrate+and+reporter+for+in+vitro+kinetoplastid+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing.</a> RNA. 8, 548-554 (2002).</li>
<li>Moshiri, H., Salavati, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+reporter+substrate+for+monitoring+RNA+editing+in+trypanosomatid+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens.</a> Nucleic Acids Res. 38, e138(2010).</li>
<li>Jenne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+characterization+of+hammerhead-ribozyme+inhibitors+using+fluorescence-based+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology.</a> Nature. 19, 56-61 (2001).</li>
<li>Hartig, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-dependent+ribozymes+report+molecular+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time.</a> Nature. 20, 717-722 (2002).</li>
<li>Famulok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+aptamers+and+aptazymes+as+probes+for+screening+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+molecular+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches.</a> Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).</li>
<li>Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+an+apolipoprotein+B+messenger+RNA+editing+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein.</a> Science. 260, 1816-1819 (1993).</li>
<li>Jurica, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+a+wrench+to+throw+into+the+splicing+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Searching for a wrench to throw into the splicing machine.</a> Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).</li>
<li>Spahn, C., Prescott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Throwing+a+spanner+in+the+works%3A+antibiotics+and+the+translation+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus.</a> Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zaprezentowano nową, wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych w celu identyfikacji inhibitorów kompleksu trypanosomów do edycji RNA, dostarczając nowego narzędzia do opracowywania leków przeciwdziałających chorobom wywoływanym przez trypanosomatydy. Test rybozymowy na bazie FRET jest szeroko stosowany do różnych celów20-22; jednak wykorzystaliśmy zdolność testu rybozymu opartego na FRET do monitorowania in vitro aktywności edycji RNA19. Test ten może być potencjalnie zaadaptowany do inn...

Proces edycji RNA, posttranskrypcyjnej modyfikacji mRNA, został po raz pierwszy odkryty u trypanosomatidów1. Od tego czasu przeprowadzono znaczące prace nad badaniem mechanizmu stojącego za edycją RNA u Trypanosoma brucei2,3. W serii reakcji enzymatycznych editosom, rdzeń kompleksu około 20 białek, tworzy dojrzałe mitochondrialne mRNA dla wielu składników systemu fosforylacji oksydacyjnej generującego energię. Kolejność zdarzeń katalitycznych to rozszczepienie endonukleolityczne, dodanie lub delecja urydylanu (U) oraz ligacja, zgodnie z wytycznymi RNA (gRNA)4.
Oprócz podstawowych białek kompleksu edosomów, zidentyfikowano również szereg czynników pomocniczych5-7. Białka te są najczęściej pogrupowane w niezależne kompleksy. Jednak kolejność składania białek w rdzeniowym kompleksie edosomowym i wzorce interakcji kompleksu rdzeniowego z kompleksami pomocniczymi nie zostały jeszcze ustalone. Ukierunkowanie na proces edycji RNA w trypanosomatydach może dostarczyć chemicznych dyssektorów, które pomagają w badaniu składania i funkcji kompleksu edosomów. Co więcej, badania funkcjonalne nad kilkoma białkami editosomów wykazały niezbędność na różnych etapach życia, co wskazuje na ich potencjał jako celów terapeutycznych8-12. Dlatego znalezione inhibitory editosomu mogą również działać jako związki ołowiowe przeciwko trypanosomatydom. Jest to bardzo ważne, ponieważ obecnie dostępne leki przeciwko chorobom wywoływanym przez trypanosomatid są toksyczne, nieskuteczne i drogie13,14.
Skuteczny i wygodny test in vitro jest niezbędny do zbadania chemicznego wszechświata pod kątem specyficznych inhibitorów, które blokują edycję RNA. Opracowano trzy testy, które zastosowano do monitorowania aktywności edyosomów: (a) pełny test edycji RNA in vitro 15, (b) wstępnie rozszczepiony test edycji RNA in vitro 16,17 oraz (c) test oparty na rybozymie młotkowatym (HHR)18. Pierwsze dwa testy polegają na bezpośredniej wizualizacji edytowanego produktu (mRNA ATPazy 6) za pomocą radioaktywności. Test oparty na HHR wykorzystuje zmodyfikowaną wersję mRNA ATPazy 6, która jest modelowana tak, aby zachowywała się jak rybozym podczas edycji. Funkcjonalny rybozym następnie specyficznie rozszczepia znakowany radioaktywnie substrat RNA, służąc jako reporter. Niedawno Moshiri i in. opracowali test reporterowy in vitro oparty na HHR do monitorowania edycji RNA, w którym znakowany radioaktywnie substrat RNA jest zastępowany substratem rezonansu fluorescencyjnego (FRET)19. Główne zalety tego testu to: (a) jest to szybki i wygodny test typu mieszania i mierzenia, ponieważ produkcja aktywnego rybozymu i rozszczepienie substratu zachodzą jednocześnie w tej samej probówce w małej objętości (tj. 20 μl), (b) pozwala uniknąć stosowania materiałów znakowanych radioaktywnie, (c) czułość, którą zapewnia oprzyrządowanie fluorescencyjne w formacie płytki z mikromiareczkowaniem, oraz d) wysoki stosunek sygnału do szumu. Za pomocą tego testu potwierdzono wpływ znanych inhibitorów ligazy edytujących RNA na oczyszczony edytosom19. Eksperyment ten potwierdził walidację testu do szybkiej identyfikacji inhibitorów edycji RNA, głównie w odniesieniu do całych edosomów z T. brucei.
Rysunek 1 to szczegółowy schemat testu edycji RNA in vitro opartego na fluorescencji. Protokół ten może być używany do monitorowania edycji RNA in vitro lub łatwo dostosowany do badań przesiewowych bibliotek związków o różnych skalach.

<table><tbody><tr><td>SDM-79 Medium</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>12483-020</td><td>inaktywacja termiczna przy 55 i #176; C dla 1 godziny</td></tr><tr><td>Hemin, minimum 80%</td><td>Sigma</td><td>H5533-10G</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dnaza 1 rekombinowana, bez rnazy&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMax Express Duża&nbsp; skala RNA&nbsp; system produkcyjny</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>K885300-0040&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gradient Master, wer. 5.25&nbsp;</td><td>Biocomp</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Ultra przezroczysta tubka, 13,2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100XP&nbsp; Ultrawirówka&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti ROTOR</td><td>Redlica Beckman 331336</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroSeal 'B' Seal, Uszczelki</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>CFX 384 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Biorad</td><td>185-5484</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Acryl/Bis (19:1), 40% (w/v)</td><td>Bio Basic</td><td>A0006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik, Klasa biologii molekularnej, 1 kg</td><td>Technologie życiowe</td><td>AM9902</td><td></td></tr></tbody></table>

katalizator rna jako reporter do badań przesiewowych leków przeciwko edycji rna w trypanosomach

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Znaczący postęp został osiągnięty w określaniu mechanizmu edycji mitochondrialnego RNA w trypanosomach. Podobnie poczyniono znaczne postępy w identyfikacji składników kompleksu edosomów, które katalizują edycję RNA. Jednak nadal nie jest jasne, w jaki sposób te białka współpracują ze sobą. Związki chemiczne uzyskane z wysokoprzepustowego sita przeciwko editosomowi mogą blokować lub wpływać na jeden lub więcej etapów cyklu edycji. W związku z tym identyfikacja nowych związków chemicznych pozwoli na uzyskanie cennych sond molekularnych do analizy funkcji i składania edosomów. W poprzednich badaniach testy edycji in vitro przeprowadzano przy użyciu znakowanego radioaktywnie RNA. Testy te są czasochłonne, nieefektywne i nieodpowiednie do celów wysokoprzepustowych. W tym miejscu przedstawiono jednorodny test reporterowy rybozymu młota in vitro oparty na fluorescencji "mix and measure" do monitorowania edycji RNA. Dopiero w wyniku edycji RNA rybozymu młota dochodzi do rozszczepienia substratu oligorybonukleotydu fluorescencji rezonansu (FRET). To z kolei powoduje oddzielenie fluoroforu od wygaszacza, wytwarzając w ten sposób sygnał. W przeciwieństwie do tego, gdy funkcja editosomu jest zahamowana, sygnał fluorescencji zostanie wygaszony. Jest to bardzo czuły i prosty test, który powinien być ogólnie stosowany do monitorowania edycji RNA in vitro lub wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych, które mogą hamować funkcję editosomów.

Aby zademonstrować kroki niezbędne do przygotowania przesiewu na dużą skalę, Rysunki 2-5 przedstawiają reprezentatywne eksperymenty kontrolne dotyczące jakości testu. Są to kluczowe eksperymenty kontrolne, zapewniające spójność testu w ciągu wielu dni przesiewania lub służące do porównywania różnych paneli przesiewowych.
Ocena stosunku sygnału do szumu fluorescencji
Aby zapewnić stabilność i jakość znakowanego fluoresceiną substratu...

W tym artykule opisano wysoce czuły test oparty na rybozymie, mający zastosowanie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych ukierunkowanych na unikalny proces edycji RNA w patogenach trypanosomatidów. Inhibitory mogą być wykorzystywane jako narzędzia do opartej na hipotezach analizy procesu edycji RNA, a ostatecznie jako terapie.

Katalizator RNA jako reporter do badań przesiewowych leków przeciwko edycji RNA w trypanosomach

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza edycji RNA z wykorzystaniem funkcjonalnych omów wyekstrahowanych z Trias Broce w celu szybkiej identyfikacji inhibitorów omów. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie mitochondriów oraz docelowych stref edycji z tbr. Drugim krokiem jest przygotowanie syntetycznego substratu reporterowego edycji RNA.Następnie związki poddaje się wiązaniu do oczyszczonych stref edytujących wraz z reporterem edycji RNA. W obecności związków blokujących funkcję stref edytujących reporter RNA nie zostanie poddany edycji i pozostanie nieaktywny. Ostatnim krokiem jest dodanie substratu w postaci nici F i monitorowanie zdolności reportera edycji RNA do selektywnego i specyficznego rozcinania tego substratu.W przypadku związku hamującego edycja RNA zostaje zablokowana, a wykryty zostanie zredukowany sygnał fluorescencyjny lub jego brak. Ostatecznie do monitorowania fluorescencji emitowanej przez substrat FRET w funkcji czasu wykorzystuje się urządzenie do PCR w czasie rzeczywistym. Główną zaletą tej techniki w stosunku do konwencjonalnych testów edycji in vitro jest to, że jest to prosty i szybki fluorescencyjny test reporterowy typu „wymieszaj i zmie

rna-catalyst-as-reporter-for-screening-drugs-against-rna-editing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Katalysator RNA jako reporter do przesiewania leków działających na edycję RNA w kinetoplastydach

Podobne do prionów rozprzestrzenianie się agregatów białkowych pojawiło się ostatnio jako związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi. Celem tego protokołu jest opisanie sposobu wykorzystania nicienia C. elegans jako systemu modelowego do monitorowania rozprzestrzeniania się białek i badania zjawisk podobnych do prionów.

Badanie rozprzestrzeniania się i toksyczności białek priopodobnych przy użyciu metazoańskiego organizmu modelowego C. elegans

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Tutaj opisany jest test in vitro bez przeciwciał do bezpośredniej analizy aktywności metylotransferazy na syntetycznym lub transkrybowanym in vitro RNA.

Test bez przeciwciał do analizy aktywności metylotransferazy RNA

Testy aktywności oparte na NMR zostały opracowane w celu identyfikacji i scharakteryzowania inhibitorów dwóch nukleozydowych enzymów rybohydrolazy. Przedstawiono protokoły dla początkowych testów związków chemicznych przy 500 μM i 250 μM, testów dawka-odpowiedź do oznaczania wartości IC50, testów przesiewowych licznika detergentów, testów przesiewowych licznika rozcieńczeń skokowych oraz testów w całych komórkach E. coli.

Testy aktywności oparte na NMR do określania inhibicji związku, wartości IC50, aktywności artefaktów i aktywności całych komórek rybohydrolaz nukleozydowych

Ten protokół opisuje nieradioaktywny test do pomiaru aktywności kinaz polinukleotydowych (PNK) na małych substratach DNA i RNA.

Test nieradioaktywny do pomiaru fosforylacji polinukleotydów małych substratów nukleotydowych

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.

Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA

Szybkie wykrywanie i wiarygodna ilościowa identyfikacja zdarzeń edycjonujących RNA na skalę genomową pozostają wyzwaniem i obecnie opierają się na bezpośrednich metodach sekwencjonowania RNA. Opisany tutaj protokół wykorzystuje elektroforezę żelową z gradientem mikrotemperatury (μTGGE) jako prostą, szybką i przenośną metodę wykrywania edycji RNA.

Podejście niesekwencjonujące do szybkiego wykrywania edycji RNA

Poznaj szybką metodę fluorescencyjną do badania edycji RNA w mitochondriach Trypanosoma brucei. Technika FRET z rywozymem młotkowym umożliwia przesiewowe wykrywanie inhibitorów kompleksu editosomowego.

Katalizator RNA jako reporter do badań przesiewowych leków przeciwko edycji RNA w trypanosomach

Przeglądaj więcej filmów