Name: In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowej kultury do generowania samoorganizujących się organoidów trzustki z mysich progenitorów embrionalnych. Technika umożliwia ekspansję, różnicowanie i obserwację morfogenezy w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana kolejno przez pilotażową nagrodę NCCR Frontiers in Genetics, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 i Grant 12-126875 od Det Frie Forskningsråd/Sundhed og Sygdom. Autorzy dziękują laboratorium Spagnoli za zorganizowanie sesji zdjęciowej.

Ten protokół ma na celu hodowlę organoidów trzustki pochodzących z mysich zdysocjowanych komórek nabłonkowych trzustki E10.5.
Protokół wymaga etycznego zatwierdzenia dla eksperymentów na zwierzętach.
1. Wycięcie grzbietowego pąka trzustki z zarodków myszy E10.5
<ol>
	<li>Uśmierc myszy w ciąży w czasie w dniu embrionalnym (E) 10,5, otwórz brzuch nożyczkami, usuń dwa rogi macicy i umieść je na 10-centymetrowej szalce Petriego wypełnionej zimnym buforem fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) lub modyfikowaną pożywką eteryczną Dulbecco (DMEM) przechowywaną na lodzie. Cały eksperyment od ofiary do wysiewu komórek jest wykonywany w ciągu 60-90 minut, aby zapobiec uszkodzeniu komórek.</li>
	<li>Podziel macicę na poszczególne segmenty zarodka za pomocą małych nożyczek. Przenieś jeden zarodek na szalkę Petriego o średnicy 35 mm z zimnym PBS i uwidocznij go pod mikroskopem preparacyjnym z oświetleniem z góry. Za pomocą kleszczy preparacyjnych usuń otaczające mięśnie, decidua i woreczek żółtkowy i odsłonij zarodek. Umieść zarodek z powrotem w zimnym pożywce DMEM. Zarodki można łatwo przenieść za pomocą plastikowej pipety/zakraplacza o pojemności 3 ml. Odizoluj każdy pojedynczy zarodek w podobny sposób przed kontynuacją.</li>
	<li>Umieścić zarodek na czystej szalce Petriego o średnicy 35 mm w PBS.
	<ol>
		<li>Użyj cienkich kleszczy (o szerokości 0,05 mm), aby usunąć kończynę przednią. Delikatnie włóż kleszcze do otworu, aby odłączyć przewód pokarmowy od obszaru rdzenia kręgowego (ryc. 1). OPCJONALNIE: Aby lepiej zobaczyć żołądek, usuń górną część zarodka, aż do serca i obszaru ogona poniżej łodygi żółtka.</li>
		<li>Zlokalizuj żołądek, wątrobę i jelita. Za pomocą kleszczy odizoluj przewód pokarmowy od żołądka do jelita i umieść go w zimnym DMEM na lodzie (ryc. 1). Pączek grzbietowy trzustki jest przyczepiony grzbietowo, z tyłu do żołądka (ryc. 1).</li>
		<li>Przed kontynuowaniem odizoluj każdy przewód pokarmowy w podobny sposób. Jeśli zarodki muszą zostać poddane genotypowaniu, należy pobrać ogon w momencie sekcji i przechowywać każdy pojedynczy przewód pokarmowy w innym dołku na 24-dołkowej płytce z zimnym DMEM na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść jeden przewód pokarmowy na czystej szalce Petriego o średnicy 35 mm w zimnym PBS. Teraz użyj oświetlenia od dołu w jasnym polu, aby zobrazować i wypreparować grzbietowy pączek trzustki pod mikroskopem preparacyjnym. Te warunki zoptymalizują wizualizację objętości. Używając elektrolitycznie zaostrzonych igieł wolframowych lub igieł strzykawkowych 20 G, odizoluj pączek trzustki z jak najmniejszą ilością mezenchymy wokół nabłonka (ryc. 1).
	<ol>
		<li>Przenieś wyizolowany pączek na szalkę Petriego zawierającą zimny roztwór dypazy (1,25 mg/ml) na 2-3 minuty. Od tego momentu transfer można najwygodniej przeprowadzić za pomocą ciągnących płomieniem szklanych kapilar o pojemności 50 μl przymocowanych do elastycznej rurki sterowanej ustami. Alternatywnie, ale z większym ryzykiem utraty pąka, użyj pipety automatycznej o pojemności 10 μl (Pipetman) z odpowiednimi plastikowymi końcówkami.</li>
		<li>Wykonaj aspirację i wyrzut pączków trzustki pod kontrolą mikroskopową. Umieść pączek trzustki z powrotem w PBS. Następnie oczyścić izolowany pączek trzustki z mezenchymy za pomocą igieł i delikatnie zassać za pomocą szklanej kapilary (ryc. 1).</li>
		<li>Po usunięciu całej mezenchymy opłucz pączek trzustki w zimnym PBS; przenieś każdy pączek do zimnego DMEM w indywidualnych dołkach (60-dołkowe mini-tace wypełnione 10 μl zimnego DMEM). Ważne jest, aby nie usuwać mezenchymy w dyspazie, co sprawia, że tkanka jest bardzo lepka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Posiewanie i hodowla rozproszonych komórek
<ol>
	<li>Przenieść wypreparowany nabłonek ze wszystkich zarodków za pomocą szklanej kapilary ciągniętej płomieniem do stożkowych studzienek z 60-dołkowymi mini-tacami wypełnionymi 10 μl PBS w celu przepłukania.
	<ol>
		<li>Przenieś pączek do 10 μl Trypsin 0,05 % i pozwól mu inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 minuty. Dezaktywuj trypsynę, przenosząc pączek do studzienki z 10 μl DMEM + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS).</li>
		<li>Dysocjację zawiesiny komórek przez aspirację przez cienką kapilarnę pociągniętą za pomocą ściągacza do pipet. Ważne jest, aby na tym etapie unikać pęcherzyków powietrza podczas pipetowania w górę i w dół w celu dysocjacji komórek. Organoidy trzustki optymalnie zaczynają się od małych grup po 5-15 komórek, dlatego zalecana jest częściowa dysocjacja (ryc. 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz komórki z kilku zarodków w probówce Eppendorfa, aby zminimalizować różnice wynikające z indywidualnego przetwarzania. Rozcieńczyć zawiesinę komórek w schłodzonym Matrigel w stosunku 1:3. Podwielokrotnić tę mieszaninę na płytkę 96-dołkową, 8 μl/basenik lub na płytce zoptymalizowanej do obrazowania (patrz poniżej).</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 5 minut, pozwalając Matrigelowi zgęstnieć. Napełnić studzienki 70 μl wybranego podłoża (organoidu lub kuli, patrz tabele 1 i 2) i pozostawić w wilgotnym środowisku zawierającym 5% CO2 i 95 % powietrza w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pożywkę należy wymieniać co 4dni. Codziennie monitoruj rosnące kolonie trzustki i dokumentuj ten proces za pomocą obrazowania.</li>
	<li>Małe cząsteczki lub białka będące przedmiotem zainteresowania mogą być dodawane do pożywki na tym etapie w celu przeprowadzenia eksperymentów interferencyjnych, jak opisano wcześniej 28.</li>
</ol>
Tabela 1: Pożywka organoidowa.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa materiału</td>
			<td>Koncentracja zapasów</td>
			<td>Zagęszczenie w pożywce końcowej</td>
			<td>Wolumen zapasów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina-Streptomycyna</td>
			<td>W 100%</td>
			<td>1 proc</td>.
			<td>50 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zamiennik KnockOut Serum (suplement)</td>
			<td>W 100%</td>
			<td>10%</td>
			<td>500 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-merkaptoetanol</td>
			<td>14,3 mln</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octan mirystynianu forbolu (PMA)</td>
			<td>16 μM</td>
			<td>16 nM</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (inhibitor ROCK)</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EFG (EFG</td>)
			<td>50 μg/ml</td>
			<td>25 ng/ml</td>
			<td>2,5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowana ludzka R-spondyna 1</td>
			<td>250 μg/ml</td>
			<td>500 ng/ml</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td> -lub- </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowana mysia R-spondyna 1</td>
			<td>250 μg/ml</td>
			<td>500 ng/ml</td>
			<td>10 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowany ludzki FGF1 (aFGF)</td>
			<td>100 μg/ml</td>
			<td>25 μg/ml</td>
			<td>1,25 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparyna (Liquemin)</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>2,5 U/ml</td>
			<td>2 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowany ludzki FGF10</td>
			<td>100 μg/ml</td>
			<td>100 ng/ml</td>
			<td>5 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 412,25 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łączny</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 000 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Medium sferyczne.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa materiału</td>
			<td>Koncentracja zapasów</td>
			<td>Zagęszczenie w pożywce końcowej</td>
			<td>Wolumen zapasów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicylina-Streptomycyna</td>
			<td>W 100%</td>
			<td>1 proc</td>.
			<td>50 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 x50 (uzupełnienie)</td>
			<td>W 100%</td>
			<td>10%</td>
			<td>100 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rekombinowany ludzki FGF2 (bFGF)</td>
			<td>100 μg/ml</td>
			<td>64 ng/ml</td>
			<td>3,2 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (inhibitor ROCK)</td>
			<td>50 mM</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4845,8 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łączny</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5000 μl</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
3. Obrazowanie postępu rozwoju organoidów
<ol>
	<li>Obrazowanie organoidów codziennie lub za pomocą mikroskopii poklatkowej przy użyciu fluorescencyjnego mikroskopu poklatkowego. Do obrazowania poklatkowego należy użyć automatycznego odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego XY(Z).</li>
	<li>Małe kropelki o objętości 3 μl należy umieścić na płytkach 4-dołkowych lub płytkach ze szklanym dnem wypełnionych 2-5 ml podłoża. Obraz z obiektywem dalekiego zasięgu 10x. Uwaga: Można użyć myszy transgenicznych wykazujących ekspresję fluorescencyjnych znaczników. Film 1 pokazuje na przykład początkową ekspansję organoidów z myszy Pdx1-Ngn3-ER TM-ires-nGFP+4. Jądrowy GFP umożliwia użytkownikowi śledzenie komórek jako pojedynczych obiektów, ale podobne zasady można zastosować do śledzenia komórek z fluorescencją błonową, takich jak myszy mT/mG29.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie poklatkowe 3 godziny po rozsianiu komórek, aby uniknąć dryftów ostrości i ustaw oprogramowanie sterujące automatyzacją tak, aby robiło 1 zdjęcie na godzinę przez 3 lub więcej dni w ręcznie zdefiniowanych pozycjach. Dla każdej pozycji uzyskaj obraz różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), a także sygnał GFP, informujący o ekspresji markera fluorescencyjnego.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie organoidów do badań histologicznych
<ol>
	<li>Umieścić 96-dołkową płytkę na lodzie i usunąć pożywkę, zastępując ją lodowatym PBS. To częściowo depolimeryzuje Matrigel.</li>
	<li>Delikatnie odessaj każdy pojedynczy organoid, usuwając otaczający go Matrigel za pomocą końcówki o pojemności 1,000 μl, aby nie zakłócić ogólnej architektury. Przenieś każdy organoid do studzienki z lodowatym PBS. Trzymaj talerz na lodzie. Możliwe jest również bezpośrednie utrwalenie w Matrigelu.</li>
	<li>Utrwal organoid przez 15 minut w 4% paraformaldehydzie (PFA), zakonserwuj go w sacharozie i zanurz w żelatynie. Przetwarzaj każdy organoid do kriosekcji i histologii, jak opisano wcześniej (Johansson i wsp., 2007) 4.</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie organoidów do PCR i biochemii
<ol>
	<li>Umieść 96-dołkową płytkę na lodzie i usuń podłoże. Dodaj 60 μl RNAlater na studzienkę, aby ustabilizować i chronić komórkowe RNA.</li>
	<li>Rozbić mechanicznie żel w każdym dołku poprzez częściową depolimeryzację go na lodzie. Albo odzyskać pojedyncze organoidy za pomocą końcówki o pojemności 1 000 μl, aby nie zakłócić ogólnej architektury, albo odzyskać całą studzienkę (za pomocą Matrigel), mechanicznie rozbijając żel za pomocą końcówki o pojemności 200 μl. Użyj końcówki o pojemności 1 000 μl, aby przenieść zawartość studzienki do nieklejącej się probówki Eppendorfa bez RNAzy trzymanej na lodzie.</li>
	<li>Umyj studzienki 60 μl RNAlater i dodaj pozostałą zawartość do tej samej probówki Eppendorfa.</li>
	<li>Wirować probówki przez 5 minut w temperaturze 500-1 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant, pozostawiając tylko 20-30 μl RNA później w probówce razem z osadem. Do celów biochemicznych należy przechowywać próbki tak suche, jak to możliwe.</li>
	<li>Nie zamrażać natychmiast próbek w RNA, przechowywać w temperaturze 4 °C O/N (aby umożliwić RNAlater dokładne wniknięcie w tkankę). Tkanka może być przechowywana w temperaturze -20 °C w celu długotrwałego przechowywania, a następnie może być przetwarzana w celu rozerwania tkanki i ekstrakcji niewielkich ilości RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Pagliuca, F. W., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+functional+beta-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make a functional beta-cell.</a> Development. 140, 2472-2483 (2013).</li>
<li>Percival, A. C., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li>
<li>Attali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+beta-cell+differentiation+by+the+pancreatic+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme.</a> Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).</li>
<li>Johansson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+neurogenin3+activity+in+pancreas+progenitors+reveals+competence+windows+for+the+generation+of+different+endocrine+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types.</a> Dev Cell. 12, 457-465 (2007).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).</li>
<li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Dev Biol. 4, 242-255 (1962).</li>
<li>Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follistatin+regulates+the+relative+proportions+of+endocrine+versus+exocrine+tissue+during+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development.</a> Development. 125, 1017-1024 (1998).</li>
<li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , 3979(2012).</li>
<li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).</li>
<li>Hope, K., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+interrogation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal interrogation of stem cells.</a> Nat Methods. 8, 36-40 (2011).</li>
<li>Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+markers+of+fetal+pancreatic+epithelium+permit+prospective+isolation+of+islet+progenitor+cells+by+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Sugiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+pancreas+development+from+purified+progenitor+cells+reveals+genes+essential+for+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. , (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. , (2009).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15, 701-706 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
<li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Produkcja funkcjonalnych komórek beta in vitro na dużą skalę jest nadal nieefektywna 1. W tym trudnym kontekście badania biologii rozwoju mogą pomóc w rozszyfrowaniu dokładnych sygnałów, które są wymagane do różnicowania funkcjonalnych komórek beta. Protokół ten pozwala na utrzymanie, ekspansję i różnicowanie embrionalnych komórek progenitorowych trzustki in vitro. Obejmuje to tworzenie komórek beta wytwarzających insulinę, które nie wykazują współekspresji innych hormonów endokrynnych, mają ...

Hodowla narządów dostarcza użytecznego modelu, który wypełnia luki między złożonymi, ale bardzo istotnymi badaniami in vivo, a wygodną, ale przybliżoną symulacją modeli linii komórkowych. W przypadku trzustki nie ma linii komórkowej idealnie równoważnej przodkom trzustki, chociaż istnieją transformowane linie komórkowe symulujące komórki endokrynne i zewnątrzwydzielnicze. Dorosła cała trzustka nie może być hodowana; Izolowane wyspy wydzielnicze mogą być utrzymywane przez kilka tygodni bez proliferacji komórek, a wycinki tkanek mogą być przechowywane in vitro przez kilka godzin 5. Posiew zarodkowej trzustki jest szeroko stosowany nie tylko do badania jej rozwoju, ale także do badania interakcji nabłonkowo-mezenchymalnych 4,6,7, do obrazowania procesów 8 lub do chemicznego ingerowania w nie 9. Stosowane są głównie dwie metody hodowli narządów: pierwsza polega na hodowli pąków trzustki na płytkach pokrytych fibronektyną 2, co jest wygodne do celów obrazowania; Drugą opcją jest hodowla narządów na filtrach na granicy faz powietrze-ciecz 3,4, co najlepiej zachowuje morfogenezę. Chociaż metody te są bardzo przydatne, prowadzą do pewnego stopnia spłaszczenia; Ekspansja komórek progenitorowych jest bardzo ograniczona w porównaniu z normalnym rozwojem, a populacja wyjściowa jest złożona i obejmuje wszystkie typy komórek trzustki i komórek mezenchymalnych.
Zdolność do hodowli i ekspansji rozproszonych komórek pierwotnych jest cenna dla badania powiązań między liniami i odkrywania wewnętrznych właściwości izolowanych typów komórek 10. Sugiyama i wsp. 11 mogli utrzymać przodków trzustki i endokrynologiczne komórki progenitorowe, które zachowywały pewne cechy funkcjonalne przez 3-5 dni w hodowli na nioskach żywiących. Trzustonosfery, podobne do neurosfer 12 i mammosfer 13, zostały rozszerzone z dorosłych wysp trzustkowych i komórek przewodowych, chociaż natura komórek progenitorowych / komórek macierzystych, które generują te sfery, nie jest jasna. Ponadto, w przeciwieństwie do rozwoju fizjologicznego, w trzustosferze znajdowały się neurony 14,15. Niedawno wyprodukowano również kule z embrionalnych przodków trzustki 16,17 i regenerującej się trzustki18 z dobrą ekspansją progenitorów i późniejszym różnicowaniem, ale nie udało im się zrekapitulować morfogenezy.
Modele 3D z rozproszonych i często zdefiniowanych komórek, które samoorganizują się w zminiaturyzowane narządy, ostatnio rozkwitły i symulują rozwój lub dorosły obrót wielu narządów, takich jak jelito 19,20, żołądek 21, wątroba 22, prostata 23 i tchawica 24. W niektórych przypadkach morfogeneza i różnicowanie rozwoju zostały zrekapitulowane w 3D z komórek ES, jak ma to miejsce w przypadku miseczek nerwu wzrokowego 25, jelita 26 lub mózgu 27.
Tutaj opisujemy metodę rozszerzania zdysocjowanych multipotencjalnych komórek progenitorowych trzustki w rusztowaniu 3D Matrigel, gdzie mogą się różnicować i samoorganizować.

<table><tbody><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -20 &deg; C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum zamiennik (suplement)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -20 &deg; C</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3148-25ML</td><td>Zapas przechowywany w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Octan mirystynianu forbolu (PMA)</td><td>Calbiotech</td><td>524400-1MG</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Y-27632 (inhibitor ROCK)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ab120129</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -20 stopni C. Uwaga! Stabilność/źródło jest częstym źródłem problemów.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644-2MG</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka R-spondyna 1</td><td>R& D</td><td>4645-RS-025/CF</td><td>Stan magazynowy utrzymywany na poziomie -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz R-spondyna 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF1 (aFGF)</td><td>R& D</td><td>232-FA-025</td><td>Zapas utrzymywany w temperaturze -80 &deg; C - nie należy włączać w celu zwiększenia produkcji komórek beta</td></tr><tr><td>Heparyna (Liquemin)</td><td>Drossapharm</td><td></td><td>Zapas utrzymywany w temperaturze 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG-025</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -80 &deg; C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Zapas utrzymywany w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>B27 x50 (suplement)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Zapas utrzymywany na poziomie -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF2 (bFGF)</td><td>R& D</td><td>233-FB-025</td><td>Zapas utrzymywany w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Zapasy utrzymywane na poziomie -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Trypsyna 0,05%</td> <td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Zapas utrzymywany w temperaturze 4 & deg; C</td></tr><tr><td>RNAlater - odczynnik stabilizujący RNA</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4818-2MG</td><td>Stężenie robocze: 1,25 mg/ml. Zapas utrzymywany na poziomie -20 &deg; C</td></tr><tr><td>BSA do rekonstytucji</td><td>Milipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td><td>Do rekonstytucji cytokin&nbsp; - zapas utrzymywany na poziomie -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Gibco</td><td>16141079</td><td>Zapas utrzymywany w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>60-dołkowe tacki MicroWell</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0815-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 4-dołkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 95-dołkowe F F dno</td><td>Greiner Bio</td><td>6555180</td><td></td></tr><tr><td>Glas Płytki dolne</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipety szklane do utylizacji</td><td></td><td>Mikroskop</td> 708745 <td></td>Blaubrand</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Stacja obrazowania Cell&#174 (zmotoryzowany odwrócony statyw Olympus IX81) wyposażona w kamerę Hamamatsu ORCA ER B7W oraz Ludin Cube and Box. 
Stanowisko Leica DMI6000 B otoczone kostką Ludin Cube i skrzynką, wyposażone w kamerę Leica DFC365 FX i interfejs poleceń oprogramowania AF6000 Expert/Matrix.</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td></td><td></td><td>Olympus UPLAN FL NA 0.30 air 9.50 mm 10X długi dystans; 
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 air 11.0 mm 10X długi dystans</td></tr></tbody></table>

in vitro organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

Trzustka jest niezbędnym organem, który reguluje homeostazę glukozy i wydziela enzymy trawienne. Badania nad embriogenezą trzustki doprowadziły do opracowania protokołów wytwarzania komórek trzustki z komórek macierzystych 1. Cały narząd zarodkowy może być hodowany na wielu etapach rozwoju 2-4. Te metody hodowli okazały się przydatne do testowania leków i obrazowania procesów rozwojowych. Jednak ekspansja narządu jest bardzo ograniczona, a morfogeneza nie jest wiernie odwzorowana, ponieważ narząd spłaszcza się. 
Proponujemy trójwymiarowe (3D) warunki hodowli, które umożliwiają efektywną ekspansję zdysocjowanych embrionalnych komórek progenitorowych trzustki myszy. Manipulując składem pożywki hodowlanej, możliwe jest wytworzenie pustych kulek, składających się głównie z komórek progenitorowych trzustki rozszerzających się w stanie początkowym, lub złożonych organoidów, które rozwijają się do bardziej dojrzałych, rozszerzających się komórek progenitorowych i różnicują się w komórki endokrynne, groniaste i przewodowe, i które spontanicznie samoorganizują się, przypominając zarodkową trzustkę. 
Pokazujemy tutaj, że proces in vitro podsumowuje wiele aspektów naturalnego rozwoju trzustki. Ten system hodowli jest odpowiedni do zbadania, w jaki sposób komórki współpracują ze sobą, tworząc narząd, redukując jego początkową złożoność do kilku komórek progenitorowych. Jest to model, który odtwarza architekturę 3D trzustki i dlatego jest przydatny do badania morfogenezy, w tym polaryzacji struktur nabłonkowych i rozgałęzień. Właściwe jest również oszacowanie reakcji na mechaniczne sygnały niszy, takie jak sztywność i wpływ na tensegrację komórki.

Dysocjowane i wysiane w 3D Matrigel progenitory grzbietowej części trzustki z etapu E10.5 odtwarzają rozwój trzustki. Progenitory można najłatwiej śledzić za pomocą reporterów fluorescencyjnych. W naszym przypadku zastosowaliśmy transgeniczną mysz wykazującą ekspresję jądrowego białka GFP kontrolowaną przez promotor Pdx1 (Pdx1-Ngn3-ERTM-nGFP) (Film 1) w obecności tamoksymenu, a zatem bez aktywacji Neurog3 4 (Rysunek 2).
<p class="jove_content"...

Metoda hodowli trójwymiarowej opisana w tym protokole podsumowuje rozwój trzustki z rozproszonych embrionalnych przodków trzustki myszy, włączając ich znaczną ekspansję, różnicowanie i morfogenezę do rozgałęzionego organu. Ta metoda jest podatna na obrazowanie, funkcjonalną ingerencję i manipulację niszą.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Ogólnym celem tej procedury jest namnożenie powiązanych wielopotencjalnych progenitorów trzustki w trójwymiarowym rusztowaniu Matrigel, w którym mogą one ulegać różnicowaniu i samoorganizacji. Osiąga się to poprzez wstępną izolację trzustki z embrionów myszy z 10,5 dnia embrionalnego. Drugim krokiem jest usunięcie mezenchymy i dysocjacja nabłonka do pojedynczych komórek oraz małych skupisk.Ostatnim krokiem jest zawieszenie komórek w matrigelu i inkubacja spolimeryzowanego żelu w celu ekspansji. Prowadzi to ostatecznie do powstania samorganizujących się rozgałęzionych organoidów trzustki, podobnych do embrionalnej trzustki myszy, które można obrazować na żywo lub w punkcie końcowym za pomocą mikroskopii. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak eksplantacja całej trzustki, jest rozpoczęcie procesu od dobrze zdefiniowanej i mniej złożonej populacji komórek.Progenitory komórek trzustki są lepiej utrzymywane w hodowlach 3D niż w hodowlach komórkowych 2D. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na niektóre kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak interakcje międzykomórkowe lub oddziaływanie komórek z macierzą. Ostatecznie doprowadzi to do zroz

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In Vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych zarodkowych komórek macierzystych myszy

Opisano trójwymiarowy test kolonogenny, który pozwala progenitorom o fenotypie trzustkowym na różnicowanie się w kolonie wykazujące ekspresję insuliny. Metoda ta wykorzystuje półstałe podłoża zawierające metylocelulozę, Matrigel oraz czynniki wzrostu, w których pojedyncze komórki progenitorowe proliferują i różnicują się in vitro, co umożliwia ilościowe określenie liczby funkcjonalnych progenitorów w populacji.

Ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji, hodowli i manipulacji embrionalną trzustką myszy. Stanowi ona doskonały system ex vivo do badania różnych aspektów rozwoju trzustki, w tym morfogenezy, różnicowania i wzrostu. Eksplanty pąka trzustki mogą być hodowane przez kilka dni i wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, w tym w immunofluorescencji całych preparatów oraz obrazowaniu na żywo.

System do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

Opisano protokół izolacji, hodowli i obrazowania klastrów komórek wysp trzustkowych (ICC) pochodzących z ludzkich komórek trzustki płodu. Metoda szczegółowo opisuje kroki niezbędne do wygenerowania ICC z tkanki, hodowli jako monowarstw lub w zawiesinie jako agregatów, oraz obrazu dla markerów proliferacji i decyzji o losie komórek trzustki.

Izolacja, hodowla i obrazowanie klastrów ludzkich płodowych komórek trzustkowych

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Ten protokół przedstawia porównanie dwóch różnych protokołów indukcji różnicowania ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSC) w kierunku linii trzustki in vitro: protokół integracyjny i protokół nieintegracyjny. Protokół integracyjny generuje więcej komórek produkujących insulinę (IPC).

Metody in vitro Indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę trójwymiarowej kultury do generowania samoorganizujących się organoidów trzustki z mysich progenitorów embrionalnych. Technika umożliwia ekspansję, różnicowanie i obserwację morfogenezy w czasie rzeczywistym.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

Przeglądaj więcej filmów