Name: Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj metodę trwałej okluzji dalszej tętnicy środkowej mózgu u myszy za pomocą elektrokoagulacji. Model ten umożliwia badanie udaru niedokrwiennego z niską śmiertelnością i wysoką powtarzalnością wyników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez klaster doskonałości niemieckiej fundacji badawczej "Munich Cluster for Systems Neurology (SyNergy)" oraz przez fundację Daimler-Benz dla A.L.

Oświadczenie etyczne
Eksperymenty opisane w tym filmie zostały przeprowadzone zgodnie z krajowymi wytycznymi dotyczącymi wykorzystania zwierząt doświadczalnych, a protokoły zostały zatwierdzone przez niemieckie komitety rządowe (Regierung von Oberbayern, Monachium, Niemcy). W tym badaniu wykorzystano 10-tygodniowe, męskie myszy C57Bl/6J. Zwierzęta trzymano w kontrolowanej temperaturze (22 ± 2 °C), z 12-godzinnym cyklem światła i ciemności oraz dostępem do granulowanego pokarmu i wody ad libitum. Protokoły analgezji i sedacji są opisane jako zatwierdzone przez lokalną komisję rządową, ale mogą różnić się od protokołów stosowanych w innych laboratoriach.
1. Przygotowanie materiałów i instrumentów
<ol>
	<li>Podłącz koc grzewczy, aby utrzymać ciepło w miejscu operacji i utrzymać temperaturę ciała myszy podczas znieczulenia (37 °C).</li>
	<li>Przygotuj autoklawowane nożyczki, kleszcze i bawełnę, maść do oczu z dekspantenolu i materiał do szycia. Przygotować strzykawkę z roztworem soli fizjologicznej (bez igły), aby utrzymać nawodnienie miejsca operacji. Przygotuj gaz znieczulający (70%N2O+ 30%O2 + izofluran).</li>
	<li>Leki przeciwbólowe wstrzykiwać dootrzewnowo: Metamizol 200 mg/kg, karprofen 4 mg/kg i buprenorfina 0,1 mg/kg.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej o natężeniu przepływu izofluranu 4%, aby znieczulić ją do momentu ustania spontanicznych ruchów ciała i wibrysów.</li>
	<li>Przenieś mysz w pozycji bocznej z nosem do maski anestezjologicznej i utrzymuj stężenie izofluranu na poziomie 4% przez około kolejną minutę, a następnie zmniejsz i wynosi około 1,5%, aby utrzymać odpowiednie znieczulenie.</li>
	<li>Nałóż maść do oczu z dekspantenolem na oba oczy. </li>
</ol>
2. Dystalny model MCAO
<ol>
	<li>Wykonaj 1 cm nacięcie skóry między uchem a okiem za pomocą małych nożyczek operacyjnych po aseptycznym przygotowaniu pola operacyjnego przy użyciu środka dezynfekującego skórę.</li>
	<li>Oddziel skórę i zlokalizuj mięsień skroniowy.</li>
	<li>Wybierz w generatorze wysokiej częstotliwości funkcję krzepnięcia, tryb bipolarny, wybierz 12 W i połącz kleszczyki do elektrokoagulacji z.</li>
	<li>Dodaj kroplę soli fizjologicznej i użyj kleszczy, aby odłączyć mięsień skroniowy od czaszki w jej wierzchołkowej i grzbietowej części, tworząc w ten sposób płat mięśniowy bez całkowitego usuwania mięśnia.</li>
	<li>Zidentyfikuj MCA poniżej przezroczystej czaszki, w rostralnej części obszaru skroniowego, grzbietowo do zatoki zadoczodołowej (ryc. 2A). Jeśli rozwidlenie MCA nie jest widoczne (ze względu na anatomiczną normalną zmianę), zidentyfikuj naczynie najbardziej rostralne.</li>
	<li>Dodaj trochę soli fizjologicznej na czaszkę i rozcieńcz kość wiertłem tuż nad gałęzią MCA, aż uzyska cienką i półprzezroczystą teksturę (ryc. 2B).</li>
	<li>Ostrożnie wycofaj kość powyżej tętnicy za pomocą bardzo cienkich kleszczy.</li>
	<li>Wybierz tryb bipolarny w generatorze wysokiej częstotliwości o mocy 7 W. Skoaguluj tętnicę za pomocą kleszczy elektrokoagulacyjnych proksymalnych i dystalnych do rozwidlenia (rysunek 2C). Gdy rozwidlenie nie jest widoczne ze względu na wariant anatomiczny, należy skoagulować prawidłowo zidentyfikowaną gałąź MCA (patrz wyżej) w dwóch miejscach w odległości ok. 1 mm. Nie jest konieczne chwytanie tętnicy kleszczami w celu koagulacji, wystarczy ostrożne dotykanie tętnicy kleszczami po obu stronach od góry i powoduje mniejsze uszkodzenia mechaniczne.</li>
	<li>Odczekaj 30 sekund i delikatnie dotknij tętnicy kleszczami, aby sprawdzić, czy nie ma przepływu krwi z powodu spontanicznej rekanalizacji. W przypadku rekanalizacji należy powtórzyć elektrokoagulację jeden raz.</li>
	<li>Przenieś mięsień skroniowy do jego pozycji, zakrywając otwór w zadziorach.</li>
	<li>Zszyć ranę i umieścić zwierzę w pudełku do karmienia w temperaturze 32 °C, aby wyzdrowiało ze znieczulenia i wróciło do klatki. Ogólnie rzecz biorąc, zwierzę potrzebuje 5-10 minut, aby dojść do siebie po znieczuleniu.</li>
	<li>Wstrzyknąć znieczulenie pooperacyjne (i.p.) po 24 godzinach, a następnie codziennie do piątego dnia po operacji: karprofen 4 mg/kg.</li>
</ol>
3. Fikcyjna operacja
Wykonaj wszystkie procedury identycznie jak w operacji opisanej powyżej - włączając w to ścieńczenie czaszki i jej usunięcie - z wyjątkiem niekoagulacji odsłoniętej tętnicy.
4. Test cylindra13
<ol>
	<li>Umieść zwierzę w przezroczystym cylindrze ze szkła akrylowego (średnica: 8 cm; wysokość: 25 cm) przed dwoma lustrami i taśmą wideo na 5 minut. Ustaw kamerę centralnie przed dwoma lustrami i cylindrem, aby uzyskać optymalny obraz (Rysunek 3A).</li>
	<li>W celu oceny niezależnego użycia kończyn przednich należy ocenić (1) kontakt ścianki cylindra z jedną kończyną przednią podczas pełnego tylnego ruchu oraz (2) lądowanie z tylko jedną kończyną przednią na podłodze po pełnym tylnym ustawieniu. Policz co najmniej 20 kontaktów na jedną kończynę przednią, korzystając z funkcji zwolnionego tempa lub klatka po klatce darmowego oprogramowania Video Lan Client (VLC) (<a href="http://www.videolan.org/vlc">http://www.videolan.org/vlc</a>).</li>
	<li>W przypadku analizy wyjściowej przed zabiegiem chirurgicznym: wykonaj test dwa razy na mysz, z 1-godzinną przerwą między próbami. Używanie kończyn przednich jest wyrażone jako stosunek prawo- i lewostronnego, niezależnego używania kończyn przednich.</li>
	<li>Po koagulacji MCA: wykonaj test ponownie dwa razy na mysz, z 1-godzinną przerwą między próbami, jak wskazano powyżej.</li>
</ol>
5. Perfuzja
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzęta (np. odpowiednio ketaminą i ksylazyną w dawce 120/16 mg/kg masy ciała).</li>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i otwórz jamę brzuszną za pomocą środkowego cięcia. Usuń rozdarcia i mostek. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku. Wprowadzić kaniulę perfuzyjną do lewej komory i powoli perfuzjonować 20 ml soli fizjologicznej.</li>
	<li>Odetnij głowę zwierzęciu, otwórz kalwarię i delikatnie oderwij mózg od podstawy czaszki.</li>
	<li>Zamrozić mózgi w temperaturze -40 °C zimnego izopentanu na 10 minut, a następnie wyjąć mózgi z izopentanu i przechowywać do dalszej analizy w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Wolumetria zawału
<ol>
	<li>Kriosekcja: Wycinaj mózgi seryjnie na kriostacie do odcinków o grubości 20 μm co 400 μm na szkiełkach i przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Barwienie fioletem krezylowym (CV):
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór barwiący: Wymieszać 0,5 g octanu CV w 500 ml H2O. Wymieszać i podgrzewać (60 °C) aż do rozpuszczenia kryształów. Pozostaw roztwór do ostygnięcia i przechowuj w ciemnej butelce. Podgrzej do 60 °C i przefiltruj przed każdym użyciem.</li>
		<li>Suszyć szkiełka w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie umieść je w 95% etanolu na 15 minut, a następnie w 70% etanolu na 1 minutę, a następnie w 50% etanolu na 1 minutę.</li>
		<li>Umieścić szkiełka w wodzie destylowanej na 2 minuty, odświeżyć wodę destylowaną i umieścić je w niej na 1 minutę. Następnie umieścić szkiełka w roztworze barwiącym (60 °C) na 10 minut i umyć je dwukrotnie w wodzie destylowanej przez 1 minutę.</li>
		<li>Umieść szkiełka w 95% etanolu na 2 minuty. Następnie umieść je w 100% etanolu na 5 minut, odśwież 100% etanol i umieść je na 2 minuty. Następnie przykryj szkiełka medium montażowym.</li>
		<li>Analiza: 
		Zeskanuj szkiełka i przeanalizuj objętość pośredniego zawału metodąSwansona 14, aby skorygować obrzęk: 
		(Obszar niedokrwienny) = (Obszar kory po stronie przeciwnej) - (Obszar kory niedokrwiennej po stronie ipsilateralnej) (Rysunek 4A).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Donnan, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Stroke.</a> Lancet. 371, 1612-1623 (2008).</li>
<li>Di Carlo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+stroke+in+Europe%3A+A+collaborative+study+of+population-based+cohorts.+ILSA+Working+Group+and+the+Neurologic+Diseases+in+the+Elderly+Research+Group.+Italian+Longitudinal+Study+on+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Frequency of stroke in Europe: A collaborative study of population-based cohorts. ILSA Working Group and the Neurologic Diseases in the Elderly Research Group. Italian Longitudinal Study on Aging.</a> Neurology. 54, 28-33 (2000).</li>
<li>Hacke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombolysis+with+alteplase+3+to+4.5+hours+after+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Thrombolysis with alteplase 3 to 4.5 hours after acute ischemic stroke.</a> N. Engl. J. Med. 359, 1317-1329 (2008).</li>
<li>Jauch, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+early+management+of+patients+with+acute+ischemic+stroke%3A+a+guideline+for+healthcare+professionals+from+the+American+Heart+Association%2FAmerican+Stroke+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the early management of patients with acute ischemic stroke: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association.</a> Stroke. 44, 870-947 (2013).</li>
<li>Longa, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20, 84-91 (1989).</li>
<li>Engel, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> J. Vis. Exp. (47), e2423(2011).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rat+model+of+thrombotic+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 123-135 (1997).</li>
<li>Tamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischaemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).</li>
<li>Chen, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat%3A+reproducible+extensive+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17, 738-743 (1986).</li>
<li>Tureyen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> J. Neurosci. Methods. 139, 203-207 (2004).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2, 396-409 (2005).</li>
<li>Howells, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+strokes+for+different+folks%3A+the+rich+diversity+of+animal+models+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).</li>
<li>Schallert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).</li>
<li>Swanson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semiautomated+method+for+measuring+brain+infarct+volume%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">A semiautomated method for measuring brain infarct volume.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 10, 290-293 (1990).</li>
<li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalational+anesthetics+as+neuroprotectants+or+chemical+preconditioning+agents+in+ischemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 27, 1108-1128 (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intravenous+recombinant+tissue+plasminogen+activator+on+ischemic+stroke+lesion+size+measured+by+computed+tomography.+NINDS%3B+The+National+Institute+of+Neurological+Disorders+and+Stroke+%28NINDS%29+rt-PA+Stroke+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Effect of intravenous recombinant tissue plasminogen activator on ischemic stroke lesion size measured by computed tomography. NINDS; The National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) rt-PA Stroke Study Group.</a> Stroke. 31, 2912-2919 (2000).</li>
<li>Sowell, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cortical+change+across+the+human+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mapping cortical change across the human life span.</a> Nat. Neurosci. 6, 309-315 (2003).</li>
<li>Brott, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+acute+cerebral+infarction%3A+lesion+size+by+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Measurements of acute cerebral infarction: lesion size by computed tomography.</a> Stroke. 20, 871-875 (1989).</li>
<li>Hacke, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant%27+middle+cerebral+artery+territory+infarction%3A+clinical+course+and+prognostic+signs%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Malignant' middle cerebral artery territory infarction: clinical course and prognostic signs.</a> Arch. Neurol. 53, 309-315 (1996).</li>
<li>Majid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+vulnerability+to+permanent+focal+cerebral+ischemia+among+3+common+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains.</a> Stroke. 31, 2707-2714 (2000).</li>
<li>Liesz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+regulatory+T+cells+limits+neuroinflammation+in+permanent+cortical+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Boosting regulatory T cells limits neuroinflammation in permanent cortical stroke.</a> J. Neurosci. 33 (44), 17350-17362 (2013).</li>
<li>Liesz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+lymphocyte+trafficking+shields+the+brain+against+deleterious+neuroinflammation+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Inhibition of lymphocyte trafficking shields the brain against deleterious neuroinflammation after stroke.</a> Brain. 134, 704-720 (2011).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotarod+suitable+for+quantitative+measurements+of+motor+incoordination+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn+Schmiedebergs+Arch.+Exp.+Pathol.+Pharmakol%22%5BJournal%5D)">A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 259, 211(1968).</li>
<li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesive+removal+test%3A+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nat. Protoc. 4, 1560-1564 (2009).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+test+for+detecting+long-term+sensorimotor+dysfunction+in+the+mouse+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia.</a> J. Neurosci. Methods. 117, 207-214 (2002).</li>
<li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38, 2771-2778 (2007).</li>
<li>Farr, T. D., Whishaw, I. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+impairments+in+skilled+reaching+in+the+mouse+%28Mus+musculus%29+after+a+focal+motor+cortex+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (Mus musculus) after a focal motor cortex stroke.</a> Stroke. 33, 1869-1875 (2002).</li>
<li>Kassem-Moussa, H., Graffagnino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonocclusion+and+spontaneous+recanalization+rates+in+acute+ischemic+stroke%3A+a+review+of+cerebral+angiography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Nonocclusion and spontaneous recanalization rates in acute ischemic stroke: a review of cerebral angiography studies.</a> Arch. Neurol. 59, 1870-1873 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Niniejszy protokół opisuje eksperymentalny model udarowy dystalnego, trwałego MCAO metodą elektrokoagulacji przezczaszkowej – tzw. "model krzepnięcia". W międzyczasie model ten stał się jednym z najczęściej wykorzystywanych modeli zwierzęcych w eksperymentalnych badaniach nad udaremmózgu 12. W porównaniu z innymi modelami ogniskowego niedokrwienia mózgu, model krzepnięcia przedstawiony w tym filmie ma tę zaletę, że zapewnia bardzo krótki czas operacji, wynoszący około 10 minut, gdy jest wykonywany przez wyszkolonego naukowca. W związku z tym w tym modelu można osiągnąć krótkie czasy znieczulenia, co jest korzystną cechą eksperymentalnego modelu udaru, ponieważ wpływ środków znieczulających na neuroprotekcję i wynik udaru jest dobrze znany15. Ponadto, jak wcześniej opisali Carmichael i wsp. 11, potwierdzamy, że wynikająca objętość i lokalizacja zawału po dystalnej trwałej koagulacji MCA odpowiada niedokrwiennym zmianom mózgu w większości udarów u ludzi proporcjonalnie do wielkości mózgu. Udar mózgu u ludzi jest głównie niewielkich rozmiarów ze zmianami obejmującymi około 5-15% półkuli, na podstawie wcześniejszych badań populacyjnych i klinicznych badań obrazowych16-18, w przeciwieństwie do rozległych zmian udarowych z kompresyjnym obrzękiem mózgu, które występują w mniej niż 10% udarów klinicznych19. W związku z tym zmiany udarowe na obszarze MCA około 12% półkuli osiągnięte przez prezentowany model można uznać za istotną translacyjnie objętość wyrzutową. Należy jednak wziąć pod uwagę, że różne szczepy myszy lub stosowane protokoły znieczulenia mogą wpływać na powstałą objętość zmiany20.
Śmiertelność w okresie obserwacji po indukcji udaru mózgu w tym modelu jest praktycznie nieobecna. Na ogólną śmiertelność poniżej 5% składają się głównie zgony podczas operacji z powodu powikłań anestezjologicznych lub poświęcenia z powodu spełnienia kryteriów wykluczenia. Aby zagwarantować niską zmienność tego modelu i jego doskonałą odtwarzalność, sugerujemy następujące kryteria wykluczenia: 1) Jakikolwiek krwotok podpajęczynówkowy podczas operacji. 2) Czas operacji dłuższy niż 15 min. 3) Rekanalizacja MCA po dwóch próbach elektrokoagulacji tylko z przejściowym MCAO. Co więcej, zwierzęta muszą być badane codziennie po MCAO (podstawowe zachowania fizjologiczne, wygląd futra i masa ciała) w celu kontrolowania bólu, dyskomfortu lub zachowań chorobowych.
Do analizy wyników udaru można zastosować kilka środków, takich jak pomiar plamek laserowych, rezonans magnetyczny, testy behawioralne lub analiza histologiczna. W tym protokole udostępniamy przykładowe metody analizy zachowania i analizy objętości zawału. Opracowano kilka testów do analizy behawioralnej po ogniskowym niedokrwieniu mózgu i wykorzystano je w eksperymentalnych badaniach nad udarem. Odpowiednimi testami na dysfunkcję sensomotoryczną wcześniej stosowaną przez naszą grupę w tym modelu skoku21,22 były test Rotarod23, test lepkiej etykiety24, test narożny25 i test cylindryczny13, który jest pokazany w tym filmie. Test cylindryczny konsekwentnie obrazuje asymetrię motoryczną w ostrej fazie po dystalnym stałym MCAO, a także wykrywa kolejne odzyskiwanie funkcji motorycznej.
Pomimo oczywistych zalet, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia tego modelu skoku. Po pierwsze, trepanacja czaszki jest potrzebna w celu koagulacji tętnicy, wytwarzając w ten sposób potencjalny dostęp do okołooperacyjnych infekcji mózgu, chociaż infekcje bakteryjne rany operacyjnej, mięśnia skroniowego lub samego mózgu nigdy nie zostały wykryte przez nas samych ani udokumentowane przez innych korzystających z tego modelu. Ponadto nie można wykluczyć mechanicznego uszkodzenia kory mózgowej podczas preparacji i krzepnięcia, ale można je ograniczyć poprzez staranne wiercenie i usuwanie czaszki, stałe nawilżanie miejsca operowanego i minimalną niezbędną elektrokoagulację (patrz kryteria wyłączenia). Chociaż przebieg MCA, jak pokazano na rysunku 2 , występuje u większości myszy C57Bl/6, w protokole opisujemy, jak postępować przy normalnych zmianach kursu statku, aby zminimalizować zmienność modelu. Ponadto sugerujemy stosowanie wielu (3 w przypadku bifurkacji; 2 bez bifurkacji MCA) miejsc okluzji, aby zminimalizować ryzyko częściowej rekanalizacji MCA, co z naszego doświadczenia jest ważnym czynnikiem wpływającym na zmienność tego modelu.
Jeśli chodzi o testy behawioralne, w wyżej wymienionych testach behawioralnych można wykryć tylko niewielkie deficyty behawioralne, a regenerację funkcjonalną można zaobserwować w ciągu pierwszego tygodnia po udarze. W związku z tym bardziej zaawansowane systemy testowe o wyższej czułości i jakościowych parametrach testowych, takie jak test wykwalifikowanego docierania27 , mogą być bardziej odpowiednie do wykrywania długoterminowych wyników funkcjonalnych w tym modelu.
Wreszcie, ze względu na trwałą koagulację MCA nie można uzyskać reperfuzji, co jest cechą obserwowaną u znacznego odsetka pacjentów z udarem mózgu z powodu spontanicznej lizy skrzepów lub terapii28. Jednak wcześniej opisany model udaru zakrzepowo-zatorowego26 przewiduje opcję uzupełniającego modelu udaru z reperfuzją korowego niedokrwienia mózgu. Podsumowując, wysoka odtwarzalność, możliwa długoterminowa obserwacja ze względu na minimalną śmiertelność oraz porównywalna względna objętość i lokalizacja zawału w odniesieniu do udaru u człowieka wyróżniają "model krzepnięcia" jako cenny model dla podstawowych i translacyjnych badań nad udarem.

Udar mózgu jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów i jedną z głównych przyczyn nabytej niepełnosprawności dorosłychw krajach rozwiniętych. 1. Około 80% tej ostrej choroby neurologicznej jest spowodowane niedokrwieniem mózgu wynikającym z niedrożności przepływu krwi w mózgu, podczas gdy około 15% jest spowodowanych krwotokiem śródmózgowym2. Pomimo trwających badań, dożylne podawanie tkankowego aktywatora plazminogenu jest jak dotąd jedynym zatwierdzonym leczeniem farmakologicznym udaru niedokrwiennego i dostępnym tylko dla mniejszości pacjentów z udarem ze względu na krótkie, zatwierdzone okno czasowe wynoszące 4,5 godziny po wystąpieniu udaru3,4. Ponieważ nie ma modeli in vitro, które mogłyby prawidłowo modelować złożone interakcje między mózgiem, naczyniami krwionośnymi i ogólnoustrojowymi mechanizmami patofizjologicznymi podczas udaru, modele zwierzęce są niezbędne w przedklinicznych badaniach nad udarem.
Dlatego też opracowano kilka modeli udaru niedokrwiennego u różnych gatunków. Jednym z najczęściej stosowanych modeli udaru jest "model włóknisty", w którym włókno szwu jest przejściowo wprowadzane do tętnicy szyjnej wewnętrznej i przekazywane do momentu, gdy końcówka zasłania początek tętnicy środkowej mózgu (MCA), co powoduje zatrzymanie przepływu krwi, a następnie zawał mózgu w obszarach podkorowych, a w przypadku przedłużonej okluzji również w korze mózgowej5,6. W fotozakrzepowych modelach udaru niedokrwiennego uzyskuje się fotochemiczną okluzję napromieniowanego naczynia korowego po wstrzyknięciu fotouczulacza, w wyniku czego powstają małe, miejscowo opisane zmiany7. Trwałe zamknięcie MCA dystalnej tętnic soczewkowo-strzechowych można osiągnąć przez podwiązanie tętnicy, jej przejściowe ściśnięcie lub przez trwałe krzepnięcie8,9. Powstały zawał w tym modelu dotyczy głównie kory nowej10, ponieważ okluzja MCA w tym modelu jest dystalna do tętnic soczewkowo-trójstronnych, które zaopatrują zwoje podstawy.
Ponieważ większość zmian po udarze mózgu u ludzi znajduje się na terytorium tętnicy środkowej mózgu, wszystkie typowe modele udaru przypominają okluzje MCA lub jednej z jego gałęzi11. MCA jest jedną z głównych tętnic, która zapewnia dopływ krwi do mózgu; Powstaje z tętnicy szyjnej wewnętrznej, biegnie wzdłuż bruzdy bocznej, gdzie następnie rozgałęzia się i wystaje do zwojów podstawy i bocznych powierzchni płatów czołowych, ciemieniowych i skroniowych, w tym pierwotnej kory ruchowej i czuciowej. Prawy i lewy MCA są połączone z przednimi tętnicami mózgowymi i tylnymi tętnicami komunikacyjnymi, które łączą się z tylnymi tętnicami mózgowymi, tworząc koło Willisa (ryc. 1).
Jak wcześniej zgłaszali Carmichael et al.11, zawały modelowane przez model dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO) u myszy obejmują około 10-15% półkuli, naśladując w ten sposób większość zmian po udarze mózgu, które znajdują się na korowym terytorium MCA11,12. W 1981 roku Tamura i wsp. opisali stały, przezczaszkowy model krzepnięcia MCAO u szczurów 8. Jednak model opisany przez Tamurę obejmował proksymalne zamknięcie MCA w celu obejścia bardziej dystalnego rozwidlenia tętnicy. Tak więc oryginalny "model Tamura" indukuje nie tylko zmiany korowe, ale także prążkowiowe, podobne do zmian uzyskanych przez "model włóknisty"6. W tym miejscu opisujemy stały dystalny model MCAO za pomocą elektrokoagulacji przezczaszkowej u myszy. Ponadto przedstawiamy powiązane metody histologiczne i funkcjonalne do analizy wyniku udaru w tym modelu. Wszystkie metody oparte są na standardowych procedurach operacyjnych opracowanych i stosowanych w naszych laboratoriach.

<table><tbody><tr><td>Aparat Canon Eos 500D</td> Optyka <td>Canon</td><td></td><td>: 18-55 mm; 30 kl./s; 640 x 480 funkcja wideo</td></tr><tr><td>Lustro</td><td>Kristallform</td><td>2677089</td><td>30 x 30 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>Cylinder ze szkła akrylowego</td><td>przezroczysty H& S Kunststofftechnik</td><td></td><td>Średnica: 8 cm,&nbsp; wysokość: 25 cm</td></tr><tr><td>Koc grzewczy</td><td>FHC DC Regulator</td><td></td><td></td>temperatury</tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo</td><td>FST</td><td>1410-15</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>FST</td><td>11616-15</td><td></td></tr><tr><td>Bawełna</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli Braun</td><td></td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen pommade</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>System anestezjologiczny do izofluranu</td><td>Dräger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie elektrochirurgiczne</td><td>ERBETOM ICC 80/50 HF-Chirurgieger&auml; t</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wiertło</td><td>Proxxon</td><td>D-34343</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylacine</td><td>Albrecht</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5ml Strzykawka&nbsp;</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem PH: 7,4</td><td>Apotheke Innestadt Uni München</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>Isopentane</td><td>Fluka</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Thermo</td><td>Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Fiolet kresylowy</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma Life Science</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Roti-Histokit</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>Myszy C57Bl/6J Charles</td><td>River</td><td>000664</td><td></td></tr></tbody></table>

modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Modeling Stroke in Mice: Permanent Coagulation of the Distal Middle Cerebral Artery

Udar mózgu jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów i główną przyczyną nabytej niepełnosprawności dorosłych w krajach rozwiniętych. Tylko bardzo ograniczone opcje terapeutyczne są dostępne dla niewielkiej części pacjentów z udarem mózgu w ostrej fazie. Obecne badania intensywnie poszukują nowych strategii terapeutycznych i coraz częściej koncentrują się na fazie podostrej i przewlekłej po udarze, ponieważ więcej pacjentów może kwalifikować się do interwencji terapeutycznych w dłuższym oknie czasowym. Te opóźnione mechanizmy obejmują ważne szlaki patofizjologiczne, takie jak zapalenie po udarze, angiogeneza, plastyczność neuronów i regeneracja. Aby przeanalizować te mechanizmy, a następnie ocenić nowe cele leków, poszukuje się eksperymentalnych modeli udaru o znaczeniu klinicznym, niskiej śmiertelności i wysokiej odtwarzalności. Co więcej, myszy są najmniejszymi ssakami, u których można wywołać ogniskową zmianę udaru mózgu i dla których dostępne jest szerokie spektrum modeli transgenicznych. Dlatego opisujemy tutaj mysi model przezczaszkowego, trwałego krzepnięcia tętnicy środkowej mózgu poprzez elektrokoagulację dystalną tętnic soczewkowo-triataliowych, tzw. "model krzepnięcia". Powstały zawał w tym modelu zlokalizowany jest głównie w korze; Względna objętość zawału w stosunku do wielkości mózgu odpowiada większości udarów u ludzi. Ponadto model spełnia wyżej wymienione kryteria odtwarzalności i niskiej śmiertelności. W tym filmie demonstrujemy chirurgiczne metody indukcji udaru mózgu w "modelu krzepnięcia" oraz przedstawiamy narzędzia do analizy histologicznej i funkcjonalnej.

Ze względu na krótki czas znieczulenia i umiarkowany stopień uszkodzenia mózgu, około 10 min po przeniesieniu do klatek wszystkie zwierzęta były przytomne, poruszały się swobodnie i wchodziły w interakcje z towarzyszami z jednej grupy. Śmiertelność podczas operacji MCAO wynosiła poniżej 5%, głównie w wyniku przypadkowego krwawienia podpajęczynówkowego lub nieprawidłowego znieczulenia. Śmiertelność w ciągu 7-dniowego okresu obserwacji po indukcji udaru występuje bardzo rzadko, u około 1-2% zwierząt. W serii operacyjnej 10 zwierząt do niniejszego raportu wszystkie osobniki przeżyły operację oraz 7-dniowy okres obserwacji, a żadne z nich nie musiało zostać wykluczone ze względu na kryteria wyłączenia.
Deficyty behawioralne po koagulacji MCA oceniono za pomocą testu cylindra13, analizując asymetrię w wykorzystaniu przednich łap. W teście tym stosunek niezależnego użycia lewej i prawej przedniej łapy mierzono w określonych punktach czasowych po indukcji udaru i porównywano z wartościami wyjściowymi uzyskanymi 24 h przed MCAO (Ryc. 3B). U zwierząt zaobserwowano istotną zmianę asymetrii w użyciu kończyn podczas wspólnej eksploracji ścian w teście cylindra 24 h (1,72 ± 0,326; p &lt; 0,05) oraz 3 dni (1,36 ± 0,17; p &lt; 0,05) po MCAO. Mimo że stosunek ten uległ poprawie w ciągu tygodnia obserwacji, asymetria motoryczna była nadal istotna 7 dni po MCAO (1,35 ± 0,29; p &lt; 0,05) w porównaniu z wartościami wyjściowymi.
Wykonano wolumetrię obszaru zawału przy użyciu seryjnych coronalnych przekrojów mózgu barwionych fioletem krezylowym 7 dni po indukcji udaru (Rysunek 4B). Średnia objętość zawału wynosiła 15,4 mm3, co stanowiło 12% jednej półkuli mózgu (Rysunek 4C). Zmienność tego modelu udaru jest wyjątkowo niska, z odchyleniem standardowym wynoszącym około 10%. Obszar uszkodzenia obejmuje korę somatosensoryczną i motoryczną, przy jedynie niewielkim zajęciu struktur podkorowych. Ponadto lokalizacja obszaru zawału jest wysoce przewidywalna, z minimalną zmiennością, co przedstawiono na schematycznym diagramie rozmieszczenia (Rysunek 4D).
<img alt="Schemat koła Willisa z opisanymi tętnicami, z zaznaczeniem miejsca zamknięcia MCA, krążenie mózgowe." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie koła Willisa. Tętniczy krąg Willisa jest utworzony przez tętnice mózgu środkowe (MCA) i tętnice mózgu przednie (ACA), które odgałęziają się od tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), a także przez tętnice mózgu tylne (PCA) i tętnice łączące tylne (PComA). MCA biegnie w stronę bruzdy bocznej, gdzie rozgałęzia się na korę mózgową. Dominująca gałąź MCA, zaopatrująca główną część kory ruchowej i część kory somatosensorycznej, jest trwale zamknięta w zaprezentowanym modelu (AcomA = tętnica łącząca przednia; BA = tętnica podstawna; SuCA = górna tętnica móżdżkowa).
<img alt="Układ do iniekcji w mózg myszy; schemat rozmieszczenia włókna optycznego i konfiguracji eksperymentalnej." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig2highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Widok przezczaszkowy po usunięciu mięśnia skroniowego i schematyczna prezentacja okluzji MCA. (A) Po usunięciu mięśnia skroniowego tętnice korowe są widoczne przez częściowo półprzezroczystą czaszkę myszy (u myszy w wieku 8–12 tygodni). Dominującą gałąź MCA można zidentyfikować w przedniej części widoku skroniowego, a także kolejne tętnice korowe odgałęziające się od MCA oraz PCA w części tylnej. (B) Schematyczny widok na dominującą gałąź MCA w jej najczęstszym wariancie z rozwidleniem na bocznej korze skroniowej po wywierceniu otworu trepanacyjnego i usunięciu fragmentu czaszki. (C) Czarne kwadraty reprezentują miejsca koagulacji MCA po stronie proksymalnej i dystalnej rozwidlenia.
<img alt="Analiza zachowania myszy; wykres stosunku wykorzystania przednich kończyn; eksperyment dotyczący wzorców lokomocji i powrotu do sprawności." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza deficytów behawioralnych. (A) Układ testu cylindra: mysz jest umieszczana w pionowym cylindrze, a za nim ustawia się lustra w celu rejestracji wszystkich ruchów za pomocą kamery wideo. (B) Asymetrię wykorzystania przednich kończyn analizowano za pomocą testu cylindra. Stosunki lewej/prawej kończyny w zakresie niezależnego wykorzystania przednich kończyn obliczano 24 hr przed MCAO oraz w indicated punktach czasowych po indukcji udaru. N = 10, *p &lt; 0.05 pomiędzy wskazanym punktem czasowym a wartością bazową (kontrolną).
<img alt="Analiza zawału mózgu myszy; przekroje MRI, wykres objętości zawału, schemat obszarów zawału." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wolumetryczna analiza zawału i wynik zawału po dystalnej MCAO. (A) Reprezentatywny obraz koronalnego przekroju mózgu barwionego fioletem krezylowym 7 dni po MCAO. Żółta linia wskazuje wybór kory przeciwległej (prawej), a czerwona linia wybiera niezawałowaną (zabarwioną) korę mózgu jednostronnej. Blady obszar w lewej półkuli przedstawia obszar tkanki zawałowej. (B) Analiza objętości zawału w 10 mózgach (każda kropka reprezentuje jeden osobniczy mózg) 24 h, 3 dni i 7 dni po dystalnej koagulacji MCA. Pozioma czerwona linia reprezentuje średnią, słupki błędów wskazują odchylenie standardowe. (C) Reprezentatywne koronalne przekroje mózgu barwione fioletem krezylowym co 400 µm w 7. dniu po koagulacji MCA. (D) Schematyczny rozkład zawałowej tkanki mózgowej 7 dni po MCAO. Każdy slajd przedstawia skumulowane informacje o rozkładzie zawału (zakodowane kolorystycznie zgodnie z oznaczeniem) w danym przekroju w odniesieniu do bregma (obraz zmodyfikowany z: Liesz A et al., Brain, 2011; za zgodą Oxford University Press). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51729/51729fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Różne mysie modele zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) są szeroko stosowane w eksperymentalnych badaniach mózgu. W tym miejscu demonstrujemy model przezczaszkowego stałego dystalnego MCAO, który powoduje konsekwentny zawał kory mózgowej o wielkości odpowiadającej uszkodzeniom spowodowanym przez większość udarów niedokrwiennych u ludzi.

Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Stroke is the third most common cause of death and a main cause of acquired adult disability in developed countries. Only very limited therapeutical ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest trwałe zamknięcie dystalnego odcinka tętnicy środkowej mózgu u myszy w celu wywołania zawału obejmującego głównie korę mózgową, którego wielkość jest proporcjonalnie zbliżona do udarów u ludzi. Realizuje się to poprzez wstępną ocenę bazowej asymetrii w użytkowaniu kończyn przed operacją. Kolejnym krokiem procedury jest przeprowadzenie operacji indukcji udaru poprzez elektrokoagulację dystalnego odcinka tętnicy środkowej mózgu.Po operacji testuje się ogniskowe deficyty sensoryczno-motoryczne poprzez ocenę asymetrii wykorzystania czterech kończyn. Ostatnim krokiem jest analiza objętości zawału przy użyciu barwienia fioletem krystalicznym. W rezultacie powstające uszkodzenia kory mają umiarkowaną wielkość i niewielką zmienność, co czyni tę technikę wartościowym modelem dla podstawowych i translacyjnych badań nad udarem.Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z innymi powszechnymi modelami udaru są minimalny wskaźnik śmiertelności oraz precyzyjna objętość i lokalizacja obszaru zawału. Neokora stanowi obszar większości udarów u ludzi, a model ten charakteryzuje się wysoką powtarzalnością. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają początkowo trudności z delikatnym usunięciem czaszki w celu zminimalizowania uszkodzeń mechanicznych.Po drugie, prawidłowa identyfikacja i odpowiednia korelacja dystalnej tętnicy środkowej mózgu są kluczowe dla tego modelu. Najpierw, na 30 minut przed rozpoczęciem operacji, podaj leki przeciwbólowe. Włącz koc grzewczy dla myszy i ustaw go na 37 °C na czas operacji.Następnie należy upewnić się, że gaz anestetyczny składający się z 70% nitrogen, 30% oxygen oraz isofluranu jest gotowy. Potem należy poddać mysz działaniu 4% isofluranu w komorze indukcyjnej do momentu ustania ruchów. Następnie należy umieścić mysz na podkładce grzewczej i podawać isofluran w stężeniu 4% przez kolejną minutę.Po minucie zmień szybkość podawania izofluranu na 1,5%. Teraz, upewnij się za pomocą ucisku palca u stopy, że mysz jest odpowiednio znieczulona, a następnie nanieś etanol na oczy za pomocą nożyczek. Rozpocznij operację, wykonując nacięcie o długości jednego centymetra pomiędzy uchem a okiem. Oddziel skórę i zlokalizuj mięsień skroniowy.Następnie w generatorze wysokiej częstotliwości ustaw funkcję na koagulację, tryb na bipolarny, moc na 12 W i podłącz kleszczyki. Do przygotowanego preparatu dodaj kroplę soli fizjologicznej na odsłonięty mięsień skroniowy. Następnie za pomocą kleszczyków do elektrokoagulacji oddziel mięsień skroniowy od czaszki w jego częściach szczytowej i dystalnej.Wynikiem jest poluzowana płat mięśniowy. Teraz zidentyfikuj tętnicę środkową mózgu lub MCA pod przezroczystą czaszką. Znajduje się ona w przedniej części obszaru skroniowego, grzbietowo względem zatoki zaocznej.Za pomocą wiertła należy cieńszyć kość bezpośrednio nad tą tętnicą, aż stanie się ona prześwitująca. Podczas wiercenia należy utrzymywać czaszkę w stanie wilgotnym, używając soli fizjologicznej. Następnie, używając bardzo precyzyjnej pincety, należy ostrożnie usunąć kość, aby odsłonić odgałęzienie MCA.Ustaw generator wysokiej częstotliwości na siedem watów. Następnie koaguluj tętnicę za pomocą kleszczyków do elektrokoagulacji, delikatnie ją dotykając, bez chwytania. Koaguluj tętnicę zarówno proksymalnie, jak i dystalnie względem rozwidlenia; w przypadku wariacji anatomicznej bez rozwidlenia MCA, koaguluj tętnicę jak najbliżej proksymalnie w dwóch miejscach, w odstępie około jednego milimetra po przeprowadzeniu koagulacji.Odczekać 30 sekund, a następnie delikatnie dotknąć tętnicy za pomocą tępych pęsety. Następnie przesunąć mięsień z powrotem na pozycję zakrywającą otwór trepanacyjny. Zaszyć ranę i umieścić zwierzę w inkubatorze w temperaturze 32 stopni Celsius, aby mogło dojść do siebie po znieczuleniu, a następnie zwrócić je do klatki.Zazwyczaj powrót zwierzęcia do pełnej świadomości po znieczuleniu trwa od 5 do 10 minut. Test cylindra służy do sprawdzenia, czy zwierzę preferuje jedną kończynę nad drugą. Umieść zwierzę w przezroczystym cylindrze z akrylowego szkła, flankowanym przez dwa lustra ustawione pod kątem prostym.Nagraj zwierzę przez pięć minut, ustawiając kamerę naprzeciwko wierzchołka dwóch luster po przeciwnej stronie cylindra. Po każdej próbie przemyj cylinder i blat stołu 60% etanolem. Następnie przeprowadź analizę klatka po klatce.Wynik testu ocenia się poprzez zliczanie kontaktów jednej kończyny przedniej z cylindrem podczas pełnego wspięcia się na tylne łapy, a także poprzez zliczanie lądowań na jednej kończynie przedniej. Po ocenie pełnego wspięcia, co najmniej 20 kontaktów jednej kończyny przedniej na każdą próbę, wykonać krio-sekcje mózgu w serię przekrojów o grubości 20 µm w odstępach 400 µm. Przekroje zebrać na szkiełkach i przechowywać w temperaturze -20 °C.Stosując ten protokół sekcjonowania, wszystkie przekroje obejmujące obszar zawału z jednego mózgu można umieścić na jednym szkiełku przedmiotowym. Przekroje należy zabarwić zgodnie ze standardowym protokołem barwienia fioletem krystalicznym, aby wyznaczyć obszar zawału tkanki w każdym przekroju mózgu. Następnie szkiełka można zamontować, zeskanować i przeanalizować przy użyciu metody Swansona w celu oceny obrzęku.Korekcyjna śmiertelność wynikająca z zabiegu okluzji MCA wyniosła mniej niż 5% i była spowodowana głównie krwotokami podpajęczynówkowymi lub błędami w znieczuleniu. W trakcie badania nie odnotowano zgonów. W analizie dotyczącej zastosowania PA asymetrię mierzono za pomocą testu cylindra po indukcji udaru i porównano z wartościami bazowymi uzyskanymi przed okluzją MCA; w 24. godzinie stwierdzono znaczną asymetrię kończyn, która częściowo ustąpiła w ciągu pierwszego tygodnia po udarze, tydzień po udarze.Indukcja zawału z barwieniem fioletem krystalicznym wykazała średnią objętość zawału na poziomie 15,4 mm³, co stanowi około 12% jednej półkuli mózgu. Odchylenie standardowe w tym modelu jest bardzo niskie. Ponadto lokalizacja zawału charakteryzowała się minimalną zmiennością.Po przygotowaniu operacja ta może zostać ukończona w ciągu 10 minut, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Oprócz zademonstrowanych testów cylindra oraz barwienia fioletem krystalicznym, do dalszej charakterystyki wyników i odpowiedzi na konkretne pytania badawcze można wykorzystać inne uznane testy behawioralne i metody histologiczne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić trwałe zamknięcie dystalnego odcinka MCA u myszy.Zdecydowanie zalecamy stosowanie standardowych procedur operacyjnych oraz szczegółowej dokumentacji w celu zapewnienia powtarzalności metody.

modeling-stroke-mice-permanent-coagulation-distal-middle-cerebral

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modelowanie udaru u myszy: trwałe skrzepliny w odcinku końcowym tętnicy mózgowej środkowej

Włóknista okluzja tętnicy środkowej mózgu jest powszechnie stosowanym modelem badania udaru niedokrwiennego u myszy.

Modelowanie udaru u myszy – zator tętnicy środkowej mózgu z wykorzystaniem modelu filamentowego

W materiale wideo demonstrujemy metodę wywołania zatoru w środkowej tętnicy mózgowej u dorosłych myszy z wykorzystaniem wewnątrzluminalnego monofilamentu. Pokazujemy również, jak oceniać zakres zawału mózgu za pomocą barwienia chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolu (TTC).

Myszy model udaru niedokrwiennego wywołanego zamknięciem tętnicy środkowej mózgu

Model intraluminalnego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) jest najczęściej stosowanym modelem wśród eksperymentalnych modeli udaru niedokrwiennego. W niniejszym materiale szczegółowo zaprezentujemy cały model z wykorzystaniem laserowej flowmetrii dopplerowskiej oraz przedstawimy reprezentatywne wyniki.

Model wewnątrznaczyniowego zamknięcia tętnicy środkowej mózgu (MCAO) w udarze niedokrwiennym u myszy z prowadzeniem za pomocą laserowej dopplerometrii przepływu

Podwiązanie tętnicy środkowej mózgu (MCA) jest techniką służącą do badania ogniskowego niedokrwienia mózgu w modelach zwierzęcych. W tej metodzie tętnica środkowa mózgu zostaje odsłonięta poprzez kraniotomię, a następnie podwiązana za pomocą kauteryzacji. Metoda ta zapewnia wysoką powtarzalność objętości zawału oraz zwiększoną przeżywalność pooperacyjną w porównaniu z innymi dostępnymi metodami.

Zastosowanie trwałego podwiązania środkowej tętnicy mózgowej u myszy

Wewnątrzświateł okluzja włókien środkowej tętnicy mózgowej jest najczęściej używanym modelem in vivo eksperymentalnego udaru mózgu u gryzoni. Wykonuje się tutaj alternatywne podejście chirurgiczne umożliwiające naprawę tętnicy szyjnej wspólnej, które umożliwia reperfuzję tętnicy szyjnej wspólnej i pełną reperfuzję do obszaru tętnicy środkowej mózgu.

Niedrożność tętnicy środkowej mózgu umożliwiająca reperfuzję poprzez wspólną naprawę tętnicy szyjnej u myszy

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Tutaj opisany jest model udaru fotozakrzepowego, w którym udar jest wytwarzany przez nienaruszoną czaszkę poprzez wywołanie trwałej okluzji mikronaczyniowej za pomocą oświetlenia laserowego po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru u myszy: ogniskowe zmiany korowe spowodowane fotozakrzepicą

Różne modele niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAo) są używane w eksperymentalnych badaniach nad udarem. W tym miejscu opisano eksperymentalny model udaru przejściowego MCAo przez tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA), który ma na celu naśladowanie udaru u człowieka, w którym skrzeplina naczyniowo-mózgowa jest usuwana w wyniku spontanicznej lizy skrzepu lub terapii.

Modelowanie udaru u myszy: przejściowe zamknięcie tętnicy środkowej mózgu przez tętnicę szyjną zewnętrzną

Ten protokół demonstruje unikalny model udaru myszy ze średniej wielkości zawałem i doskonałym wskaźnikiem przeżycia. Model ten pozwala przedklinicznym badaczom zajmującym się udarem mózgu wydłużyć czas trwania niedokrwienia, wykorzystać starzejące się myszy i ocenić długoterminowe wyniki funkcjonalne.

Zmodyfikowany przezczaszkowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu do badania wyników udaru u starszych myszy

Ten protokół opisuje model przejściowego ogniskowego niedokrwienia mózgu u myszy poprzez śródświetlne zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej. Dodatkowo przedstawiono przykłady oceny wyników z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego i testów behawioralnych.

Przejściowy model niedrożności tętnicy środkowej mózgu

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia modelu dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) poprzez przezczaszkową elektrokoagulację u myszy C57BL/6J i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych.

Indukcja ostrego udaru niedokrwiennego u myszy przy użyciu techniki niedrożności dystalnej tętnicy środkowej

Poznaj metodę trwałej okluzji dalszej tętnicy środkowej mózgu u myszy za pomocą elektrokoagulacji. Model ten umożliwia badanie udaru niedokrwiennego z niską śmiertelnością i wysoką powtarzalnością wyników.

Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Przeglądaj więcej filmów