Modelowanie udaru u myszy: trwała koagulacja dalszej tętnicy środkowej mózgu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest trwałe zamknięcie dystalnego odcinka tętnicy środkowej mózgu u myszy w celu wywołania zawału obejmującego głównie korę mózgową, którego wielkość jest proporcjonalnie zbliżona do udarów u ludzi. Realizuje się to poprzez wstępną ocenę bazowej asymetrii w użytkowaniu kończyn przed operacją. Kolejnym krokiem procedury jest przeprowadzenie operacji indukcji udaru poprzez elektrokoagulację dystalnego odcinka tętnicy środkowej mózgu.

Po operacji testuje się ogniskowe deficyty sensoryczno-motoryczne poprzez ocenę asymetrii wykorzystania czterech kończyn. Ostatnim krokiem jest analiza objętości zawału przy użyciu barwienia fioletem krystalicznym. W rezultacie powstające uszkodzenia kory mają umiarkowaną wielkość i niewielką zmienność, co czyni tę technikę wartościowym modelem dla podstawowych i translacyjnych badań nad udarem.

Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z innymi powszechnymi modelami udaru są minimalny wskaźnik śmiertelności oraz precyzyjna objętość i lokalizacja obszaru zawału. Neokora stanowi obszar większości udarów u ludzi, a model ten charakteryzuje się wysoką powtarzalnością. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają początkowo trudności z delikatnym usunięciem czaszki w celu zminimalizowania uszkodzeń mechanicznych.

Po drugie, prawidłowa identyfikacja i odpowiednia korelacja dystalnej tętnicy środkowej mózgu są kluczowe dla tego modelu. Najpierw, na 30 minut przed rozpoczęciem operacji, podaj leki przeciwbólowe. Włącz koc grzewczy dla myszy i ustaw go na 37 °C na czas operacji.

Następnie należy upewnić się, że gaz anestetyczny składający się z 70% nitrogen, 30% oxygen oraz isofluranu jest gotowy. Potem należy poddać mysz działaniu 4% isofluranu w komorze indukcyjnej do momentu ustania ruchów. Następnie należy umieścić mysz na podkładce grzewczej i podawać isofluran w stężeniu 4% przez kolejną minutę.

Po minucie zmień szybkość podawania izofluranu na 1,5%. Teraz, upewnij się za pomocą ucisku palca u stopy, że mysz jest odpowiednio znieczulona, a następnie nanieś etanol na oczy za pomocą nożyczek. Rozpocznij operację, wykonując nacięcie o długości jednego centymetra pomiędzy uchem a okiem. Oddziel skórę i zlokalizuj mięsień skroniowy.

Następnie w generatorze wysokiej częstotliwości ustaw funkcję na koagulację, tryb na bipolarny, moc na 12 W i podłącz kleszczyki. Do przygotowanego preparatu dodaj kroplę soli fizjologicznej na odsłonięty mięsień skroniowy. Następnie za pomocą kleszczyków do elektrokoagulacji oddziel mięsień skroniowy od czaszki w jego częściach szczytowej i dystalnej.

Wynikiem jest poluzowana płat mięśniowy. Teraz zidentyfikuj tętnicę środkową mózgu lub MCA pod przezroczystą czaszką. Znajduje się ona w przedniej części obszaru skroniowego, grzbietowo względem zatoki zaocznej.

Za pomocą wiertła należy cieńszyć kość bezpośrednio nad tą tętnicą, aż stanie się ona prześwitująca. Podczas wiercenia należy utrzymywać czaszkę w stanie wilgotnym, używając soli fizjologicznej. Następnie, używając bardzo precyzyjnej pincety, należy ostrożnie usunąć kość, aby odsłonić odgałęzienie MCA.

Ustaw generator wysokiej częstotliwości na siedem watów. Następnie koaguluj tętnicę za pomocą kleszczyków do elektrokoagulacji, delikatnie ją dotykając, bez chwytania. Koaguluj tętnicę zarówno proksymalnie, jak i dystalnie względem rozwidlenia; w przypadku wariacji anatomicznej bez rozwidlenia MCA, koaguluj tętnicę jak najbliżej proksymalnie w dwóch miejscach, w odstępie około jednego milimetra po przeprowadzeniu koagulacji.

Odczekać 30 sekund, a następnie delikatnie dotknąć tętnicy za pomocą tępych pęsety. Następnie przesunąć mięsień z powrotem na pozycję zakrywającą otwór trepanacyjny. Zaszyć ranę i umieścić zwierzę w inkubatorze w temperaturze 32 stopni Celsius, aby mogło dojść do siebie po znieczuleniu, a następnie zwrócić je do klatki.

Zazwyczaj powrót zwierzęcia do pełnej świadomości po znieczuleniu trwa od 5 do 10 minut. Test cylindra służy do sprawdzenia, czy zwierzę preferuje jedną kończynę nad drugą. Umieść zwierzę w przezroczystym cylindrze z akrylowego szkła, flankowanym przez dwa lustra ustawione pod kątem prostym.

Nagraj zwierzę przez pięć minut, ustawiając kamerę naprzeciwko wierzchołka dwóch luster po przeciwnej stronie cylindra. Po każdej próbie przemyj cylinder i blat stołu 60% etanolem. Następnie przeprowadź analizę klatka po klatce.

Wynik testu ocenia się poprzez zliczanie kontaktów jednej kończyny przedniej z cylindrem podczas pełnego wspięcia się na tylne łapy, a także poprzez zliczanie lądowań na jednej kończynie przedniej. Po ocenie pełnego wspięcia, co najmniej 20 kontaktów jednej kończyny przedniej na każdą próbę, wykonać krio-sekcje mózgu w serię przekrojów o grubości 20 µm w odstępach 400 µm. Przekroje zebrać na szkiełkach i przechowywać w temperaturze -20 °C.

Stosując ten protokół sekcjonowania, wszystkie przekroje obejmujące obszar zawału z jednego mózgu można umieścić na jednym szkiełku przedmiotowym. Przekroje należy zabarwić zgodnie ze standardowym protokołem barwienia fioletem krystalicznym, aby wyznaczyć obszar zawału tkanki w każdym przekroju mózgu. Następnie szkiełka można zamontować, zeskanować i przeanalizować przy użyciu metody Swansona w celu oceny obrzęku.

Korekcyjna śmiertelność wynikająca z zabiegu okluzji MCA wyniosła mniej niż 5% i była spowodowana głównie krwotokami podpajęczynówkowymi lub błędami w znieczuleniu. W trakcie badania nie odnotowano zgonów. W analizie dotyczącej zastosowania PA asymetrię mierzono za pomocą testu cylindra po indukcji udaru i porównano z wartościami bazowymi uzyskanymi przed okluzją MCA; w 24. godzinie stwierdzono znaczną asymetrię kończyn, która częściowo ustąpiła w ciągu pierwszego tygodnia po udarze, tydzień po udarze.

Indukcja zawału z barwieniem fioletem krystalicznym wykazała średnią objętość zawału na poziomie 15,4 mm³, co stanowi około 12% jednej półkuli mózgu. Odchylenie standardowe w tym modelu jest bardzo niskie. Ponadto lokalizacja zawału charakteryzowała się minimalną zmiennością.

Po przygotowaniu operacja ta może zostać ukończona w ciągu 10 minut, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Oprócz zademonstrowanych testów cylindra oraz barwienia fioletem krystalicznym, do dalszej charakterystyki wyników i odpowiedzi na konkretne pytania badawcze można wykorzystać inne uznane testy behawioralne i metody histologiczne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić trwałe zamknięcie dystalnego odcinka MCA u myszy.

Zdecydowanie zalecamy stosowanie standardowych procedur operacyjnych oraz szczegółowej dokumentacji w celu zapewnienia powtarzalności metody.