Name: Tworzenie ogniska: test komórkowy w celu określenia potencjału onkogennego genu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Poznaj test tworzenia ogniska do oceny potencjału onkogennego genu w komórkach fibroblastów myszy NIH 3T3. Ta metoda wykorzystuje wektory retrowirusowe i barwienie krystaliczną fioletową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z NIH Director's New Innovator Award Program (E.D.). A. A. była częściowo wspierana przez nagrody licencjackie od National Cancer Institute i National Science Foundation.

1. Tworzenie wektorów wirusowych
Sekwencje kodujące dla interesującego genu, jak również kontrole pozytywne i negatywne, są wprowadzane do pBABEpuro za pomocą tradycyjnych metod klonowania (amplifikacja PCR, trawienie restrykcyjne i ligacja). Na wektorze znajdują się cztery miejsca restrykcyjne, w których można wprowadzić DNA: BamHI, SnaBI, EcoRI i SalI.
<ol>
	<li>Przygotuj plazmidowe DNA klasy transfekcyjnej z kompetentnych komórek za pomocą zestawu QIAGEN plasmid midi.</li>
	<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop2000.</li>
</ol>
2. Produkcja retrowirusów
Linia komórkowa Plat-E zostanie wykorzystana do produkcji ekotropowego retrowirusa, który dostarczy interesujące cDNA do komórek NIH 3T3.
<ol>
	<li>Zakładanie kultur Plat-E z zamrożonych komórek
	<ol>
		<li>Szybko rozmrozić komórki Plat-E w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Powoli dodawać 9 ml pożywki Plat-E (Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + 10% Płodowej Surowicy Bydlęcej (FBS) + Penicylina i Streptomycyna).</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 180 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki Plat-E i przenieść do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm.</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu, aż osiągną 80-90% zlewu (około 2 dni).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzielenie komórek
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę i raz przemyć komórki PBS.</li>
		<li>Dodać 2 ml 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Oderwać komórki przez stukanie palcem, dodać 10 ml pożywki Plat-E i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 180 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki Plat-E i wysiać je w nowych szalkach w rozcieńczeniach 1:4-1:6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Siewnik i transfekcja Plat-E
	<ol>
		<li>Wysiew 2 x 106 komórek na 10 cm naczynie hodowlane przy użyciu pożywki Plat-E bez żadnych antybiotyków.</li>
		<li>Inkubować komórki O/N w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Następnego dnia przenieś 300 μl Opti-MEM do 1,5 ml probówki do mikrofuge.</li>
		<li>Dodać 27 μl polietylenininy (PEI), ekonomicznego odczynnika do transfekcji12, do przygotowanej probówki z Opti-MEM. Delikatnie wymieszać, stukając palcem i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 9 μg plazmidowego DNA klasy transfekcyjnej do probówki Opti-MEM/PEI, delikatnie wymieszać przez wirowanie i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodawać kompleks DNA/PEI kroplami do szalki Plat-E i inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Następnego dnia odessać pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji i dodać 10 ml świeżej pożywki Plat-E (bez antybiotyków).</li>
		<li>Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Komórki NIH 3T3 i infekcja
<ol>
	<li>Ustanawianie kultur NIH 3T3 i wysiew
	<ol>
		<li>Szybko rozmrozić komórki NIH 3T3 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Powoli dodawać 9 ml pożywki NIH 3T3 (DMEM + 10% FBS).</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 180 x g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki NIH 3T3 i przenieść do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm.</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Bardzo ważne jest, aby komórki NIH 3T3 były zawsze utrzymywane w niedostatecznym zlewaniu (50-60%), ponieważ częstotliwość spontanicznej transformacji (a tym samym podstawowy poziom tworzenia ognisk) wzrasta, gdy hodowla osiągnie zbieg.</li>
		<li>Wysiewaj 3 x 105 komórek na 10 cm naczynie i inkubuj O/N do infekcji następnego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakażać
	<ol>
		<li>Zbierz retrowirusowy supernatant z szalki Plat-E za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml, przefiltruj go przez nylonowy filtr membranowy o wielkości porów 0,45 μm i przenieś do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 10 ml świeżej pożywki Plat-E do komórek (bez antybiotyków) i umieścić je z powrotem w inkubatorze.</li>
		<li>Odessać pożywkę z naczynia na komórki NIH 3T3, która ma być zakażona, i dodać 5 ml zwykłej pożywki NIH 3T3 i 5 ml przefiltrowanego supernatantu zawierającego wirusa.</li>
		<li>Do naczynia dodać polibren w stężeniu 6 μg/ml.</li>
		<li>Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Następnego dnia powtórz kroki 3.2.1 – 3.2.5 dla drugiej rundy infekcji.</li>
		<li>Zastąp pożywkę zawierającą wirusa zwykłą pożywką NIH 3T3.</li>
		<li>Pozwól komórkom NIH 3T3 rosnąć przez 2-3 tygodnie, w razie potrzeby wymieniając pożywkę. Sprawdź ekspresję interesującego białka za pomocą konwencjonalnej elektroforezy białek i immunoblot na lizatach całych komórek z płytek replik</li>.
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Barwienie kryształowym fioletem
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę NIH 3T3 i umieścić naczynia na lodzie.</li>
		<li>Umyj naczynia dwukrotnie lodowatym PBS.</li>
		<li>Namocuj komórki lodowatym metanolem przez 10 minut.</li>
		<li>Wyjmij naczynia z lodu, odessaj metanol i dodaj 3 ml 0,5% roztworu fioletu krystalicznego wykonanego z 25% metanolu (RT).</li>
		<li>Inkubuj naczynia przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać roztwór fioletu krystalicznego i ostrożnie wypłukać naczynie preparatem Milli-QH2O, aż z płukanki nie zniknie żaden kolor.</li>
		<li>Pozostaw naczynia do wyschnięcia O/N na blacie (bez przykrycia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja ognisk
	<ol>
		<li>Gdy naczynia wyschną, użyj linijki, aby zmierzyć ciemne zbiory komórek na talerzu. Licz tylko te, które mają średnicę większą niż 5 mm jako "ogniska". Zapisz liczbę ognisk i oblicz średnie oraz istotność w porównaniu z kontrolami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Clark, G. J., Cox, A. D., Graham, S. M., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+assays+for+Ras+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Biological assays for Ras transformation.</a> Methods in enzymology. , 255-395 (1995).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+biology+%3A+a+laboratory+handbook%22">Cell biology : a laboratory handbook</a>. , 3rd edn, Elsevier Academic. 345-352 (2006).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+transformation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Neoplastic transformation assays.</a> Methods in molecular biology. 165, 151-164 (2001).</li>
<li>Johnson, P. J., Coussens, P. M., Danko, A. V., Shalloway, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpressed+pp60c-src+can+induce+focus+formation+without+complete+transformation+of+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Overexpressed pp60c-src can induce focus formation without complete transformation of NIH 3T3 cells.</a> Molecular and cellular biology. 5, 1073-1083 (1985).</li>
<li>Bonner, T. I., Kerby, S. B., Sutrave, P., Gunnell, M. A., Mark, G., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+biological+activity+of+human+homologs+of+the+raf%2Fmil+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22IMolecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Structure and biological activity of human homologs of the raf/mil oncogene.</a> IMolecular and cellular biology. 5, 71400-71407 (1985).</li>
<li>Yancopoulos, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-myc+can+cooperate+with+ras+to+transform+normal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">N-myc can cooperate with ras to transform normal cells in culture.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 5455-5459 (1985).</li>
<li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+activity+of+purinergic+receptor+P2Y%2C+G+protein+coupled%2C+8+revealed+by+retroviral+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+lymphoma%22%5BJournal%5D)">Transforming activity of purinergic receptor P2Y, G protein coupled, 8 revealed by retroviral expression screening.</a> Leukemia & lymphoma. 48, 978-986 (2007).</li>
<li>Morita, S., Kojima, T., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plat-E%3A+an+efficient+and+stable+system+for+transient+packaging+of+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses.</a> Gene. 7, 1063-1066 (2000).</li>
<li>Morgenstern, J. P., Land, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+mammalian+gene+transfer%3A+high+titre+retroviral+vectors+with+multiple+drug+selection+markers+and+a+complementary+helper-free+packaging+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Advanced mammalian gene transfer: high titre retroviral vectors with multiple drug selection markers and a complementary helper-free packaging cell line.</a> Nucleic acids research. 18, 3587-3596 (1990).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Klaver, B., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+5%27+and+3%27+long+terminal+repeat+promoter+function+in+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Comparison of 5' and 3' long terminal repeat promoter function in human immunodeficiency virus.</a> Journal of virology. 68, 3830-3840 (1994).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+gene+transfection+by+DNA+compaction+at+pH+4.0+using+acidified%2C+long+shelf-life+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine.</a> Cytotechnology. 62, 73-82 (2010).</li>
<li>Fox, E. J., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-phase-specific+expression+of+the+Mad3+gene+in+proliferating+and+differentiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">S-phase-specific expression of the Mad3 gene in proliferating and differentiating cells.</a> The Biochemical journal. 359, 361-367 (2001).</li>
<li>Yun, J. S., Rust, J. M., Ishimaru, T., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+of+the+Mad+family+member+Mad3+in+cerebellar+granule+neuron+precursor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">A novel role of the Mad family member Mad3 in cerebellar granule neuron precursor proliferation.</a> Molecular and cellular biology. 27, 8178-8189 (2007).</li>
<li>Gore, Y., Lantner, F., Hart, G., Shachar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad3+negatively+regulates+B+cell+differentiation+in+the+spleen+by+inducing+Id2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Mad3 negatively regulates B cell differentiation in the spleen by inducing Id2 expression.</a> Molecular biology of the cell. 21, 1864-1871 (2010).</li>
<li>Barisone, G. A., Yun, J. S., Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cerebellar+proliferation+to+tumorigenesis%3A+new+insights+into+the+role+of+Mad3%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">From cerebellar proliferation to tumorigenesis: new insights into the role of Mad3.</a> Cell cycle. 7, 423-427 (2008).</li>
<li>Barisone, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MXD3+in+proliferation+of+DAOY+human+medulloblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Role of MXD3 in proliferation of DAOY human medulloblastoma cells.</a> PloS One. 7, e38508(2012).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112, 193-205 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

FFA zapewnia szybką i łatwą metodę oceny przemiany złośliwej in vitro. Jest podatny na badania przesiewowe stosunkowo dużej liczby genów kandydujących, a jego skromne wymagania techniczne sprawiają, że jest opłacalny. Co więcej, dwa lub więcej genów może być współeksprymowanych (czasami określanych jako test "współpracy") w celu oceny potencjału rakotwórczego kombinacji. Zalety tego testu polegają na jego prostej technice, łatwości oznaczania ilościowego i stosunkowo krótkim czasie realizacji. Należy jednak podk...

Komórki nowotworowe można odróżnić od swoich normalnych odpowiedników za pomocą szerokiego zakresu zmian, od wzorców ekspresji genów, przez epigenomikę, po zmiany morfologiczne i proliferacyjne. Wśród tych ostatnich, zmniejszona zależność od surowicy, zahamowanie utraty kontaktu (gęstości), nabycie proliferacji niezależnej od zakotwiczenia i ostatecznie zdolność do tworzenia guzów po wstrzyknięciu zwierzętom są przydatnymi, mierzalnymi wskaźnikami transformacji złośliwej3. Opracowano kilka testów in vitro i in vivo do transformacji komórkowej. Testy in vitro mają na celu identyfikację i pomiar zmian w morfologii kultur (test tworzenia ognisk), dynamice hodowli (szybkość wzrostu, gęstość nasycenia) i wymaganiach dotyczących czynnika wzrostu (wzrost w zmniejszonej surowicy) lub zakotwiczenia (wzrost w miękkim agarze). Złotym standardem w określaniu złośliwej natury typu komórki pozostaje tworzenie nowotworów (ksenoprzeszczepy) u zwierząt doświadczalnych. Jednak koszt i czas trwania badań in vivo nie zawsze sprawiają, że są one uzasadnione jako pierwszy etap walidacji lub badania przesiewowego potencjalnych onkogenów. Chociaż żaden test in vitro nie zapewnia ostatecznej oceny potencjału onkogennego genu, dostarcza on wglądu w potencjał onkogenny, który może zawęzić przyszłe badania in vivo. Jednym z najczęściej stosowanych systemów oceny potencjału onkogennego in vitro jest Focus Formation Assay2. Podejście to opiera się na wykorzystaniu mysiego fibroblastu NIH 3T3, nieprzekształconej linii komórkowej, która wykazuje silne hamowanie kontaktowe. Nadekspresja onkogenu powoduje utratę wzrostu zależnego od gęstości; Przekształcone komórki mogą następnie rosnąć w wielu warstwach, tworząc "ogniska", które można łatwo zwizualizować na tle monowarstwy nieprzekształconych komórek. Test tworzenia ostrości mierzy zatem zdolność kandydującego onkogenu do indukowania złośliwej transformacji, czego dowodem jest utrata hamowania kontaktu jako mierzalny fenotyp. FFA został wykorzystany do oceny transformacji przez nadekspresję m.in. kinaz białkowych (np. Src4, BRAF5), czynników transkrypcyjnych (np. N-myc6), receptorów sprzężonych z białkiem G (np. P2RY87) i GTPaz (np. Ras1). Względna łatwość tego testu sprawia, że jest to dobry wybór, który zapewni szybką i wizualnie jasną odpowiedź na pytanie, czy nadekspresja genu jest wystarczająca do transformacji mysich komórek fibroblastów NIH 3T3 in vitro.
FFA opisany w tym protokole wykorzystuje linię komórkową8 Plat-E, która dostarcza białka do pakowania wirusów, oraz wektor retrowirusowy pBABEpuro9 (plazmid Addgene 1764) do produkcji retrowirusa. Po transfekcji konstruktem pBABEpuro zawierającym interesujący gen, linia komórkowa Plat-E wytworzy ekotropowego retrowirusa, który może być wykorzystany do zakażenia komórek NIH 3T3. Ta wirusowa metoda dostarczania genów jest bardziej wydajna niż tradycyjne metody transfekcji chemicznej i oferuje sposób na trwałą ekspresję genu10. Po włączeniu do genomu komórek NIH 3T3 nadekspresja interesującego genu jest napędzana przez promotor wirusowych długich powtórzeń końcowych (LTR)11. To stałe wyrażenie można wykorzystać do określenia, czy gen będący przedmiotem zainteresowania ma aktywność onkogenną, mierzoną tworzeniem ognisk, na komórkach NIH 3T3.

<table><tbody><tr><td>pBABE-puro wektor</td><td>Addgene</td><td>Plasmid 1764</td><td>wektor klonowania</td></tr><tr><td>Platinum-E Retroviral Packaging Cell Line, Ecotropic</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td>Linia komórkowa <td>RV-101</td><td>do produkcji wirusów</td></tr><tr><td>Linia komórkowa NIH 3T3 mysia</td> linia komórkowa <td>Sigma-Aldrich</td><td>93061524</td><td>do testu tworzenia ognisk</td></tr><tr><td>10 ml strzykawka z końcówką BD Luer-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td>odczynnik do produkcji wirusa</td></tr><tr><td>0,45 i mu; m Filtr strzykawkowy Puradisc Whatman</td><td></td><td>6750-2504</td><td>odczynnik do produkcji wirusów</td></tr><tr><td>Polietyleniminę (PEI)</td> <td>Polysciences, Inc.</td><td>23966-2</td><td>odczynnik do transfekcji komórek</td></tr><tr><td>Odczynnik do infekcji / transfekcji polibrenu</td><td>EMD Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>odczynnik do transfekcji komórek</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Fisher Scientific</td><td>C581-25</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Plus Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12945</td><td>oczyszczanie plazmidu</td></tr><tr><td>BD Falcon Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Materiały do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>dostarcza hodowlę komórkową</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Zredukowana pożywka surowicy</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>Pożywka do hodowli bydła</td></tr><tr><td>płodowego (FBS)</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td> <td>Gibco</td><td>16000-044</td></tr></tbody></table>

tworzenie ogniska: test komórkowy w celu określenia potencjału onkogennego genu

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Złośliwa transformacja komórek zazwyczaj wiąże się ze zwiększoną proliferacją, utratą hamowania kontaktu, nabyciem niezależnego od zakotwiczenia potencjału wzrostu i zdolnością do tworzenia nowotworów u zwierząt doświadczalnych1. W komórkach NIH 3T3 wiadomo, że szlak transdukcji sygnału Ras wyzwala wiele z tych zdarzeń, co jest znane jako transformacja Ras. Wprowadzenie nadekspresji genu w komórkach NIH 3T3 może sprzyjać transformacji morfologicznej i utracie hamowania kontaktu, co może pomóc w określeniu potencjału onkogennego tego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Testem, który zapewnia prostą metodę oceny jednego z aspektów potencjału transformacyjnego onkogenu, jest test formacji ostrości (FFA)2. Kiedy komórki NIH 3T3 dzielą się normalnie w hodowli, robią to, dopóki nie osiągną zlewającej się monowarstwy. Jednak w obecności nadekspresji onkogenu komórki te mogą zacząć rosnąć w gęstych, wielowarstwowych ogniskach1, które można uwidocznić i określić ilościowo za pomocą barwienia fioletem krystalicznym lub Hema 3. W tym artykule opisujemy protokół FFA z transdukcją retrowirusową interesującego genu do komórek NIH 3T3 oraz sposób ilościowego określania liczby ognisk poprzez barwienie. Transdukcja retrowirusowa oferuje bardziej wydajną metodę dostarczania genów niż transfekcja, a zastosowanie ekotropowego mysiego retrowirusa zapewnia kontrolę bezpieczeństwa biologicznego podczas pracy z potencjalnymi ludzkimi onkogenami.

MXD3 jest podstawowym czynnikiem transkrypcyjnym typu helix-loop-helix leucine zipper (bHLHZ), należącym do sieci MYC/MAX/MAD. Jest on atypowym członkiem rodziny MAD13-15 i według doniesień bierze udział w kancerogenezie16,17. W porównaniu z pBABEpuro (kontrola negatywna) oraz MYC (kontrola pozytywna), w naczyniach z komórkami NIH 3T3, w których nadeksprymowano MXD3, stwierdzono znacznie mniejszą liczbę ognisk (Rycina 1A). Dane przedstawione na Rycynie 1B zostały ze...

Test Focus Formation dostarcza prostej metody oceny potencjału transformacyjnego kandydującego onkogenu.

Tworzenie ogniska: test komórkowy w celu określenia potencjału onkogennego genu

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie testu tworzenia ognisk (focus formation assay) w liniach komórek fibroblastów mysich, przy użyciu retrowirusa w celu określenia potencjału onkogennego genu. Osiąga się to poprzez uprzednie sklonowanie sekwencji interesującego genu do wektora retrowirusowego. Drugim krokiem jest wytworzenie cząstek retrowirusowych przy użyciu wektora wirusowego i komórek pakujących PLA e.Następnie retrowirus jest wykorzystywany do zakażenia komórek fibroblastów mysich NIH 3T3 w celu oceny potencjału transformującego badanego genu. W ostatnim kroku pozwala się komórkom NIH 3T3 dzielić przez dwa do trzech tygodni, po czym przeprowadza się barwienie fioletem krystalicznym, aby określić liczbę powstałych ognisk. Ostatecznie test tworzenia ognisk służy do wykazania, czy nadekspresja badanego genu jest wystarczająca do indukowania wzrostu niezależnego od gęstości w komórkach fibroblastów mysich.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii nowotworów, takie jak badanie potencjału onkogennego genu. W pierwszej kolejności należy przygotować wektor wirusowy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie należy przeprowadzić hodowlę komórek plat E z zamrożonych komórek poprzez szybkie rozmrożenie komórek plat E w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, a następnie przeniesienie ich do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.Powoli dodaj 9 ml medium PLA E do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwiruj probówkę z prędkością 180 ×g przez pięć minut, a następnie odlej supernatant. Resuspenduj komórki w 10 ml medium plat E i przenieś je do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm.Następnie inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, aż osiągną konfluencję na poziomie od 80 do 90%. Przeprowadź pasażowanie komórek, najpierw odsysając medium, a następnie płucząc komórki raz PBS-em przed dodaniem 2 mL 0,05% trypsyny EDTA i inkubacją przez jedną minutę w temperaturze pokojowej; odczep komórki, delikatnie opukując dno naczynia palcem. Następnie dodaj 10 mL medium plat E i przelej zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 mL.Odwiruj probówkę w ten sam sposób co wcześniej i resuspenduj komórki w 10 mililitrach medium plat E. Następnie zasiadź 2 miliony komórek na 10 centymetrową płytkę hodowlaną, używając medium plat E bez antybiotyków, i pozostaw komórki do inkubacji na noc. Następnego dnia przenieś 300 mikrolitrów optimum do probówki mikrolitrowej o pojemności 1,5 mililitra.Do przygotowanej probówki z Optum dodać 27 µL polietyleniaminy. Delikatnie wymieszać, opukując probówkę palcem, a następnie inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie do probówki dodać 9 µg plazmidowego DNA klasy do transfekcji, wymieszać delikatnie za pomocą wortexa i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj mieszaninę kroplami do naczynia typu plat E przed inkubacją przez noc. Następnego dnia odessaj medium zawierające odczyn do transfekcji i dodaj 10 mililitrów świeżego medium plat E, a następnie przenieś komórki z powrotem do inkubatora w celu ustanowienia kultur NIH three T three. Najpierw szybko rozmroź komórki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przenieś je do probówki o pojemności 15 mililitrów.Powoli dodaj 9 mL pożywki NIH-3T3 do komórek, odwiruj probówkę przy 180 ×g przez 5 minut i odlej nadsącz. Następnie resuspenderuj komórki w 10 mL pożywki NIH-3T3 i przenieś je do naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, utrzymując je poniżej pełnej konfluencji, ponieważ częstotliwość spontanicznej transformacji wzrasta wraz ze wzrostem gęstości hodowli.Gdy kultura osiągnie odpowiednią gęstość, zasiać 3×10⁵ komórek T3 na płytkę 10 cm i inkubować przez noc przed następną infekcją. Następnego dnia zebrać nadsącz retrowirusowy z płytki za pomocą jednorazowej strzykawki 10 ml, przefiltrować go przez membranowy filtr nylonowy o rozmiarze porów 0,45 µm i przenieść do probówki 15 ml. Przed powrotem do inkubatora dodać do komórek 10 ml świeżej pożywki plat E.Następnie odessać pożywkę z płytki z komórkami NIH 3T3 przeznaczonymi do infekcji i dodać 5 ml standardowej pożywki dla NIH 3T3 oraz 5 ml przefiltrowanego supernatantu zawierającego wirusa. Następnie do płytki dodać polybrene w stężeniu 6 µg/ml.Inkubuj komórki przez noc przed powtórzeniem kroków infekcji w celu przeprowadzenia drugiej rundy zakażania. Po infekcji zastąp medium zawierającym wirusa zwykłym podłożem IH3T3. Pozostaw komórki IH3T3 do wzrostu przez dwa do trzech dni, wymieniając medium w razie potrzeby, przed zabarwieniem fioletem krystalicznym.Odssać pożywkę z komórek NIH 3T3 i umieścić naczynia na lodzie. Przemyć naczynia dwukrotnie lodowatym PBS. Utrwalić komórki lodowatym metanolem przez 10 minut.Następnie wyjmij naczynia z lodu i odessij metanol. Dodaj 3 ml 0,5% roztworu fioletowego krystalicznego przygotowanego w 25% metanolu i inkubuj naczynia przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odessij roztwór fioletowego krystalicznego i ostrożnie płucz naczynie wodą Milli Q, aż do momentu, gdy w wodzie płuczącej nie pojawi się już żadna barwa.Pozostaw naczynia do wyschnięcia bez przykrycia przez noc na blacie. Po wyschnięciu naczyń użyj linijki do pomiaru ognisk i policz te, których średnica przekracza pięć milimetrów, a następnie zapisz wynik. Liczba MXD3 to podstawowy czynnik transkrypcyjny typu helix-loop-helix leucine zipper, który jest nietypowym członkiem rodziny MAD i według doniesień bierze udział w kancerogenezie w porównaniu z kontrolą negatywną oraz kontrolą pozytywną.W naczyniach z komórkami NIH 3T3, w których nadeksprymowano MXD3, zaobserwowano znacznie mniejszą liczbę ognisk. Dane zebrano z wielu eksperymentów w celu określenia istotności statystycznej, a w tym teście zaobserwowano takie same trendy. Wyniki sugerują, że po przeprowadzeniu tej procedury MXD3 nie funkcjonuje jako onkogen.W celu odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące roli badanego genu w patogenezie onkogenezy można przeprowadzić inne metody, takie jak test tworzenia ognisk (focus formation assay) z kombinacjami genów, analizę proliferacji w miękkiej agarozie oraz analizę cyklu komórkowego.

focus-formation-cell-based-assay-to-determine-oncogenic-potential

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Koncentracja formacji: test oparty na komórkach do określenia onkogennego potencjału genu

Ten film opisuje test tworzenia miękkiego kolonii agaru w celu sprawdzenia wpływu inhibitora enzymu PADI i BB-Cl-amidyny na rak piersi in vitro. Test ten umożliwia również ilościową ocenę potencjału transformacji komórek w kontekście zaburzeń genetycznych.

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru: metoda testowania wpływu nowych związków na proliferację komórek rakowych

Ten film opisuje test tworzenia kolonii, który pomaga określić zdolność komórek raka płuc do rozmnażania się w nieskończoność i tworzenia indywidualnych kolonii. Możemy przeanalizować wpływ środka przeciwnowotworowego na komórki tworzące kolonie, analizując zmiany w liczbie i/lub wielkości powstałych kolonii.

Test tworzenia kolonii: ocena skuteczności środków przeciwnowotworowych na komórkach raka płuc tworzących kolonie

Ten film opisuje protokół dla jednostki tworzenia kolonii na bazie metylocelulozy lub testu CFU, który pomaga zidentyfikować i policzyć liczbę kolonii utworzonych przez komórki białaczkowe w odpowiedzi na leczenie związkami przeciwnowotworowymi.

Test CFU na bazie metylocelulozy: metoda określania wpływu związków przeciwnowotworowych na tworzenie kolonii w komórkach białaczkowych

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Test tworzenia miękkiego kolonii agaru jest metodą używaną do potwierdzania wzrostu in vitro niezależnego od zakotwiczenia komórkowego. Celem tego protokołu jest zilustrowanie rygorystycznej metody wykrywania potencjału rakotwórczego transformowanych komórek oraz supresyjnego wpływu białek na transformowane komórki.

Test tworzenia kolonii miękkiego agaru

Identyfikacja nowych celów leków, które przechodzą od testów przedklinicznych do badań na ludziach, jest priorytetem naukowym. W tym celu opisujemy tutaj podejście genomiki funkcjonalnej do badania wpływu wyczerpania genów na sferoidy linii komórek nowotworowych, które bardziej odpowiednio modelują nowotwory u ludzi in vivo.

Wykorzystanie badań przesiewowych genomiki funkcjonalnej do identyfikacji potencjalnie nowych celów leków w hodowlach sferoidalnych komórek nowotworowych

Opracowaliśmy nowy protokół do badania dynamiki populacji heterokomórkowej w odpowiedzi na zakłócenia. Niniejszy manuskrypt opisuje platformę opartą na obrazowaniu, która tworzy ilościowe zestawy danych do jednoczesnej charakterystyki wielu fenotypów komórkowych populacji heterokomórkowych w solidny sposób.

Dyskryminacja i charakterystyka populacji heterokomórkowych z wykorzystaniem technik obrazowania ilościowego

Tutaj opisujemy protokoły genetycznej i chemicznej walidacji c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, używając genetycznych i humanizowanych modeli mysich in vitro i in vivo. Metodę tę można zastosować do dowolnego celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Ten protokół opisuje powtarzalną metodę izolacji komórek pierwotnych mięsaka prążkowanokomórkowego u myszy, tworzenia i leczenia guza oraz przeszczepu allogenicznego, zaczynając od hodowli guzów.

Wyprowadzanie i leczenie guza z pierwotnych komórek nowotworowych wyizolowanych z mięsaków prążkowanokomórkowych myszy

Domeny wewnętrznie nieuporządkowane są ważne dla funkcji czynnika transkrypcyjnego fuzji onkogennej. Aby terapeutycznie ukierunkować te białka, konieczne jest bardziej szczegółowe zrozumienie mechanizmów regulacyjnych stosowanych przez te domeny. Tutaj używamy transkryptomiki do mapowania ważnych cech strukturalnych wewnętrznie nieuporządkowanej domeny EWS w mięsaku Ewinga.

Mapowanie zależności struktura-funkcja zaburzonych onkogennych czynników transkrypcyjnych za pomocą analizy transkryptomicznej

Ten eksperymentalny protokół zapewnia stabilną, opłacalną i efektywną metodę, łączącą knockdown lncRNA z testami tworzącymi kolonie, aby ilościowo określić wpływ lncRNA na proliferację komórek kostniaraka.

Test formowania kolonii wykrywający zdolność proliferacji komórek osteosaraka LncRNA-knockdown

Poznaj test tworzenia ogniska do oceny potencjału onkogennego genu w komórkach fibroblastów myszy NIH 3T3. Ta metoda wykorzystuje wektory retrowirusowe i barwienie krystaliczną fioletową.

Tworzenie ogniska: test komórkowy w celu określenia potencjału onkogennego genu

Przeglądaj więcej filmów