Tworzenie ogniska: test komórkowy w celu określenia potencjału onkogennego genu

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie testu tworzenia ogniska w liniach komórkowych fibroblastów myszy przy użyciu retrowirusa w celu określenia potencjału onkogennego genu. Osiąga się to poprzez najpierw sklonowanie sekwencji interesującego genu do wektora retrowirusowego. Drugim krokiem jest wytworzenie cząstek retrowirusowych przy użyciu wektora wirusowego i komórek pakujących PLA e.

Następnie retrowirus jest używany do infekowania NIH trzech mysich komórek fibroblastów w celu oceny potencjału transformacyjnego interesującego genu. Ostatnim krokiem jest umożliwienie NIH trzem komórkom T trzech podziałów przez dwa do trzech tygodni, a następnie barwienie fioletem krystalicznym w celu ilościowego określenia liczby powstałych ognisk. Ostatecznie test tworzenia ogniska służy do pokazania, czy nadekspresja genu będącego przedmiotem zainteresowania jest wystarczająca do wywołania niezależnego od gęstości wzrostu w komórkach fibroblastów myszy.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii nowotworów, takie jak badania przesiewowe pod kątem potencjału onkogennego genu. Na początek utwórz wektor wirusowy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie utwórz kultury płytki E z zamrożonych komórek, szybko rozmrażając komórki płytki E w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie przenosząc do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Powoli dodaj dziewięć mililitrów pożywki PLA E do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 180 razy G przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 mililitrów pożywki E i przenieść do 10-centymetrowej płytki hodowlanej.

Następnie inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2, aż osiągną poziom zlewania się od 80 do 90%. Wykonaj podział komórek, najpierw zasysając pożywkę, a następnie umyj komórki raz PBS przed dodaniem dwóch mililitrów 0,05% tripsin EDTA i inkubacją przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, odłącz komórki przez stukanie palcem. Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki E i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.

Odwirować probówkę jak poprzednio i ponownie zawiesić komórki za pomocą 10 mililitrów pożywki E Medium. Następny wysiew, 2 miliony komórek na 10-centymetrową naczynię hodowlaną przy użyciu pożywki E bez żadnych antybiotyków i pozostawienie komórek do inkubacji na noc. Następnego dnia przenieś 300 mikrolitrów optimum do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra.

Do przygotowanej probówki z Optum dodać 27 mikrolitrów aminy polietylenowej. Delikatnie wymieszaj, stukając palcem i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj dziewięć mikrogramów plazmidowego DNA klasy transfekcyjnej do probówki, delikatnie mieszając przez wirowanie i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj mieszaninę kroplami do szalki E przed inkubacją przez noc. Następnego dnia odessać pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji i dodać 10 mililitrów świeżej pożywki E przed powrotem komórek do inkubatora w celu ustalenia NIH trzech kultur T, trzech. Najpierw szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przenieść do 15-mililitrowej probówki.

Powoli dodaj dziewięć mililitrów pożywki NIH trzy, T trzy do komórek, odwiruj probówkę przy 180 razy G przez pięć minut i wyrzuć snat. Następnie ponownie zawieś komórki za pomocą 10 mililitrów pożywki NIH trzy, T trzy i przenieś do 10-centymetrowej pożywki hodowlanej. Inkubuj komórki w inkubatorze CO2 o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5%, utrzymując je w stanie konfluencji w miarę wzrostu częstotliwości spontanicznej transformacji.

Gdy kultura osiągnie płynność ko, raz wyhodowane nasiona trzy razy 10 do piątego nih, trzy komórki T trzy na 10-centymetrową szalkę i inkubować przez noc w celu infekcji następnego dnia. Następnego dnia zbierz retrowirusowy supernatant z płytki E za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 10 mililitrów, przefiltruj go przez nylonowy filtr membranowy o wielkości porów 0,45 mikrona i przenieś do 15-mililitrowej probówki. Dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki E do komórek przed powrotem do inkubatora.

Następnie odessać pożywkę z naczynia NIH z trzema trzema T-komórkami, które mają być zakażone, i dodać pięć mililitrów zwykłego NI H trzy, T trzy i pięć mililitrów wirusa zawierającego przefiltrowany supernatant. Następnie dodaj poli brain do potrawy. Dodaj stężenie sześciu mikrogramów na mililitr.

Inkubuj komórki przez noc przed powtórzeniem etapów infekcji w drugiej rundzie infekcji. Po zakażeniu zastąp wirusa, zaspokój pożywkę zwykłą pożywką IH trzy T trzy pożywki. Pozwól trzem komórkom IH T trzy rosnąć przez dwie do trzech, zastępując pożywkę w razie potrzeby do barwienia fioletem krystalicznym

Odessać NIH trzy T trzy podłoża i umieścić naczynia na lodzie. Umyj naczynia dwukrotnie lodowatym PBS. Napraw komórki lodowatym metanolem przez 10 minut.

Następnie wyjmij naczynia z lodu i odessaj metanol. Dodaj trzy mililitry 0,5% roztworu fioletu krystalicznego wykonanego z 25% metanolu i inkubuj naczynia przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji odessać roztwór fioletu krystalicznego i ostrożnie opłukać naczynie wodą Milli Q, aż w płukaniu nie zniknie kolor.

Pozostaw naczynia do wyschnięcia bez przykrycia przez noc na blacie stołu. Gdy naczynia wyschną, użyj linijki, aby zmierzyć ogniska i policz te, które mają średnicę większą niż pięć milimetrów. Liczba MXD trzy jest podstawowym czynnikiem transkrypcyjnym pętli helisy leucyny zamka błyskawicznego, który jest nietypowym członkiem rodziny MAD i doniesiono, że bierze udział w rakotwórczości w porównaniu z kontrolą ujemną i kontrolą pozytywną.

Naczynia NIH trzy T, w których MXD trzy były nadmiernie eksprymowane, miały znacznie mniej ognisk. Dane zebrano z wielu eksperymentów w celu określenia istotności i zaobserwowano te same trendy w tym teście. Wyniki sugerują, że MXD 3 nie działa jako onkogen Po tej procedurze.

Inne metody, takie jak test tworzenia ostrości z kombinacjami genów, wzrost proliferacji miękkiego ślimaka i analiza cyklu komórkowego, można przeprowadzić w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania Aby ocenić rolę interesującego genu w patogenezie onkogenezy.