Name: Serotypowanie torebki Streptococcus pneumoniae metodą aglutynacji lateksowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Naucz się serotypowania Streptococcus pneumoniae metodą aglutynacji lateksowej. Poznaj przygotowanie odczynników, kontrolę jakości i zastosowanie tej techniki w diagnostyce mikrobiologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częścią projektu PneuCarriage, finansowanego przez Fundację Billa i Melindy Gatesów z wkładem Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej Rządu Wiktorii.

1. Przygotowanie własnych odczynników lateksowych
<ol>
	<li>Przygotowanie soli fizjologicznej buforowanej glicyną (GBS)
	<ol>
		<li>Dodać 1,5 g glicyny, 11,7 g chlorku sodu i 100 ml wody destylowanej do szklanej zlewki o pojemności 200 ml.</li>
		<li>Wymieszać do rozpuszczenia za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę do cylindra miarowego o pojemności 500 ml i dodać wodę destylowaną, aby uzyskać w sumie 200 ml.</li>
		<li>Przenieść roztwór z powrotem do zlewki o pojemności 200 ml, sprawdzić pH i dostosować do 8,2 za pomocą 5 M wodorotlenku sodu. UWAGA: Wodorotlenek sodu jest, należy stosować środki ochrony osobistej.</li>
		<li>Filtruj roztwór za pomocą filtrów 0,22 μM i kilku strzykawek o pojemności 60 ml do 250 ml wstępnie autoklawowanej szklanej butelki z nakrętką.</li>
		<li>Sklep w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymywanie GBS z 0,2% albuminą surowicy bydlęcej
	<ol>
		<li>Dodać 0,2 g albuminy surowicy bydlęcej w proszku (BSA) i 100 ml GBS do szklanej zlewki o pojemności 200 ml i wymieszać do rozpuszczenia za pomocą mieszadła magnetycznego.</li>
		<li>Filtr Wysterylizuj roztwór przez filtry 0,22 μM za pomocą kilku strzykawek o pojemności 60 ml do 250 ml wstępnie autoklawowanej, zakręcanej szklanej butelki.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynnika lateksowego
	<ol>
		<li>Oznacz probówkę do mikrofugi z okrągłym dnem o pojemności 2 ml. 
		UWAGA: probówki z okrągłym dnem służą do zminimalizowania osadzania się cząstek, które mogą wpływać na przyczepianie przeciwciał.</li>
		<li>Za pomocą pipety P1000 ze sterylnymi końcówkami dodać 975 μl GBS do probówki do mikrofuge, a następnie dodać 25 μl odpowiedniej surowicy przeciw pneumokokom dla przygotowywanego odczynnika lateksowego (tj. puli, grupy, typu lub czynnika). Odwróć pięć razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Rozcieńczyć cząstki lateksu polistyrenowego w stosunku 1:10, dodając 120 μl cząstek lateksu do 1 080 μl sterylnego soli fizjologicznej. 
		UWAGA: Można to zrobić w większych ilościach, ale powinno być świeże za każdym razem, gdy produkowane są odczynniki lateksowe.</li>
		<li>Dodać 1 000 μl zawiesiny lateksowej 1:10 (przygotowanej w kroku 1.3.3) do 1 000 μl zawiesiny surowicy 1:40 (przygotowanej w kroku 1.3.2). Odwróć pięć razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C na wolno obracającym się kole (np. 4 obr./min dla koła o średnicy 38,5 cm) przez 2 godziny.</li>
		<li>Wirować przez 15 minut przy stężeniu 1 100 x g. Odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić osad w 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
		<li>Wirować przez 15 minut przy 1,100 x g. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml GBS i delikatnie zawiesić osad.</li>
		<li>Zawiesinę lateksową należy odpipetować do oznaczonej probówki z nakrętką o pojemności 5 ml. Dodaj kolejny 1 ml GBS.</li>
		<li>Dodać 2 ml GBS zawierającego 0,2% BSA (w/v) (pH 8,2) (przygotowanego w kroku 1.2). Dodać 40 μl 10% (w/v) roztworu azydku sodu jako środka konserwującego. 
		UWAGA: Azydek sodu jest niebezpieczny w przypadku wdychania i działa drażniąco na skórę i oczy. Pożądane jest zakupienie przygotowanego 10% roztworu, a nie postaci sproszkowanej, ponieważ minimalizuje to ryzyko narażenia przez drogi oddechowe. Podczas pracy z tym odczynnikiem należy nosić środki ochrony osobistej (w tym rękawice i okulary przeciwbryzgowe). Szczegółowe informacje można znaleźć w karcie charakterystyki substancji niebezpiecznej.</li>
		<li>Odczynniki lateksowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie odczynnika lateksowego do kontroli ujemnej
	<ol>
		<li>Oznacz probówkę do mikrofugi z okrągłym dnem o pojemności 2 ml. 
		UWAGA: probówki z okrągłym dnem służą do zminimalizowania osadzania się cząstek, które mogą wpływać na przyczepianie przeciwciał.</li>
		<li>Za pomocą pipety P1000 ze sterylnymi końcówkami dodaj 975 μl GBS do probówki do mikrofuge, a następnie dodaj 25 μl normalnej surowicy króliczej. Odwróć pięć razy, aby wymieszać.</li>
		<li>Postępować jak w krokach od 1.3.3 do 1.3.10 powyżej</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kontrola jakości (QC) odczynników lateksowych
<ol>
	<li>Przynieś odczynnik lateksowy do RT. Bezpośrednio przed użyciem delikatnie wymieszaj odczynnik lateksowy, kilkakrotnie odwracając rurkę.</li>
	<li>Sprawdzić odczynnik do autoaglutynacji, pipetując 15 μl na szklane szkiełko mikroskopowe i postępować jak w krokach 4.7 i 4.8 poniżej. Nie powinno dochodzić do aglutynacji cząstek lateksu. Odczynnik powinien wydawać się biały i gładki.</li>
	<li>Przeprowadzić odczynnik na panelu izolatów pneumokoków o niskim pasażu. Użyj świeżo wyhodowanych kultur przygotowanych jak w kroku 3. Panel izolatów powinien obejmować izolaty serotypu "docelowego" (serotyp specyficzny dla badanego odczynnika) i serotypów "niedocelowych" (izolaty innych serotypów, które normalnie nie powinny reagować krzyżowo z odczynnikiem). Dołączyć co najmniej jeden izolat każdego serotypu docelowego i niedocelowego dla każdego odczynnika lateksowego poddawanego kontroli jakości. Jeżeli istnieje tylko jeden serotyp docelowy lub niedocelowy, należy przeprowadzić badanie na obecność dwóch różnych izolatów danego serotypu. 
	UWAGA: Panel testowy powinien zawierać kilka izolatów każdego serotypu, z których niektóre są rzadkie w kolekcjach chorób inwazyjnych i/lub kultur typowych. Zaleca się włączenie niektórych izolatów nosicielstwa, ponieważ są one często bardziej wymagające do serotypowania (dane nie pokazane), co pozwala na dalsze testowanie pojemności odczynników i zapewnienie, że odczynniki są prawdopodobnie zdolne do serotypowania zarówno izolatów inwazyjnych, jak i nosicieli.</li>
	<li>Kontynuuj testowanie odczynników lateksowych z docelowymi i niedocelowymi izolatami pneumokoków zgodnie z metodą opisaną w krokach 3 i 4 poniżej.</li>
	<li>Odczynniki do kontroli jakości w momencie produkcji, a następnie co najmniej raz w roku. 
	UWAGA: Jeśli odczynnik nie przejdzie kontroli jakości, partię należy wyrzucić i przygotować nowy preparat. W przypadku powtarzającego się niepowodzenia kontroli jakości zalecamy, aby odczynniki były produkowane przy użyciu alternatywnych metod opisanych w Ortika i wsp., 20138 oraz w poniższej dyskusji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultur pneumokokowych do serotypowania
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli wybierz pojedynczą kolonię izolatu pneumokoków i rozprowadź ją na stałym nieselektywnym agarze z krwią, tak aby pierwotny inokulum pokrył około jednej trzeciej powierzchni płytki. Smuga dla pojedynczych kolonii. 
	UWAGA: Odpowiednie są płytki przygotowane z defibrynowanej krwi końskiej lub owczej; ale płytki krwi przygotowane z krwi ludzkiej lub cytrynowanej krwi zwierzęcej nie są.</li>
	<li>Inkubować płytkę O/N w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .</li>
	<li>Obserwuj narośl na płytce pod kątem czystości i oceń, czy jest wystarczający wzrost do serotypowania. 
	UWAGA: Do serotypowania wymagana jest czysta hodowla izolatu pneumokoków. Z naszego doświadczenia wynika, że zlewający się lub prawie zlewający się wzrost obejmujący około jednej trzeciej powierzchni płytki jest zwykle wystarczający do zakończenia serotypowania. Ponieważ kultury pneumokokowe mogą być podatne na autolizę, kultury przygotowane do serotypowania powinny zostać przetestowane w ciągu 24 godzin od subhodowli. Nie wyjmować płytki hodowlanej z inkubatora nie więcej niż 15 do 20 minut przed rozpoczęciem oznaczania serotypów.</li>
</ol>
4. Przeprowadzanie aglutynacji lateksowej Serotypowanie
<ol>
	<li>Wyjmij wszystkie odczynniki lateksowe z lodówki i pozwól im ogrzać się do temperatury suchej temperatury przez około 30 minut. Bezpośrednio przed użyciem delikatnie odwróć probówki, aby wymieszać odczynniki.</li>
	<li>Oznacz szkiełko mikroskopowe.</li>
	<li>Umieścić 15 μl odczynnika lateksowego do kontroli ujemnej na szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Używając sterylnej jednorazowej pętli o pojemności 1 μl, przeszukaj kulturę pneumokokową tak, aby pętla była wypełniona w przybliżeniu do połowy.</li>
	<li>Delikatnie rozsmarować inokulum na powierzchni szkiełka w pobliżu kropli odczynnika lateksowego do kontroli ujemnej. Inokulum powinno być widoczne na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Szybko i dokładnie wymieszać inokulum z odczynnikiem lateksowym do kontroli negatywnej za pomocą pętli. Upewnij się, że kropla nie rozprzestrzenia się dalej niż jej początkowy rozmiar.</li>
	<li>Podnieś szkiełko, trzymając je za oba końce. Kołysz zjeżdżalnią w przód iw tył przez 1 minutę. Uważaj, aby płyn poruszał się powoli i upewnij się, że wielkość kropli nie zwiększa się. 
	UWAGA: Alternatywnie użyj wahacza płytowego.</li>
	<li>Obserwować aglutynację makroskopową (tj. gołym okiem) i usuwanie zawiesiny na czarnym tle.</li>
	<li>Jeżeli odczynnik lateksowy do kontroli ujemnej nie wykazuje aglutynacji ani klarowania, należy kontynuować badanie hodowli, zastępując odczynniki lateksowe do kontroli ujemnej odczynnikiem lateksowym w krokach 4.1-4.8 powyżej. Za każdym razem należy użyć nowej pętli. Kontynuuj testowanie odczynników lateksowych, zaczynając od puli.</li>
	<li>Testować kolejno każdy z "pulowych" odczynników lateksowych, aż do uzyskania pozytywnego wyniku. 
	UWAGA: Kolejność testowania basenów może być przeprowadzana w "rundach", aby odzwierciedlić lokalne występowanie poszczególnych serotypów (np. poprzez testowanie dla trzech najbardziej prawdopodobnych basenów na pierwszym slajdzie). Jeśli nie uzyskasz pozytywnej reakcji, przetestuj kolejne trzy najbardziej prawdopodobne z pozostałych basenów na drugim slajdzie; i tak dalej, aż do uzyskania pozytywnej reakcji). Gwarantuje to, że najczęstsze serotypy są badane w pierwszej kolejności, co minimalizuje czas i potrzebne odczynniki.</li>
	<li>Korzystając z klucza producenta surowic odpornościowych, określ, które poszczególne surowice odpornościowe są reprezentowane w puli dodatniej.</li>
	<li>Należy przebadać każdą z grup lub typów zawartych w puli dodatniej indywidualnie w celu określenia "grupy" lub "typu", jak w krokach 4.1–4.8 powyżej.</li>
	<li>Określić wynik, odwołując się do klucza producenta surowic odpornościowych. W przypadku określenia "typu" (np. serotyp 5) nie są potrzebne dalsze badania, a wynik jest rejestrowany.</li>
	<li>W przypadku określenia "grupy" (np. grupy 19) należy odwołać się do klucza producenta, aby określić czynniki, które mają być badane. Kontynuuj badanie z użyciem poszczególnych odczynników lateksowych "czynnika" i określ ostateczny serotyp (np. serotyp 19B).</li>
</ol>

<ol><li>Rudan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+etiology+of+childhood+pneumonia+in+2010%3A+estimates+of+incidence%2C+severe+morbidity%2C+mortality%2C+underlying+risk+factors+and+causative+pathogens+for+192+countries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Glob+Health%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and etiology of childhood pneumonia in 2010: estimates of incidence, severe morbidity, mortality, underlying risk factors and causative pathogens for 192 countries.</a> J Glob Health. 3 (10401), (2013).</li>
<li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J Clin Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li>
<li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease%3A+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use%2C+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin Infect Dis. 30, 100-121 (2000).</li>
<li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li>
<li>Satzke, C., et al. Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSatzke%2C+C+%22Vaccine%22">Vaccine</a>. , (2013).</li>
<li>Ortika, B. D., Habib, M., Dunne, E. M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+latex+agglutination+reagents+for+pneumococcal+serotyping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Production of latex agglutination reagents for pneumococcal serotyping.</a> BMC Res Notes. 6 (49), (2013).</li>
<li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Med+Int+Health%22%5BJournal%5D)">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Trop Med Int Health. 11, 1128-1135 (2006).</li>
<li>Slotved, H. C., Kaltoft, M., Skovsted, I. C., Kerrn, M. B., Espersen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+latex+agglutination+test+for+serotyping+of+pneumococci+%28Pneumotest-Latex%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid latex agglutination test for serotyping of pneumococci (Pneumotest-Latex).</a> J Clin Microbiol. 42, 2518-2522 (2004).</li>
<li>Turner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+nasopharyngeal+cocolonization+by+multiple+pneumococcal+serotypes+by+use+of+latex+agglutination+or+molecular+serotyping+by+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved detection of nasopharyngeal cocolonization by multiple pneumococcal serotypes by use of latex agglutination or molecular serotyping by microarray.</a> J Clin Microbiol. 49, 1784-1789 (2011).</li>
<li>Mudany, M. A., Kikuchi, K., Totsuka, K., Uchiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+serotyping+kit+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new serotyping kit for Streptococcus pneumoniae.</a> J Med Microbiol. 52, 975-980 (2003).</li>
<li>Lalitha, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+by+agglutination+assays%3A+a+cost-effective+technique+for+developing+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Serotyping of Streptococcus pneumoniae by agglutination assays: a cost-effective technique for developing countries.</a> Bull World Health Organ. 74, 387-390 (1996).</li>
<li>Shutt, C. K., Samore, M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+Denka+Seiken+slide+agglutination+method+to+the+quellung+test+for+serogrouping+of+Streptococcus+pneumoniae+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the Denka Seiken slide agglutination method to the quellung test for serogrouping of Streptococcus pneumoniae isolates.</a> J Clin Microbiol. 42, 1274-1276 (2004).</li>
<li>Gella, F., Serra, J., Gener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latex+agglutination+procedures+in+immunodiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Pure+Appl+Chem%22%5BJournal%5D)">Latex agglutination procedures in immunodiagnosis.</a> Pure Appl Chem. 63, 1131-1134 (1991).</li>
<li>Pneumococcus Key to S. pneumoniae types and pneumococcal diagnostic antisera. SSI Diagnostica. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> (2013).</li>
<li>Habib, M., Porter, B. D., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+using+the+Quellung+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Capsular serotyping of Streptococcus pneumoniae using the Quellung reaction.</a> J. Vis. Exp. (84), (2014).</li>
<li>Arai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+antiserum-coated+latex+particles+for+serotyping+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae.</a> Microbiol Immunol. 45, 159-162 (2001).</li>
<li>Lafong, A. C., Crothers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+latex+agglutination+method+for+typing+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Simple latex agglutination method for typing pneumococci.</a> J Clin Pathol. 41, 230-231 (1988).</li>
<li>Ortega-Vinuesa, J. L., Bastos-Gonzalez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+factors+affecting+the+performances+of+latex+agglutination+tests%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Sci+Polym+Ed%22%5BJournal%5D)">A review of factors affecting the performances of latex agglutination tests.</a> J Biomater Sci Polym Ed. 12, 379-408 (2001).</li>
<li>Yap, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+slide+latex+agglutination+test+for+rotavirus+antigen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Malays+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Development of a slide latex agglutination test for rotavirus antigen detection.</a> Malays J Pathol. 16, 49-56 (1994).</li>
<li>Severin, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latex+agglutination+in+the+diagnosis+of+meningococcal+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Latex agglutination in the diagnosis of meningococcal meningitis.</a> J Clin Pathol. 25, 1079-1082 (1972).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aglutynacja lateksowa to prosta, szybka i niedroga metoda serotypowania pneumokoków. Dostępne są dostępne komercyjne odczynniki do aglutynacji lateksowej pneumokoków, ale obecnie nie różnicują one wszystkich znanych serotypów pneumokoków10,12. Jednak odczynniki do aglutynacji lateksowej można łatwo wyprodukować we własnym zakresie przy użyciu zakupionych surowic odpornościowych wyhodowanych przeciwko określonym pneumokokowym antygenom otoczkowym. W opisanej tutaj metodzie przeciwciała są biernie przyłączane do cząstek lateksu w celu wytworzenia zestawu odczynników do aglutynacji lateksu.
Pozytywna reakcja lateksowa zachodzi, gdy specyficzne przeciwciała związane z cząstkami lateksu przyłączają się do antygenów na polisacharydowej kapsułce izolatu pneumokoków 18,19. Cząsteczki lateksu przyłączone do przeciwciał pozwalają na wizualizację specyficznej reakcji przeciwciało-antygen bez powiększenia.
Aglutynacja lateksowa jest odpowiednią metodą dla laboratoriów o wysokiej przepustowości, a także dla środowisk o ograniczonych zasobach. Kluczowymi zaletami metody aglutynacji lateksowej jest to, że do wykonania testu nie jest wymagany specjalistyczny sprzęt, odczynniki mają okres trwałości co najmniej 2 lata, gdy są przechowywane w temperaturze 4 °C8 oraz że jest niedroga, prosta i szybka do wykonania. Serotypowanie izolatu pneumokoków metodą aglutynacji lateksowej trwa około 10 minut, a na jednym szkiełku można testować równolegle do czterech odczynników lateksowych. Ponadto, jeżeli częstość występowania serotypów jest znana w danym otoczeniu epidemiologicznym, testy można przeprowadzać w rundach, zaczynając od pul zawierających najczęstsze serotypy, podobnie jak w przypadku testu Quellung17. Takie podejście minimalizuje liczbę testów potrzebnych do określenia serotypu. Metoda jest również wysoce powtarzalna między różnymi operatorami (dane nie są pokazane). Wadą serotypowania aglutynacji lateksowej jest to, że produkcja odczynników jest czasochłonna i trwa około 4 godzin; Chociaż wiele odczynników można łatwo wytwarzać równolegle. Ponadto niektóre antygeny są wspólne dla różnych serotypów pneumokoków, co prowadzi do reakcji krzyżowych z niektórymi surowicami odpornościowymi (np. serotypem 29, 42 i grupą 35). Jednak te reakcje krzyżowe są dobrze scharakteryzowane przy użyciu komercyjnych surowic odpornościowych (które są zwykle wstępnie wchłaniane w celu usunięcia bardziej problematycznych przeciwciał reagujących krzyżowo), a producent dostarcza dodatkowe tabele reakcji w celu rozróżnienia, który serotyp jest obecny. Odczynniki lateksowe mogą również reagować krzyżowo, jeśli przeciwciała nie są prawidłowo ustawione na cząsteczkach lateksu; są one wykrywane jako awarie kontroli jakości. Z naszego doświadczenia wynika, że rygorystyczna kontrola jakości ma kluczowe znaczenie dla sukcesu tej metody, nawet jeśli do produkcji stosuje się dostępne na rynku surowice odpornościowe. Kontrola jakości trwa około 15 minut na odczynnik i opiera się na zestawie odpowiednich izolatów kontroli jakości, jak opisano powyżej.
Opisana tutaj metoda daje odczynniki, które dają pozytywną reakcję dobrze w okresie testowym. Z naszego doświadczenia wynika, że fałszywe alarmy są w praktyce rzadkie (dane nie są pokazane). Sporadycznie obserwuje się fałszywie ujemne reakcje; zwykle odnoszą się one do znanych problemów z określoną surowicą odpornościową (np. izolaty serogrupy 6 mogą nie reagować z surowicą antysurowicy grupy B) lub obniżonej regulacji ekspresji kapsułki przez izolat. Ważne jest również użycie algorytmu serotypowego dostarczonego przez producenta, ponieważ w większości przypadków fałszywie dodatnia lub negatywna reakcja doprowadzi do wyniku "ślepego końca". W takich przypadkach oraz gdy reakcje są trudne do interpretacji, zalecamy powtórzenie testów i/lub przetestowanie alternatywną metodą, taką jak reakcja Quellunga.
Czasami wymagane jest rozwiązywanie problemów w celu uzyskania zadowalających odczynników lateksowych. W opisanej tutaj metodzie przeciwciało jest przyłączane do cząstek lateksu poprzez adsorpcję pasywną15,19, więc zmienną krytyczną jest stężenie użytego przeciwciała, które decyduje o tym, jak dobrze pokryta jest powierzchnia cząstek lateksu i późniejsze wyrównanie miejsc aktywnych przeciwciała15,20. W rezultacie, jeśli do cząstek lateksu przyłączy się niewystarczająca ilość lub nadmiar przeciwciała, reakcje przeciwciało-antygen nie będą optymalne i mogą powstać niezadowalające odczynniki15,20,21. Ponieważ miana przeciwciał różnią się w zależności od partii surowic odpornościowych, standardowy zestaw rozcieńczeń może nie dać odczynników, które działają dobrze8. Użytecznym punktem wyjścia jest użycie rozcieńczenia surowicy w stosunku 1:40, a jeśli to się nie powiedzie, dalsze rozcieńczanie surowicy. Z naszego doświadczenia wynika, że zwykle rozwiązuje to problem8. W niewielkiej liczbie przypadków odczynniki mogą wykazywać słabą aglutynację, której nie towarzyszy usuwanie zawiesiny podczas badania z docelowymi izolatami. W takich przypadkach rozcieńczenie surowicy odpornościowej nie poprawia jakości odczynnika, ale zadowalające odczynniki można zwykle uzyskać, pomijając etapy wirowania i płukania8,22.
Cząsteczki lateksu powlekane przeciwciałami są powszechnie stosowane w mikrobiologii diagnostycznej do wykrywania, identyfikacji lub serotypowania wielu różnych drobnoustrojów15,20. W związku z tym opisana tutaj metoda może być odpowiednia do przygotowania odczynników lateksowych do innych celów, pod warunkiem, że dostępne są odpowiednie surowice odpornościowe i przyjęte zostaną odpowiednie procedury kontroli jakości.

Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności u dzieci poniżej piątego roku życia na całym świecie, szczególnie w miejscach ubogich w zasoby1,2. Choroba pneumokokowa obejmuje zarówno miejscowe infekcje, jak i stany zagrażające życiu, takie jak zapalenie płuc, sepsa i zapalenie opon mózgowo-rdzeniowychtypu 1,2.
Ponad 90 serotypów pneumokoków zostało zidentyfikowanych na podstawie różnic w ich polisacharydach otoczkowy3. Obecne szczepionki są ukierunkowane na polisacharyd otoczkowy i zapewniają ochronę przed głównymi serotypami powodującymi chorobę inwazyjną4. Serotypowanie izolatów pneumokoków jest ważne dla oceny wpływu szczepień na nosicielstwo i chorobę, a także dla dostarczenia szerszych informacji epidemiologicznych5,6. Obecnym "złotym standardem" serotypowania pneumokoków jest test Quellunga, ale jest on czasochłonny i wymaga pewnych umiejętności do wykonania7. Aglutynacja lateksowa jest alternatywną metodą serotypowania zalecaną przez Światową Organizację Zdrowia7. Aglutynacja lateksowa jest szybka i prosta do wykonania i jest stosowana w wielu laboratoriach na całym świecie8-11. Co ważne, aglutynacja lateksowa wykazała porównywalną dokładność do testu Quellung dla serotypowania pneumokoków10,12-14. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda jest idealna dla środowisk o ograniczonych zasobach, a także dla laboratoriów o wysokiej przepustowości.
Odczynniki do aglutynacji lateksowej ("odczynniki lateksowe") powstają przez przyłączenie przeciwciał do cząsteczek lateksu15. W pozytywnej reakcji te znakowane cząstki aglutynują się w obecności specyficznego antygenu. Dostępne są komercyjne odczynniki lateksowe dla ograniczonego zakresu serotypy. Odczynniki lateksowe można również przygotować we własnym zakresie przy użyciu dostępnych na rynku surowic odpornościowych10. Dostępne są mieszaniny surowic odpornościowych ("pule"), jak również swoiste surowice odpornościowe dla serogrup pneumokokowych (np. grupa 19), indywidualnych serotypów (np. serotyp 5) oraz dla określonych antygenów ("czynniki", np. czynnik 19c rozpoznający serotyp 19A) w celu dalszego definiowania serotypów w obrębie grup16.
Ten manuskrypt przedstawia główne etapy produkcji odczynników lateksowych przy użyciu pasywnego przyłączania dostępnych na rynku surowic odpornościowych do cząsteczek lateksu. Opisano aspekty kontroli jakości (QC) tej metody oraz dołączono protokół stosowania odczynników lateksowych do serotypowania pneumokoków.

<table><tbody><tr><td>Mikrocząstki na bazie polistyrenu, 800 nm</td><td>Sigma</td><td>65984-10 ml-F</td><td>Lub inne objętości zgodnie z wymaganiami</td></tr><tr><td>Normalna surowica królika</td><td>Przeciwciała Australia&nbsp;</td><td>NRS-1ml</td><td>Lub inne objętości zgodnie z wymaganiami, przynieść do RT przed użyciem</td></tr><tr><td>Pneumokoki (Neufeld) antisurús</td><td>SSI Diagnostica</td><td>Różne</td><td>Przynieś do RT przed użyciem <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>Sterylna albumina bydlęca&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A-4503</td><td>Przynieś do rRT przed użyciem</td></tr><tr><td>Roztwór azydku sodu 10% (v/v)&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>ROAC3902/100 ml</td><td>Uwaga: niebezpieczne w przypadku wdychania; działa drażniąco na skórę i oczy</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td>Okrągłodenny</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>10241.AP</td><td></td></tr><tr><td>Kalibrowane jednorazowe pętle inokulacyjne 1 i mikro; l</td><td>Szkiełka mikroskopowe Copan</td><td>CD175SO1</td><td></td></tr><tr><td>szklane 76 mm x 26 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LBS 2950RC</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaOH</td><td>BDH</td><td>10252</td><td>Uwaga: silnie</td></tr><tr><td>glicyny</td><td>Merck</td><td>10119.05</td><td></td></tr><tr><td>Płytki z agarem z krwią końską (HBA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td>Przynieś do RT przed użyciem <a href="http://www.thermofisher.com.au/">http://www.thermofisher.com.au</a></td></tr><tr><td>Koło obrotowe</td><td>Wyble Engineering Development Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa rurka z płaskim dnem, 5 ml</td><td>Technoplas</td><td>S5016SU</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki 60 ml bez igieł</td> Jednostka filtrująca strzykawka <td>Terumo</td><td>SS-60L</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP, 0,22 &mikro; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Broszura na temat surowicy surowic neurofeldskich</td><td>Statens Serum Institut</td><td></td><td>Klucz do określania serotypów <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>Klucz do surowicy czynnika pneumokokowego</td><td>Statens Serum Institut</td><td>18058</td><td>Do określania serotypu w obrębie Grup <a href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a></td></tr><tr><td>*dla większości materiałów</td><td></td><td></td><td></td> dostępne są alternatywne źródła</tr></tbody></table>

serotypowanie torebki streptococcus pneumoniae metodą aglutynacji lateksowej

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Odczynniki do aglutynacji lateksowej są szeroko stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej, identyfikacji i serotypowaniu. Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Obecnie szczepionki są ukierunkowane na kapsułkę pneumokokową i istnieje ponad 90 serotypów otoczkowych. Serotypowanie izolatów pneumokoków jest zatem ważne dla oceny wpływu programów szczepień oraz dla celów epidemiologicznych. Światowa Organizacja Zdrowia zaleciła aglutynację lateksową jako metodę alternatywną dla "złotego standardu" testu Quellung do pneumokoków serotypowych. Aglutynacja lateksowa jest stosunkowo prostą, szybką i niedrogą metodą; i dlatego nadaje się do zastosowań o ubogim zasobach, a także do laboratoriów o dużym obciążeniu pracą. Odczynniki do aglutynacji lateksowej można przygotować we własnym zakresie przy użyciu komercyjnie pozyskiwanych przeciwciał, które są pasywnie przyłączone do cząstek lateksu. Niniejszy manuskrypt opisuje metodę produkcji i kontroli jakości odczynników do aglutynacji lateksowej oraz szczegółowo opisuje podejście do testowania sekwencyjnego, które jest efektywne czasowo i kosztowo. 
Ta metoda produkcji i kontroli jakości może być również odpowiednia do innych celów testowych.

Dodatnia reakcja lateksowa zachodzi, gdy przeciwciało specyficzne dla danego typu, przyłączone do cząsteczki lateksu, wiąże się z kapsułą pneumokoków, co prowadzi do aglutynacji cząsteczek znakowanych przeciwciałem15. Rysunek 1A przedstawia reakcję dodatnią, która charakteryzuje się widoczną aglutynacją oraz przejaśnieniem zawiesiny w tle. Reakcja ujemna charakteryzuje się tym, że zawiesina odczynnika do aglutynacji lateksowej pozostaje jednorodna i biała (Rysunek 1B). Odczynniki są zoptymalizowane w taki sposób, aby reakcja dodatnia była obserwowalna przed upływem jednego interwału czasowego wynoszącego 1 min (zazwyczaj jest ona wykrywalna w ciągu około 20 s). Nie zaleca się odczytywania wyników reakcji po upływie 1 min. Bardzo rzadko reakcje wykazują słabą aglutynację na krawędzi kropli, której nie towarzyszy przejaśnienie zawiesiny w tle, lub przyjmują formę „nitkowatą” bez przejaśnienia tła (dane nie pokazano). Są to najprawdopodobniej reakcje ujemne. W takich przypadkach zalecamy powtórzenie badania i/lub dalszą diagnostykę z wykorzystaniem innej metody serotypowania (na przykład reakcji Quellunga17).
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej: porównanie rozkładu DNA w jądrze komórkowym, skala 1 mm." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Dodatnie i ujemne reakcje aglutynacji lateksowej. Preparaty izolatu pneumokokowego zmieszanego z odczynnikiem do aglutynacji lateksowej wykazujące reakcję dodatnią (A) lub reakcję ujemną (B). W reakcji dodatniej (A) widoczna jest aglutynacja której towarzyszy przejaśnienie tła. Brak widocznej aglutynacji w przypadku odczynnika lateksowego kontroli ujemnej lub w ujemnej reakcji testowej (B). Fotografie8 użyte za zgodą autora. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51747/51747fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Testy aglutynacji lateksowej to prosta, szybka i tania metoda serotypowania Streptococcus pneumoniae, która jest również szeroko stosowana w mikrobiologii diagnostycznej. Manuskrypt opisuje własną produkcję odczynników do aglutynacji lateksowej, procedury kontroli jakości oraz zastosowanie tej techniki do serotypowania pneumokoków.

Serotypowanie torebki Streptococcus pneumoniae metodą aglutynacji lateksowej

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest typowanie serytowe izolatów Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem antyser w postaci cząstek lateksu. Pierwszym krokiem w typowaniu serytowym izolatu pneumokokowego jest jego przetestowanie z odczynnikiem lateksowym kontroli negatywnej. Drugim krokiem procedury jest testowanie izolatu pneumokokowego z pulami odczynników lateksowych do momentu zaobserwowania reakcji dodatniej.Trzecim krokiem jest przetestowanie izolatu z grupami i typami obecnymi w puli pozytywnej, korzystając z klucza producenta antyserum w celu wybrania odpowiednich odczynników do testu. Ostatnim krokiem jest przetestowanie izolatu z wszelkimi wymaganymi lateksowymi odczynnikami czynnikowymi, a następnie interpretacja wyników zgodnie z kluczem producenta antyserum w celu określenia ostatecznego serotypu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak test Quogue, jest fakt, że nie wymaga ona użycia mikroskopu i jest stosunkowo prosta oraz szybka w wykonaniu.Procedurę tę zaprezentuje Belinda, asystentka badawcza z naszego laboratorium. Najpierw należy opisać probówkę typu microcentrifuge o pojemności 2 ml. Wybierz probówkę z zaokrąglonym dnem, aby zapobiec osadzaniu się cząstek podczas etapu przyłączania przeciwciał.Za pomocą pipety 1000 µL dodaj do probówki 975 µL soli fizjologicznej buforowanej glicyną. Następnie dodaj 25 µL przeciwciał przeciwpneumokokowych niezbędnych do przygotowywanego odczynnika lateksowego. Odwróć probówkę pięciokrotnie w celu wymieszania, a następnie rozcieńcz 120 µL cząsteczek lateksu polistyrenowego w 1080 µL sterylnej soli fizjologicznej.Odwróć naczynie pięć razy, aby wymieszać, a następnie pipetuj 1000 µL zawiesiny lateksu do 1000 µL roztworu antyserum. Odwróć naczynie pięć razy w celu wymieszania, a następnie przenieś do inkubatora ustawionego na 37 °C i umieść na wolnoobrotowym wirniku. Inkubuj mieszaninę przez dwie godziny; po inkubacji odwiruj cząsteczki z prędkością 1 100 ×g przez 15 minut.Usunąć nadsącz za pomocą pipety 1000 µL. Odrzucić nadsącz i resuspender osad w 2 mL sterylnej soli fizjologicznej. Następnie ponownie odwirować mieszaninę, odrzucić nadsącz i resuspender wypłukany osad w 1 mL soli fizjologicznej buforowanej glicyną.Przenieś zawiesinę do probówki z nakrętką o pojemności 5 ml i dodaj kolejny 1 ml soli fizjologicznej buforowanej glicyną. Następnie dodaj 2 ml soli fizjologicznej buforowanej glicyną z 0,2% BSA. Na koniec dodaj 40 µL 10% azotku sodu.Stosując konserwant, należy ściśle przestrzegać karty charakterystyki materiałowej. Środki ostrożności przy użyciu azotku sodu. Następnie należy zapoznać się z kluczem producenta przeciwciał, aby określić odpowiednie izolaty do kontroli jakości, które należy przetestować z odczynnikiem.Następnie należy przetestować odczynnik, używając tych izolatów serotypów kontrolnych dodatnich i ujemnych. Badanie kontroli jakości jest bardzo istotne. Proces ten zapewnia wytworzenie prawidłowo reagującego odczynnika, co stanowi kluczowy etap kontrolny. Odczynniki, które przeszły kontrolę jakości, należy przechowywać w temperaturze 4°C.Rozpocznij od przygotowania kultur. Za pomocą sterylnej pętli wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep jedną trzecią nieaselektywnej płytki z agarem krwi. Następnie wykonaj posiew metodą kreskową, aby uzyskać pojedyncze kolonie.Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia, przed rozpoczęciem SYP, wyjąć odczynniki lateksowe z lodówki i pozostawić je do osiągnięcia temperatury pokojowej.Wyjmij płytkę z inkubatora. Kultura musi być czysta, a wzrost konfluencyjny lub niemal konfluencyjny. Nad jedną trzecią płytki kilkukrotnie odwróć probówkę z odczynnikiem lateksowym dla kontroli negatywnej.Odbierz 15 µL i nanieś pipetą na opisane szkiełko przedmiotowe. Następnie, używając sterylnej pętli o objętości 1 µL, pobierz próbkę kultury, aż środek pętli będzie wypełniony w połowie. Delikatnie rozmaż zawartość pętli na szkiełku w pobliżu kropli odczynnika kontrolnego ujemnego.Inokulum powinno być widoczne na szkle. Następnie, używając pętli, wymieszaj inokulum z kroplą odczynnika lateksowego. Staraj się nie rozmazać kropli po szkiełku.Unieś oba końce szkiełka i delikatnie kołysz nim w przód i w tył. Utrzymuj powolną rotację cieczy, starając się nie dopuścić do rozprzestrzenienia się kropli po szkiełku. Kontynuuj kołysanie szkiełka przez jedną minutę, a następnie odczytaj wynik.Wyniki są czerwone na ciemnym tle. Kropla odczynników kontroli negatywnej nie powinna ulec zmianie, bez aglutynacji lub przejaśnienia. Po ustaleniu, że z odczynnikiem kontroli negatywnej nie zachodzi reakcja, należy rozpocząć testowanie poszczególnych lateksowych odczynników puli, aż do uzyskania reakcji dodatniej.Dla każdego odczynnika należy zastosować tę samą procedurę i nową sterylną pętlę. Zazwyczaj na każdym szkiełku bada się trzy pule. Przed oceną reakcji należy kołysać szkiełkiem przez jedną minutę.Dodatnia reakcja lateksowa zachodzi, gdy swoiste przeciwciała przyczepione do cząsteczek lateksu wiążą się z otoczką pneumokoków, co prowadzi do aglutynacji znakowanych cząsteczek. Zjawisku temu zazwyczaj towarzyszy częściowe przejaśnienie zawiesiny w tle. Reakcja negatywna charakteryzuje się tym, że zawiesina odczynnika lateksowego pozostaje jednorodna i biała, bez widocznej aglutynacji lub przejaśnienia.Sporadycznie niektóre prawdopodobnie reakcje negatywne wykazują słabą aglutynację na obrzeżach kropli, której nie towarzyszy przejaśnienie zawiesiny w tle. W obu tych niejednoznacznych przypadkach inne prawdopodobne reakcje negatywne mogą mieć charakter śluzowaty, bez przejaśnienia tła. Należy powtórzyć badanie lub zastosować inną metodę stereotypowania.Po uzyskaniu reakcji dodatniej należy skorzystać z klucza producenta, aby ustalić, które grupy lub typy znajdują się w tej mieszaninie puli. Następnie należy przebadać izolat z poszczególnymi grupami lub typami tworzącymi tę pulę, aż do momentu zaobserwowania reakcji dodatniej. Jeśli typ zostanie zidentyfikowany, dalsze badania nie są wymagane.Jeśli jednak zostanie zidentyfikowana grupa, należy skorzystać z klucza producenta, aby ustalić, które czynniki muszą zostać przetestowane w celu zidentyfikowania serotypu. Po uzyskaniu wyników testów czynników ponownie należy odwołać się do klucza, aby określić ostateczny serotyp. Po opanowaniu ta prosta i niedroga technika może być wykorzystywana do typowania serologicznego.Izolacja pneumokoków trwa 10 minut, jeśli procedura jest przeprowadzana prawidłowo. Przystępujemy do wykonania tej procedury. Należy pamiętać o stosowaniu świeżych, sterylnych pętelek i końcówek do pipet dla każdego z testów, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbek lub odczynników.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak przygotowywać i stosować odczynniki lateksowe do typowania pneumokoków.

capsular-serotyping-of-streptococcus-pneumoniae-by-latex-agglutination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Serotypage kapsykulowe Streptococcus pneumoniae metodą lateksowej aglutynacji

Opisano wydajną metodę oceny ekspozycji powierzchniowej białek leptospir. Metoda ta została zaprojektowana specjalnie w celu uniknięcia uszkodzenia delikatnej błony zewnętrznej komórek leptospir. Technika ta wymaga zastosowania kilku kontroli negatywnych w celu oceny integralności błony zewnętrznej oraz specyficzności reakcji przeciwciał.

Analiza immunofluorescencyjna białek powierzchniowych leptospir**

Niedawno opracowany nowoczesny test aglutynacji cząsteczek (PA) z wykorzystaniem cząsteczki receptora wirusowego umożliwił szybką i łatwą identyfikację poliwirusa (PV). W niniejszym artykule przedstawimy procedurę testu PA służącą do identyfikacji PV.

Metoda aglutynacji cząsteczek w identyfikacji poliwirusa

Ten film demonstruje test opsono-adherencji do badania interakcji między opsonizowanymi bakteriami a komórkami odpornościowymi. Bakterie znakowane fluorescencyjnie, potraktowane surowicą testową zawierającą przeciwciała antykapsułkowe, inkubuje się z makrofagami. Po zabarwieniu makrofagów fluorescencją, przyczepione bakterie na powierzchni makrofagów obserwuje się pod mikroskopem w celu wizualizacji.

Test adherencji opsonowej do oceny opsonizacji bakterii otoczkowanych przez przeciwciała antykapsułkowe

Eksperymentalne nosicielstwo ludzkiej pneumokoki oferuje naturalny model nosicielstwa i potencjalny model do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek. Technika ta jest cenna, ale złożona i wiąże się z ryzykiem klinicznym związanym z wprowadzeniem patogenu do organizmu człowieka. Opracowaliśmy szczegółowy protokół.

Eksperymentalny nosiciel pneumokoków u ludzi

Reakcja Quellung jest złotym standardem w określaniu Streptococcus pneumoniae. Technika ta wykorzystuje mikroskop i specyficzne surowice odpornościowe na pneumokoki i jest powszechnie stosowana w laboratoriach referencyjnych i badawczych na całym świecie.

Serotypowanie torebki Streptococcus pneumoniae za pomocą reakcji Quellung

Streptococcus pneumoniae tworzy dyskretne, nieropne, mikroskopijne zmiany w sercu. Przedstawiono protokół mysiego modelu powstawania mikrouszkodzeń serca. Prowadzone są szkolenia dotyczące wizualizacji mikrozmian za pomocą mikroskopii, rozróżniania wczesnych i późnych mikrouszkodzeń oraz metod wykrywania przebudowy serca w sercach rekonwalescentów.

Wizualizacja Streptococcus pneumoniae w obrębie mikrouszkodzeń serca i późniejsza przebudowa serca

Ten test zabijania opsonofagocytarnego służy do porównywania zdolności komórek odpornościowych fagocytarnych do reagowania i zabijania bakterii w oparciu o różne metody leczenia i/lub warunki. Klasycznie test ten służy jako złoty standard do oceny funkcji efektorowych przeciwciał podniesionych przeciwko bakterii jako opsonina.

Test zabijania opsonofagocytarnego w celu oceny odpowiedzi immunologicznej przeciwko patogenom bakteryjnym

Rozszerzenie kodu genetycznego jest stosowane do wprowadzenia nienaturalnego aminokwasu posiadającego biorthogonalną grupę funkcyjną na białku nośnikowym w określonym miejscu. Funkcja biortogalna jest dalej wykorzystywana do selektywnego sprzęgania antygenu węglowodanowego w celu uzyskania jednorodnej szczepionki skoniugowanej glikokoniugatem.

Jednorodny glikokoniugat wytwarzany przez połączenie nienaturalnej inkorporacji aminokwasów i chemii kliknięć do celów szczepionkowych

Tutaj opisujemy szczep S. pneumoniae serotyp 1 519/43, który może być genetycznie modyfikowany poprzez wykorzystanie jego zdolności do naturalnego pozyskiwania DNA i plazmidu samobójczego. Jako dowód tej zasady stworzono izogenicznego mutanta w genie pneumolizyny (ply).

Konstruowanie mutantów w serotypie 1 Streptococcus pneumoniae szczep 519/43

W zakażeniu Mycoplasma pneumoniae, testy serologiczne mogą dać dobre wyniki, ale z niską swoistością ze względu na immunologiczną reakcję krzyżową. Opisany w tym artykule wewnętrzny test ELISA do wychwytywania antygenu gwarantuje wysoką swoistość gatunkową i okazał się wiarygodnym testem przesiewowym do dokładnej diagnozy M. pneumoniae.

Test immunoenzymatyczny wychwytujący antygen do specyficznego wykrywania Mycoplasma pneumoniae

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

Naucz się serotypowania Streptococcus pneumoniae metodą aglutynacji lateksowej. Poznaj przygotowanie odczynników, kontrolę jakości i zastosowanie tej techniki w diagnostyce mikrobiologicznej.

Serotypowanie torebki Streptococcus pneumoniae metodą aglutynacji lateksowej

Przeglądaj więcej filmów