Obrazowanie skóry myszy metodą flat mount i jego zastosowanie do analizy wzorca mieszków włosowych i morfologii aksonów czuciowych

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja struktur skóry, takich jak mieszki włosowe i zakończenia nerwowe, w ich całości, bez konieczności fizycznego przekroju próbki. Osiąga się to poprzez uprzednie pobranie skóry z różnych obszarów ciała, w tym z grzbietu, tylnej łapy i ogona. Drugim krokiem jest spłaszczenie i oczyszczenie próbek skóry.

Następnie próbki skóry poddaje się odpowiedniej fiksacji. Ostatnim etapem jest przeprowadzenie barwienia immunocytochemicznego lub histochemicznego próbek skóry. W końcowym kroku wykorzystuje się obrazowanie za pomocą mikroskopu stereoskopowego lub konfokalnego w celu wizualizacji geometrii różnych struktur skóry.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przygotowanie preparatów hormonalnych naskórka, jest możliwość jej zastosowania w dowolnym miejscu ciała oraz brak konieczności oddzielania naskórka od skóry właściwej. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad polarnością komórek roślinnych. Ponieważ dwuwymiarowa geometria skóry oraz specyficzny układ mieszków włosowych czynią skórę idealnym systemem do badania tego procesu, metoda ta nie tylko pozwala na uzyskanie wglądu w polarność komórek roślinnych, ale może być również zastosowana do badania innych aspektów rozwoju skóry, takich jak definiowanie typów neuronów somatosensorycznych na podstawie bezpośredniej wizualizacji poszczególnych aksonów i ich morfologii końcowych.

Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ preparatyka skóry z niektórych obszarów, takich jak stopy i ogon, jest trudna do opanowania; istotne jest ich idealne rozprostowanie oraz unikanie zmarszczek i nadmiernego rozciągania. W tej demonstracji skóra grzbietowa zostanie pobrana od trzech myszy w fazie P, uśpionych za pomocą izofluranu. Stosując ostrza, należy wykonać cięcie poziome od nasady ogona wzdłuż każdego boku, przechodząc po stronie grzbietowej nasady każdej kończyny, kierując się bocznie w stronę uszu i kończąc na nosie.

Ostrożnie oddzielono skórę od leżącej pod nią tkanki, kierując się od strony tylnej do przedniej, trzymając skórę między palcami w rękawiczkach, aby nie została ona przycięta pincetą. Podczas oddzielania skóry w obrębie uszu, należy najpierw odciąć uszy nożyczkami i postępować szczególnie powoli, ponieważ w tym miejscu skóra może ulec rozerwaniu. Od tego momentu skórę należy układać wewnętrzną stroną do góry.

Przymocuj skórę do S Guard za pomocą około 20 szpilek entomologicznych, rozmieszczonych równomiernie wokół obwodu. Nie naciągaj skóry zbyt mocno. Przykryj skórę od 10 do 20 mililitrów PBS, używając pęsety kątowej lub zakrzywionej.

Odprzypuść tkankę tłuszczową i tkankę łączną związaną ze skórą. Prowadź ostrze pęsety poziomo, aby zminimalizować ryzyko przebicia skóry. Usuń pęcherzyki powietrza uwięzione pod skórą, delikatnie przesuwając aplikator z bawełnianym końcem po powierzchni skóry.

Kolejnym krokiem jest utrwalenie skóry z okolicy przypiętej szpilki. Jeśli skóra będzie wykorzystana do obrazowania melaniny lub histochemii fosfatazy alkalicznej, należy dodać 20 mililitrów na płytkę 10 cm świeżo przygotowanego 4% PFA w PBS lub 10% buforu formalinowego. Jeśli skóra będzie wykorzystana do immunobarwienia lub wizualizacji transgenicznej keratyny, KRT 17 GFP, należy dodać 20 mililitrów na płytkę 10 cm świeżo przygotowanego 2% PFA w PBS, delikatnie obracać przez noc w chłodni, a następnego dnia przemyć w PBS przez ponad 10 minut.

Procedura histochemiczna dla fosfatazy zasadowej nie zostanie zaprezentowana w tym filmie. W celu obrazowania melaniny, odwodnij skórę, stosując szereg stężeń etanolu przez jeden dzień dla każdego etapu, przy łagodnej rotacji poziomej w temperaturze pokojowej. Po trzech dniach usuń pozostałe tkanki łączną z odwodnionej skóry, gdy ta znajduje się w 100% etanolu.

Usuń szpilki entomologiczne i przenieś skórę do szklanej szalki o średnicy 10 centymetrów. Aby procedura zakończyła się sukcesem, próbka skóry musi zostać pobrana w całości i idealnie spłaszczona. Połóż na skórze dwa szklane przedmioty szkiełka mikroskopowe, aby ją spłaszczyć i zapobiec zwijaniu się.

Dodać 20 mililitrów benzożynianu benzoilu i alkoholu benzylowego (BBBA), który w ciągu następnych kilku godzin szybko utwardzi tkankę. Podnieść preparaty ze skóry na kilka sekund, aby BBBA mógł dokładnie obmyć skórę. Skórę stóp do analizy rozmieszczenia mieszków włosowych pobiera się zazwyczaj od zwierząt w wieku od P1 do P8. Po eutanazji odciąć stopy powyżej stawu skokowego i wykonać pojedyncze proste cięcie wzdłuż powierzchni brzusznej przez podeszwy stóp.

Ostrożnie oddziel skórę od tkanki podścielającej, przesuwając się w kierunku proksymalno-dystalnym. Przetnij palce, aby zwolnić skórę, a następnie przypnij ją do podstawki, powierzchnią wewnętrzną skierowaną do góry. Na stopie znajduje się minimalna ilość tkanki łącznej.

Transgeniczna skóra. Skóra KRT 17 GFP jest teraz gotowa do obrazowania melaniny. Utrwal i opracuj skórę w sposób zademonstrowany wcześniej dla skóry grzbietowej. Po eutanazji zwierzęcia w wieku P 21 usuń sierść, pocierając skórę środkiem do depilacji.

Nałóż żel na powierzchnię skóry za pomocą palca wskazującego i kciuka w rękawiczce i odczekaj 10 minut. Przemyj powierzchnię skóry wodą z kranu. Następnie przeprowadź sekcję i przypnij skórę stopy do podpór S, zgodnie z wcześniejszym opisem.

Utrwal w 1% PFA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj w PBS. Aby przygotować skórę ogona, wykonaj cięcie okrężne u nasady ogona, a następnie nacięcie podłużne wzdłuż całej długości ogona po stronie brzusznej. Zdejmij skórę ogona, zaczynając od czubka, mocno chwytając czubek kości ogonowej i/lub tkankę łączną jedną pęsetą, a skórę drugą pęsetą.

Przymocuj skórę ogona do podkładki SIL w celu analizy rozkładu melaniny i orientacji mieszków włosowych. Utrwal i opracuj skórę zgodnie z procedurą zaprezentowaną dla skóry grzbietowej do analizy gruczołów łojowych przed utrwaleniem. Potnij skórę ogona na serię segmentów o długości około 0,5 do 1 cm i inkubuj fragmenty skóry w PBS z 5 mM EDTA przez noc w temperaturze 37 °C.

Aby następnego dnia osłabić przyleganie naskórka do skóry właściwej, należy delikatnie oddzielić naskórek od skóry właściwej. Przypiąć powierzchnię naskórka do osłony S i utrwalić w 4%P-F-A-P-B-S przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć naskórek buforem PBS i zabarwić Oil Red O zgodnie z opisem w tekście protokołu.

Mikroskop stereoskopowy jest wykorzystywany do obrazowania skóry grzbietowej stopy lub ogona, która jest zanurzona w BBBA, spłaszczona pod szkiełkiem przedmiotowym i wciąż znajduje się w szalku szklanym. Takie podejście minimalizuje zanieczyszczenie mikroskopu BBBA. Oświetl szalkę od dołu, aby zminimalizować przestrzenne różnice w natężeniu światła w polu widzenia.

Podnieś szalkę szklaną na wysokość około 10 cm ponad standardową powierzchnię roboczą mikroskopu stereoskopowego i umieść dyfuzyjną płytkę plastikową lub szklaną nad źródłem światła. Po zakończeniu obrazowania przenieś skórę z powrotem do 100% etanolu w celu długoterminowego przechowywania w temperaturze -20 °C. Aby przygotować skórę barwioną na fosfatazę alkaliczną do obrazowania, umieść ją pomiędzy dwiema płytkami szklanymi typu stosowanego do małych żeli białkowych.

Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza pomiędzy płytki a skórę. Nadmiar BBBA należy ostrożnie odsączyć ręcznikiem papierowym. Tak przygotowany układ (płytka-skóra-płytka) należy umieścić na stoliku mikroskopu.

Należy zastosować oświetlenie w jasnym polu lub DIC z obiektywem 10 x oraz skokiem w osi Z wynoszącym 2 µm lub 5 µm. Używając zmechanizowanego stolika XY, należy zarejestrować montaż obrazów XY, które zostaną następnie połączone w jeden trójwymiarowy zestaw danych w skali szarości. Śledzenie rozgałęzień aksonów należy przeprowadzić w trybie półautomatycznym przy użyciu dowolnego z dostępnych pakietów oprogramowania.

Obrazowanie w polu jasnym preparatów skóry rozkładanej na płasko może być wykorzystane do obrazowania pojedynczego skórnego drzewa sensorycznego, przedstawionego tutaj wraz z jego obrazem śladowym. Obrazowanie w polu jasnym umożliwia również wizualizację wzorców mieszków włosowych na podstawie pigmentacji melaniną. Obrazy te przedstawiają skórę P1 myszy typu dzikiego i myszy z nokautem Frizzled six oraz skórę P7 myszy z nokautem Frizzled six.

Obrazowanie preparatów skóry w rozkładzie płaskim za pomocą mikroskopii świetlnej może służyć do określenia geometrii gruczołów łojowych i ich przewodów. W skórze uwidocznionej za pomocą Oil Red O gruczoły łojowe u myszy z knockoutem genu frizzled six są zdezorganizowane w porównaniu do grzbietowej części stopy myszy typu dzikiego. Skóra pobrana od myszy typu dzikiego i myszy z knockoutem frizzled six niosących keratynę KRT 17 z tagiem GFP i barwiona Oil Red O.

Barwienie Red O wykazało, że skóra z knockoutem posiada wir włosowy w centrum. Obrazowanie konfokalne preparatów skóry typu flat mount pozwala również określić geometrię mieszków włosowych zwizualizowanych za pomocą KRT 17 GFP i immunobarwienia anty-GFP oraz mięśni prostowników. Mięśnie oka zwizualizowano za pomocą immunobarwienia anty-smooth muscle actin.

Klastry komórek Merkla są wizualizowane za pomocą przeciwciał przeciwko cytokeratynie 8 lub poprzez pobieranie barwnika AM 1 43, a centralny mieszek włosowy jest wizualizowany za pomocą KRT 17 GFP. Zamiast być otwarte w stronę przednią, klaster komórek Merkla u myszy z nokautem genu Frizzled 6 tworzy zamknięty okrąg. Po opanowaniu techniki, sekcja może zostać przeprowadzona w około 30 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo, a różne barwienia można wykonać w ciągu od kilku dni do tygodnia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak pobierać skórę z różnych regionów ciała oraz jak ją barwić w celu wizualizacji różnych struktur skóry w formacie hormonalnym. Obrazy struktur skóry o pełnej grubości i wysokiej rozdzielczości można uzyskać za pomocą standardowej mikroskopii świetlnej oraz mikroskopii konfokalnej.

Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem i BBBA może być niezwykle niebezpieczna. Należy zminimalizować wdychanie oparów, przechowując te roztwory w zamkniętych pojemnikach, oraz unikać kontaktu z skórą. Nie dopuszczać do kontaktu BBBA z tworzywami sztucznymi.