Znakowanie nanozłotem układu endosomalnego drożdży do analiz ultrastrukturalnych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja przedziałów endosomalnych drożdży Saccharomyces cei na poziomie ultrastrukturalnym. Osiąga się to poprzez przygotowanie sferoplastów drożdżowych, które następnie ulegają endocytozie dodatnio naładowanych nanocząsteczek złota. W drugim kroku próbka zostaje utrwalona i poddana sekcjonowaniu w celu uzyskania ultracienkich krioprzestrojów komórek.

Następnie skrawki mrożone poddaje się reakcji wzmacniania srebrem. W celu powiększenia i wizualizacji endocytowanych, dodatnio naładowanych nanocząsteczek złota, uzyskuje się wyniki obrazujące morfologię różnych przedziałów endosomalnych drożdży na podstawie specyficznego znakowania w tej procedurze. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi dotychczasowymi metodami, takimi jak znakowanie skrawków metodą ImmunoGold, jest fakt, że nie opiera się ona na przeciwciałach, które często nie działają w preparatach do elektronowych badań mikroskopowych.

Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w system lizosomalny drożdży Saccharomyces cerevisiae, może być ona zastosowana również w innych modelach eukariotycznych, takich jak inne gatunki drożdży oraz komórki ssaków. Drożdże, z których przygotowywane będą sferoplasty, inkubuje się najpierw przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza w 10 mililitrach odpowiedniej pożywki, dobranej zgodnie z planem eksperymentu przewidzianym na następny dzień. Po pomiarze gęstości optycznej hodowli przy 600 nanometrach, należy rozcieńczyć komórki w tej samej pożywce do wartości OD 600 wynoszącej od 0,2 do 0,4.

Hodować komórki do fazy wzrostu wykładniczego, aż osiągną wartość OD 600 od jednego do dwóch. Przenieść równowartość OD 600 wynoszącą 10 komórek do probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 2100 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w pięciu ml 100 mM PBS oraz 10 mM DTT. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 10 minut. Zebrać komórki poprzez wirowanie.

Po odlaniu nadsączu, resuspensuj komórki w 5 mL medium zawierającego 1 M sorbitolu oraz 5 mg enzymu litycznego. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 30 °C przy łagodnym wytrząsaniu przez 30 minut. Wirowarkuj zawiesinę komórkową z prędkością 300 ×g przez 5 minut, aby zebrać osad stanowiący frakcję sferoplastów.

Odlej nadsącz i ponownie zawiesić sferoplasty w 960 µL schłodzonej w lodzie pożywki zawierającej 1 M sorbitolu. Przenieś mieszaninę do schłodzonej w lodzie probówki do mikrowirówki o pojemności 2 mL. Aby rozpocząć procedurę pobierania nanocząsteczek złota, użyj pipety i delikatnie wymieszaj sferoplasty z czterema dodatnio naładowanymi nanocząsteczkami złota.

Resuspendować w 40 µL wody. Końcowa objętość mieszaniny musi wynosić 1 mL. Umieścić otrzymaną zawiesinę komórkową na lodzie na 15 minut.

Przenieść zawiesinę do temperatury pokojowej i inkubować przez wymagany czas, aby umożliwić internalizację nanozłota poprzez endocytozę. Po osiągnięciu pożądanego stopnia pobrania nanozłota, zatrzymać reakcję, dodając do zawiesiny komórkowej jeden mililitr dwukrotnie stężonego utrwalacza zawierającego sorbitol 1 M. Przechowywać probówkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Podczas 30-minutowego okresu oczekiwania należy kilka razy delikatnie i ręcznie odwrócić probówkę do mikrowirówki, aby utrzymać PHE plast i zawiesinę w ruchu. Następnie odwiruj próbkę dwukrotnie przy 1700 Gs przez 25 sekund, odlej supernatant i dodaj jeden mililitr świeżego utrwalacza o standardowym stężeniu zawierającego jeden molar sorbitolu; inkubuj przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na powoli obracającym się kole. Następnie komórki są przetwarzane i poddawane kriosekcjonowaniu zgodnie z opisem w protokole tekstowym poprzedzającym tę procedurę. Przed rozpoczęciem procedury wyjmij zestaw do wzmacniania srebra z zamrażarki i rozmroź go w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Umieść rozmrożony zestaw w inkubatorze stołowym o temperaturze 24 °C, który wcześniej został umieszczony w ciemni, do momentu użycia.

Umieść płytę grzewczą w ciemnym pomieszczeniu i rozgrzej ją do temperatury końcowej 24 stopni Celsjusza. Przykryj górną część płyty grzewczej powierzchnią ochronną blatu, stroną błyszczącą do góry, i zabezpiecz ją taśmą. Na osłonie powierzchni połóż parafilm i zaznacz krawędzie czarnym markerem, aby umożliwić ich wizualizację w ciemności.

Przyklej termometr do górnej części osłony powierzchni. Aby monitorować temperaturę płyty grzejnej, stopniowo dostosuj temperaturę. Jeśli nie wynosi ona 24°C, umieść probówkę o pojemności 50 ml zawierającą wodę podwójnie destylowaną.

Wewnątrz inkubatora napełnij małą szalkę Petriego wodą dwukrotnie destylowaną, uprzednio ogrzaną do 37 °C. Umieść dwie siatki niklowe z przekrojami krio w wodzie stroną preparatu skierowaną w dół na 30 minut. Po 30 minutach napełnij drugą szalkę Petriego uprzednio ogrzaną wodą dwukrotnie destylowaną i umieść te same dwie siatki niklowe w wodzie na kolejne 30 minut.

Ponownie wypłucz siatki, przesuwając je stroną z preparatem w dół po kilku kroplach wody dwukrotnie destylowanej o temperaturze 24 °C, umieszczonych na szkiełku zegarkowym utrwalonym na płycie grzejnej. Upewnij się, że na szkiełku zegarkowym przygotowano dziewięć dodatkowych kropel wody dwukrotnie destylowanej do płukania po reakcji wzmacniania srebrem. Na tym etapie procedury wszystkie światła w ciemni muszą zostać wyłączone, a zapalone musi zostać światło czerwone.

Jednakże, wyłącznie na potrzeby filmowania, światło pozostanie włączone. W tej demonstracji należy wyjąć roztwory A i B z zestawu do wzmacniania srebra z inkubatora ustawionego na 24 °C do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml, odmierzając sześć kropli roztworu A, a następnie sześć kropli roztworu B, i dokładnie wymieszać za pomocą szklanej pipety Pasteura, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Roztwór należy wymieszać w wstrząsarze typu vortex.

Krótko przenieś roztwory A i B z powrotem do inkubatora ustawionego na 24°C i wyjmij roztwór C. Dodaj sześć kropli roztworu C do mieszaniny AB. Ponownie wymieszaj za pomocą pipety Pasteura, a następnie użyj wortexa, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.

Uzyskanej końcowej mieszaniny należy użyć natychmiast. Za pomocą czystej pęsety antymagnetycznej nanieś krople na parafilm. Następnie umieść siateczki w mieszaninie.

Jest to reakcja wzmacniania srebrem. Pozostaw siatki na czas od 6 do 15 minut, w zależności od pożądanego stopnia wzmocnienia dla danego eksperymentu. Wyjmij siatki z mieszaniny i szybko przepłucz je w serii sześciu kropli wody dwukrotnie destylowanej umieszczonych na Perfilu, przy czym ostatnie trzy płukania wykonaj w temperaturze 24 °C.

Pozostaw siatki na siedem minut na każdą kroplę wody. W przypadku przeprowadzania rzeczywistego eksperymentu, po zakończeniu płukania włącz ponownie światło. Następnie wyniki są wizualizowane za pomocą znakowania ImmunoGold lub barwienia membrany w celu przeprowadzenia badania EM.

Różne rodzaje przedziałów endosomalnych drożdży można znakować nanozłotem wzmocnionym srebrem i wizualizować za pomocą mikroskopii elektronowej. Pięciominutowe pobieranie nanozłota pozwala na znakowanie błony plazmatycznej oraz wczesnych przedziałów endosomalnych, takich jak pojedyncze pęcherzyki, które prawdopodobnie są pęcherzykami endocytowymi, oraz struktury cewkowate, które z dużym prawdopodobieństwem są wczesnymi endosomami. 30-minutowa inkubacja z nanozłotem prowadzi do znakowania późnych endosomów lub ciał wielopęcherzykowych.

Moc rozdzielcza połączenia procedury immuno-mikroskopii elektronowej z tym protokołem nano-złotej intensyfikacji srebrem jest podkreślona przez zachowanie i jakość morfologii pokazanych organelli, w szczególności wewnętrznych pęcherzyków ciał wielopęcherzykowych. Przed zastosowaniem metody intensyfikacji srebrem konieczne jest przeprowadzenie eksperymentu pilotażowego w celu określenia optymalnego czasu inkubacji niezbędnego dla uzyskania odpowiedniego rozmiaru i jednorodności tych cząsteczek srebra. Postępuj zgodnie z poniższą procedurą.

W celu odpowiedzi na pytania takie jak lokalizacja konkretnego białka w określonym przedziale podmembranowym można zastosować inne metody, np. znakowanie immunologiczne.