Name: Znakowanie nanozłotem układu endosomalnego drożdży do analiz ultrastrukturalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę znakowania nanozłotem kompartmentów endosomalnych drożdży Saccharomyces cerevisiae do analiz ultrastrukturalnych. Technika ta umożliwia szczegółowe wizualizowanie struktur komórkowych bez konieczności stosowania przeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują René Scriwankowi za pomoc w przygotowaniu rysunku. F.R. jest wspierany przez granty ECHO (700.59.003), ALW Open Program (821.02.017 i 822.02.014), DFG-NWO cooperation (DN82-303) i ZonMW VICI (016.130.606).

1. Przygotowanie sferoplastów
<ol>
	<li>Drożdże inkubować przez noc w temperaturze 30 °C w 10 ml odpowiedniej pożywki określonej przez projekt doświadczenia.</li>
	<li>Następnego dnia zmierz gęstość optyczną kultury przy 600 nm (OD600) za pomocą fotometru, rozcieńczyć komórki w tej samej pożywce hodowlanej do OD600 0,2-0,4 i wyhoduj je do fazy wzrostu wykładniczego, chyba że projekt eksperymentu wymaga innych warunków. Komórki znajdują się w fazie wykładniczej, gdy hodowla ma OD600 1-2.</li>
	<li>Zebrać 10 OD600 ekwiwalentów komórek przez odwirowanie przy 3 500 x g przez 5 minut w probówce o pojemności 50 ml. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 5 ml 100 mM RUR (pH 9,6), 10 mM ditiotreitolu i inkubować w temperaturze 30 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Zebrać ponownie komórki przez odwirowanie w stężeniu 3 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 5 ml pożywki (określonej przez projekt doświadczenia) zawierającej 1 M sorbitol i 5 mg enzymu litycznego i inkubować mieszaninę w temperaturze 30 °C, delikatnie wstrząsając przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 5 minut, aby zebrać frakcję osadów, która odpowiada sferoplastom. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić sferoplasty w 960 μl lodowatej pożywki (pożywka określona przez projekt eksperymentu) zawierającej 1 M sorbitol i przenieść mieszaninę do lodowatej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
2. Absorpcja nanozłota
<ol>
	<li>Za pomocą pipety delikatnie wymieszaj sferoplast z 4 nmol dodatnio naładowanych cząstek nanozłota zawieszonych w 40 μl wody. Ostateczna objętość mieszaniny musi wynosić 1 ml.</li>
	<li>Otrzymaną zawiesinę komórkową umieścić na lodzie na 15 minut.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę w temperaturze pokojowej i inkubować ją przez wymagany czas, aby umożliwić internalizację nanozłota przez endocytozę. 
	UWAGA: 5-minutowy wychwyt doprowadzi głównie do znakowania pęcherzyków endocytarnych i wczesnych kompartmentów endosomalnych, podczas gdy 15-minutowy wychwyt pozwoli na oznaczenie całego układu endosomalnego (wczesne i późne endosomy). Dłuższy czas inkubacji (ponad 30 minut) pozwoli również na oznakowanie wakuoli. 
	UWAGA: Tą metodą nie można przeprowadzać eksperymentów z etykietowaniem impulsowym. W związku z tym, przy znakowaniu do analizy LE, nanozłoto znajdzie się również w PM i inEE.</li>
</ol>
3. Utrwalenie i podział na sekcje
<ol>
	<li>Zatrzymaj wchłanianie nanozłota, dodając 1 ml utrwalacza o podwójnej mocy [4% paraformaldehydu (PFA), 0,4% aldehydu glutarowego (GA) w 0,1 M buforze PHEM (20 mM PIPES, 50 mM HEPES, pH 6,9, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl2)] zawierającego 1 M sorbitol do zawiesiny komórek. Utrzymuj probówkę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie ręcznie odwrócić probówki mikocentryczne kilka razy w ciągu 30 minut (pozwoli to na utrzymanie sferoplastów w zawiesinie), a następnie odwirować je dwukrotnie przy 1 700 x g przez 25 sekund.</li>
	<li>Zastąpić utrwalacz, odrzucając supernatant i dodając 1 ml świeżego utrwalacza o standardowej mocy (2% PFA, 0,2% GA w 0,1 M buforze PHEM) zawierającego 1 M sorbitol i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na wolno obracającym się kole.</li>
	<li>Przetwarzaj komórki do kriosekcji, jak opisano wcześniej6. UWAGA: W przypadku zabiegów wychwytu nanozłota i wzmacniania srebra nie należy wykonywać okresowego leczenia kwasem opisanego we wskazanym protokole. Leczenie kwasem okresowym ma na celu lepszą przepuszczalność ściany komórkowej26, ale struktura ta została wyeliminowana podczas wytwarzania sferoplastów.</li>
	<li>Wyciąć cienkie kriosekcje o długości fali 50 nm w temperaturze -120 °C suchym nożem diamentowym za pomocą ultramikrotomu UCT, jak opisanowcześniej 8 i umieścić je na siatkach niklowych Formvar o 50 oczkach powlekanych węglem.</li>
</ol>
4. Ulepszenie srebra do wizualizacji cząsteczek nanozłota
UWAGA: Procedura przygotowania mieszanin reakcyjnych jest zasadniczo taka sama, jak wskazana przez producenta. Praktyczne adaptacje z wykorzystaniem tego protokołu sprawiają, że procedura wzmacniania srebra jest skuteczna i niezawodna w przypadku kriosekcji.
<ol>
	<li>Wyjmij srebrny zestaw wzmacniający z zamrażarki i rozmroź go w inkubatorze lub łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu umieścić zestaw w inkubatorze o temperaturze 24 °C umieszczonym w ciemnym pomieszczeniu do czasu użycia (patrz 4.7).</li>
	<li>Umieść płytę grzewczą w ciemnym pomieszczeniu i podgrzej ją do końcowej temperatury 24 °C.</li>
	<li>Przykryj górną część płyty grzewczej osłoną powierzchni, błyszczącą stroną do góry i zabezpiecz ją taśmą.</li>
	<li>Umieść Parafilm na Benchkote i zaznacz krawędzie czarnym markerem, aby móc zobaczyć krawędzie Parafilmu w ciemności.</li>
	<li>Przyklej termometr na górze Benchkote, aby monitorować temperaturę płyty grzewczej. Stopniowo reguluj temperaturę, jeśli nie 24 °C.</li>
	<li>Umieść w środku probówkę o pojemności 50 ml z podwójnie destylowaną wodą i srebrnym zestawem wzmacniającym.</li>
	<li>Napełnij małe szalki Petriego podwójnie destylowaną wodą, wstępnie podgrzaną w temperaturze 37 °C. Umieść kratki w wodzie próbką do dołu na 30 minut.</li>
	<li>Powtórz ten krok 4.7 jeszcze raz.</li>
	<li>Przenieś siatki do schowka i przynieś je do ciemnego pokoju.</li>
	<li>Ponownie przepłukać kratki, przesuwając je (próbką do dołu) na kilka kropli podwójnie destylowanej wody o temperaturze 24 °C umieszczonej na Parafilmie, który został przymocowany do płyty grzewczej.</li>
	<li>Upewnij się, że 9 dodatkowych kropel podwójnie destylowanej wody jest gotowych na Parafilm, do płukania po reakcji wzmacniania srebra.</li>
	<li>Wyłącz światło i upewnij się, że wszystkie światła są wyłączone. Włącz czerwone światło.</li>
	<li>Z inkubatora o temperaturze 24 °C wyjąć roztwory A i B z zestawu wzmacniającego srebro.</li>
	<li>Umieść najpierw 6 kropli roztworu A, a następnie 6 kropli roztworu B w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i dobrze wymieszaj szklaną pipetą Pasteura, unikając tworzenia pęcherzyków. Roztwór jest dość gęsty i należy go ręcznie wymieszać pipetą, a na koniec krótko go zawirować.</li>
	<li>Umieścić roztwory A i B z powrotem w inkubatorze o temperaturze 24 °C i wyjąć roztwór C.</li>
	<li>Dodaj 6 kropli roztworu C do mieszanki A/B. Następnie ponownie wymieszaj, najpierw pipetą Pasteura, a następnie wirując, unikając tworzenia pęcherzyków.</li>
	<li>Natychmiast użyj końcowej mieszanki, umieszczając krople (~20 μl/kroplę) na Parafilmie.</li>
	<li>Za pomocą czystej, antymagnetycznej pęsety umieść siatki na mieszaninie (np. reakcja wzmacniająca srebro) na 6 do 15 minut, w zależności od pożądanego wzmocnienia (tj. wielkości cząsteczek złota).</li>
	<li>Usunąć kratki z mieszaniny i przepuścić je na wierzch kropli podwójnie destylowanej wody w temperaturze 24 °C do prania. Najpierw użyj w krótkim odstępie czasu 6 kropli, a następnie 3 kropli z 7-minutowym czasem inkubacji na kroplę, przed włączeniem świateł.</li>
	<li>Przejdź do następnego kroku, znakowania immuno-złotem lub barwienia błony27 w celu wizualizacji wyniku badania EM.</li>
</ol>

<ol><li>Gruenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocytic+pathway%3A+a+mosaic+of+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The endocytic pathway: a mosaic of domains.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).</li>
<li>Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes%3A+multipurpose+designs+for+integrating+housekeeping+and+specialized+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks.</a> Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).</li>
<li>Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Meel, E., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+imagination%3A+understanding+the+endo-lysosomal+system%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system.</a> Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).</li>
<li>Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+screen+for+vacuolar+protein+sorting+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+nanogold-labeled+endocytic+compartments+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+using+a+cryosectioning+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure.</a> J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).</li>
<li>Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESCRT-III%3A+an+endosome-associated+heterooligomeric+protein+complex+required+for+MVB+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting.</a> Dev Cell. 3, 271-282 (2002).</li>
<li>Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryosectioning+procedure+for+the+ultrastructural+analysis+and+the+immunogold+labelling+of+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 9, 1060-1072 (2008).</li>
<li>Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+retrieval+of+the+exocytic+SNARE+Snc1p+from+early+yeast+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes.</a> Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordering+of+compartments+in+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway.</a> Traffic. 3, 37-49 (2002).</li>
<li>Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fab1p+PtdIns%283%29P+5-kinase+function+essential+for+protein+sorting+in+the+multivesicular+body%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body.</a> Cell. 95 (3), 847-858 (1998).</li>
<li>Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+labeling+of+cryosections+from+high-pressure+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells.</a> Traffic. 8, 471-485 (2007).</li>
<li>Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neutral+pH+silver+development+method+for+the+visualization+of+1-nanometer+gold+particles+in+pre-embedding+electron+microscopic+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry.</a> J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).</li>
<li>Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+visualization+of+insulin+translocation+into+the+cytoplasm+and+nuclei+of+intact+H35+hepatoma+cells+using+covalently+linked+Nanogold-insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin.</a> Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).</li>
<li>Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+enhancement+at+the+electron+microscopic+level+using+Nanogold+and+gold-based+autometallography%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography.</a> Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).</li>
<li>Cabrera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+a+membrane+curvature-sensing+motif+switches+function+of+the+HOPS+subunit+Vps41+in+membrane+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering.</a> J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).</li>
<li>Harner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+contact+site+complex%2C+a+determinant+of+mitochondrial+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture.</a> EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+proteins+are+required+for+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SNARE proteins are required for macroautophagy.</a> Cell. 146, 290-302 (2011).</li>
<li>Jacquier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li>
<li>Karanasios, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid+droplet+and+membrane+biogenesis+by+the+acidic+tail+of+the+phosphatidate+phosphatase+Pah1p%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p.</a> Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).</li>
<li>Mari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Atg9-containing+compartment+that+functions+in+the+early+steps+of+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis.</a> J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).</li>
<li>Nair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+Atg8-PE+deconjugation+in+autophagosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis.</a> Autophagy. 8, 780-793 (2012).</li>
<li>Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exit+from+the+Golgi+is+required+for+the+expansion+of+the+autophagosomal+phagophore+in+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).</li>
<li>Erpapazoglou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+role+for+K63-linked+ubiquitin+chains+in+multivesicular+body+biogenesis+and+cargo+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting.</a> Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).</li>
<li>Tuinen, E., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%2C+hexokinase%2C+and+carboxypeptidase+Y+in+yeast+cells+at+the+ultrastructural+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level.</a> J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).</li>
<li>Slot, J. W., Geuze, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+and+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning and immunolabeling.</a> Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).</li>
<li>Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+the+yeast+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of the yeast endocytic pathway.</a> Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).</li>
<li>Vida, T. A., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+vital+stain+for+visualizing+vacuolar+membrane+dynamics+and+endocytosis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast.</a> J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).</li>
<li>Hainfeld, J. F., Powell, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+frontiers+in+gold+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">New frontiers in gold labeling.</a> J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroskopia immunoelektronowa to technika, która pozwala połączyć lokalizację białek z ultrastrukturalną rozdzielczością nośników i organelli, w których te białka się znajdują. Jest to szczególnie ważne podczas badania układu endosomalnego drożdży, ponieważ jego przedziały wyglądają jak struktury punktowe w mikroskopii fluorescencyjnej. Trudno je zatem rozróżnić. Z tego powodu użycie sondy wykrywalnej przez EM i wprowadzającej drogę endocytarną w sposób zależny od czasu ma kluczowe znaczenie dla specyficznego oznaczenia ...

System endosomalny to główny aparat do sortowania błon, który pełni wiele kluczowych ról komórkowych, w tym transport receptorów sortowania enzymów lizosomalnych i recykling receptorów błony plazmatycznej (PM)1,2. Endosomy są podzielone na trzy różne przedziały, tj. endosomy wczesne (EE), endosomy późne (LE) i endosomy recyklingowe. Klasyfikacja ta opiera się na czasie potrzebnym do dotarcia do nich materiału endocytozowego, na specyficznych białkach markerowych i ich morfologii. Błony, tj. dwuwarstwy białkowe i lipidowe, zinternalizowane z PM mogą być dostarczane do lizosomów przez endosomy w celu degradacji lub być zawracane z powrotem. Błony są również transportowane do endosomów z Golgiego i podobnie, albo kontynuują lizosomy, albo są odzyskiwane z powrotem do Golgiego. Co więcej, białka mogą być sortowane w pęcherzyki świetlne pączkujące do wewnątrz od endosomalnej błony ograniczającej, proces, który prowadzi do powstania podkategorii LE, ciał wielopęcherzykowych.
Endosomalny system drożdży jest stosunkowo mniej skomplikowany niż ten z wysoko osadzonych komórek eukariotycznych. Endosomy drożdży dzielą się na EE i LE. W przeciwieństwie do komórek ssaków nie zawierają endosomów recyklingowych, ale także organelle związane z lizosomami specyficznymi dla tkanki. W związku z tym mają mniej złożoną sieć endosomalnych szlaków transportowych3,4. Dlatego drożdże stanowiły i nadal stanowią korzystny system eksperymentalny do badania niektórych zasad leżących u podstaw ruchu błonowego w układzie endosomalnym. Zaletę tę podkreśla fakt, że liczne geny zaangażowane w szlaki endosomalne zostały początkowo wyizolowane za pomocą genetycznych badań przesiewowych u drożdży5. Podczas gdy układ endosomalny drożdży w komórkach typu dzikiego i zmutowanych był szeroko badany przy użyciu metod mikroskopii biochemicznej i fluorescencyjnej, jego badania na poziomie ultrastrukturalnym były tylko minimalne. Analizy morfologiczne są szczególnie istotne w przypadku drożdży, ponieważ większość organelli endosomalnych jest wykrywana jako struktury punktowe za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, co utrudnia ich jednoznaczną identyfikację6. Niestety, tylko ograniczona liczba surowic odpornościowych rozpoznających endosomalne markery białkowe drożdży działa w preparatach immuno-mikroskopii elektronowej (IEM)7-10. W przypadku niektórych białek problem ten został ominięty przez endogenne znakowanie interesującego genu i zastosowanie przeciwciała rozpoznającego znacznik w celu jego wykrycia7,11,12. Często jednak białka są niewykrywalne przez IEM ze względu na ich niski poziom ekspresji. Ich nadekspresja nie jest rozwiązaniem, ponieważ takie podejście może wywołać błędne lokalizacje i/lub zmiany w morfologii/funkcjach organelli. W związku z tym znakowanie przedziałów endocytarnych za pomocą sondy wykrywalnej za pomocą mikroskopii elektronowej EM jest skuteczną opcją. Jest to optymalne rozwiązanie zwłaszcza wtedy, gdy sonda wchodzi w drogę endocytarną w sposób zależny od czasu, co pozwala wiedzieć, kiedy oznaczy konkretną organellę6.
Wychwyt dodatnio naładowanego nanozłota przez sferoplasty drożdży (tj. drożdże, z których ściana komórkowa została enzymatycznie usunięta) został z powodzeniem wykorzystany do identyfikacji endosomalnych przedziałów drożdży10. Cząstki te silnie wiążą się z ujemnie naładowanymi lipidami tworzącymi błony biologiczne. W ten sposób dodatnio naładowane nanozłoto wiąże się z PM, przenika do komórki przez endocytozę i przechodzi przez EE i LE, zanim dotrze do wakuoli. Te małe cząsteczki złota nie mają jednak odpowiedniego rozmiaru, aby mogły być widziane przez EM. Aby uczynić je widocznymi, ich rozmiar można powiększyć w wyniku reakcji chemicznych, które prowadzą do osadzania się srebra lub złota wokół złotej sondy13-15. Opracowaliśmy i z powodzeniem zastosowaliśmy podejście IEM oparte na metodzie Tokuyasu do przeprowadzenia badań lokalizacji subkomórkowej8,16. Metoda ta pozwala na znakowanie immunozłotem preparatów drożdżowych z doskonałą rozdzielczością morfologii8,17-24. Ustaliliśmy również procedurę łączącą ten protokół IEM z znakowaniem nanozłotem przedziałów układu endosomalnegodrożdży 6. Stosując to podejście, scharakteryzowaliśmy morfologicznie różne podklasy endosomów i ultrastrukturalnie przebadano mutanty z endosomalnym defektem transportu6,25. Co więcej, wykazaliśmy, że to znakowanie nanozłotem można łączyć z znakowaniem immunozłotem, co daje możliwość zbadania dystrybucji interesującego białka w różnych subpopulacjach endosomów. W tym artykule przedstawiamy, w jaki sposób praktycznie przebiega znakowanie układu endosomalnego drożdży dodatnio naładowanym nanozłotem.

<table><tbody><tr><td>RURY (piperazyna-1,4-bis (2-etansulfensaure)</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1,102,200,250</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>391,340</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma, St Louis, MO</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1,058,330,250</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Dodatnio naładowane nanosondy nanozłota</td><td>, Yaphank, NY</td><td>2022</td><td>sklep pod adresem -20 &deg; C</td></tr><tr><td>HQ-silver&trade; zestaw wzmacniający</td><td>Nanosondy, Yaphank, NY</td><td>2012</td><td>sklep pod adresem -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma, St Louis, MO</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 8% klasy EM</td><td>Polyscience, Inc., Warrington, PA</td><td>216</td><td>przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Enzym lityczny</td><td>MP Biomedicals, Santa Ana, CA</td><td>153526</td><td>przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>50 siatek siatek niklowych&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, Wielka Brytania</td><td>G209N</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy krioimmunologiczny 35&deg;</td><td>Diatome AG, Biel, Szwajcaria</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom UCT&nbsp;</td><td>Leica, Solms, Niemcy</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 15/95 żywiczna</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>50 siatek niklowych&nbsp;</td><td>Agar Scientific, Stansted, Wielka Brytania</td><td>AGG2050N</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma, St louis, MO</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka do przechowywania siatek</td><td>Leica, Solms, Niemcy</td><td>162-50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm szalka Petriego</td><td>Corning, Corning, Nowy Jork</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Pipety kapilarne Pasteura 150 mm</td><td>Van Bruggen Glas, Rotterdam, Holandia</td><td>10216234</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka 1,5 ml&nbsp;</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Niemcy</td><td>72690001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubka</td><td>Bio-one, Alphen aan den Rijn, Holandia</td><td>210296</td><td></td></tr><tr><td>Ochraniacz powierzchni Benchkote</td><td>Whatman, Maidstone, Wielka Brytania&nbsp;</td><td></td><td></td>1159201</tr></tbody></table>

znakowanie nanozłotem układu endosomalnego drożdży do analiz ultrastrukturalnych

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomy są jednym z głównych punktów kontrolnych sortowania błon w komórkach eukariotycznych i regulują recykling lub niszczenie białek, głównie z błony plazmatycznej i Golgiego. W rezultacie układ endosomalny odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy komórek, a mutacje w genach należących do tej sieci organelli połączonych transportem pęcherzykowym powodują poważne patologie, w tym raka i zaburzenia neurobiologiczne. Dlatego tak ważne jest zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw biogenezy i organizacji układu endosomalnego. Drożdże Saccharomyces cerevisiae odegrały kluczową rolę w tym zadaniu. Aby dokładnie oznaczyć i przeanalizować na poziomie ultrastrukturalnym układ endosomalny tego organizmu modelowego, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół wychwytu dodatnio naładowanego nanozłota przez sferoplasty, a następnie wizualizacji tych cząstek poprzez reakcję wzmacniania srebra. Metoda ta jest również cennym narzędziem do badania morfologicznego mutantów z defektami w transporcie endosomalnym. Co więcej, ma zastosowanie nie tylko do badań ultrastrukturalnych, ale może być również łączony z znakowaniem immunogold w celu badania lokalizacji białek.

Zgodnie z przedstawionym protokołem, morfologię układu endosomalnego drożdży można badać za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Rysunek 1 przedstawia różne typy przedziałów endosomalnych, które zostały osiągnięte, a w konsekwencji oznakowane nanocząsteczkami złota. Nanocząsteczki złota po wzmocnieniu srebrem są wyraźnie widoczne jako gęste elektronowo cząsteczki. Optymalne ustawienia reakcji wzmacniania srebrem pozwalają na uzyskanie cząsteczek złota w jednorodnym zakresie wielkości od 5...

Drożdże, Saccharomyces cerevisiae, były kluczowym organizmem modelowym do identyfikacji i badania genów regulujących biogenezę i funkcje układu endosomalnego. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół specyficznego znakowania przedziałów endosomalnych do badań ultrastrukturalnych.

Znakowanie nanozłotem układu endosomalnego drożdży do analiz ultrastrukturalnych

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wizualizacja przedziałów endosomalnych drożdży Saccharomyces cei na poziomie ultrastrukturalnym. Osiąga się to poprzez przygotowanie sferoplastów drożdżowych, które następnie ulegają endocytozie dodatnio naładowanych nanocząsteczek złota. W drugim kroku próbka zostaje utrwalona i poddana sekcjonowaniu w celu uzyskania ultracienkich krioprzestrojów komórek.Następnie skrawki mrożone poddaje się reakcji wzmacniania srebrem. W celu powiększenia i wizualizacji endocytowanych, dodatnio naładowanych nanocząsteczek złota, uzyskuje się wyniki obrazujące morfologię różnych przedziałów endosomalnych drożdży na podstawie specyficznego znakowania w tej procedurze. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi dotychczasowymi metodami, takimi jak znakowanie skrawków metodą ImmunoGold, jest fakt, że nie opiera się ona na przeciwciałach, które często nie działają w preparatach do elektronowych badań mikroskopowych.Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w system lizosomalny drożdży Saccharomyces cerevisiae, może być ona zastosowana również w innych modelach eukariotycznych, takich jak inne gatunki drożdży oraz komórki ssaków. Drożdże, z których przygotow

nanogold-labeling-yeast-endosomal-system-for-ultrastructural

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Nanogold Labeling systemu endosomalnego drożdży w analizach ultrastrukturalnych

Białka fuzyjne z GFP są powszechnie wykorzystywane do wizualizacji organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednak przesiewanie mutacji wpływających na morfologię organelli zazwyczaj wymaga indywidualnej mutogenezy i jest czasochłonne. W niniejszej pracy prezentujemy metodę jednoczesnego wprowadzenia markerów organelle-GFP do prawie 5 000 genów nieessentialnych u drożdży.

Wysokoprzepustowa metoda globalnego badania morfologii organelli w *S. cerevisiae*

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł opisuje metody syntezy i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek (NP). Nanocząsteczki zastosowano w eksperymentach z pogonią za impulsami w celu oznaczenia układu endolizosomalnego komórek eukariotycznych. Manipulację układu endo-lizosomalnego przez aktywność wewnątrzkomórkowego patogenu Salmonella enterica przeprowadzono następnie za pomocą obrazowania żywych komórek i określono ilościowo.

Zastosowanie nanocząstek fluorescencyjnych do badania przebudowy układu endolizosomalnego przez bakterie wewnątrzkomórkowe

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Obecny protokół opisuje technologię znakowania za pomocą klonowalnego mikroskopu elektronowego do wykrywania białek znakowanych metalotioneiną w komórkach za pomocą nowatorskiej techniki syntezy nanocząstek złota opartej na mechanizmie tłumienia autonukleacji.

Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

Poznaj metodę znakowania nanozłotem kompartmentów endosomalnych drożdży Saccharomyces cerevisiae do analiz ultrastrukturalnych. Technika ta umożliwia szczegółowe wizualizowanie struktur komórkowych bez konieczności stosowania przeciwciał.

Znakowanie nanozłotem układu endosomalnego drożdży do analiz ultrastrukturalnych

Przeglądaj więcej filmów