Pomiar funkcji oddechowych u myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała
12 sierpnia 2014
Ocena fizjologii układu oddechowego tradycyjnie opierała się na technikach, które wymagają unieruchomienia lub uspokojenia zwierzęcia. Nieskrępowana pletyzmografia całego ciała zapewnia jednak precyzyjną, nieinwazyjną, ilościową analizę fizjologii układu oddechowego w modelach zwierzęcych. Ponadto technika ta umożliwia wielokrotną ocenę układu oddechowego myszy, co pozwala na badania podłużne.
Ogólnym celem tej procedury jest pomiar parametrów oddechowych przytomnego gryzonia za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała. Osiąga się to poprzez pierwszą kalibrację wzmacniacza mostkowego. Po kalibracji mysz umieszcza się w komorze pletyzmografii i pozwala na aklimatyzację przed badaniem.
Następnie rejestrowane są zmiany ciśnienia, które zachodzą w komorze. Na podstawie informacji uzyskanych podczas korzystania z systemu pletyzmografii oblicza się następnie wiele parametrów oddechowych. Wyniki pokazują, że nieograniczona pletyzmografia całego ciała jest wiarygodną oceną czynności płuc u gryzoni.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak inwazyjna pletyzmografia, jest to, że zwierzęta nie są znieczulane, co oznacza, że nie kojarzymy artefaktów ze znieczuleniem. Ponadto, ze względu na nieinwazyjny charakter tego protokołu, pozwala on na pomiary podłużne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej technice, mają tendencję do niedoceniania czasu potrzebnego na aklimatyzację zwierząt do komory plazmowej.
Aby rozpocząć, skonfiguruj wzmacniacz mostka maszyny do akwizycji danych i przetwornik ciśnienia. Gdy wszystko będzie gotowe, przejdź do komputera i otwórz oprogramowanie do analizy. Otwórz opcję ustawień kanału znajdującą się na pasku narzędzi ustawień i zmień liczbę nagrywanych kanałów na jeden.
Następnie ustaw aparat do słupa wody, jak pokazano. Połącz dwie pięciomililitrowe pipety serologiczne z plastikową rurką. Napełnij kolumny wodą i upewnij się, że poziom wody jest zrównoważony.
Za pomocą linijki połącz jeden kawałek plastikowej rurki z górną częścią każdej pipety. Aby skalibrować wzmacniacz mostkowy, najpierw podłącz jednomililitrową strzykawkę wypełnioną 300 mikrolitrami powietrza po prawej stronie słupa wody. Podłącz rurkę po lewej stronie do złącza na przetworniku ciśnienia.
Następnie otwórz menu przewijane w dół i wybierz wzmacniacz mostkowy. Wprowadź prawidłowe ustawienia i kliknij zero, aby ustawić ścieżkę na około zero miliwoltów. Gdy będziesz gotowy, wciśnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra, uzyskane ciśnienie przesunie wodę w kolumnie o jeden centymetr i pokaże nagły skok w oprogramowaniu z powodu zmiany ciśnienia.
Następnie wybierz jednostki wejściowe z okna wzmacniacza mostka i podświetl ślad tła przed skokiem, znany również jako obszar zerowy. Kliknij strzałkę obok wartości 0,1, aby wytworzyć sygnał tła w zakresie od minus 0,002 miliwolta do dodatniego 0,002 miliwolta. Wpisz zero w oknie sąsiadującym z oknem sygnału tła.
Zaznacz na wykresie obszar zwiększonego ciśnienia od momentu wciśnięcia strzykawki. Kliknij strzałkę obok pozycji 0,2. Wartość powinna mieścić się w zakresie od 0,9 do 1,2 miliwolta.
Następnie wpisz jeden w oknie. Obok okna zwiększonego ciśnienia przejdź do zdefiniowania jednostek i wybierz centymetry H2O i naciśnij OK. Wróć do menu wzmacniacza mostka.
Wybierz jeden miliwolt i ustaw wzmacniacz na zero. Spowoduje to zakończenie kalibracji, a słup wody będzie można bezpiecznie usunąć. W celu uzyskania najlepszych wyników, badane zwierzęta powinny zostać wprowadzone do komory pletyzmografii na tydzień przed rozpoczęciem doświadczeń.
Na początek umieść wilgotność względną temperatury, sondę na jednym całym końcu komory pletyzmografii i zapisz temperaturę, wilgotność i ciśnienie atmosferyczne. Po zarejestrowaniu wagi zwierzęcia i temperatury ciała należy umieścić je w komorze pletyzmografii i zamknąć komorę. Następnie włóż przetwornik i strzykawkę do dwóch otworów po drugiej stronie komory.
Naciśnij start w oprogramowaniu i nagrywaj przez maksymalnie 45 sekund. Upewnij się, że zapisujesz dane przez pięć sekund, gdy zwierzę się nie porusza. Zatrzymaj nagrywanie po 45 sekundach i wyjmij mysz z komory pletyzmografii.
Natychmiast zapisz temperaturę i wilgotność w komorze. Umieść mysz z powrotem w klatce w sprayu i wytrzyj komorę 80% objętością na objętość. Etanol pozwala komorze wyschnąć i powrócić do podstawowej temperatury i wilgotności przed przejściem do następnej myszy.
Aby rozpocząć, otwórz program na pełnym ekranie i wybierz dane. Otwórz mini okno konsoli danych i wybierz pomiary cyklu w lewej kolumnie i średnią wysokość cykliczną. W prawej kolumnie kolumny pierwszej wybierz opcję i ustaw skalę wykrywania minimalnego piku na jeden.
Spowoduje to wyświetlenie deflacji ciśnienia spowodowanej pomiarem objętości oddechowej PT w mini padowniku danych. Wybierz pomiary cyklu, a następnie liczbę zdarzeń, aby przedstawić pomiar częstotliwości F. Następnie wybierz pomiary cyklu, a następnie średni okres cykliczny, aby przedstawić całkowity czas cyklu oddychania T tote sekundy pomiaru w celu wygenerowania szczytowych wartości wdechu i czasu wydechu, upewnij się, że kursor znajduje się bezpośrednio nad maksimum szczytowego dołka i dodaj komentarz do dziewięciu sekwencyjnych szczytów i dołków.
Otwórz nowe okno i kliknij informacje o zaznaczeniu w lewej kolumnie i czas trwania w prawej kolumnie przed wybraniem. Okej, wybierz makro znajdujące się w górnej części programu, aby rozpocząć nagrywanie. Następnie zlokalizuj pierwsze pole komentarza za pomocą narzędzia do majsterkowania.
Przejdź do początku pliku, a następnie do pierwszego komentarza i wybierz polecenie dodaj do konsoli danych. Na koniec wybierz rozpocznij Powtórz z makropoleceń i upewnij się, że okno liczby powtórzeń jest ustawione na dziewięć. Użyj opcji znajdź następny i wybierz polecenie dodaj do konsoli danych.
Po zakończeniu wybierz i powtórz. Zatrzymaj nagrywanie i zapisz makro na podstawie liczby zwierząt. Makro można teraz uruchomić, aby uzyskać inspirację i czas wygaśnięcia między każdym komentarzem.
Ponieważ wygaśnięcie i wdech następują po sobie, dane pojawiają się w tej kolejności i muszą zostać ręcznie podzielone. Ten ślad oddechowy ilustruje odpowiednie, spójne dane od zwierzęcia kontrolnego. Dziewięć kolejnych komentarzy dodaje się do szczytów i dołków oscylacji oddechowych w celu uzyskania parametrów oddechowych.
Poniższe przykłady pokazują najczęstsze ślady nieoptymalne, które nigdy nie powinny być używane do analizy. Ślad ten został zarejestrowany, gdy zwierzę wąchało i poruszało się, ślad z oscylacjami, które stopniowo rosną w czasie, jest zwykle spowodowany kondensacją i gromadzeniem się wilgoci. Hałas w tym śladzie jest wynikiem interakcji zwierzęcia lub badacza ze sprzętem.
Rysunek ten przedstawia czynność płuc myszy ze zwłóknieniem płuc wywołanym bleomycyną. Zwróć uwagę na nieregularny wzór w śladzie oddechowym. Po opanowaniu techniki i skalibrowaniu sprzętu, dane można zebrać od każdego zwierzęcia w ciągu pięciu minut.
Zebrane dane można następnie przeanalizować i wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego Excel. Chociaż próba tej procedury jest ważna, aby zaaklimatyzować mysz do komory pletyzmografii przed zebraniem danych, może się to różnić w zależności od szczepu myszy. Średnio używamy czarnych sześciu myszy C 57 u nastolatków, a to zajmie od czterech do pięciu dni przed zebraniem danych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule omówiono zastosowanie nieograniczonej pletyzmografii całego ciała do pomiaru parametrów oddechowych u świadomych gryzoni. Ta nieinwazyjna technika umożliwia precyzyjną i powtarzalną ocenę fizjologii układu oddechowego, co ułatwia prowadzenie badań podłużnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia układu oddechowego
- Modele zwierzęce
- Techniki nieinwazyjne
Wstęp
- Tradycyjne metody oceny fizjologii układu oddechowego często wymagają sedacji lub unieruchomienia zwierząt.
- Bezużycie pletyzmografia całego ciała stanowi nieinwazyjną alternatywę.
- Technika ta umożliwia wielokrotne pomiary w czasie.
- Jest ona szczególnie użyteczna w badaniu funkcji płuc u gryzoni.
Cel badania
- Pomiar parametrów oddechowych u przytomnych gryzoni.
- Wykazanie niezawodności nieograniczonej pletyzmografii całego ciała.
- Umożliwienie prowadzenia podłużnych badań nad fizjologią układu oddechowego.
Zastosowane metody
- Kalibracja wzmacniacza pomostowego.
- Aklimatyzacja myszy w komorze pletyzmograficznej.
- Rejestracja zmian ciśnienia wewnątrz komory.
- Obliczenie wielu parametrów oddechowych na podstawie zarejestrowanych danych.
Główne wyniki
- Nierestrykcyjna pletyzmografia całego ciała pozwala na wiarygodną ocenę funkcji płuc.
- Można dokładnie zmierzyć wiele parametrów oddechowych.
- Technika ta umożliwia wielokrotne oceny u tych samych osobników.
- Wyniki potwierdzają przydatność tej metody w badaniach podłużnych.
Wnioski
- Nieograniczona pletyzmografia całego ciała jest skuteczną metodą badania fizjologii układu oddechowego u gryzoni.
- Metoda ta zwiększa możliwość prowadzenia badań podłużnych.
- Stanowi ona znaczący postęp w stosunku do tradycyjnych technik opartych na unieruchomieniu zwierząt.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Nierestrykcyjna pletyzmografia całego ciała umożliwia nieinwazyjny, powtarzalny pomiar parametrów oddechowych u świadomych gryzoni, co pozwala na podłużną ocenę funkcji płuc w modelach przedklinicznych. Podejście to ogranicza wpływ zniekształcający anestezji i unieruchomienia, zwiększając wiarygodność danych w badaniach nad walidacją celów oraz badaniach mechanistycznych w obszarze chorób układu oddechowego. Technika ta dostarcza ilościowych wyników oddechowych, które mogą być wykorzystane do oceny potencjalnych kandydatów terapeutycznych oraz minimalizacji ryzyka w procesach translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie fenotypów oddechowych w modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Możliwość przeprowadzania wielokrotnych pomiarów u tego samego zwierzęcia w celu zmniejszenia zmienności i zwiększenia mocy statystycznej.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie potwierdzania celu terapeutycznego poprzez powtarzalne odczyty funkcji płuc w różnych punktach czasowych.
Przesiewy i rozwój testów analitycznych
- Gotowość testu: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do przesiewu związków z ustandaryzowanymi punktami końcowymi w zakresie funkcji oddychania.
- Wyniki ilościowe: Wyznaczenie objętości oddechowej, objętości minutowej oraz szybkości przepływu wdechowego do analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Powtarzalność: Minimalizacja artefaktów wynikających z anestezji i manipulacji w celu poprawy spójności testu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Zastosowanie w modelach włóknienia płuc, astmy i POChP w celu oceny wpływu terapeutycznego na mechanikę płuc.
- Ciągłość translacyjna: Połączenie etapu odkryć z walidacją przedkliniczną przy użyciu spójnego, nieinwazyjnego monitorowania oddechowego.
- Decyzje dostosowane do ryzyka: Ustalanie kryteriów go/no-go w oparciu o długofalowe trendy funkcji oddechowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkrywania leków, od walidacji celu, przez optymalizację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w programach koncentrujących się na układzie oddechowym.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez pomiar funkcjonalnych parametrów oddechowych u zwierząt świadomych.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację i powtarzalność testów w celu oceny wpływu związków na funkcję płuc.
- Analityka: Dostarcza mierzalne parametry, takie jak objętość oddechowa i cykl pracy wdechowej, do analiz porównawczych.
- Badania translacyjne: Łączy wstępne odkrycia z ciągłością przedkliniczną poprzez powtarzalny, nieinwazyjny monitoring oddechowy.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku w wielu modelach chorób układu oddechowego i seriach związków.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w fenotypach oddechowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację, powtarzalność i skalowalność w badaniach wielogrupowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go i redukuje późnoetapowe ryzyko biologiczne w programach dotyczących układu oddechowego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko w oparciu o podłużne dane dotyczące funkcji oddechowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie fizjologii układu oddechowego i systemów akwizycji danych.
- Zależność od skalibrowanych przetworników ciśnienia i stabilnego monitorowania parametrów środowiskowych.
- Konieczność opracowania międzyzespołowych SOP dla aklimatyzacji w komorze i identyfikacji artefaktów.
- Wymaga uwzględnienia różnic w adaptacji pomiędzy szczepami myszy a modelami chorób.
- Ograniczenie ze względu na podatność na artefakty ruchowe oraz kondensację pary wodnej w środowisku, co wymaga starannego wykluczania wartości odstających.
