Name: Pomiar funkcji oddechowych u myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała do pomiaru parametrów oddechowych u myszy. Ta nieinwazyjna technika umożliwia wielokrotne, precyzyjne badania fizjologii oddechowej w długoterminowych studiach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Prof. Davidowi Walkerowi za jego porady techniczne i dostarczenie sprzętu w rozwoju tej techniki. Prace te są wspierane przez Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu stanu Wiktoria. Prace te były częściowo wspierane przez Program Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu stanu Wiktoria.

UWAGA: Poniższa procedura eksperymentalna została zatwierdzona przez Komitet ds. Etyki Zwierząt na Uniwersytecie Monash i przeprowadzona zgodnie z Australijskim Kodeksem Postępowania w zakresie opieki i wykorzystywania zwierząt do celów naukowych (2006). Dorosłe samice myszy C57BL/6 użyte do wygenerowania reprezentatywnych wyników uzyskano z Monash Animal Services. Myszy trzymano w specyficznym, wolnym od patogenów pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności z 12-godzinnym cyklem światło-ciemność. Myszy te miały swobodny dostęp do pożywienia i wody.
1. Wstępna konfiguracja
<ol>
	<li>Podłącz laptopa/komputer stacjonarny do urządzenia do akwizycji danych w celu nagrywania za pomocą USB.</li>
	<li>Podłącz wzmacniacz mostkowy od "wyjścia 1" do "wejścia 1" urządzenia do akwizycji danych za pomocą BNC.</li>
	<li>Włóż przetwornik ciśnienia do "kanału 1" wzmacniacza ósemkowego. Włącz maszynę do akwizycji danych i otwórz oprogramowanie do analizy. Oprogramowanie powinno automatycznie wykryć konfigurację sprzętu (patrz tabela materiałów i wyposażenia).</li>
	<li>Otwórz ustawienia kanału znajdujące się na pasku narzędzi konfiguracji oprogramowania. Zmień liczbę nagrywanych kanałów na 1.</li>
	<li>Ustaw barometr do pomiaru ciśnienia w pomieszczeniu i aparat do słupa wody do kalibracji wzmacniacza mostkowego. Aparat do pomiaru słupa wody składa się z dwóch serologicznych pipet strzykawkowych o pojemności 5 ml połączonych plastikową rurką.</li>
	<li>Napełnij kolumny wodą i upewnij się, że poziom wody jest zrównoważony za pomocą linijki. Podłącz jeden kawałek plastikowej rurki do górnej części każdej pipety. Rysunek 2 przedstawia ustawienie słupa wody.</li>
</ol>
2. Kalibracja wzmacniacza mostka
Uwaga: Aby skalibrować wzmacniacz mostkowy, wymagane jest wstrzyknięcie powietrza do słupa wody, aby uzyskać odchylenie o 1 cm H2O. Nastąpi to w jednym zestawie warunków i zależy od aparatury użytkownika. Dla wyjaśnienia, poniższe kroki pokazują, w jaki sposób to laboratorium wykona kalibrację.
<ol>
	<li>Wyjąć strzykawkę o pojemności 1 ml do 300 μl; przymocować strzykawkę do kranu na końcu rurki po prawej stronie słupa wody. UWAGA: Upewnij się, że zawór odcinający jest otwarty na strzykawkę i słup wody i zamknięty na powietrze w pomieszczeniu. Jeśli w tym momencie poziom wody nie jest zrównoważony, przekręć kran tak, aby był otwarty na powietrze w pomieszczeniu i słup wody, co spowoduje zrównoważenie wody. Rurka po lewej stronie słupa wody powinna być podłączona do przetwornika ciśnienia w celu zmierzenia zmiany ciśnienia wywołanej zanurzeniem strzykawki.</li>
	<li>Podłącz rurkę ze słupa wody po lewej stronie do złącza na przetworniku ciśnienia (górny pierścień przetwornika).</li>
	<li>Wybierz przewijane menu znajdujące się obok kanału 1 na ekranie głównym po prawej stronie oprogramowania i wybierz "Bridge amp" (patrz tabela materiałów i sprzętu).</li>
	<li>Wprowadź ustawienia na 5 mV, 20 Hz dolnoprzepustowe, zaznacz pole "odwróć" i kliknij "zero". Kliknij "zero", aby ustawić ślad na ~0 mV. Zmniejsz rozmiar okna do 4:1, aby ułatwić przeglądanie.</li>
	<li>Gdy wszystko jest już gotowe, wciśnij strzykawkę o pojemności 1 ml, pozostawiając ją na 3 sekundy. Spowoduje to nagły skok w oprogramowaniu, ponieważ zmieniło się ciśnienie. Gdy 300 μl zostanie obniżone, ciśnienie przesunie wodę w słupie wody o 1 cm. Ta znana wartość pomoże skalibrować mostek Amplifier. 
	UWAGA: Wzrost ciśnienia w komorze spowodowany wgłębieniem 300 μl odpowiada wartości PK użytej do późniejszych obliczeń.</li>
	<li>Wybierz "jednostki wejściowe" znajdujące się w lewym dolnym rogu okna Bridge Amp.</li>
	<li>Podświetl "ślad tła" przed skokiem, znany również jako "obszar zerowy".
	<ol>
		<li>Kliknij strzałkę obok "punktu 1", a spowoduje to wytworzenie sygnału tła w zakresie -0,002 mV-0,002 mV (wartość nigdy nie będzie dokładnie równa 0 mV).</li>
		<li>Wpisz "0" w oknie obok okna sygnału tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podkreślić " obszar zwiększonego ciśnienia na wykresie" od momentu wciśnięcia strzykawki. Kliknij strzałkę obok punktu 2, a wartość powinna mieścić się w zakresie 0,9-1,2 mV.
	<ol>
		<li>Wpisz "1" w oknie obok okna "podwyższone ciśnienie". Wizualne wyjaśnienie kroków 2.7 i 2.8 znajduje się na rysunku 3. Wartości znalezione poza określonymi zakresami mogą wskazywać na uszkodzenie wzmacniacza ósemkowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do opcji "zdefiniuj jednostki" znajdującej się w prawym górnym rogu okna i wybierz "cmH2O". Jeśli ta opcja nie jest dostępna, można ją wprowadzić ręcznie. Kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Wróć do menu "Bridge Amp" (patrz 2.1). Wybierz 1 mV i ustaw amplifier na "zero". Spowoduje to zakończenie kalibracji, a słup wody będzie można bezpiecznie usunąć.</li>
</ol>
3. Rejestrowanie funkcji płuc
<ol>
	<li>Zważ mysz (g). UWAGA: Na tydzień przed oceną fizjologiczną wprowadzić mysz do środowiska komory pletyzmografii. Pomoże to w aklimatyzacji i zmniejszy stres podczas przeprowadzania tej procedury w późniejszym terminie. Ogólny schemat przedstawiający konfigurację UWBP znajduje się na rysunku 4.</li>
	<li>Zmierz temperaturę ciała za pomocą termometru doodbytniczego. Nasmaruj termometr wazeliną przed włożeniem. Zapisz odczyt temperatury i oczyść smar 80% (v/v) etanolem. W przypadku wykorzystywania bardzo małych zwierząt, takich jak nowonarodzone młode myszy, średnią wartość temperatury ciała można zamiast tego określić za pomocą termometru na podczerwień.</li>
	<li>Umieść sondę temperatury/wilgotności względnej na jednootworowym końcu komory pletyzmografii. Zapisz temperaturę, wilgotność i ciśnienie atmosferyczne wewnątrz komory pletyzmografii przed umieszczeniem w niej myszy.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze pletyzmografii, lekko zakryj otwarty koniec. Dzięki temu mysz może się zaaklimatyzować. Zamknij komorę.</li>
	<li>Po włożeniu sondy temperatury/wilgotności z boku komory pletyzmograficznej z jednym otworem, teraz włóż przetwornik i strzykawkę po drugiej stronie z dwoma otworami.</li>
	<li>Naciśnij "Start" w oprogramowaniu i nagrywaj przez około 15-45 sekund. Zapisz 5-10 sekund danych, w których zwierzę się nie porusza. Ruch zmieni podstawową fizjologię układu oddechowego zwierzęcia i zapewni słabe wyniki. Oddychanie powinno oscylować po liniowej ścieżce w programie. Są to dane użyteczne. Uwaga: Oddawanie moczu lub kału może prowadzić do wzrostu temperatury i wilgotności wewnątrz komory pletyzmografii. Spowoduje to zaciemnienie wyników podczas analizy. W przypadku oddawania moczu lub kału należy natychmiast przerwać nagrywanie i wyczyścić komorę pletyzmograficzną 80% (v/v) etanolem. Patrz rysunek 6, aby zapoznać się z wizualną reprezentacją nieoptymalnych wyników, w których dane powinny zostać odrzucone.</li>
	<li>Po nagraniu przez 45 sekund naciśnij przycisk "Stop" w oprogramowaniu (patrz tabela materiałów i sprzętu). Wyjmij mysz z komory pletyzmografii i natychmiast zapisz temperaturę i wilgotność w komorze. Nie nagrywaj w sposób ciągły dłużej niż 45 sekund, ponieważ może to stresować zwierzę.</li>
	<li>Włóż mysz z powrotem do klatki, spryskaj i wytrzyj komorę 80% (v/v) etanolem.</li>
	<li>Poczekaj, aż komora wyschnie i powróci do podstawowej temperatury i wilgotności przed przejściem do następnej myszy. Powtórzyć kroki od 3.1 do 3.9 dla kolejnych zwierząt. Uwaga: Jeśli badanych jest wiele zwierząt, upewnij się, że temperatura i wilgotność w komorze powrócą do wartości bliskich wartości wyjściowych przed umieszczeniem każdego nowego zwierzęcia w komorze.</li>
</ol>
4. Analiza pletyzmograficzna
Uwaga: Aby obliczyć parametry oddechowe, takie jak objętość oddechowa (VT) i objętość minutowa, należy zmierzyć następujące zmienne: częstość oddechów (oddechy/min), całkowity czas cyklu oddechowego (s), czas wdechu/wydechu (Ti/ Te, sekundy) oraz zmiana ciśnienia spowodowana każdą objętością oddechową (PT). Rysunek 1 ilustruje zmienne, które można zmierzyć na podstawie śladu. W poniższych krokach wykorzystuje się oprogramowanie (patrz tabela materiałów i sprzętu) do pomiaru tych zmiennych. Podczas analizy należy unikać obszarów śladu, w których występuje podsłuchiwanie lub ruch. Aby uzyskać powtarzalne wyniki, wymagane jest co najmniej 5 sekund dobrego śladu oddechowego. Przykład różnych śladów oddychania znajduje się na rysunkach 5 i 6.
<ol>
	<li>Otwórz ekran na pełny ekran, ustaw widok na 1:1 i wybierz 5 sekund użytecznych danych. Reprezentatywny obraz tego zjawiska przedstawiono na rysunku 5.</li>
	<li>Otwórz mini okno datapad znajdujące się w górnej części programu w zakładce DataPad. Wybierz kanał 1 i wybierz "pomiary cykliczne" w lewej kolumnie i "średnia wysokość cykliczna" w prawej kolumnie.
	<ol>
		<li>Wybierz "Opcja" i ustaw skalę minimalnego wykrywania piku na 1 (ms). Umożliwi to wykrycie każdej wartości szczytowej i staje się niezwykle ważne w przypadku korzystania z małych zwierząt, które wytwarzają małe oscylacje.</li>
		<li>Kliknij "OK". Spowoduje to pomiar "Odchylenia ciśnienia spowodowanego każdą objętością oddechową" (PT).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W mini konsoli danych wybierz "pomiary cyklu", a następnie "liczba zdarzeń" i kliknij "OK". W ten sposób zostanie przedstawiony pomiar "częstotliwości" (f).
	<ol>
		<li>Częstotliwość musi być przeliczona na oddechy/min. Odbywa się to poprzez pomnożenie wartości przez 60 sekund i podzielenie odpowiedzi przez całkowity czas nagrywania (min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W mini klawiaturze wybierz "pomiary cyklu", a następnie "okres" i kliknij "OK". Spowoduje to wyświetlenie pomiaru "całkowitego czasu cyklu oddychania" (Ttot, s).</li>
	<li>Kolejne kroki służą do tworzenia makroinstrukcji w celu wygenerowania szczytowych wartości inspiracji i czasu wygaśnięcia. Upewnij się, że kursor znajduje się bezpośrednio nad maksimum szczytu/dołka i dodaj komentarz do 9 sekwencyjnych szczytów i dołków. Zacznij od szczytu oscylacji, jak pokazano na rysunku 5.</li>
	<li>Następnie wybierz okno: konsola danych i kolumna 1. W wyświetlonym oknie kliknij "informacje o zaznaczeniu" w lewej kolumnie, "czas trwania" w prawej kolumnie i kliknij "OK".</li>
	<li>Wybierz makro znajdujące się w górnej części programu, a następnie rozpocznij nagrywanie. Teraz wybierz polecenia: 'Znajdź', 'Idź', 'Początek pliku' i kliknij 'Znajdź'.</li>
	<li>Wybierz polecenia: 'Znajdź' i 'Znajdź komentarze'. Wpisz tę samą frazę, która została wpisana w polu komentarza w odpowiednim polu "zawierające". Wybierz zakładkę "Wybierz do poprzedniego punktu" i "Znajdź".</li>
	<li>Wybierz polecenia: 'Dodaj do konsoli danych'. Następnie wybierz makro: makropolecenia i rozpocznij powtarzanie. Okno liczby powtórzeń, które się pojawi, powinno być ustawione na 9.</li>
	<li>Wybierz polecenie: 'Znajdź następny'. Wybierz polecenie: 'Dodaj do konsoli danych'. Na koniec wybierz polecenia makr i zakończ powtarzanie.
	<ol>
		<li>Teraz wybierz makro i zatrzymaj nagrywanie. Zapisz makro i nazwij je po numerze zwierzęcia. UWAGA: Ustawienie makra dla każdego zwierzęcia pozwala na użycie makra do badań podłużnych i oszczędza czas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Makro można teraz uruchomić, aby uzyskać czas inspiracji (Ti) i wygaśnięcia (Te) między każdym komentarzem. Dane pojawią się w kanale 1 tabletu danych. Wygaśnięcie i inspiracja następują po sobie, a dane pojawią się w tej kolejności.
	<ol>
		<li>Dane należy ręcznie podzielić na wartości inspiracji i wygaśnięcia. Uśrednić cztery wartości danych każdego parametru, aby uzyskać średnią Ti i T e.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wyprowadzeniu wartości podstawowych można obliczyć objętość oddechową (V,T, ml). Aby uzyskać objętość oddechową, stosuje się równanie Drorbaugha i Fenna8: 
	VT (ml)= (PT / PK) x (VK) x ((T CORE(PB -P C)) / (T CORE(PB - PC) - TC(PB - PCORE)))) 
	 
	Gdzie 
	VT: Objętość oddechowa 
	Pk: Odchylenie ciśnienia spowodowane każdym wstrzyknięciem 1 ml (patrz krok 2.5) 
	Rdzeń T: Temperatura rdzenia każdego zwierzęcia 
	PC: Ciśnienie pary wodnej w temperaturze komory X Wilgotność względna w komorze 
	TC: temperatura w komorze dla zwierząt 
	Rdzeń P: Ciśnienie w temperaturze ciała (ciśnienie pary wodnej w temperaturze ciała x 1,0) 
	PT: Odchylenie ciśnienia spowodowane każdą objętością oddechową 
	Vk: Wtrysk objętościowy do kalibracji 
	 PB: Ciśnienie barometryczne 
	 </li>
	<li>Po obliczeniu objętości oddechowej można również określić następujące parametry:
	<ul>
		<li>Objętość minutowa (ml/min) = VT x f</li>
		<li>Objętość minutowa (ml/min/kg) = (VT x f) / Masa ciała (kg)</li>
		<li>VT (ml/kg) = VT (ml) / Masa ciała (kg)</li>
		<li>Wdechowy cykl pracy (%) = Ti / Ttot</li>
		<li>Natężenie przepływu wdechowego (ml/s) = VT / T i</li>
		<li>Stosunek czasu wdechu do czasu wydechu = Ti / Te</li>
		<li>Całkowity czas cyklu (s) = czas wdechu (s) + czas wydechu (s)</li>
	</ul>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization, World Health Statistics. , WHO, Geneva, Switzerland. (2008).</li>
<li>Jones, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M2+macrophage+polarization+is+associated+with+alveolar+formation+during+postnatal+lung+development%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">M2 macrophage polarization is associated with alveolar formation during postnatal lung development.</a> Respir. Res. 14 (41), 14-41 (2013).</li>
<li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+factor-induced+airway+hyperreactivity+in+allergic+and+normal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Stem cell factor-induced airway hyperreactivity in allergic and normal mice.</a> Am. J. Pathol. 154 (4), 1259-1265 (1999).</li>
<li>Card, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclooxygenase-2+deficiency+exacerbates+bleomycin-induced+lung+dysfunction+but+not+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cyclooxygenase-2 deficiency exacerbates bleomycin-induced lung dysfunction but not fibrosis.</a> Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 37 (3), 300-308 (2007).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+unrestrained+plethysmography+and+forced+oscillation+for+identifying+genetic+variability+of+airway+responsiveness+in+inbred+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of unrestrained plethysmography and forced oscillation for identifying genetic variability of airway responsiveness in inbred mice.</a> Physiol. Genomics. 43 (1), 1-11 (2011).</li>
<li>Flandre, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+somatic+growth%2C+strain%2C+and+sex+on+double-chamber+plethysmographic+respiratory+function+values+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of somatic growth, strain, and sex on double-chamber plethysmographic respiratory function values in healthy mice.</a> J. Appl. Physiol. 94 (3), 1129-1136 (2003).</li>
<li>Petak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxia-induced+changes+in+mouse+lung+mechanics%3A+forced+oscillations+vs.+barometric+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced oscillations vs. barometric plethysmography.</a> J. Appl. Physiol. 90 (6), 2221-2230 (2001).</li>
<li>Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+barometric+method+for+measuring+ventilation+in+newborn+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A barometric method for measuring ventilation in newborn infants.</a> Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).</li>
<li>Milton, P. L., Dickinson, H., Jenkin, G., Lim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+respiratory+physiology+of+C57BL%2F6+mice+following+bleomycin+administration+using+barometric+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration%22%5BJournal%5D)">Assessment of respiratory physiology of C57BL/6 mice following bleomycin administration using barometric plethysmography.</a> Respiration. 83 (3), 253-266 (2012).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+care%2C+part+I%3A+anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and care, part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR J. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
<li>Hildebrandt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+other+considerations+for+in+vivo+imaging+of+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and other considerations for in vivo imaging of small animals.</a> ILAR J. 49 (1), 17-26 (2008).</li>
<li>Meijer, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+restraint+and+injection+methods+on+heart+rate+and+body+temperature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice.</a> Lab Anim. 40, 382-391 (2006).</li>
<li>Hamelmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+airway+responsiveness+in+allergic+mice+using+barometric+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of airway responsiveness in allergic mice using barometric plethysmography.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156 (3), 766-775 (1997).</li>
<li>Lim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+reduce+lung+injury+in+immunocompromised+mice+but+not+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells reduce lung injury in immunocompromised mice but not in immunocompetent mice.</a> Respiration. 85 (4), 332-341 (2013).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+prevent+Bleomycin-induced+lung+injury+and+preserve+lung+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells prevent Bleomycin-induced lung injury and preserve lung function.</a> Cell Transplant. 20, 909-923 (2011).</li>
<li>Murphy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+amnion+epithelial+cells+do+not+abrogate+pulmonary+fibrosis+in+mice+with+impaired+macrophage+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function.</a> Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).</li>
<li>Wichers, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+exposing+rodents+to+resuspended+particles+using+whole-body+plethysmography%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">A method for exposing rodents to resuspended particles using whole-body plethysmography.</a> Part. Fibre Toxicol. 13 (12), (2006).</li>
<li>Chong, B. T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+bronchoconstriction+using+whole-body+plethysmograph%3A+comparison+of+freely+moving+versus+restrained+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Measurement of bronchoconstriction using whole-body plethysmograph: comparison of freely moving versus restrained guinea pigs.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 39 (3), 163-168 (1998).</li>
<li>Lizuka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+respiratory+function+using+whole-body+plethysmography+in+unanesthetized+and+unrestrained+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of respiratory function using whole-body plethysmography in unanesthetized and unrestrained nonhuman primates.</a> J. Toxicol. Sci. 35 (6), 863-870 (2010).</li>
<li>McGregor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+prenatal+exposure+to+carbon+monoxide+on+breathing+and+growth+of+the+newborn+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of prenatal exposure to carbon monoxide on breathing and growth of the newborn guinea pig.</a> Pediatr. Res. 43, 126-131 (1998).</li>
<li>Lundblad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reevaluation+of+the+validity+of+unrestrained+plethysmography+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A reevaluation of the validity of unrestrained plethysmography in mice.</a> J. Appl. Physiol. 93, 1198-1207 (2002).</li>
<li>Bartlett, D., Tenney, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+breathing+in+experimental+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Control of breathing in experimental anemia.</a> Respir. Physiol. 10 (3), 384-395 (1970).</li>
<li>Malan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventilation+measured+by+body+plethysmography+in+hibernating+mammals+and+in+poiiulotherms%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ventilation measured by body plethysmography in hibernating mammals and in poiiulotherms.</a> Respir. Physiol. 17 (1), 32-44 (1973).</li>
<li>Seifert, E. L., Mortola, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+pattern+of+breathing+in+conscious+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The circadian pattern of breathing in conscious adult rats.</a> Respir. Physiol. 129 (3), 297-305 (2002).</li>
<li>DuBois, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+measuring+airway+resistance+in+man+using+a+body+plethysmograph%3A+Values+in+normal+subject+and+in+patients+with+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A new method for measuring airway resistance in man using a body plethysmograph: Values in normal subject and in patients with respiratory disease.</a> J. Clin. Invest. 35 (3), 327-335 (1956).</li>
<li>Enhorning, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+plethysmography%2C+does+it+measure+tidal+volume+of+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Physiol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Whole-body plethysmography, does it measure tidal volume of small animals.</a> Can. J. Physiol. Pharmacol. 76 (10-11), 945-951 (1998).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+unrestrained+single-chamber+plethysmography+provide+a+valid+assessment+of+airway+responsiveness+in+allergic+BALB%2Fc+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Does unrestrained single-chamber plethysmography provide a valid assessment of airway responsiveness in allergic BALB/c mice.</a> Respir. Res. 10 (61), (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów. Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Opisana tutaj technika jest nieinwazyjną metodą oceny parametrów oddechowych myszy nieskrępowanych i nieznieczulonych. Mocne strony tego protokołu to jego prostota i precyzja w pomiarze wzdłużnym funkcji płuc przy minimalnej ilości artefaktów. Istnieją jednak pewne ograniczenia i krytyczne kroki, na które należy zwrócić uwagę w związku z procedurą. Po pierwsze i najważniejsze, mysz musi zachować spokój w komorze przez co najmniej pięć sekund. Dodatkowy stres zakłóci wzorzec oddychania myszy, a tym samym zapewni zmienne w...

Dysfunkcja płuc jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności na świecie. Stan ten charakteryzuje się niedostateczną wymianą tlenu, co jest równoznaczne z kaszlem, bólami w klatce piersiowej i dusznością. Choroby układu oddechowego odpowiadają za ~10% śmiertelności na całym świecie1. Według Światowej Organizacji Zdrowia śmiertelność wzrośnie z powodu uporczywego palenia, zanieczyszczenia i czynników drażniących w miejscu pracy. UWBP jest użytecznym dodatkiem do badań nad fizjologią płuc, który zdecydowanie uzupełnia tradycyjne analizy biochemiczne i histologiczne2. Inne procedury stosowane do oceny płuc nie zapewniają takich samych korzyści jak UWBP. Pletyzmografia inwazyjna jest powszechnie stosowaną techniką, która wymaga znieczulenia zwierzęcia3,4, a zatem uzyskane pomiary oddechowe niekoniecznie odzwierciedlają stan naturalny. Ponadto wymóg wentylacji mechanicznej i wyzwania chemiczne wykluczają przyszłe pomiary3,4. Inną metodą zbierania danych oddechowych jest oscylacja wymuszona, która jest bardziej wrażliwa na drobniejsze zmiany parametrów oddechowych w porównaniu z UWBP5. Wymuszona oscylacja jest jednak techniką inwazyjną i wymaga terminacji przez zwierzę w celu zebrania danych5-7.
UWBP polega na umieszczeniu zwierzęcia w specjalistycznej komorze. Podczas wdechu powietrze pływowe jest ogrzewane i nawilżane w płucach, zwiększając ciśnienie pary wodnej i powodując rozszerzalność cieplną gazu8. Efekt ten powoduje zmianę objętości powietrza netto, powodując wzrost ciśnienia w komorze pletyzmografu8. Odwrotna sytuacja ma miejsce podczas wydechu, tworząc falę oddechową zwierzęcia. Analiza kształtu fali jest następnie wykorzystywana do pomiaru na podstawie śladu oddechowego: częstości oddechów (oddechów/min), całkowitego czasu cyklu oddychania (s), czasu wdechu/wydechu (Ti/Te, s) oraz zmian ciśnienia spowodowanych każdą objętością oddechową(PT). Rysunek 1 ilustruje każdy pomiar rozpoczynający się od śladu oddechowego. Pomiary te są łatwe do obliczenia i na ich podstawie można uzyskać wiele parametrów oddechowych. Parametry te obejmują: objętość oddechową (objętość powietrza przemieszczającego się między normalnym wdechem a wydechem), objętość minutową (objętość gazu wdychanego z płuc na minutę), cykl pracy wdechowej (procent czasu wdechu w stosunku do całkowitego czasu trwania cyklu oddychania) i natężenie przepływu wdechowego (ilość wdychanego powietrza w danym czasie).
UWBP zapewnia precyzyjną, nieinwazyjną, ilościową analizę fizjologii układu oddechowego w modelach zwierzęcych i może być używany do pomiaru postępu choroby układu oddechowego i funkcji płuc6,9. W przeciwieństwie do innych technik pletyzmografii, UWBP unika stosowania znieczulenia, ograniczeń i inwazyjnych manipulacji, które wytwarzają artefakty i zmienność eksperymentalną6,9. Znieczulenie może hamować oddychanie, zmieniać tętno i może być trudne do regulacji10. Ograniczenia wywołują przyspieszenie oddychania z powodu dodatkowego stresu poprzez uwalnianie kortykosteronu i epinefryny11,13. Kluczową cechą UWBP jest powtarzalna ocena fizjologiczna, dzięki czemu jest on podatny na badania podłużne. UWBP jest zdecydowanie zalecany do podłużnej oceny fizjologii płuc i oferuje cenną umiejętność do przyszłej oceny leków oddechowych.
Bleomycyna, albumina jaja kurzego i niedotlenienie zostały wykorzystane do wywołania problemów oddechowych w kilku badaniach, a UWBP z powodzeniem zmierzyło dokładną ocenę fizjologiczną płuc7,9,13-16. Opisany protokół jest przeznaczony dla standardowych dorosłych myszy laboratoryjnych. Jednak UWBP został przystosowany do innych zwierząt, takich jak szczury, świnki morskie i naczelne inne niż ludzie17-20. UWBP nie ogranicza się tylko do oceny dysfunkcji płuc, ale jest również stosowany do oceny dojrzewania płuc3. Wszechstronność, prostota i powtarzalność UWBP pozwoliły na stworzenie doskonałej techniki oceny funkcji płuc u zwierząt. Do wykonania tej procedury wymagane będzie różne programy (patrz tabela materiałów i wyposażenia). Doświadczony naukowiec byłby w stanie wykonać ten protokół za pomocą myszy w ciągu 1 godziny.

<table><tbody><tr><td>Oprogramowanie LabChart 7 (dla komputerów Macintosh)</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>MLU60/7</td><td>używane w kroku 4 protokołu</td></tr><tr><td>PowerLab 8/30 (model ML870)</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Ósemkowy wzmacniacz mostkowy (model ML228)</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>FE228</td><td></td></tr><tr><td>BNC do BNC (1 m)</td><td>ADINSTRUMENTS</td><td>MLAC01</td><td></td></tr><tr><td>Macintosh OS</td><td>Apple Inc.</td><td></td><td>Mac OS X 10.4 lub nowszy</td></tr><tr><td>Cyfrowy termometr doodbytniczy Surgipack</td><td>Vega Technologies</td><td>MT-918</td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik ciśnienia woluterycznego do trawy PT5A</td><td>Grass Instruments Co.</td><td>Numer modelu PT5A; nr seryjny L302P4.</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serologiczne pipety strzykawkowe</td><td>Greiner Bio One</td><td>606160</td><td>Podłączane za pomocą plastikowej rurki</td></tr><tr><td>Wagi</td><td>VWR International, Pty Ltd</td><td>SHIMAUW220D</td><td>Dowolna waga o rozdzielczości 0,1 grama</td></tr><tr><td>HM40 Miernik wilgotności i temperatury</td><td>Vaisala</td><td>HM40A1AB</td><td></td></tr><tr><td>Barometr</td><td>Barometr World</td><td>1586</td><td></td></tr><tr><td>Rurki laboratoryjne</td><td>Dow Corning</td><td>508-101</td><td>Służy do podłączenia kolumny wody do strzykawki i przetwornika ciśnienia</td></tr><tr><td>Cylindryczna komora perspex</td><td>Dynalab Corp.</td><td></td><td>Specjalnie zbudowana cylindryczna komora o wymiarach wewnętrznych: 50 mm (szer.) x 1 500 mm (dł.). Z każdej strony znajdują się dwie pokrywy o wymiarach 80 mm (dł.) x 80 mm (szer.). Każda pokrywka ma okrągły otwór o szerokości 60 mm wycięty na powierzchni pokrywy o głębokości 50 mm. Dzięki temu komora mieści się w pokrywie. Gumowy pierścień jest zamontowany wokół każdego otworu pokrywy, w którym zmieści się komora. Do zamocowania strzykawki i przetwornika ciśnienia otwory mają średnicę 5 mm. Do zamocowania sondy wilgotności otwory mają średnicę 25 mm.</td></tr><tr><td>80% etanol (4 l)</td><td>VWR International, Pty Ltd</td><td>BDH1162-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar funkcji oddechowych u myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała

Measuring Respiratory Function in Mice Using Unrestrained Whole-body Plethysmography

Dysfunkcja układu oddechowego jest jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności na świecie, a wskaźniki śmiertelności nadal rosną. Ilościowa ocena czynności płuc w modelach gryzoni jest ważnym narzędziem w opracowywaniu przyszłych terapii. Powszechnie stosowane techniki oceny funkcji oddechowej, w tym inwazyjna pletyzmografia i wymuszona oscylacja. Chociaż techniki te dostarczają cennych informacji, gromadzenie danych może być obarczone artefaktami i zmiennością eksperymentalną ze względu na potrzebę znieczulenia i/lub inwazyjnego oprzyrządowania zwierzęcia. W przeciwieństwie do tego, nieskrępowana pletyzmografia całego ciała (UWBP) oferuje precyzyjny, nieinwazyjny, ilościowy sposób analizy parametrów oddechowych. Technika ta pozwala uniknąć stosowania znieczulenia i ograniczeń, co jest powszechne w tradycyjnych technikach pletyzmografii. Ten film zademonstruje procedurę UWBP, w tym konfigurację sprzętu, kalibrację i rejestrację czynności płuc. Wyjaśni, jak analizować zebrane dane, a także identyfikować eksperymentalne wartości odstające i artefakty, które wynikają z ruchu zwierząt. Parametry oddechowe uzyskane za pomocą tej techniki obejmują objętość oddechową, objętość minutową, wdechowy cykl pracy, wdechowe natężenie przepływu oraz stosunek czasu wdechu do czasu wydechu. UWBP nie opiera się na specjalistycznych umiejętnościach i jest niedrogi w wykonaniu. Kluczową cechą UWBP, najbardziej atrakcyjną dla potencjalnych użytkowników, jest możliwość wykonywania powtarzających się pomiarów czynności płuc na tym samym zwierzęciu.

Przy prawidłowym przeprowadzeniu tej procedury w oprogramowaniu do analizy danych powstaje spójny ślad oscylujący. Procedura ta pozwala na uzyskanie zapisu oddechowego w ciągu kilku minut od konfiguracji, a proste obliczenia komputerowe umożliwiają wyznaczenie wymienionych parametrów oddechowych. Rycina 5 przedstawia prawidłowy zapis oddechu myszy kontrolnej (zdrowej). Odpowiednie dane oscylacyjne są uzyskiwane, gdy zwierzę nie wykazuje aktywnej ruchliwości.
UWBP jest niezwykl...

Ocena fizjologii układu oddechowego tradycyjnie opierała się na technikach, które wymagają unieruchomienia lub uspokojenia zwierzęcia. Nieskrępowana pletyzmografia całego ciała zapewnia jednak precyzyjną, nieinwazyjną, ilościową analizę fizjologii układu oddechowego w modelach zwierzęcych. Ponadto technika ta umożliwia wielokrotną ocenę układu oddechowego myszy, co pozwala na badania podłużne.

Pomiar funkcji oddechowych u myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała

Respiratory dysfunction is one of the leading causes of morbidity and mortality in the world and the rates of mortality continue to rise. Quantitative ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar parametrów oddechowych u świadomego gryzonia z wykorzystaniem nieograniczającej ruchów pletyzmografii całego ciała. Osiąga się to poprzez uprzednią kalibrację wzmacniacza mostkowego. Po kalibracji mysz umieszcza się w komorze pletyzmograficznej, pozwalając jej na aklimatyzację przed rozpoczęciem testów.Następnie rejestrowane są zmiany ciśnienia występujące wewnątrz komory. Na podstawie informacji uzyskanych podczas korzystania z systemu pletyzmografii oblicza się wiele parametrów oddechowych. Wyniki pokazują, że nieograniczona pletyzmografia całego ciała jest niezawodną metodą oceny funkcji płuc u gryzoni.Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak inwazyjna pletyzmografia, są fakt, że zwierzęta nie są znieczulane, co oznacza brak artefaktów związanych z anestezją. Ponadto, dzięki nieinwazyjnemu charakterowi tego protokołu, możliwe jest przeprowadzanie pomiarów podłużnych. Co do zasady osoby rozpoczynające pracę z tą techniką mają tendencję do niedoszacowania czasu potrzebnego na aklimatyzację zwierząt w komorze pletyzmograficznej.Na początek należy przygotować wzmacniacz mostkowy urządzenia do akwizycji da

measuring-respiratory-function-mice-using-unrestrained-whole-body

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar funkcji oddechowych u myszy za pomocą nieograniczającej całego ciała pletyzmografu

Eksperymentalne modele mysie astmy alergicznej oferują nowe możliwości badania patogenezy choroby oraz opracowywania nowych terapii. Modele te są odpowiednie do pomiaru czynników kontrolujących alergiczną odpowiedź immunologiczną, zapalenie dróg oddechowych i patofizjologię płuc.

Mysi model astmy indukowanej alergenem

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis krok po kroku procedur wymaganych do wykonania pomiarów mechaniki układu oddechowego, jak również oceny reakcji dróg oddechowych na wdychaną metacholinę u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji (flexiVent; SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Kanada).

Ocena mechaniki układu oddechowego u myszy przy użyciu techniki wymuszonej oscylacji

Ten artykuł przedstawia metodę wielokrotnych pomiarów wentylacji i aktywności mięśni oddechowych w swobodnie zachowującym się modelu myszy ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) podczas postępu choroby za pomocą pletyzmografii całego ciała i elektromiografii za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego.

Wielokrotne pomiary aktywności mięśni oddechowych i wentylacji w mysich modelach choroby nerwowo-mięśniowej

Częstość występowania otyłości wzrasta i zwiększa ryzyko przewlekłych chorób płuc. Aby ustalić podstawowe mechanizmy i strategie zapobiegawcze, potrzebne są dobrze zdefiniowane modele zwierzęce. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody (test tolerancji glukozy, pletysmografia ciała i stabilizacja płuc) w celu zbadania wpływu otyłości na wyniki płucne u myszy.

Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Nieskrępowana pletyzmografia barometryczna służy do ilościowego określenia wzorca oddychania u obudzonych myszy. Pokazujemy, że 15-sekundowe segmenty w ustandaryzowanym protokole wyświetlają podobne wartości do wydłużonego czasu cichego oddychania. Metodologia ta pozwala również na ilościowe określenie bezdechu i przyspieszonych oddechów w ciągu pierwszej godziny w komorze.

Metoda uzyskiwania wzorca oddychania u starzejących się myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii barometrycznej

Ten protokół przedstawia budowę i wykorzystanie uproszczonego aparatu do pletyzmografii całego ciała do nieinwazyjnego monitorowania postępu bakteryjnej choroby układu oddechowego.

Uproszczona pletyzmografia całego ciała w celu scharakteryzowania funkcji płuc podczas melioidozy oddechowej

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.

Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

8-kanałowy system CODA do wysokoprzepustowego nieinwazyjnego pomiaru ciśnienia tętniczego pozwala na jednoczesny pomiar ciśnienia krwi u maksymalnie 8 myszy lub szczurów. Ten system z mankietem ogonowym wykorzystuje metodę Volume Pressure Recording (VPR) do pomiaru ciśnienia krwi poprzez wyznaczanie objętości krwi w ogonie.

Pomiar ciśnienia tętniczego u myszy z wykorzystaniem rejestracji objętościowo-ciśnieniowej metodą mankietu ogonowego

Metoda podwójnego znakowania oksydazy cytochromu c/dehydrogenazy sodowej (COX/SDH) umożliwia bezpośrednią wizualizację niedoborów enzymów oddechowych mitochondriów w świeżo zamrożonych przekrojach tkanek. Jest to prosta technika histochemiczna, która okazuje się przydatna w badaniu chorób mitochondrialnych, starzenia się oraz zaburzeń związanych z wiekiem.

Wizualizacja funkcji oddechowej mitochondriów przy użyciu histochemii z podwójnym znakowaniem oksydazy cytochromu C / dehydrogenazy bursztynianowej (COX/SDH)

Poznaj metodę nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała do pomiaru parametrów oddechowych u myszy. Ta nieinwazyjna technika umożliwia wielokrotne, precyzyjne badania fizjologii oddechowej w długoterminowych studiach.

Pomiar funkcji oddechowych u myszy za pomocą nieskrępowanej pletyzmografii całego ciała

Przeglądaj więcej filmów