Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Ogólnym celem tej procedury jest szczegółowe wypreparowanie nienaruszonego OUN od larw trzeciego stadium rozwojowego. W celu zbadania asymetrycznych podziałów komórek macierzystych, różnicowania komórkowego i morfogenezy. Osiąga się to poprzez pierwsze osadzenie OUN z ciała larwalnego przez grubą sekcję.

Drugim krokiem jest odizolowanie nienaruszonego mózgu od tkanek obwodowych poprzez drobną mikrodysekcję przy użyciu specjalnie wykonanych narzędzi. Następnie zdrowe mózgi są albo montowane do obrazowania żywych komórek, albo poddawane chemicznemu utrwalaniu i immunofluorescencji, ostatecznie mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem służy do pokazania zdarzeń, które rządzą podziałami nerwowych komórek macierzystych i zapewniają mechanistyczny wgląd w rozwój OUN. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka komórek macierzystych i rozwoju neuronów.

Przyczyniając się do naszego zrozumienia, w jaki sposób regulowana jest proliferacja komórek macierzystych, wiemy, że podział komórek macierzystych ABER jest związany z nowotworem i małogłowiem, a nasze badania obrazowe ujawniają mechanizmy, które regulują te podziały komórek macierzystych. Demonstracja wizualna tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ mikrodysekcja i montaż mózgu są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają pewnych rąk, cierpliwości i praktyki. Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia dwóch kropli ciepłego środka preparacyjnego na jednym szklanym szkiełku, jednej do grubego rozwarstwienia, a drugiej do drobnego rozwarstwienia.

Następnie przenieś kilka larw do jednej z kropli pożywki. Następnie przenieś szklane szkiełko z larwami do mikroskopu preparacyjnego. Teraz powiększ kroplę zawierającą larwy tak, aby widoczne były przednie i tylne końce larw.

Chwyć środkową część pojedynczej larwy parą kleszczy i chwyć inny obszar tuż obok niego drugą parą kleszczy. Następnie rozerwij larwy na pół. Powtórz procedury dla wszystkich larw na pokrywie, wsuń i wyrzuć tylne połówki.

Powiększ larwę tak, aby haczyki w przednim otworze gębowym były wyraźnie widoczne. Następnie wykonaj małe nacięcie lub nacięcie po przeciwnej stronie haczyków gębowych larw między trzecią klatką piersiową a pierwszą brzuszną opaską CLE. Następnie chwyć kleszczem haczyki do ust.

Delikatnie oderwij naskórek od przodu do tyłu i kontynuuj, aż OUN zostanie odsłonięty. Następnie rozerwij tkanki, aby odizolować OUN od reszty larw. Należy uważać, aby nie uszkodzić OUN i wyrzucić uszkodzone próbki z rozerwanym brzusznym rdzeniem nerwowym lub zniekształconymi płatami wzrokowymi.

Powtórz procedury dla wszystkich larw na szkiełku nakrywkowym. Następnie przenieś zdrową eksplantowaną tkankę do drugiego czystego podłoża. Upuść na szkiełko nakrywkowe, aby przeprowadzić dokładne rozwarstwienie.

Użyj szpilek preparacyjnych, aby usunąć tkanki obwodowe z mózgu. Wsuń skalpel między mózg a niechcianą tkankę i przypnij tkankę łączną do szkiełka podstawowego. Za pomocą haczyka delikatnie zetrzeć niechcianą chusteczkę, jednocześnie dociskając skalpel do szkiełka nakrywkowego ruchami huśtawki.

Pracuj powoli i celowo, aby usunąć wszystkie dyski z każdego mózgu. Zachowaj ostrożność, aby nie zakłócić morfologii mózgu. Zdrowy mózg będzie miał nienaruszony brzuszny rdzeń nerwowy i symetryczne okrągłe płaty wzrokowe.

Teraz odwróć 50-milimetrową przepuszczalną dla gazu naczynie hodowlane z przezroczystą folią skierowaną do góry, umieść niewielką kroplę pożywki na środku naczynia. Następnie za pomocą haczyka zgarnij mózgi pod płatami wzrokowymi i przenieś je jeden po drugim do kropli pożywki na szalce. Zbierz od pięciu do 10 mózgów w kropli pożywki.

Następnie popchnij je na dno jeden po drugim, ponieważ wiele z nich zostanie później uwięzionych w łąkotce. Zorientuj mózg tak, aby umożliwić obrazowanie neuroblastu w celu zobrazowania przedniego brzusznego neuroblastu. Umieść mózgi z brzusznym rdzeniem nerwowym skierowanym do góry, ustaw mózgi tak, aby wszystkie brzuszne sznury nerwowe były skierowane w tym samym kierunku w płaszczyźnie XY.

Użyj strzykawki lub plastikowej pipety transferowej, aby umieścić cztery krople oleju węglowego halo na membranie przepuszczającej gaz. Objętość każdej kropli oleju powinna być równa sobie nawzajem i kropli pożywki. Po ukończeniu pięć kropli będzie przypominać pięć faset na kościach w stylu zachodnim.

Następnie opuść szkiełko nakrywkowe na zespół tak, aby uderzyło we wszystkie pięć kropli w tym samym czasie. Utrzymanie równomiernego ciśnienia w próbkach zmniejsza prawdopodobieństwo ich zakłócenia. Poczekaj około trzech minut.

Gdy olej i medium rozpraszają się pod ciężarem szkiełka nakrywkowego pod lunetą sekcyjną. Opuść szkiełko nakrywkowe na powierzchnię mózgu, usuwając nadmiar pożywki za pomocą z bibuły, aż szkiełko nakrywkowe dotknie, mózgi nie będą nadmiernie przechylone, ponieważ spowoduje to zniekształcenie tkanki lub eksplozję mózgu, aby zobrazować anteryjny neuroblast brzuszny. Szkiełko nakrywkowe musi być nieznacznie przesunięte w kierunku końcówek brzusznego rdzenia nerwowego.

Powoduje to obracanie się mózgu, co powoduje, że płaty mózgowe stykają się bezpośrednio ze szkiełkiem nakrywkowym, aby ułatwić obrazowanie, a następnie uszczelnia komorę za pomocą enc. Szkiełko nakrywkowe z niewielką ilością oleju węglowego halo. Nadmiar oleju sączący się z szkiełka nakrywkowego należy zminimalizować i zetrzeć chusteczką.

Przed obrazowaniem. Dodaj kroplę olejku immersyjnego do szkiełka nakrywkowego tuż nad zamontowanymi mózgami, aby pomóc wyśrodkować obiektyw bezpośrednio nad próbką. Delikatnie umieść zamontowaną próbkę w inkubatorze ze stopniem 25 stopni Celsjusza i przykryj komorę pokrywą.

Następnie zlokalizuj centralny neuroblast mózgu za pomocą światła przechodzącego, skupiając się na dużych okrągłych komórkach, które znajdują się w centralnych i przyśrodkowych obszarach płatów wzrokowych. Po umieszczeniu na miejscu wykonaj szybkie ekspozycje za pomocą konfokalnego, aby określić właściwą lokalizację i głębokość neuroblastu. Ogranicz głębokość do pierwszych 10 do 15 mikrometrów.

Dostosuj w razie potrzeby i zrób kolejny obraz testowy. Aby wyeliminować dryf osiowy, użyj urządzenia do ciągłego automatycznego ustawiania ostrości, które wykorzystuje diodę LED na podczerwień lub ręcznie skoryguj płaszczyznę ogniskowej. Po zidentyfikowaniu interesującego nas neuroblastu zoptymalizuj wszystkie parametry przed obrazowaniem.

Teraz zobrazuj cały neuroblast, zbierając od 12 do 14 obrazów oddalonych od siebie o jeden mikrometr w osi Z. Dostosuj rozdzielczość czasową, aby uchwycić jeden lub wiele cykli komórkowych tego samego neuroblastu. Używaj interwałów od 10 do 32 sekund dla obrazowania pojedynczego cyklu komórkowego i interwałów od jednej do trzech minut dla wielu cykli komórkowych.

Następnie potwierdź, że próbka jest zdrowa, monitorując czas trwania mitozy. Jeśli mitoza trwa dłużej niż 15 minut, przejdź do innego mózgu. Zdrowy mózg pokaże wiele neuroblastów w tym samym polu widzenia, przechodząc kilka rund mitozy.

Po zakończeniu obrazowania zdemontuj komorę inkubacyjną i wyrzuć wszystko oprócz naczyń do hodowli przepuszczalnych dla gazu. Spłucz powierzchnię naczynia hodowlanego 95% etanolem i wytrzyj olej chusteczką. Powtórz procedurę jeszcze dwa razy.

Pokazano tutaj obrazowanie na żywo podziałów komórek macierzystych neuroblastów w preparatach całego montażu. Są to obrazy poklatkowe pojedynczego cyklu komórkowego z neuroblastu eksprymującego GFP Mosin do precyzyjnej analizy komórkowej, pojedynczy cykl komórkowy neuroblastów jest obrazowany w mniej niż 32. odstępach czasu. Są to obrazy poklatkowe przedstawiające kolejne cykle podziału komórki z neuroblastu wyrażającego zarówno G-F-P-M-O, jak i marker centrosomowy znakowany GFP.

Do obrazowania wielu cykli komórkowych neuroblastów. Mózgi są zwykle obrazowane w odstępach czasu od jednej do trzech minut w okresie od dwóch do trzech godzin. Projekcje konfokalne utrwalonych komórek macierzystych z preparatów do montażu domowego są pokazane tutaj.

Aby zobrazować wszystkie neuroblasty znajdujące się na obu płatach wzrokowych, stosuje się 20-krotne powiększenie. Analiza ta jest szczególnie przydatna do zbadania ogólnej morfologii mózgu i ilościowego określenia liczby neuroblastów. Większość neuroblastów z pojedynczego płata wzrokowego można uwidocznić w 40-krotnym powiększeniu.

Do szczegółowej analizy komórkowej kilku neuroblastów należy użyć 100-krotnego powiększenia. Ten zmutowany neuroblast wykazuje wiele centrosomów na każdym biegunie wrzeciona. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby uniknąć uszkodzeń zdjęcia poprzez ograniczenie ilości światła padającego na próbkę.

Ta technika obrazowania żywych podziałów neuroblastów w preparatach całych wierzchowców utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych do zbadania asymetrycznego podziału komórek w żywym natywnym kontekście rozwijającego się mózgu drosophila.