Name: Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-11T18:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Poznaj wysokoprzepustowy test fenotypowy Salmonella enterica Typhimurium w makrofagach. Ta metoda pozwala badać geny odpowiedzialne za inwazję i replikację bakterii w komórkach gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był częściowo wspierany przez grant dla National Institutes of Health NIAID (dla A.J.B. i L.G.A., R01 AI076246). Kolekcja mutantów Salmonelli była częściowo wspierana przez granty National Institutes of Health (dla M.M., U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 i R01 AI075093-01), częściowo przez granty National Institutes of Health (dla H.A.P, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Dziękujemy Steffenowi Prowollikowi za wykonanie repliki i potwierdzenie obecności mutantów w kolekcji.

1. Mysi makrofag RAW264.7 Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hoduj mysie komórki makrofagów o niskiej liczbie pasażów, RAW264.7 (numer ATCC®, TIB-71) w nasadce filtra wentylowanego w kolbie do hodowli komórek T-75 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 0,5% NaHCO3 i 1% 100x aminokwasów endogennych (NEAA) w temperaturze 37°C, w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 60-80% konfluencji w kolbie, użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki, policz komórki w hemacytometrze i oblicz stężenie komórek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki i rozcieńczyć stężenie komórek do 2,5 x 105/ml w świeżej pożywce do hodowli komórkowych DMEM. Za pomocą pipet wielokanałowych umieścić 200 μl pożywki do hodowli komórkowych DMEM zawierającej 5 x 104 komórek w każdym dołku 96-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Umieść na płytce cztery dołki każdego szczepu Salmonelli. Ustaw trzy oddzielne płytki dla jednego zestawu testów inwazji komórek fagocytarnych i oznacz je odpowiednio słowami "asocjacja", "inwazja" i "replikacja".</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C ON, aby umożliwić komórkom makrofagów przyczepienie się do dna studzienek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie Salmonelli typu dzikiego i mutantów
<ol>
	<li>Tego samego dnia, w którym przygotowywane są komórki makrofaga RAW264.7, należy pobrać pojedyncze kolonie serotypu dzikiego (WT) Salmonella enterica Typhimurium 14028s, mutanta DinvA, mutanta DphoP i pożądanych zmutowanych szczepów testowych i wyhodować je w bulionie Luria-Bertani (LB) uzupełnionym odpowiednio antybiotykami. Użyj każdego zestawu testów inwazji komórek fagocytarnych, aby przetestować do 10 zmutowanych szczepów (mutant DinvA i mutant DphoP są wadliwe odpowiednio w inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej).</li>
	<li>Hodować bakterie przez 14 godzin w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 220 obr./min w 5 ml bulionu LB w luźno zakręconych 14 ml polipropylenu w probówce z okrągłym dnem. Rosół LB zawiera odpowiednie antybiotyki, w naszym przypadku większość zmutowanych szczepów jest oporna na Kanamycynę, 50 μg/ml</li>
	<li>Następnego dnia subkulturuj każdą z kultur ON szczepów Salmonelli w zwykłych 5 ml bulionów LB w proporcji 1:50 przez dodatkowe 4 godziny z wytrząsaniem przy 220 obr./min.</li>
	<li>Odczytaj wartości OD600 każdej kultury bakteryjnej na spektrofotometrze, a każdy odczyt powinien mieścić się w zakresie 0,6-1,2, aby zoptymalizować ekspresję genu systemu wydzielania patekoli Salmonella typu III (SPI-1 TTSS) pod kątem inwazji.</li>
	<li>Użyj wzoru 1 OD600 = 7,5 x 108 CFU/ml, aby oszacować stężenie bakterii, a następnie rozcieńczyć bakterie do stężenia 5 x 106 CFU/ml w świeżej pożywce do hodowli komórkowych DMEM.</li>
</ol>
3. Test inwazji na 96-dołkowej płytce hodowlanej
<ol>
	<li>Wyjąć trzy 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych z inkubatora CO2 i przemyć każdą studzienkę raz 200 μl 1x buforu PBS.</li>
	<li>Po umyciu i całkowitym usunięciu PBS, dodaj 200 μl bakterii w pożywce DMEM (patrz wyżej) do każdej studzienki. Daje to 1 x 106 komórek Salmonelli w każdym dołku i wielokrotność infekcji (MOI) 20:1.</li>
	<li>Odwirować płytki o sile 1 000 x g w szczelnie zamkniętym nośniku przez 10 minut, a następnie umieścić płytki (czas zero) w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 30 minut. Dla każdego szczepu ustaw co najmniej cztery zduplikowane studzienki.</li>
	<li>Po 30 minutach wyjąć płytki z inkubatora i przemyć je trzykrotnie 200 μl 1x PBS w celu usunięcia niezwiązanych bakterii.</li>
	<li>Po umyciu należy zachować płytkę oznaczoną "skojarzeniem" do dalszej obróbki. Dodać 200 μl pożywki DMEM zawierającej 100 μg/ml gentamycyny do każdej studzienki z płytek oznaczonych słowami "inwazja" i "replikacja" w celu zabicia zewnątrzkomórkowej Salmonelli. Umieścić płytki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na dodatkową godzinę.</li>
	<li>Zachowaj jedną studzienkę z każdego zakażonego szczepu do rejestracji liczby komórek makrofagów, resztę studzienek na płytce "asocjacyjnej" potraktuj 200 μl 1x PBS zawierającego 1% Triton X-100 przez 10 minut. Roztwór Triton spowoduje lizę komórek makrofagów i uwolnienie związanej z nimi Salmonelli.</li>
	<li>Zbierz Salmonellę z każdej studzienki i umieść je w probówkach Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Wykonaj trzy 10-krotne seryjne rozcieńczenia 900 μl 1x PBS na pobranych próbkach z każdej studzienki, między każdym rozcieńczeniem przeprowadza się wirowanie.</li>
	<li>Trzecie rozcieńczenie, 10-3, umieścić na płytkach LB (WT) lub LB Kan (mutanty). Oznacz płytki odpowiednią nazwą szczepu Salmonella, numerem rozcieńczenia, punktem czasowym i datą.</li>
	<li>Po zawirowaniu trzeciej probówki z rozcieńczaczem, naniec 10 μl próbki na powierzchnię agaru i powtórz cztery razy, co daje w sumie 5 kropli. Upewnij się, że pięć kropli o pojemności 10 μl jest równomiernie rozmieszczonych na płytkach Petriego7.</li>
	<li>Po zanurzeniu kropli w agarze odwróć płytki i inkubuj przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . </li>
	<li>Studzienki zachowane do liczenia makrofagów należy traktować 150 μl 1xPBS zawierającego 0,25% trypsyny-EDTA przez 10 minut.</li>
	<li>Po trypsynizacji umieść makrofagi w 1,5 ml probówkach Eppendorfa i potraktuj je 50 μl FBS w celu zneutralizowania roztworu trypsyny/EDTA, wybarwić komórki 0,4% błękitem trypanowym i ocenić je za pomocą hemytometru.</li>
	<li>Po upływie jednej godziny inkubacji wyjąć płytki "inwazji" i "replikacji" z inkubatora CO2 i umyć każdą z nich zgodnie z "Krokiem 3.4".</li>
	<li>Zachowaj tabliczkę "inwazji" do dalszej obróbki jako "Krok 3.6-3.12".</li>
	<li>Dodać 200 μl pożywki DMEM zawierającej 10 μg/ml gentamycyny do płytki "replikacyjnej" w celu utrzymania klirensu zewnątrzkomórkowej Salmonelli w pożywce. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 na dodatkowe 22,5 godziny.</li>
	<li>Następnego dnia wyjmij płytkę "replikacyjną" z inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i umyj każdą studzienkę jako "Krok 3.4" i potraktuj je jako "Krok 3.6-3.12".</li>
	<li>Na koniec, po inkubacji przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C należy usunąć płytki agarowe i ocenić liczbę kolonii bakteryjnych.</li>
	<li>Dobry rozkład kolonii powinien wynosić od 10 do 100 kolonii, każde miejsce zawiera w przybliżeniu od 2 do 20 kolonii, trudno byłoby zdobyć, gdyby w jednym miejscu było więcej niż 20 kolonii. Jeśli liczba jest zbyt niska lub zbyt wysoka, w razie potrzeby należy ponownie pokryć próbkę 10-krotnie wyższymi lub niższymi rozcieńczeniami.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Obliczyć jtk (jednostki tworzenia kolonii na ml) każdej płytki na podstawie objętości posiewu i współczynnika rozcieńczenia.</li>
	<li>Ustal liczbę Salmonelli na makrofagi za pomocą zarejestrowanej liczby komórek makrofagów z każdego szczepu.</li>
	<li>Obliczyć średnie geometryczne CFU na makrofag z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów odpowiednio dla asocjacji, inwazji lub replikacji komórek i znormalizować dalej do WT dla wartości względnej.</li>
	<li>Przeanalizuj dane pod kątem asocjacji, inwazji i replikacji za pomocą testu t Studenta, porównując każdy szczep z WT i określ istotność statystyczną na podstawie wartości p.</li>
</ol>

<ol><li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonellae+interplay+with+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li>
<li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li>
<li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li>
<li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li>
<li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li>
<li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li>
<li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li>
<li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Salmonella+survive+against+the+odds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li>
<li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).</li>
<li>Molinari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li>
<li>Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li>
<li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li>
<li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869(2011).</li>
<li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Test ochrony gentamycyną jest szeroko stosowany do badania inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych wewnątrz komórki gospodarza i jest szczególnie ważnym narzędziem biologicznym do badania patogenów, takich jak Salmonella, których inwazja jest warunkiem wstępnym do ustalenia infekcji1. Standardowy test ochrony przed gentamycyną w społeczności badawczej zajmującej się salmonellą jest stosowany w 24-dołkowym naczyniuhodowlanym 5. Chociaż zastosowanie 48-, a naw...

Nietyfusowa Salmonella jest ważną przyczyną chorób jelitowych u wszystkich kręgowców. Salmonelloza u ludzi jest jedną z głównych bakteryjnych chorób przenoszonych przez żywność1. Charakterystyka mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw interakcji Salmonelli z ich zwierzęcymi gospodarzami, jest osiągana głównie dzięki badaniu serotypu Salmonella enterica Typhimurium (STM) w hodowlach tkankowych i zwierzęcych modelach infekcji. Uzyskanie wglądu w interakcje STM z gospodarzem pomoże nam zrozumieć, w jaki sposób Salmonella przeżywa i rozwija się w komórkach gospodarza. Pierwszym wyzwaniem w badaniu tych interakcji jest zidentyfikowanie jak największej liczby czynników uczestniczących zarówno w organizmie gospodarza, jak i patogenu, ale wysiłki te są w dużej mierze utrudnione przez znaczne trudności w radzeniu sobie jednocześnie z dwoma niezależnymi złożonymi systemami biologicznymi, tj. gospodarzem i Salmonellą, w warunkach fizjologicznych. Ponadto duży repertuar genów Salmonelli i gospodarza potencjalnie kodujących czynniki zaangażowane w interakcje z gospodarzem wymaga wysokoprzepustowej platformy biologicznej, aby sprostać temu wyzwaniu.
Zmodyfikowany, standaryzowany test do fenotypowego kojarzenia, inwazji i replikacji Salmonelli w makrofagach o wysokiej przepustowości został opracowany w celu zbadania dużego zestawu genów prawdopodobnie angażujących się w interakcje Salmonella - gospodarz. Test ochrony gentamycyną został opracowany w 1973 r.2 , ale po raz pierwszy został dokładnie opisany przez Elsinghorsta w 1994 r.3,4. Obecnie stała się standardowym narzędziem do badania ex vivo wielu wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych, w tym Salmonelli5,6. Zinternalizowane bakterie unikają zabicia przez niektóre antybiotyki, takie jak gentamycyna, które nie mogą przeniknąć do komórek eukariotycznych3. Wykorzystując to zjawisko, test ochrony gentamycyny mierzy przeżywalność i wzrost wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych. Trzy zdarzenia podczas infekcji, tj. związek z komórkami eukariotycznymi, inwazja i replikacja, można ocenić dla wewnątrzkomórkowych patogenów bakteryjnych na podstawie odstępu czasu między infekcją, leczeniem gentamycyną i dalszą inkubacją (ryc. 1). Eukariotyczne linie komórkowe zapewniają środowisko fizjologiczne, które jest mniej złożone niż odpowiednie modele zwierzęce do badań interakcji gospodarz-patogen.
Test ochrony gentamycyny jest odpowiednią platformą do badania interakcji STM-gospodarz, ale standardowy test w 24-dołkowym naczyniu hodowlanym ma niską przepustowość. Analiza obliczeniowa zestawów danych in vivo zidentyfikowała 149 produktów genu Salmonella, które według prognoz mogą wchodzić w interakcje z około 300 produktami genów gospodarza (dane niepublikowane). Standardowy test ochrony gentamycyny nie jest w stanie skutecznie fenotypować tej liczby mutantów.
Ponadto, test ochrony gentamycyny może teoretycznie wykryć inwazję nawet pojedynczej bakterii. Ze względu na tę nieodłączną wrażliwość, surowe dane są podatne na odchylenia techniczne, gdy powtarzają się w różnym czasie. Kontrole wewnętrzne i względna prezentacja danych po normalizacji są niezbędne do miarodajnej interpretacji wyników. Biorąc pod uwagę te czynniki, opracowano zmodyfikowany, znormalizowany test ochrony gentamycyny w celu zwiększenia możliwości testowania i precyzji.
Poniższy protokół jest szczegółowo opisany i zilustrowany, aby przeprowadzić zmodyfikowany test ochrony gentamycyny przy użyciu 96-dołkowych szalek hodowlanych i mysiej linii komórkowej makrofagów RAW264.7. W porównaniu ze standardowym protokołem w 24-dołkowych szalkach hodowlanych, zmodyfikowany protokół ma następujące zalety: 1) Użycie 96-dołkowych szalek hodowlanych pozwala na fenotypowanie do 10 różnych zmutowanych szczepów, w tym wewnętrznych kontroli pozytywnych i ujemnych o wystarczającej mocy statystycznej; 2) Zmienność wyników jest znacznie zmniejszona, ponieważ zmutowane szczepy są testowane w tym samym naczyniu hodowlanym i w tym samym czasie; 3) Zastosowanie pipet wielokanałowych zwiększa przepustowość przy jednoczesnym zmniejszeniu zmęczenia operatora. Wreszcie, w porównaniu z 24-dołkowymi szalkami hodowlanymi, problemy związane z mniejszą liczbą komórek gospodarza na basenie w 96-dołkowym naczyniu hodowlanym zostały rozwiązane poprzez optymalizację i standaryzację protokołu.
Podsumowując, zmodyfikowany, standaryzowany test in vitro fenotypu Salmonelli lub innego związku bakteryjnego, inwazji i replikacji w komórkach fagocytarnych zwiększa precyzję i osiąga wysoką przepustowość, jednocześnie zmniejszając zmęczenie operatora.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon płodowej surowicy bydlęcej</td><td></td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Kolba do hodowli komórkowych wentylowana nasadka filtra</td><td>Nest Biotechnology</td><td>708003</td><td></td></tr><tr><td>100x Aminokwasy endogenne</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>BD Falcon</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Corning Incorporated</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) bulion</td><td>MP Biomedicals</td><td>3002-075</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Polipropylenowa probówka z okrągłym dnem</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna roztwór</td><td>Sigma</td><td>K0254</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna roztwór</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy test na fenotyp salmonella enterica typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Gatunki Salmonelli są patogenami odzwierzęcymi i głównymi przyczynami chorób przenoszonych przez żywność u ludzi i zwierząt gospodarskich1. Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw interakcji między Salmonellą a gospodarzem jest ważne dla wyjaśnienia molekularnej patogenezy zakażenia Salmonellą. Test ochrony gentamycyny przed fenotypem asocjacji, inwazji i replikacji Salmonelli w komórkach fagocytarnych został dostosowany, aby umożliwić wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu określenia ról mutantów delecyjnych serotypu Salmonella enterica Typhimurium w interakcjach z gospodarzem przy użyciu makrofagów myszy RAW 264.7. W ramach tego protokołu wariancja pomiarów jest znacznie zmniejszona w porównaniu ze standardowym protokołem, ponieważ szczepy typu dzikiego i wiele zmutowanych szczepów mogą być testowane w tym samym naczyniu hodowlanym i w tym samym czasie. Zastosowanie pipet wielokanałowych zwiększa przepustowość i precyzję. Ponadto zajęto się problemami związanymi z użyciem mniejszej liczby komórek gospodarza na studzienkę w 96-dołkowym naczyniu hodowlanym. W tym przypadku protokół zmodyfikowanego testu inwazji Salmonelli in vitro z wykorzystaniem komórek fagocytarnych został z powodzeniem zastosowany do fenotypu 38 indywidualnych mutantów delecji Salmonelli w celu asocjacji, inwazji i replikacji wewnątrzkomórkowej. Przedstawiono fenotypy in vitro, z których niektóre zostały następnie potwierdzone jako fenotypy in vivo w modelu zwierzęcym. W związku z tym zmodyfikowany, standaryzowany test na asocjację, inwazję i replikację fenotypu Salmonelli w makrofagach o wysokiej przepustowości może być szerzej wykorzystany do badania interakcji bakteria-gospodarz.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki (Rysunek 2>) po wykreśleniu danych na podstawie zmodyfikowanego testu inwazji komórek fagocytujących. Dane obejmują pięć różnych szczepów: WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A oraz mutant B. Szczepy ΔinvA, znany z defektów w inwazji, oraz ΔphoP, znany z defektów w replikacji8, posłużyły jako kontrole pozytywne w celu oceny poprawności eksperymentu. Rzeczywiście, w zmodyfikowanym teście inwazji mutant ΔinvA jest słabo inter...

Opracowano wysokoprzepustowy test in vitro fenotypu Salmonelli lub innych bakterii asocjacyjnych, inwazyjnych i replikacyjnych w komórkach fagocytarnych o wysokiej przepustowości. Metodę wykorzystano do oceny zmutowanych szczepów z nokautem genu Salmonelli pod kątem ich udziału w interakcjach gospodarz-patogen.

Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie przesiewowe i ocena genów wymaganych do inwazji i/lub przetrwania w komórkach makrofagów in vitro, w sposób wysokoprzepustowy, oraz identyfikacja mechanistycznych genów patogenezy salmonelli. Osiąga się to poprzez dodanie dzikich lub zmutowanych szczepów salmonelli do kultur komórkowych makrofagów. W 96 przypadkach płytki studzienkowe przez 30 minut jako infekcja in vitro jako drugi krok po 30-minutowej inkubacji, salmonella, która nie przyczepiła się do komórek makrofagów, jest zmywana i świeża.Na godzinę dodaje się pożywkę zawierającą wysokie stężenie antybiotyku Gentamycyny, która zabija wszystkie bakterie zewnątrzkomórkowe, które nie są zinternalizowane. Następnie hodowla komórek makrofagów jest ponownie myta i dodaje się świeżą pożywkę zawierającą niskie stężenie gentamycyny na dodatkowe 22,5 godziny inkubacji, aby utrzymać środowisko zewnątrzkomórkowe wolne od bakterii i umożliwić przetrwanie i namnażanie się tylko wewnątrzkomórkowej salmonelli. Wyniki pokazują, że porównując zmutowaną salmonellę ze szczepem typu dzikiego, fenotyp in vitro zmutowanych szczepów do inwazji asocjacyjnej i replikacji określa się na podstawie pomiaru jednostek tworzenia kolonii na komórki makrofagów uzyskanych za pomocą testu posiewu z seryjnym rozcieńczaniem dla każdego punktu czasowego.Główną zaletą naszej techniki jest to, że mierzy asocjację, inwazję i replikację komórek salmonelli i fagocytarów oraz że może mierzyć wiele szczepów jednocześnie w celu uzyskania większej przepustowości. Demonstracją procedury będzie dr Jing Wu, doktor habilitowany w moim laboratorium, oraz pani Roberta Pugh, pracownik naukowy w moim laboratorium Aby rozpocząć rząd o niskiej liczbie pasaży odzwierciedlającej komórki makrofagów surowe 2 64 0,7 w kolbie do hodowli komórek T 75 z wentylowaną nasadką filtrującą w zmodyfikowanym pożywce delcos Eagles uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą 0,5% wodorowęglanu sodu i 1% 100 x aminokwasy endogenne NEAA w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% inkubator dwutlenku węgla.Gdy komórki osiągną 60 do 80% konfluencji, zbierz komórki w DMEM za pomocą skrobaka do komórek, a następnie policz komórki w hemocytometrze i oblicz stężenie komórek, rozcieńczyć zawiesinę komórek do stężenia 2,5 razy 10 do piątych komórek na mililitr świeżej hodowli komórek DMEM. Pożywkę 200 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek za pomocą pipety wielokanałowej do każdej studzienki 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej komórki na trzy oddzielne płytki 96-dołkowe do jednego zestawu testu inwazji komórek fagocytarnych i oznaczyć każdą płytkę inwazją asocjacyjną i replikacją. Dla każdego szczepu salmonelli stosuje się cztery studzienki na płytkę.Umieść płytki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc, aby komórki makrofagów mogły przyczepić się do dna studzienek tego samego dnia. Surowe komórki makrofagów 2, 6, 4, 0,7 są siane w 96-dołkowych płytkach. Wybrać pojedyncze kolonie serotypu dzikiego salmonella entera, tyria 1 0 4 2 8 delta INVA mutant delta four P mutant i pożądaną badaną hodowlę zmutowanych szczepów.Każdy ze szczepów salmonelli w pięciu mililitrach bulionu LB i uzupełnia bulion LB dla zmutowanych szczepów Dzięki 50 mikrogramom na mililitr puszki mycyny hoduj bakterie przez 14 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 220 obr./min w luźno zamkniętych 14-mililitrowych probówkach z polipropylenu o okrągłym dnie. Po całonocnej inkubacji w subkulturze w temperaturze 37 stopni Celsjusza każdy z szczepów salmonelli w proporcji od jednego do 50 na pięć mililitrów odpowiedniego bulionu funtowego. Hoduj kultury przez dodatkowe cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przy 220 obr./min.Odczytaj wartości OD 600 każdej kultury bakteryjnej na spektrofotometrze. Każda hodowla powinna mieć wartość OD 600 w zakresie od 0,6 do 1,2, aby zoptymalizować patogenność salmonelli na wyspie od jednego do trzech, system wydzielania, SPI jeden typ trzy, system wydzielania, ekspresję genów do inwazji. Oblicz stężenie bakterii za pomocą wzoru jeden OD 600 równa się 7,5 razy 10 ósmym jednostkom tworzącym kolonię na mililitr.CFU następnie rozcieńczyć bakterie do stężenia pięć razy 10 do sześciu, FU na mililitr i trzy mililitry świeżej pożywki do hodowli komórkowych DMEM Usunąć 3 96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych zawierające makrofagi z inkubatora dwutlenku węgla i przemyć każdą studzienkę raz 200 mikrolitrami jednego XPBS. Po całkowitym usunięciu płukania PBS z każdego z nich, dobrze dodaj 200 mikrolitrów bakterii w pożywce DMEM do każdej studzienki. Powoduje to, że w każdym dołku znajduje się od 10 do sześciu komórek salmonelli i wielokrotność MOI infekcji wynosząca 20 do jednego, odwirowuje płytki w szczelnie zamkniętym pojemniku pod ciśnieniem 1000 razy G przez 10 minut.Następnie umieść płytki w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji wyjmij płytki z inkubatora i umyj każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami jednego XPBS w celu usunięcia niepowiązanych bakterii. Następnie w 200 mikrolitrach pożywki DMEM zawierającej 100 mikrogramów na mililitr gentamycyny do każdej studzienki z płytek oznaczonych inwazją i replikacją w celu zabicia zewnątrzkomórkowej salmonelli.Następnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkową godzinę. W przypadku płytki asocjacyjnej zachowaj jedną studzienkę z każdego zakażonego szczepu w celu zarejestrowania liczby komórek makrofagów, a pozostałe studzienki potraktuj 200 mikrolitrami jednego XPBS zawierającego 1% trytton X 100 przez 10 minut. Aby pokroić komórki, zbierz salmonellę z każdej studzienki i umieść je w 1,5 mililitrowych probówkach orph Wykonaj trzy dziesięciokrotne rozcieńczenia zbóż 900 mikrolitrami jednego XPBS na zebranych próbkach z każdej studzienki i wiruj między każdym wirem rozcieńczania trzecie rozcieńczenie, od 10 do ujemnych trzech dla każdej bakterii i umieść 10 mikrolitrów próbki na płytkach LB dla płytek typu dzikiego lub LB.Z puszką mycyny dla zmutowanych szczepów. Powtórz ten krok cztery razy, w sumie pięć kropli o pojemności 10 mikrolitrów rozmieszczonych równomiernie na płytkach po tym, jak krople wsiąkną w agar, odwróć płytki i inkubuj przez noc W inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza potraktuj pozostałe studzienki zapisane do liczenia makrofagów 150 mikrolitrami jednego XPBS zawierającego 0,25% TRIPSIN EDTA przez 10 minut. Po zakończeniu trypsyny przenieś makrofagi do 1,5 mililitrowych probówek einor i potraktuj 50 mikrolitrami FBS w celu zneutralizowania roztworu tryin EDTA.Następnie usunąć 10 mikrolitrów zawiesiny komórek z jednej probówki EOR do nowej probówki. Dodaj 10 mikrolitrów 0,4% błękitu trianowego do zabarwienia komórek i policz je w cytometrze hemologicznym, gdy płytki do inwazji i replikacji zakończą godzinną inkubację w inkubatorze dwutlenku węgla. Wyjąć płytki z inkubatora i umyć każdą studzienkę trzy razy 200 mikrolitrami jednego XPBS.Następnie dodaj 200 mikrolitrów pożywki DMEM zawierającej 10 mikrogramów na mililitr gentamycyny do płytki replikacyjnej, aby utrzymać klirens zewnątrzkomórkowej salmonelli w pożywce. Następnie umieść płytkę w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkowe 22,5 godziny. Następnie należy zebrać i ponownie zebrać salmonellę z płytki inwazyjnej na płytki agarowe i policzyć makrofagi z jednego dołka każdego zakażonego szczepu, postępując zgodnie z krokami opisanymi dla płytki asocjacyjnej następnego dnia.Wyjąć płytkę replikacyjną z inkubatora i przemyć każdą studzienkę trzykrotnie 200 mikrolitrami jednego XPBS. Następnie należy zebrać i ponownie zebrać salmonellę z płytki replikacyjnej na płytki agarowe i policzyć makrofagi z jednej studzienki każdego zakażonego szczepu, postępując zgodnie z krokami opisanymi dla płytki asocjacyjnej. Po nocnej inkubacji płytek agarowych w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, wyjmij płytki z inkubatora i oceń liczbę kolonii bakteryjnych na płytce.Podczas liczenia każdej płytki rozmieszczenie kolonii powinno mieścić się w przedziale od 10 do 100 kolonii. Jeżeli liczba jest zbyt wysoka lub zbyt niska, należy ponownie umieścić próbkę w dziesięciokrotnym wyższym lub niższym rozcieńczeniu, w zależności od potrzeb. Test inwazji komórek fagocytarnych odpowiednio identyfikuje fenotyp mutantów delecji salmonelli, jak pokazano dla szczepu kontrolnego inwazji delta INVA, znanego mutanta z wadami inwazji i szczepu kontrolnego replikacji delta four P.Znany zmutowany mutant A z wadliwą replikacją i zmutowany B to dwa reprezentatywne testy szczepów wykorzystujące ten protokół, które wykazują zmienione fenotypy do replikacji w makrofagach 20 z 38. Mutanty Salmonelli testowane do tej pory w teście inwazji komórek fagocytarnych wykazują zmienne, ale znaczące defekty w inwazji asocjacji i/lub replikacji w surowych makrofagach 2, 6, 4, 0,7. Ten protokół został przetestowany tylko dla niektórych komórek statycznych z efektem nala i gospodarza.W związku z tym konieczna będzie modyfikacja i optymalizacja dla innych bakterii i komórek gospodarza.

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Jung, A. L. et al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia wstępne traktowanie makrofagów pęcherzykami błony zewnętrznej (OMV) Legionella pneumophila w celu zbadania ich wpływu na replikację bakterii. Zmieniając sygnalizację immunologiczną gospodarza, OMV sprawiają, że makrofagi są bardziej podatne na infekcje. Wyższa liczba kolonii w leczonych komórkach, w porównaniu z...

Oznaczanie replikacji Legionella pneumophila w makrofagach poddanych działaniu pęcherzyków błony zewnętrznej

Ten film demonstruje test do zbadania zależnej od receptora toll-like (TLR) aktywności czynników transkrypcyjnych: czynnika jądrowego-kappa-B (NF-κB) i białka aktywatora-1 (AP-1) w makrofagach. TLR uruchamiają prozapalną kaskadę sygnalizacyjną po rozpoznaniu wzorców molekularnych związanych z uszkodzeniem (DAMP), aktywując NF-κB i AP-1. Zmodyfikowane makrofagi reporterowe wytwarzają embrionalny enzym fosfatazę alkaliczną (SEAP) po aktywacji NF-κB i AP-1, który jest wykrywany w reakcji...

Test sygnalizacji czynnika transkrypcyjnego NF-&kcy;B/AP-1 zależnego od TLR w makrofagach

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Ten film demonstruje test do ilościowego oznaczania cytozolowego i wakuolarnego Salmonella typhimurium wewnątrz makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą różnicowej przepuszczalności. Makrofagi są zakażone Salmonellą wykazującą ekspresję białka fluorescencyjnego, która jest internalizowana w wyspecjalizowanej strukturze wakuolarnej zwanej wakuolą zawierającą Salmonellę lub SCV. Podzbiór bakterii ucieka z SCV i dostaje się do cytozolu. Bogata w cholesterol błona plazmatyczna...

Test do ilościowego oznaczania cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w zakażonych pierwotnych makrofagach

Genetyka do przodu to potężne podejście do identyfikacji genów w patogenach wewnątrzkomórkowych, ważnych dla odporności na autonomiczną odporność komórki. Obecne podejście wykorzystuje wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności makrofagi, do identyfikacji nowych genów Toxoplasma gondii ważnych dla unikania odporności.

Zaawansowane badania genetyczne wykorzystujące makrofagi do identyfikacji genów Toxoplasma gondii ważnych dla odporności na niezależną od IFN-γ odporności komórek

Opisujemy kwantyfikację cytozolowej i wakuolarnej Salmonella typhimurium w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą różnicowej przepuszczalności digitoniny.

Kwantyfikacja cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w pierwotnych makrofagach przez różnicową przepuszczalność

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę izolacji fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów poprzez pokrycie bakterii biotyną i streptawidyną.

Izolacja fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Salmonella atakuje i replikuje się wewnątrz komórek nabłonka jelitowego zarówno w wakuolach specyficznych dla Salmonelli, jak i w wolnych w cytozolu (hiperreplikacja). Opisano tutaj wysokoprzepustowy protokół oparty na mikroskopii fluorescencyjnej w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowych fenotypów Salmonelli za pomocą dwóch uzupełniających się analiz obrazu za pomocą ImageJ, osiągając rozdzielczość pojedynczej komórki i punktację.

Automatyczna analiza wewnątrzkomórkowych fenotypów salmonelli za pomocą ImageJ

Poznaj wysokoprzepustowy test fenotypowy Salmonella enterica Typhimurium w makrofagach. Ta metoda pozwala badać geny odpowiedzialne za inwazję i replikację bakterii w komórkach gospodarza.

Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

Przeglądaj więcej filmów