Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Ogólnym celem tej procedury jest przetestowanie zdolności domen ekto białek do pośredniczenia w adhezji homofilnej w celu osiągnięcia tego plazmidu kodującego fuzję fragmentu domeny ekto z regionem FC ludzkiej IgG są transfekowane do komórek HEC 2 93. Wydzielane białka fuzyjne Odin FC są wychwytywane na kulkach magnetycznych sprzężonych z białkiem G, a po przemyciu powlekane kulki mogą oddziaływać w roztworze. Powlekane kulki są następnie obrazowane w celu oceny zakresu agregacji, a na koniec określane ilościowo Za pomocą prostej analizy obrazu, uzyskane dane ujawniają, czy białko jest zdolne do pośredniczenia w adhezji homofilowej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy agregacji komórek, jest to, że jest szybka, prosta i bezpośrednio testuje aktywność adhezyjną wybranego białka. Technikę tę zademonstruje dr Michelle Eman, starszy naukowiec z laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania hodowanych komórek do NCA tutaj ECFC, dwa do trzech dni przed transfekcją.

Użyj 0,05% tripów w EDTA, aby odłączyć komórki HEC 2 93 od naczyń hodowlanych. Przygotuj dwie 100-milimetrowe naczynia na każdy warunek. Podziel komórki od jednego do pięciu, a następnie hoduj je.

Uzupełnione podłoże wzrostowe. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż osiągną 60 do 80% zlewania się. W dniu transfekcji należy użyć odczynnika, takiego jak lipo, w celu wprowadzenia fuzji FC kodującego plazmid.

Po transfekcji należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na 24 godziny następnego dnia po transfekcji Prewarm, DMEM z paciorkowcem pent i bez płodowej surowicy bydlęcej do 37 stopni Celsjusza. Opłucz każde naczynie dwa razy 10 mililitrami podgrzanej pożywki, a następnie włóż naczynia z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę po inkubacji, przepłucz naczynia hodowlane jeszcze raz 10 mililitrami DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej, w sumie trzy płukania, a następnie inkubuj transektowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 48 godzin przed pobraniem pożywki. Cztery dni po transfekcji użyj pipety serologicznej, aby zebrać pożywkę z każdej pary szalek hodowlanych i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie odwiruj pożywkę z prędkością 500 g na pięć minut, aby po wirowaniu osadzać resztki komórkowe, wlej pożywkę z każdej 50-mililitrowej stożkowej probówki do 30-mililitrowej strzykawki i przefiltruj ją przez strzykawkę o średnicy 0,45 mikrona. Przefiltrować do koncentratora odśrodkowego. Obracać filtry odśrodkowe, aż objętość skoncentrowanej pożywki hodowlanej zmniejszy się do około 500 mikrolitrów.

Trwa to około 15 minut. Powtarzaj ten proces, aż cała pożywka hodowlana zostanie dodana i skoncentrowana. Następnie w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra dla każdej próbki po 1,5 mikrolitra białka G kulki magnetyczne na jeden mililitr lodowatego buforu wiążącego.

Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest agregacja ściegów. Aby zapewnić sukces, pamiętaj o dokładnym przestrzeganiu procedury. Obserwuj koraliki szybko, ale nie zbyt surowo.

Nigdy nie należy dopuścić do wyschnięcia z boku rurki lub zbyt długiego pozostawania na magnesie. Umieść probówkę na magnesie i za pomocą pipety odessaj bufor. Następnie natychmiast dodaj skoncentrowaną pożywkę hodowlaną do kulek magnetycznych białka G.

Obracaj rurki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Umieść rurki na magnesie i szybko usuń podłoże. Umyj koraliki dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego bufora wiążącego, a następnie ponownie zawieś kulki w 300 mikrolitrach buforu wiążącego.

Podziel zawieszone kulki na dwie probówki po 150 mikrolitrów w każdej tubie. Następnie dodaj 1,5 mikrolitra chlorku wapnia lub EDTA, aby uzyskać odpowiednio warunki wapnia i braku wapnia. Przenieś 100 mikrolitrów z każdego stanu do depresji.

Dobrze prześlizgnąć się za pomocą mikroskopu światła przechodzącego. Zbierz obrazy z pięciu pól widzenia dla każdego eksperymentu w każdym żądanym punkcie czasowym. Korzystanie z obrazu J lub porównywalnego oprogramowania do analizy obrazu.

Otwórz jeden z pięciu zestawów danych obrazu na obrazie J w menu rozwijanym. U góry ekranu wybierz plik. Następnie wybierz import, a następnie sekwencję obrazów.

Znajdź folder zawierający pliki obrazów, a następnie otwórz je jako stos obrazów. Następnie na pasku menu rozwijanego kliknij obraz, a następnie wybierz właściwości. Aby otworzyć tam okno właściwości.

Zmień jednostki obrazu na piksele i ustaw szerokość i wysokość pikseli na 1,0. Kliknij ponownie obraz, wybierz dostosuj, a następnie próg, aby otworzyć okno progu i użyj suwaka, aby dostosować próg obrazu. Uwzględnij piksele, które przyczyniają się do tworzenia ściegów i wykluczają oraz małe cząsteczki.

Zastosuj próg do wszystkich obrazów w stosie obrazów. Następnie na pasku menu rozwijanego u góry ekranu. Kliknij Analizuj.

Następnie wybierz opcję Ustaw miary, aby otworzyć okno dialogowe pomiaru za pomocą pól wyboru obszaru i pozycji stosu u góry ekranu. Kliknij Analizuj, a następnie wybierz Analizuj cząstki. Spowoduje to wygenerowanie listy zidentyfikowanych cząstek, w tym ich wielkości i obrazu, na którym zostały zidentyfikowane.

Powtórz ten proces dla każdego eksperymentu i każdego warunku doświadczalnego, aby określić zależną od wapnia zdolność adhezyjną danio pręgowanego i kadheryny. Komórki HEC 2 9 3 transfekowano domeną NCAT, herryną OD, połączono dwie fc, a następnie komórki agregacji kulek zależnych od wapnia zobrazowano i przeanalizowano zgodnie z opisem w tym filmie, jak widać na tych obrazach. Przy braku wapnia kulki wykazują niewielką lub żadną tendencję do agregacji, a w obecności wapnia nie następuje wzrost wielkości agregatu z czasem.

Jednak bity pokryte NCAT w tym miejscu i ECFC wykazują solidną agregację, a wielkość agregatu rośnie z czasem jako półilościowa miara przyczepności. Obrazy światła przechodzącego z trzech eksperymentów zostały przeanalizowane w celu określenia średniej wielkości agregatów. Jak widać na tym wykresie, agregację kulek powlekanych ECFC ncoer w obecności wapnia i przy braku wapnia określono w odstępach 15-minutowych.

W ciągu godziny dane te ujawniają, że domena ekto danio pręgowanego n kadheryny pośredniczy w zależnej od wapnia adhezji homofilnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak sprawdzić, czy adhezja jest wewnętrzną właściwością biochemiczną interesującego Cię białka.