Name: Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj szybką metodę testów agregacji kulek do badania adhezji białek z domenami ektodomenowymi. Technika wykorzystuje komórki HEC 293 i magnetyczne kuleczki do oceny zdolności homofilicznej adhezji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta nagrodą NSF/ARRA (IOS 0920357) oraz nagrodą od NIH (5R21MH098463).

1. Przygotowanie komórek (Dzień -2 do 0)
<ol>
	<li>Podziel komórki HEK293 1:5 przy użyciu 0,05% roztworu trypsyny-EDTA i inkubuj w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C z 5% CO2 aż do 60 - 80% zlewu (2 - 3 dni). Dla każdego warunku hoduj komórki w szalkach 2 x 100 mm.</li>
</ol>
2. Transfekcja komórek (Dzień 1)
<ol>
	<li>Transfekcja komórek HEK293 z plazmidem kodującym fuzję Fc przy użyciu odczynnika do transfekcji, takiego jak Lipofectamina. Można również stosować metody alternatywne, które prowadzą do porównywalnej skuteczności transfekcji.</li>
	<li>Z powrotem transfekowane komórki należy umieścić w inkubatorze na 24 godziny.</li>
</ol>
3. Propagacja komórek (Dzień 2)
<ol>
	<li>Podgrzej pożywkę wzrostową bez płodowej surowicy bydlęcej (-FBS) do 37 °C.</li>
	<li>Opłucz naczynia 2x 10 ml pożywki wzrostowej -FBS i włóż naczynia do inkubatora o temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Opłucz naczynia z kulturami jeszcze raz za pomocą 10 ml Growth Media -FBS, w sumie 3 mycia.</li>
	<li>Inkubować transfekowane komórki HEK293 w temperaturze 37 °C przez kolejne 48 godzin bez FBS przed pobraniem pożywki.</li>
</ol>
4. Agregacja koralików (Dzień 4)
<ol>
	<li>Aby zebrać pożywkę z szalek hodowlanych, przenieś pożywkę z każdej pary szalek do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wiruj z prędkością 500 x g przez 5 minut, aby osadzać resztki komórkowe.</li>
	<li>Przefiltrować media z probówki stożkowej o pojemności 50 ml do filtra odśrodkowego za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml i filtra strzykawkowego 0,45 μm.</li>
	<li>Filtry odśrodkowe należy obracać przy 4 000 x g i temperaturze 4 °C, aż objętość skoncentrowanej pożywki hodowlanej osiągnie około 500 μl (około 15 min). Powtarzaj, aż wszystkie podłoża hodowlane zostaną dodane i zagęszczone.</li>
	<li>Dodać 1,5 μl kulek magnetycznych białka G do 1 ml lodowatego buforu wiążącego w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki, umieścić na magnesie i usunąć bufor. Natychmiast dodaj skoncentrowaną pożywkę hodowlaną do kulek magnetycznych białka G.</li>
	<li>Obracaj probówki w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Umieść probówki na magnesie i wyjmij media. Szybko umyj koraliki dwukrotnie lodowatym 1 ml buforu wiążącego, a następnie ponownie zawieś kulki w 300 μl buforu wiążącego.</li>
	<li>Podziel zawieszone kulki na 2 probówki, 150 μl do każdej probówki, a następnie dodaj 1,5 μl 200 mM CaCl2 lub 200 mM EDTA odpowiednio dla warunków "wapń" i "brak wapnia".</li>
	<li>Przenieść 100 μl z każdego warunku do szkiełka studzienkowego wgłębienia i zebrać mikrofotografie za pomocą mikroskopu światła przechodzącego (ryc. 2). Zbierz obrazy z 5 pól widzenia dla każdego eksperymentu w każdym żądanym punkcie czasowym.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Korzystając z oprogramowania ImageJ lub porównywalnego oprogramowania do analizy obrazów, otwórz jeden z pięciu zestawów danych obrazów za pomocą opcji Importuj/Sekwencja obrazów... z menu rozwijanego Plik. Zostaną one otwarte jako stos obrazów.</li>
	<li>W oknie dialogowym Obraz/Właściwości... zmień jednostki obrazu na piksele i ustaw Szerokość pikseli i Wysokość pikseli na 1,0.</li>
	<li>Przekonwertuj obrazy na binarne za pomocą polecenia Dostosuj/Próg... w menu rozwijanym Obraz. Ustaw próg tak, aby uwzględniał piksele, które przyczyniają się do tworzenia ściegów lub agregacji ściegów, ale nie uwzględniają tła i małych cząstek. Zastosuj do wszystkich obrazów w stosie.</li>
	<li>W oknie dialogowym Ustawianie miar zaznacz pola Obszar i Położenie stosu</li>.
	<li>Uruchom polecenie Analizuj cząstki... w menu rozwijanym Analizuj. Spowoduje to wygenerowanie listy zidentyfikowanych cząstek, w tym ich rozmiaru (obszaru) i obrazu, na którym zostały zidentyfikowane.</li>
	<li>Powtórz ten proces dla którego eksperymentu i warunku eksperymentalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Adhezja komórek jest istotną cechą życia wielokomórkowego i jest pośredniczona przez szeroki wachlarz białek powierzchniowych komórek. Spośród nich szczegółowe właściwości adhezyjne są znane tylko dla stosunkowo niewielkiej części. Tutaj opisaliśmy prosty, szybki protokół badania homofilnej zdolności adhezyjnej wydzielanych ektodomen połączonych z wygodnym znacznikiem epitopu. Takie podejście ma szereg ważnych zalet. Po pierwsze, stabilne linie komórkowe nie są wymagane14,20, ponieważ wystarczające ilości biał...

Adhezja komórka-komórka jest niezbędna dla rozwoju i integralności organizmów wielokomórkowych i jest pośredniczona przez różnorodny układ cząsteczek na powierzchni komórki. Wiele z tych cząsteczek adhezyjnych zostało zidentyfikowanych i scharakteryzowanych, choć wiele z nich pozostaje do odkrycia. Do badania właściwości cząsteczek adhezyjnych komórek (CAM) stosuje się kilka metod, w tym testy sortowania komórek, testy agregacji komórek1-8 oraz metody biofizyczne, takie jak mikroskopia sił atomowych i spektroskopia sił powierzchniowych9-12.
Złożoność nawet uproszczonych systemów in vitro wykorzystujących linie komórkowe utrudnia określenie właściwości adhezyjnych domniemanego CAM. Zazwyczaj cząsteczka jest uważana za CAM, jeśli indukuje agregację komórek po transfekcji do nieadhezyjnej linii komórkowej. Oczywiste jest jednak, że nie jest to bezpośredni dowód na aktywność adhezyjną. Na przykład, ułatwienie dostarczania na powierzchnię komórki lub stabilności CAM również skutkowałoby zwiększoną agregacją komórek1,13. Co więcej, prawdziwy CAM może nie pośredniczyć w agregacji komórek, jeśli linia komórkowa nie ma innych kofaktorów wymaganych do dostarczania lub stabilizacji powierzchni komórki.
Aby uniknąć tych komplikujących czynników, można zastosować bardziej bezpośrednie testy, które opierają się na idei, że interakcje adhezyjne powinny być wewnętrzną właściwością biochemiczną domeny zewnątrzkomórkowej. Podczas gdy kulki były początkowo używane do charakteryzowania Ng-CAM2, testy te zostały rozszerzone w celu zbadania adhezji za pośrednictwem kadheryny12,14,15. Wykorzystując fuzję fuzji ektodomeny C-kadheryny-Fc, laboratorium Gumbiner wykazało, że wielokrotne powtórzenia kadheryny przyczyniają się do interakcji homofilnych14. Korzystając z porównywalnych testów agregacji kulek, scharakteryzowano również adhezję E-kadheryny i N-kadheryny12,15, podobnie jak szereg protokadheryn1,15-18 i izoform Dscam z Drosophila19. Tutaj opisujemy stosunkowo prosty i szybki test do scharakteryzowania aktywności adhezyjnej wydzielanych, znakowanych epitopami ektodomen domniemanych homofilnych CAM (Figura 1). Użyliśmy tego testu przede wszystkim do scharakteryzowania członków nadrodziny kadheryny.

<table><tbody><tr><td>pFc-N1 plazmid</td><td>Addgene</td><td>Do złożenia</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 komórki</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10,000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &ndash; Białko G</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka depresyjne</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 z membraną Ultracel-10</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0,45 mm filtr strzykawkowy</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ) Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela/roztworów</td></tr><tr><td>Pożywka wzrostowa</td><td>DMEM + 10% FBS + filtr Pen-Strep</td><td>sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td><td></td></tr><tr><td>Podłoża wzrostowe &ndash; FBS</td><td>DMEM + Pen-Strep</td><td>Filter sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td><td></td></tr><tr><td>Bufor wiążący</td><td>50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,2% BSA</td><td>Vortex aż do rozpuszczenia, przechowywać na lodzie.</td><td></td></tr></tbody></table>

testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Adhezja komórka-komórka jest fundamentalna dla życia wielokomórkowego i jest pośredniczona przez różnorodny wachlarz białek na powierzchni komórki. Jednak interakcje adhezyjne dla wielu z tych białek są słabo poznane. W tym miejscu przedstawiamy prostą, szybką metodę charakteryzowania właściwości adhezyjnych domniemanych homofilnych cząsteczek adhezyjnych komórek. Hodowane komórki HEK293 są transfekowane plazmidem DNA kodującym wydzielaną, znakowaną epitopem ektodomenę białka powierzchniowego komórki. Za pomocą funkcjonalizowanych kulek specyficznych dla znacznika epitopu, rozpuszczalne, wydzielane białko fuzyjne jest wychwytywane z pożywki hodowlanej. Powlekane kulki mogą być następnie używane bezpośrednio w testach agregacji kulek lub w testach sortowania kulek fluorescencyjnych w celu zbadania adhezji homofilowej. W razie potrzeby mutageneza może być następnie wykorzystana do wyjaśnienia określonych aminokwasów lub domen wymaganych do adhezji. Test ten wymaga tylko niewielkich ilości wyrażonego białka, nie wymaga produkcji stabilnych linii komórkowych i można go wykonać w ciągu 4 dni.

Przykład eksperymentu przedstawiono na Rysunku 2, który ukazuje zależną od wapnia agregację kulek wywołaną przez ektodomenę N-kadheryny połączoną z Fc (NcadEC-Fc). Wobec braku wapnia kulki wykazują niewielką lub żadną tendencję do agregacji, a rozmiar agregatów nie zwiększa się wraz z upływem czasu (Rysunek 1A,C). W obecności wapnia kulki pokryte NcadEC-Fc wykazują silną agregację, przy czym rozmiar agregatów zwiększa się w czasie (Rysunek 1B,C). Eksperyment ten powtórzo...

Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek. Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach. Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Ogólnym celem tej procedury jest przetestowanie zdolności domen ekto białek do pośredniczenia w adhezji homofilnej w celu osiągnięcia tego plazmidu kodującego fuzję fragmentu domeny ekto z regionem FC ludzkiej IgG są transfekowane do komórek HEC 2 93. Wydzielane białka fuzyjne Odin FC są wychwytywane na kulkach magnetycznych sprzężonych z białkiem G, a po przemyciu powlekane kulki mogą oddziaływać w roztworze. Powlekane kulki są następnie obrazowane w celu oceny zakresu agregacji, a na koniec określane ilościowo Za pomocą prostej analizy obrazu, uzyskane dane ujawniają, czy białko jest zdolne do pośredniczenia w adhezji homofilowej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy agregacji komórek, jest to, że jest szybka, prosta i bezpośrednio testuje aktywność adhezyjną wybranego białka. Technikę tę zademonstruje dr Michelle Eman, starszy naukowiec z laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania hodowanych komórek do NCA tutaj ECFC, dwa do trzech dni przed transfekcją.Użyj 0,05% tripów w EDTA, aby odłączyć komórki HEC 2 93 od naczyń hodowlanych. Przygotuj dwie 100-milimetrowe naczynia na każdy warunek. Podziel komórki od jednego do pięciu, a następnie hoduj je.Uzupełnione podłoże wzrostowe. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż osiągną 60 do 80% zlewania się. W dniu transfekcji należy użyć odczynnika, takiego jak lipo, w celu wprowadzenia fuzji FC kodującego plazmid.Po transfekcji należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na 24 godziny następnego dnia po transfekcji Prewarm, DMEM z paciorkowcem pent i bez płodowej surowicy bydlęcej do 37 stopni Celsjusza. Opłucz każde naczynie dwa razy 10 mililitrami podgrzanej pożywki, a następnie włóż naczynia z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę po inkubacji, przepłucz naczynia hodowlane jeszcze raz 10 mililitrami DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej, w sumie trzy płukania, a następnie inkubuj transektowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 48 godzin przed pobraniem pożywki. Cztery dni po transfekcji użyj pipety serologicznej, aby zebrać pożywkę z każdej pary szalek hodowlanych i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Następnie odwiruj pożywkę z prędkością 500 g na pięć minut, aby po wirowaniu osadzać resztki komórkowe, wlej pożywkę z każdej 50-mililitrowej stożkowej probówki do 30-mililitrowej strzykawki i przefiltruj ją przez strzykawkę o średnicy 0,45 mikrona. Przefiltrować do koncentratora odśrodkowego. Obracać filtry odśrodkowe, aż objętość skoncentrowanej pożywki hodowlanej zmniejszy się do około 500 mikrolitrów.Trwa to około 15 minut. Powtarzaj ten proces, aż cała pożywka hodowlana zostanie dodana i skoncentrowana. Następnie w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra dla każdej próbki po 1,5 mikrolitra białka G kulki magnetyczne na jeden mililitr lodowatego buforu wiążącego.Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest agregacja ściegów. Aby zapewnić sukces, pamiętaj o dokładnym przestrzeganiu procedury. Obserwuj koraliki szybko, ale nie zbyt surowo.Nigdy nie należy dopuścić do wyschnięcia z boku rurki lub zbyt długiego pozostawania na magnesie. Umieść probówkę na magnesie i za pomocą pipety odessaj bufor. Następnie natychmiast dodaj skoncentrowaną pożywkę hodowlaną do kulek magnetycznych białka G.Obracaj rurki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Umieść rurki na magnesie i szybko usuń podłoże. Umyj koraliki dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego bufora wiążącego, a następnie ponownie zawieś kulki w 300 mikrolitrach buforu wiążącego.Podziel zawieszone kulki na dwie probówki po 150 mikrolitrów w każdej tubie. Następnie dodaj 1,5 mikrolitra chlorku wapnia lub EDTA, aby uzyskać odpowiednio warunki wapnia i braku wapnia. Przenieś 100 mikrolitrów z każdego stanu do depresji.Dobrze prześlizgnąć się za pomocą mikroskopu światła przechodzącego. Zbierz obrazy z pięciu pól widzenia dla każdego eksperymentu w każdym żądanym punkcie czasowym. Korzystanie z obrazu J lub porównywalnego oprogramowania do analizy obrazu.Otwórz jeden z pięciu zestawów danych obrazu na obrazie J w menu rozwijanym. U góry ekranu wybierz plik. Następnie wybierz import, a następnie sekwencję obrazów.Znajdź folder zawierający pliki obrazów, a następnie otwórz je jako stos obrazów. Następnie na pasku menu rozwijanego kliknij obraz, a następnie wybierz właściwości. Aby otworzyć tam okno właściwości.Zmień jednostki obrazu na piksele i ustaw szerokość i wysokość pikseli na 1,0. Kliknij ponownie obraz, wybierz dostosuj, a następnie próg, aby otworzyć okno progu i użyj suwaka, aby dostosować próg obrazu. Uwzględnij piksele, które przyczyniają się do tworzenia ściegów i wykluczają oraz małe cząsteczki.Zastosuj próg do wszystkich obrazów w stosie obrazów. Następnie na pasku menu rozwijanego u góry ekranu. Kliknij Analizuj.Następnie wybierz opcję Ustaw miary, aby otworzyć okno dialogowe pomiaru za pomocą pól wyboru obszaru i pozycji stosu u góry ekranu. Kliknij Analizuj, a następnie wybierz Analizuj cząstki. Spowoduje to wygenerowanie listy zidentyfikowanych cząstek, w tym ich wielkości i obrazu, na którym zostały zidentyfikowane.Powtórz ten proces dla każdego eksperymentu i każdego warunku doświadczalnego, aby określić zależną od wapnia zdolność adhezyjną danio pręgowanego i kadheryny. Komórki HEC 2 9 3 transfekowano domeną NCAT, herryną OD, połączono dwie fc, a następnie komórki agregacji kulek zależnych od wapnia zobrazowano i przeanalizowano zgodnie z opisem w tym filmie, jak widać na tych obrazach. Przy braku wapnia kulki wykazują niewielką lub żadną tendencję do agregacji, a w obecności wapnia nie następuje wzrost wielkości agregatu z czasem.Jednak bity pokryte NCAT w tym miejscu i ECFC wykazują solidną agregację, a wielkość agregatu rośnie z czasem jako półilościowa miara przyczepności. Obrazy światła przechodzącego z trzech eksperymentów zostały przeanalizowane w celu określenia średniej wielkości agregatów. Jak widać na tym wykresie, agregację kulek powlekanych ECFC ncoer w obecności wapnia i przy braku wapnia określono w odstępach 15-minutowych.W ciągu godziny dane te ujawniają, że domena ekto danio pręgowanego n kadheryny pośredniczy w zależnej od wapnia adhezji homofilnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak sprawdzić, czy adhezja jest wewnętrzną właściwością biochemiczną interesującego Cię białka.

bead-aggregation-assays-for-characterization-putative-cell-adhesion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru interakcji międzykomórkowych między cząsteczkami adhezyjnymi komórek synaptycznych za pomocą testu agregacji komórek HEK. W tym teście równa liczba komórek HEK wyrażających pożądaną cząsteczkę adhezyjną komórek presynaptycznych i białko fluorescencyjne jest mieszana z komórkami HEK wyrażającymi postsynaptyczną cząsteczkę adhezyjną komórek i inne białko fluorescencyjne. Interakcja między cząsteczkami adhezyjnymi komórek zmusza komórki do agregacji, co...

Test agregacji komórek w celu wykrycia interakcji trans między cząsteczkami adhezyjnymi komórek

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Zrosty powierzchniowe komórek są kluczowe w mechanotransdukcji, ponieważ przenoszą napięcie mechaniczne i inicjują szlaki sygnałowe zaangażowane w homeostazę i rozwój tkanek. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparowania szlaków biochemicznych, które są aktywowane w odpowiedzi na napięcie, przy użyciu mikrokulek magnetycznych pokrytych ligandem i przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych.

Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Poznaj szybką metodę testów agregacji kulek do badania adhezji białek z domenami ektodomenowymi. Technika wykorzystuje komórki HEC 293 i magnetyczne kuleczki do oceny zdolności homofilicznej adhezji białek.

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Przeglądaj więcej filmów