Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek
October 17th, 2014
Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek. Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach. Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.
Ogólnym celem tej procedury jest przetestowanie zdolności domen ekto białek do pośredniczenia w adhezji homofilnej w celu osiągnięcia tego plazmidu kodującego fuzję fragmentu domeny ekto z regionem FC ludzkiej IgG są transfekowane do komórek HEC 2 93. Wydzielane białka fuzyjne Odin FC są wychwytywane na kulkach magnetycznych sprzężonych z białkiem G, a po przemyciu powlekane kulki mogą oddziaływać w roztworze. Powlekane kulki są następnie obrazowane w celu oceny zakresu agregacji, a na koniec określane ilościowo Za pomocą prostej analizy obrazu, uzyskane dane ujawniają, czy białko jest zdolne do pośredniczenia w adhezji homofilowej.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy agregacji komórek, jest to, że jest szybka, prosta i bezpośrednio testuje aktywność adhezyjną wybranego białka. Technikę tę zademonstruje dr Michelle Eman, starszy naukowiec z laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania hodowanych komórek do NCA tutaj ECFC, dwa do trzech dni przed transfekcją.
Użyj 0,05% tripów w EDTA, aby odłączyć komórki HEC 2 93 od naczyń hodowlanych. Przygotuj dwie 100-milimetrowe naczynia na każdy warunek. Podziel komórki od jednego do pięciu, a następnie hoduj je.
Uzupełnione podłoże wzrostowe. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla, aż osiągną 60 do 80% zlewania się. W dniu transfekcji należy użyć odczynnika, takiego jak lipo, w celu wprowadzenia fuzji FC kodującego plazmid.
Po transfekcji należy umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na 24 godziny następnego dnia po transfekcji Prewarm, DMEM z paciorkowcem pent i bez płodowej surowicy bydlęcej do 37 stopni Celsjusza. Opłucz każde naczynie dwa razy 10 mililitrami podgrzanej pożywki, a następnie włóż naczynia z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę po inkubacji, przepłucz naczynia hodowlane jeszcze raz 10 mililitrami DMEM bez płodowej surowicy bydlęcej, w sumie trzy płukania, a następnie inkubuj transektowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 48 godzin przed pobraniem pożywki. Cztery dni po transfekcji użyj pipety serologicznej, aby zebrać pożywkę z każdej pary szalek hodowlanych i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.
Następnie odwiruj pożywkę z prędkością 500 g na pięć minut, aby po wirowaniu osadzać resztki komórkowe, wlej pożywkę z każdej 50-mililitrowej stożkowej probówki do 30-mililitrowej strzykawki i przefiltruj ją przez strzykawkę o średnicy 0,45 mikrona. Przefiltrować do koncentratora odśrodkowego. Obracać filtry odśrodkowe, aż objętość skoncentrowanej pożywki hodowlanej zmniejszy się do około 500 mikrolitrów.
Trwa to około 15 minut. Powtarzaj ten proces, aż cała pożywka hodowlana zostanie dodana i skoncentrowana. Następnie w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra dla każdej próbki po 1,5 mikrolitra białka G kulki magnetyczne na jeden mililitr lodowatego buforu wiążącego.
Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest agregacja ściegów. Aby zapewnić sukces, pamiętaj o dokładnym przestrzeganiu procedury. Obserwuj koraliki szybko, ale nie zbyt surowo.
Nigdy nie należy dopuścić do wyschnięcia z boku rurki lub zbyt długiego pozostawania na magnesie. Umieść probówkę na magnesie i za pomocą pipety odessaj bufor. Następnie natychmiast dodaj skoncentrowaną pożywkę hodowlaną do kulek magnetycznych białka G.
Obracaj rurki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Umieść rurki na magnesie i szybko usuń podłoże. Umyj koraliki dwukrotnie jednym mililitrem lodowatego bufora wiążącego, a następnie ponownie zawieś kulki w 300 mikrolitrach buforu wiążącego.
Podziel zawieszone kulki na dwie probówki po 150 mikrolitrów w każdej tubie. Następnie dodaj 1,5 mikrolitra chlorku wapnia lub EDTA, aby uzyskać odpowiednio warunki wapnia i braku wapnia. Przenieś 100 mikrolitrów z każdego stanu do depresji.
Dobrze prześlizgnąć się za pomocą mikroskopu światła przechodzącego. Zbierz obrazy z pięciu pól widzenia dla każdego eksperymentu w każdym żądanym punkcie czasowym. Korzystanie z obrazu J lub porównywalnego oprogramowania do analizy obrazu.
Otwórz jeden z pięciu zestawów danych obrazu na obrazie J w menu rozwijanym. U góry ekranu wybierz plik. Następnie wybierz import, a następnie sekwencję obrazów.
Znajdź folder zawierający pliki obrazów, a następnie otwórz je jako stos obrazów. Następnie na pasku menu rozwijanego kliknij obraz, a następnie wybierz właściwości. Aby otworzyć tam okno właściwości.
Zmień jednostki obrazu na piksele i ustaw szerokość i wysokość pikseli na 1,0. Kliknij ponownie obraz, wybierz dostosuj, a następnie próg, aby otworzyć okno progu i użyj suwaka, aby dostosować próg obrazu. Uwzględnij piksele, które przyczyniają się do tworzenia ściegów i wykluczają oraz małe cząsteczki.
Zastosuj próg do wszystkich obrazów w stosie obrazów. Następnie na pasku menu rozwijanego u góry ekranu. Kliknij Analizuj.
Następnie wybierz opcję Ustaw miary, aby otworzyć okno dialogowe pomiaru za pomocą pól wyboru obszaru i pozycji stosu u góry ekranu. Kliknij Analizuj, a następnie wybierz Analizuj cząstki. Spowoduje to wygenerowanie listy zidentyfikowanych cząstek, w tym ich wielkości i obrazu, na którym zostały zidentyfikowane.
Powtórz ten proces dla każdego eksperymentu i każdego warunku doświadczalnego, aby określić zależną od wapnia zdolność adhezyjną danio pręgowanego i kadheryny. Komórki HEC 2 9 3 transfekowano domeną NCAT, herryną OD, połączono dwie fc, a następnie komórki agregacji kulek zależnych od wapnia zobrazowano i przeanalizowano zgodnie z opisem w tym filmie, jak widać na tych obrazach. Przy braku wapnia kulki wykazują niewielką lub żadną tendencję do agregacji, a w obecności wapnia nie następuje wzrost wielkości agregatu z czasem.
Jednak bity pokryte NCAT w tym miejscu i ECFC wykazują solidną agregację, a wielkość agregatu rośnie z czasem jako półilościowa miara przyczepności. Obrazy światła przechodzącego z trzech eksperymentów zostały przeanalizowane w celu określenia średniej wielkości agregatów. Jak widać na tym wykresie, agregację kulek powlekanych ECFC ncoer w obecności wapnia i przy braku wapnia określono w odstępach 15-minutowych.
W ciągu godziny dane te ujawniają, że domena ekto danio pręgowanego n kadheryny pośredniczy w zależnej od wapnia adhezji homofilnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak sprawdzić, czy adhezja jest wewnętrzną właściwością biochemiczną interesującego Cię białka.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szybki sposób charakteryzacji właściwości adhezji cząsteczki adhezji komórkowej za pomocą fragmentów ektodomen. Technika polega na przechwytywaniu wydzielanych, oznakowanej epitopem ektodomen na funkcjonalnych kulkach do badań agregacji kulek.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Adhezja komórek
- Interakcje białek
- Asezy biochemiczne
Tło
- Rozumienie adhezji komórek jest kluczowe dla różnych procesów biologicznych.
- Tradycyjne metody mogą być czasochłonne i skomplikowane.
- Ta metoda ma na celu uproszczenie oceny adhezji białek.
- Adhezja homofiliczna jest kluczowym punktem badania.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej i prostej metody testowania adhezji ektodomen białek.
- Ocena aktywności adhezji określonych białek.
- Ulepszenie istniejących asezy agregacji komórek.
Zastosowane metody
- Transfekcja plazmidów kodujących fragmenty ektodomen do komórek HEC 2 93.
- Przechwytywanie wydzielanych białek fuzyjnych FC na magnetycznych kulach sprzężonych z białkiem G.
- Interakcja pokrytych kulek w roztworze, poprzedzona obrazowaniem.
- Ilościowa ocena agregacji kulek za pomocą analizy obrazu.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na bezpośrednie testowanie zdolności adhezji białek.
- Wyniki wskazują, czy białko może pośredniczyć w adhezji homofilicznej.
- Zostało wykazane, że jest szybsza i prostsza niż tradycyjne metody.
- Dostarcza niezawodnego podejścia do badania cząsteczek adhezji komórkowej.
Wnioski
- Ta technika oferuje uproszczone podejście do oceny adhezji białek.
- Ma potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach badań biologicznych.
- Przyszłe badania mogą budować na tej metodzie, aby zbadać inne właściwości adhezji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid characterization of cell adhesion molecules is critical for de-risking early discovery targets and clarifying mechanistic hypotheses in cell biology-driven therapeutic programs. The bead aggregation assay enables direct, quantitative assessment of homophilic adhesion properties, supporting predictive confidence in target selection and functional validation. This streamlined workflow reduces ambiguity in protein function, accelerating portfolio triage and prioritization at the discovery inflection point.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein-mediated cell adhesion mechanisms for target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing intrinsic adhesive properties of candidate molecules.
- Facilitates rapid functional assessment to inform go/no-go decisions in early-stage programs.
- Provides a platform for mutagenesis studies to map critical adhesion domains.
Screening & Assay Development
- Delivers a reproducible, quantitative assay for evaluating adhesive activity of protein ectodomains.
- Standardizes measurement of bead aggregation, supporting assay transferability and scalability.
- Enables preparation of validated bead-based systems for downstream compound screening or mechanistic studies.
- Reduces reliance on stable cell lines, increasing throughput and flexibility.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms where cell adhesion is implicated in pathology.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic de-risking.
- Provides semi-quantitative outputs that can inform translational biomarker strategies when relevant.
Pipeline & Workflow Integration
This bead aggregation assay fits within the early discovery to lead identification continuum, providing a bridge between molecular characterization and functional screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for cell adhesion function and pathway mapping.
- Screening: Offers quantitative, reproducible readouts for comparing protein variants or conditions.
- Analytics: Generates image-based measurements of aggregate size and kinetics for robust statistical analysis.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to disease models where adhesion is a key driver.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular assay platform adaptable to diverse protein targets and mutational analyses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target function and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines workflows with rapid, scalable, and standardized assay procedures.
- Strategic Value: Enables earlier, data-driven go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of adhesion-related targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, cell culture, and quantitative image analysis.
- Needs access to protein G magnetic beads, imaging systems, and analysis software such as ImageJ.
- Demands strict adherence to protocol for reproducibility and cross-team standardization.
- Can be adapted to different protein targets and mutational studies with minimal optimization.
- Limited by the need for soluble ectodomain expression and bead compatibility with target proteins.
