Name: Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Poznaj metodę ukierunkowania genów w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych przy użyciu nukleaz palca cynkowego. Technika ta umożliwia precyzyjną modyfikację locus PITX3 kluczowego dla rozwoju ośrodkowego układu nerwowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca opisana w tym protokole była możliwa dzięki finansowaniu przez rząd wiktoriański w ramach współpracy z Kalifornijskim Instytutem Medycyny Regeneracyjnej (CIRM).

Wszystkie procedury są przeprowadzane w sterylnym kapturze z przepływem laminarnym. Wszystkie media i roztwory są równoważone do temperatury 37 °C, chyba że określono inaczej.
1. Rozszerzenie ludzkich PSC (hESC i hiPSC, WA-09 używane w tym Protokole) do transfekcji
Uwaga: Nie jest konieczne rozszerzanie hESC na Matrigel lub Geltrex. hESC rozprężone na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) mogą być używane do elektroporacji lub nukleofekcji po etapie usuwania MEF (patrz sekcja 2.8).
<ol>
	<li>Przygotować 1 x 100 mm naczynie i 1 x 75 cm2 kolbę DR4 MEF o wymiarach 2,0 x 104 komórki nacm2 w pożywce MEF (patrz Tabela 1) na naczyniach wstępnie pokrytych 0,1% w/v żelatyny. 
	Uwaga: Można stosować MEF-y CF1, BLK6 lub MF1, jednak zaleca się stosowanie linii MEF opornych na antybiotyki, np. DR410.</li>
	<li>Następnego dnia należy przenieść hESC na 100-milimetrową szalkę wstępnie posiałkową MEF przygotowanymi w sekcji 1.1. W tym celu należy odessać pożywkę hESC z naczyń hodowlanych, umyć hESC zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) wolnym od Ca2+/Mg2+, dodać dypazę (patrz tabela 2 dla odpowiednich objętości) i umieścić w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37°C/5% CO2. Po 3-5 minutowej inkubacji odessać Dispase i delikatnie przemyć 1-2 razy HBSS w celu usunięcia MEF. Dodać pożywkę z hESC (patrz Tabela 3) i za pomocą skrobaka do komórek lub pipety o pojemności 5 ml delikatnie zeskrobać kolonie z powierzchni szalki hodowlanej.</li>
	<li>Zebrać fragmenty kolonii w zawiesinie z naczynia hodowlanego do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wypłukać naczynie hodowlane pożywką hESC i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Uważaj, aby nie rozbijać grudek na pojedyncze komórki lub małe fragmenty.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 160 x g w celu osadzenia fragmentów kolonii.</li>
	<li>Aspirowany supernatant. Postukaj palcem w dno probówki o pojemności 15 ml, aby poluzować osad z fragmentu kolonii. Delikatnie zawiesić fragmenty kolonii w pożywce hESC zgodnie ze stosunkiem podziału (zwykle odpowiedni jest stosunek podziału między 1:4 a 1:8). Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie przekształcić grudek w pojedyncze komórki lub małe fragmenty, ponieważ wpłynie to na wydajność ponownego powlekania.</li>
	<li>Przed ponownym posiewem fragmentów hESC na MEF-ach przemyć 1x HBSS. Powoli dodawać odpowiednią ilość (patrz Tabela 2) zawiesiny komórek zawierającej fragmenty hESC w pożywkach hESC do szalek wstępnie posianych MEF.</li>
	<li>Umieść szalki hodowlane na półce w inkubatorze i poruszaj się powoli w przód iw tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić fragmenty kolonii.</li>
	<li>Pożywki z ludzkimi komórkami macierzystymi należy wymieniać codziennie.</li>
	<li>Aby przygotować kondycjonowane podłoża z MEF (MEF-CM), umyj kolbę o długości 75cm2 wstępnie pokrytą MEF, 1 x HBSS. Dodaj pożywkę hESC. Po upływie 24 godzin zebrać kondycjonowane podłoże i zastąpić je świeżymi pożywkami hESC. Powtarzaj codziennie przez maksymalnie 12 dni. Przechowywać MEF-CM w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkich komórek macierzystych do transfekcji
<ol>
	<li>Codziennie obserwuj wzrost hESC pod mikroskopem. Gdy kolonie zlewają się w 40-50%, ułóż płytki 3 x 100 mm z 2,0 x 105 MEF na cm2.</li>
	<li>Kiedy kolonie zlewają się w 60 - 70%, są gotowe do transfekcji. "Oczyszczaj" kolonie, usuwając zróżnicowane kolonie lub rdzenie kolonii. 
	Uwaga: Ponieważ uważamy, że wyższa wydajność transfekcji i celowania występuje, gdy komórki są w fazie logarytmicznej, sugeruje się, aby elektroporację przeprowadzono, zanim hESC osiągną konfluencję ≥ 70%.</li>
	<li>Umyj kolonie hESC HBSS i dodaj Accutase. 
	Uwaga: Nie jest konieczne wstępne traktowanie hESC inhibitorem ROCK Y-27632, ponieważ wystarczające zahamowanie nastąpi podczas inkubacji z Y-27632 na etapie 2.7</li>
	<li>Inkubować przez 10 - 20 minut w temperaturze 37°C/5% CO2 do momentu, aż kolonie staną się pojedynczymi komórkami, jak oglądane pod mikroskopem. Roztrzeć komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Dodać pożywkę hESC i przefiltrować do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą sitka komórkowego 40 μm, aby usunąć grudki komórek.</li>
	<li>Wirować przy 160 x g przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w świeżej pożywce hESC i powtórzyć czynność w celu usunięcia pozostałości roztworu Accutazy.</li>
	<li>Zawiesić komórki w pożywce hESC zawierającej 10 μM Y-27632 i przenieść całkowitą zawiesinę komórek na 100-milimetrową szalkę wstępnie pokrytą żelatyną.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>W tym czasie MEF-y będą przylegać do naczynia pokrytego żelatyną. Zebrać nieprzylegające hESC za pomocą pipety o pojemności 1 ml do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i określić gęstość komórek za pomocą hemocytometru.</li>
</ol>
3. Elektroporacja hESC
<ol>
	<li>Przefiltrować pożywkę CM-MEF za pomocą filtra 0,22 μm i dodać 10 ng/ml rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (rhFGF2).</li>
	<li>Przenieść 7,5 x 106 hESC z sekcji 2.9 do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 160 x g przez 5 minut.</li>
	<li>W tym czasie ustaw elektroporator: Wybierz program do elektroporacji wykładniczej i ustaw następujące parametry: Napięcie: 250 V, Pojemność: 500 μF i Rezystancja: ∞-.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 0,8 ml lodowatego HBSS z filtrem 0,22 μm. Przenieść roztwór do sterylnej kuwety do elektroporacji o średnicy 0,4 cm.</li>
	<li>Dodać konstrukt do kierowania do przodu TV-hPITX3 (30 μg DNA) i delikatnie wymieszać pipetą o pojemności 200 μl. Inkubować na lodzie przez 5 minut. W tym czasie usunąć jedną porcję mRNA PITX3 ZFN i rozmrozić na lodzie. Po rozmrożeniu przenieś 7,5 μl mRNA ZFN do mieszaniny DNA/komórki w kuwecie do elektroporacji. Delikatnie wymieszać pipetą o pojemności 200 μl. 
	Uwaga: Miejsce, na które kierowany jest cel, jest głównym czynnikiem wpływającym na skuteczność kierowania. Loci kodujące ciche geny, geny nieulegające ekspresji w ESC, takie jak PITX3, są trudne do namierzenia przy użyciu konwencjonalnej rekombinacji homologicznej6. W związku z tym protokół ten wykorzystuje specjalnie zaprojektowane ZFN dla ludzkiego locus PITX3 w celu wywołania pęknięcia podwójnej nici DNA.</li>
	<li>Wykonaj elektroporację, postępując zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie elektroportora.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 200 μl przenieść zawartość z kuwety do elektroporacji do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki z hESC. Przemyć kuwetę dwukrotnie 200 μl pożywki z hESC za każdym razem i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Pojawią się "śluzowate" szczątki składające się z DNA i białka z lizowanych komórek, które negatywnie wpłyną na przeżycie komórek. Wirować przy 160 x g przez 5 minut, aby usunąć te zanieczyszczenia.</li>
	<li>Odessać supernatant i delikatnie postukać w osad komórkowy, aby się poluzował. Ponownie zawiesić w 30 ml uzupełnionego MEF-CM zawierającego 10 μM Y-27632 i ponownie pokryć na szalkach 3 x 100 mm wstępnie pokrytych MEF.</li>
	<li>Zmieniaj nośniki codziennie. W dniu 2 Y-27632 można wycofać, a komórki hodować tylko w pożywkach hESC.</li>
	<li>Po 2-3 dniach hESC powinny być zlewane w 50-70%. W tym momencie należy rozpocząć selekcję antybiotyków (np. 0,5 μg/ml puromycyny).</li>
	<li>Utrzymuj selekcję, dodając codziennie świeże pożywki hESC/puromycyny. Po ~7 dniach powinny być widoczne małe kolonie. Jeśli nie stosuje się MEF opornych na antybiotyki, MEF-y można uzupełnić, dodając dodatkowe 1,0 x 104 komórki na cm2.</li>
</ol>
4. Wybieranie transgenicznych klonów hESC
<ol>
	<li>Około 14 - 21 dni po selekcji (gdy kolonie osiągną średnicę ~1 mm) przygotuj płytki do ekspansji i przesiewania. Rozpocząć od rozmrożenia porcji Matrigelu lub Geltrex w temperaturze 4°C przez co najmniej 5 godzin. Rozcieńczyć zgodnie z instrukcjami producenta i dodać 75 μl do każdego dołka z 3 x 96-dołkowych płytek. Przygotować 3 płytki 48-dołkowe, posiewając MEF-y w proporcji 2,0 x 104 komórki nacm2. Inkubować obie płytki O/N w temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
	<li>Następnego dnia rozciąć kolonie na 16-25 kawałków za pomocą igły 21 G na końcu pipety o pojemności 2 ml, przecinając siatkę.</li>
	<li>Odessać Matrigel z płytek 96-dołkowych i zastąpić je uzupełnionymi pożywkami CM-MEF. Umyć MEF-y w płytkach 48-dołkowych 1 x za pomocą HBSS i dodać pożywkę hESC.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 200 μl delikatnie przenieś 1/3 wypreparowanej kolonii na 48-dołkową płytkę w celu rozprężenia. Przenieść pozostałe 2/3 wypreparowanej kolonii na odpowiednią 96-dołkową płytkę zawierającą uzupełnione pożywki CM-MEF.</li>
	<li>Utrzymuj obie płytki, zmieniając pożywkę codziennie (uzupełniona pożywka CM-MEF dla 96-dołkowych płytek pokrytych matrycą i pożywka hESC dla płytek 48-dołkowych zawierających MEF; obie uzupełnione 0,5 μg/ml puromycyny).</li>
	<li>Rozszerzać się, aż 96-dołkowe płytki będą w 100% zlewne, a następnie wstępnie przesiewać za pomocą PCR.</li>
</ol>
5. Badania przesiewowe i ekspansja pozytywnych klonów
<ol>
	<li>Aby przygotować genomowe DNA (metoda oparta na 11), usuń wszystkie podłoża z płytek przez odwrócenie, a następnie osusz na ręcznikach papierowych.</li>
	<li>Przepłukać każdą studzienkę dwukrotnie za pomocą RT PBS (100 μl/studzienkę przy każdym przemyciu), odwrócić i osuszyć jak w kroku 5.1. Umieść płytki w temperaturze -80 °C na 1-2 godziny, aby wspomóc lizę komórek (płytki można przechowywać w ten sposób w nieskończoność).</li>
	<li>Gdy komórki są w temperaturze -80 °C, należy wykonać bufor do lizy sarkozylu (patrz Tabela 4) (50 μl/dołek). Aby zlizować komórki, należy podgrzać płytki przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie pipetować bufor do lizy do każdej studzienki. Uszczelnić krawędzie każdej płytki taśmą, umieścić w zamykanym pojemniku zawierającym wilgotne ręczniki papierowe w celu wytworzenia wilgoci i inkubować O/N w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Po inkubacji dodać 150 μl 5M NaCl do 10 ml absolutnego etanolu o temperaturze -20 °C, dobrze wymieszać i dodać 100 μl do każdego dołka (Uwaga: etanol zmętnieje po dodaniu NaCl). Delikatnie postukaj w płytki, aby wymieszać (nie pipetować) i pozostaw na minimum 30 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie roztwór stanie się klarowny, a DNA wytrąci się.</li>
	<li>Usunąć roztwór, jak w kroku 5.1, a następnie dodać 150 μl 70% etanolu do każdej studzienki. Delikatnie odwróć płytkę i osusz jak poprzednio. Powtórz ten krok jeszcze 2x. 
	Uwaga: Ponieważ wytrącone DNA naturalnie przylega do plastiku kultury tkankowej, nie ulega przemieszczeniu podczas tych etapów mycia.)</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu na krótko odwirować płytki z maksymalną prędkością, aby skoncentrować DNA na dnie każdej studzienki, a następnie wysuszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej (lub 37 °C) przez co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Dodać 40 - 50 μl T0,1E (pH 8,0) (patrz Tabela 5) lub TE (pH 8,0) do każdego dołka i umieścić płytki w temperaturze 65 °C na 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C O/N przed użyciem do PCR. Ponownie zawieś DNA, delikatnie stukając w boki płytki. Użyj 1-2 μl ponownie zawieszonego DNA/10 μl reakcji PCR.</li>
	<li>Korzystając z systemu Expand Long Template PCR z maszynami do starterów GFP R z ramieniem hPITX3 L gen. F i ramieniem GFP R hPITX3 L, wykonaj wstępne przesiewanie klonów przy wyżarzaniu w temperaturze 58 °C, wydłużenie 45 sekund, 35 cykli.</li>
	<li>Próbki elektroforezowe za pomocą Hyperladder 1kb w 1% żelu agarozowym zawierającym GelRed przy 100 V przez 45 minut i wykrywają dodatnie klony za pomocą oświetlenia UV.</li>
	<li>Walidacja klonów z dodatnim wynikiem PCR poprzez trawienie genomowego DNA z rozszerzonych klonów (patrz poniżej) za pomocą HindIII i sond hybrydyzujących 5' i 3' ramion homologii wektora do Southern blot (jak opisano wcześniej w 1). Sondy są generowane metodą PCR przy użyciu par starterów hPITX3 5' sondy F i R oraz sondy hPITX3 3' F i R, trawionych za pomocą EcoRI i ligowanych do ogólnego wektora klonowania.</li>
	<li>W zależności od liczby dodatnich klonów należy przygotować 2 dołki z 6-dołkowej płytki poprzez wstępne posiew z MEF (2,0 x 104 komórki na cm2).</li>
	<li>Następnego dnia należy wstępnie potraktować dodatnie klony w 48-dołkowej płytce 10 μM Y-27632 przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Umyj dodatnie klony HBSS i dodaj 300 μl Akutazy.</li>
	<li>Gdy kolonie zostaną przekształcone w pojedyncze komórki, dodaj 1 ml pożywki hESC i zbierz do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Zmieniaj nośniki codziennie. W 2 dniu Y-27632 można wycofać, a komórki hodować w pożywkach hESC.</li>
	<li>Gdy kolonie są w 70 - 80% zlewne, subkulturuj i zamrażaj pozostałą część fragmentów kolonii.</li>
</ol>

<ol><li>Nefzger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lmx1a+Allows+Context-Specific+Isolation+of+Progenitors+of+GABAergic+or+Dopaminergic+Neurons+During+Neural+Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).</li>
<li>Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+periods+of+neural+induction+and+propagation+of+embryonic+stem+cell-derived+neural+progenitors+with+EGF+and+FGF2+enhances+Lmx1a+expression+and+neurogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential.</a> Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).</li>
<li>Collin, J., Lako, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+putting+a+finger+on+stem+cell+biology%3A+zinc+finger+nuclease-driven+targeted+genetic+editing+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).</li>
<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+prospects%3A+zinc-finger+nucleases+as+gene+therapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents.</a> Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+expressed+and+silent+genes+in+human+ESCs+and+iESCs+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases.</a> Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).</li>
<li>Lombardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+editing+in+human+stem+cells+using+zinc+finger+nucleases+and+integrase-defective+lentiviral+vector+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery.</a> Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).</li>
<li>Boch, J., Bonas, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthomonas+AvrBs3+family-type+III+effectors%3A+discovery+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function.</a> Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).</li>
<li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+human+embryonic+cells+using+TALE+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases.</a> Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li>
<li>Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+mouse+strain+expressing+four+drug-selectable+marker+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes.</a> Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).</li>
<li>Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+microextraction%3A+a+method+to+screen+numerous+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples.</a> Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).</li>
<li>Kawasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+midbrain+dopaminergic+neurons+from+ES+cells+by+stromal+cell-derived+inducing+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity.</a> Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).</li>
<li>Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+is+an+inducing+factor+in+generating+floor+plate+progenitor+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).</li>
<li>Smidt, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homeodomain+gene+Ptx3+has+highly+restricted+brain+expression+in+mesencephalic+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Generowanie reporterowych linii komórkowych oferuje potężny sposób śledzenia, wizualizacji i izolowania komórek będących przedmiotem zainteresowania z heterogenicznej populacji pochodzącej z hESC. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej okazało się wyjątkowo nieefektywne dla ludzkichESC3. W tym protokole opisujemy stosunkowo prostą technikę wprowadzania RP do eksonu pierwszego z PITX3 locus, w hESC wykorzystujących powszechnie dostępny wektor celowania wraz z ZFN. ...

Obecne protokoły różnicowania embrionalnych komórek macierzystych (ESC) skutkują niejednorodnymi populacjami komórek, szczególnie w odniesieniu do wyprowadzania określonych fenotypów neuronalnych. Tak więc, mimo że kultury zawierają pożądany fenotyp komórkowy, często obecne są inne typy komórek neuronalnych, nieneuronalnych i niezróżnicowanych.1. Te cechy ograniczają zastosowanie źródeł komórek pochodzących z ESC do stosowania w terapii zastępczej i in vitro modelowanie chorób.
Genetyczne linie komórkowe reporterowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek, pod warunkiem, że ekspresja białka reporterowego (RP) odtwarza ekspresję endogenną. Użycie promotorów bezpośrednio przed regionem kodującym gen może być wykorzystane do uzyskania prymitywnych reporterów genetycznych, ale takie konstrukty nie mają precyzyjnych elementów regulacyjnych, które kontrolują endogenną ekspresję genów. W przeciwieństwie do tego, Rekombinacja homologiczna daje możliwość zapewnienia ekspresji RP o wysokiej wierności. W przeszłości wektory celujące przeznaczone do rekombinacji homologicznej w określonych loci zainteresowania były wykorzystywane do celowania w RP w mysich EKS (mESC) przy użyciu elektroporacji jako sposobu dostarczania DNA1,2. Jednak wytwarzanie reporterowych linii komórkowych poprzez konwencjonalną rekombinację homologiczną jest wyjątkowo nieefektywne dla ludzkich ESC (hESC), a zatem został udokumentowany tylko w kilku przypadkach (omówionych w3). Stosując zmodyfikowane białko chimeryczne zawierające fuzję nukleazy FokI ze specyficznymi dla miejsca motywami palca cynkowego, znanymi zbiorczo jako nukleazy palca cynkowego (ZFN), można wprowadzić pęknięcia dwuniciowe DNA w wcześniej określonych loci genomu. Po dodaniu wektora DNA z homologią po obu stronach pęknięcia podwójnej nici DNA, miejsce genomu można naprawić przez rekombinację homologiczną, umożliwiając włączenie sekwencji dawcy DNA. Technika ta okazała się przydatna do edycji genomu zarówno w ludzkich komórkach pierwotnych4,5, jak i w hESC6,7. Nowsze prace wykorzystały nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji (TALEN), czynniki transkrypcyjne wykorzystywane przez patogeny roślinne8, aby pomóc w projektowaniu nukleaz specyficznych dla miejsca9.
W poniższym protokole demonstrujemy generowanie linii komórek reporterowych hESC poprzez elektroporację EGFP zawierającego homologiczny wektor celowania6 wraz z ZFN dla locus ludzkiego homeoboksu przysadki 3 (PITX3). Po selekcji antybiotyków przez 2-3 tygodnie, hESC z prawidłowo zintegrowanym DNA mogą być ręcznie pobrane, namnażone i wstępnie przebadane za pomocą PCR, a następnie zwalidowane za pomocą Southern blot.

<table><tbody><tr><td>Mysie fibroblasty embrionalne (DR4)</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6004G</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1683</td><td></td></tr><tr><td>Filtr siatkowy do komórek - 40 &mu; m</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>33 mm - 0,22 &mu; m filtr</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>rhFGF2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025/CF</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>BioRad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta elektroporacyjna 0,4 cm</td><td>BioRad</td><td>165-2088</td><td></td></tr><tr><td>Human TV-hPITX3-forward targeting construct</td><td>Addgene</td><td>31942</td><td></td></tr><tr><td>ZFN Kit; Ludzki PITX3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CKOZFN1050-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Life Technologies</td><td>A1569601</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td> <td>firmy</td> <td>Dulbecco10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie z USA (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana mieszanka pożywki Eagle firmy Dulbecco F-12 (DMEM/F12)</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Wymiana surowicy nokautującej (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne&nbsp; Panie przewodniczący, panie i panowie!</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-merkaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli sodowej N-lauroilosarkozyny (sarkozyl) (30%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61747</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e9884?lang=en&amp; region=US">E9884</a></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Chlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór proteinazy K (20 mg/ml)</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-37084</td><td></td></tr><tr><td>Rozwiń system PCR z długą matrycą</td><td>Roche Australia</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td>hPITX3 L arm gen. F (starter): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3'</td><td>GeneWorks, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ramię hPITX3 L GFP R (starter): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3'</td><td>GeneWorks, Australia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperLadder 1 kb&nbsp;</td><td>Bioline Australia</td><td>BIO-33025</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Jomar Bioscience, Australia</td><td>41003</td><td></td></tr></tbody></table>

ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

Jednym z głównych ograniczeń obecnych protokołów różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) jest generowanie heterogenicznych populacji komórek. Kultury te zawierają interesujące nas komórki, ale są również zanieczyszczone niezróżnicowanymi ESC, pochodnymi nieneuronalnymi i innymi podtypami neuronalnymi. To ogranicza ich zastosowanie w zastosowaniach in vitro i in vivo, takich jak in vitro modelowanie w celu odkrywania leków lub terapii zastępczej komórek. Aby temu zaradzić, można zmodyfikować linie komórek reporterowych, które oferują środki do wizualizacji, śledzenia i izolowania komórek będących przedmiotem zainteresowania. Jednak osiągnięcie tego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej jest wyjątkowo nieefektywne. Protokół ten opisuje celowanie w homeobox 3 przysadki mózgowej (PITX3) locus w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych przy użyciu specjalnie zaprojektowanych nukleaz palca cynkowego, które wprowadzają specyficzne dla miejsca dwuniciowe pęknięcia DNA, wraz z wektorem dawcy DNA specyficznym dla PITX3-EGFP. Po wygenerowaniu linii komórek reporterowych PITX3 można je następnie różnicować za pomocą opublikowanych protokołów do wykorzystania w badaniach, takich jak modelowanie choroby Parkinsona in vitro lub terapia zastępowania komórek.

Po współelektroporacji specjalnie zaprojektowanej pary palców cynkowych dla PITX3 wraz z wektorem donorowym DNA specyficznym dla PITX3-EGFP oraz następującej selekcji puromycyną, dodatnie klony hESC zostały początkowo wykryte za pomocą przesiewowego PCR genomicznego (Rycina 1). Hybrydyzacja Southern blot tych klonów dodatnich w PCR z sondami specyficznymi dla końców 5’ i 3’ potwierdziła prawidłowe ukierunkowanie na egzon 1 locus PITX3 (Rycyna 2) z wyda...

Reporterowe linie komórkowe oferują sposób na wizualizację, śledzenie i izolowanie interesujących komórek z heterogenicznych populacji. Jednak celowanie w geny za pomocą konwencjonalnej rekombinacji homologicznej w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych jest wyjątkowo nieefektywne. W tym miejscu opisujemy celowanie w locus czynnika transkrypcyjnego PITX3 specyficznego dla OUN za pomocą EGFP przy użyciu rekombinacji homologicznej wzmocnionej nukleazą palca cynkowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Ogólnym celem tego protokołu jest skuteczne ukierunkowanie transgenów na miejsca zainteresowania w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych przy użyciu specjalnie zaprojektowanych nukleaz palca cynkowego. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (HSC) są namnażane w celu wytworzenia wystarczającej ilości materiału do elektroporacji, a następnie trawione w celu uzyskania pojedynczych komórek. Następnie mRNA kodujące dwie nukleazy z palca cynkowego o niestandardowej konstrukcji są koelektrolizowane do HSC za pomocą zlinearyzowanej sekwencji dawcy EGFP, a następnie komórki są posiewane na świeżych mysich fibroblastach embrionalnych, fibroblastach lub MEF.Elektroporowane nukleazy palców cynkowych wprowadzają podwójną nić do pierwszego eksonu dołu X trzy locus w komórkach. Następnie sekwencja dawcy EFGP, która jest otoczona ramionami docelowymi o homologii do sekwencji miejsca hamulca podwójnej nici DNA, jest włączana podczas podziału komórki po 14 do 21 dniach. Jedna trzecia pojedynczej kolonii HESC jest przenoszona do każdej studzienki 96-dołkowej płytki pokrytej matrylem, a pozostałe dwie trzecie są przenoszone do odpowiedniego dołka 48-dołkowej płytki zawierającej świeże ME Fs.

zinc-finger-nuclease-enhanced-gene-targeting-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomimo niedawnych postępów w modyfikacjach genetycznych, transfekcja ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESCs) pozostaje procesem nieprzewidywalnym. Według naszej wiedzy, w literaturze nie opisano systematycznych i wydajnych metod transfekcji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs). W niniejszej pracy opisujemy niezawodne protokoły wydajnej transfekcji i nukleofekcji ludzkich iPSCs.

Transfekcja i nukleofekcja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Usługa CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) umożliwia precyzyjną edycję genomu w dowolnym organizmie lub linii komórkowej w dowolnym locus zdefiniowanym przez użytkownika. Niniejszy artykuł opisuje proces projektowania, produkcji, walidacji i wdrażania usługi CompoZr Custom ZFN.

Edycja genomu przy użyciu niestandardowych nukleaz z palcami cynkowymi (ZFN) CompoZr

Ten film demonstruje technikę edycji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hPSC) za pomocą nukleazy palca cynkowego. Ponieważ hPSC mogą być potencjalnie różnicowane w różne typy komórek, technologia ta jest pomocna w badaniach patologicznych i farmakologicznych in vitro w sposób specyficzny dla pacjenta.

Edycja genomu oparta na nukleazie palca cynkowego: technika modyfikacji genomu w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą dwuniciowego mechanizmu naprawy zależnego od homologii

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Tutaj przedstawiamy szybką i efektywną metodę edycji genów opartą na RMCE w locus AAVS1 ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), która ulepsza poprzednio opisane systemy. Korzystając z tej techniki, linie izogeniczne mogą być szybko i niezawodnie generowane dla prawidłowych badań porównawczych, ułatwiając badania za pośrednictwem transgenezy za pomocą hPSCs.

Szybkie i wydajne wytwarzanie rekombinowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinazy w locus AAVS1

Białka często zawierają wiele domen, które mogą pełnić różne funkcje komórkowe. Nokauty genów (KO) nie uwzględniają tej różnorodności funkcjonalnej. W tym miejscu przedstawiamy podejście oparte na wymianie kasetowej za pośrednictwem rekombinacji (RMCE) oparte na strukturze i funkcji w embrionalnych komórkach macierzystych KO, które pozwala na molekularną sekcję różnych domen funkcjonalnych lub wariantów białka.

Badania strukturyczno-funkcjonalne w embrionalnych komórkach macierzystych myszy z wykorzystaniem wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju genetycznie modyfikowanych modeli myszy przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych, szczególnie dla dużych DNA knock-in (KI). Protokół ten jest dostrojony przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9, co skutkuje znacznie lepszą wydajnością KI w porównaniu z konwencjonalną metodą celowania w linearyzowane DNA za pośrednictwem rekombinacji homologicznej.

Wysoce skuteczne celowanie genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w embrionalnych komórkach macierzystych w celu opracowania modeli myszy zmanipulowanych genami

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Poznaj metodę ukierunkowania genów w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych przy użyciu nukleaz palca cynkowego. Technika ta umożliwia precyzyjną modyfikację locus PITX3 kluczowego dla rozwoju ośrodkowego układu nerwowego.

Ukierunkowanie genów na nukleazę palca cynkowego w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Przeglądaj więcej filmów