Name: Izolacja RNA z trzustki myszy: tkanka bogata w rybonukleazę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Naucz się izolować RNA o wysokiej integralności z trzustki myszy bogatej w rybonukleazy. Ta metoda zapewnia RNA o liczbie integralności powyżej siedmiu, nadające się do analizy ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jianhua Ling, Raymondowi MacDonaldowi, Galvinowi Swiftowi, Michelle Griffin, Paulowi Grippo i Satyanarayanie Rachagani za ich pomocne komentarze, sugestie i podzielenie się swoimi protokołami. Prace te zostały wsparte U01CA111294 grantowymi oraz nagrodą Idea Development Award przyznawaną przez Ohio State University Intramural Research Program.

1. Przygotowanie
Poniższe praktyki są zgodne z zasadami ustalonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC).
<ol>
	<li>Zaleca się izolowanie nie więcej niż 6 trzustek myszy w ciągu jednego dnia. Wszystkie narzędzia chirurgiczne należy oczyścić i zautoklawować, po jednym zestawie na zwierzę.</li>
	<li>Oznacz wszystkie probówki do mikrowirówek. Cztery probówki po 2 ml na zwierzę.</li>
	<li>Umieścić 8 ml odczynnika do lizy w 50 ml probówkach wirówkowych na lodzie. Uwaga: Podczas gdy zestaw do oczyszczania jest dostarczany z odczynnikiem fenolowym tiocyjanianu guanidyny, który nadaje się do izolacji trzustki, odczynnik do lizy jest używany ze względu na duże objętości, które są niezbędne na izolację.</li>
	<li>Dozować około 10 ml następujących roztworów do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml w celu oczyszczenia ostrzy homogenizatora. Etanol, 70% (2 probówki), woda klasy HPLC (1 probówka) i woda klasy HPLC zawierająca około 200 μl RNase Away lub równoważnej inaktywatora rybonukleazy.</li>
</ol>
2. Chirurgia, rozwarstwienie trzustki i homogenizacja
<ol>
	<li>Umieść 1-2 ml izofrubranu w słoiku zawierającym bawełnianą gazę lub ręczniki papierowe. Myszy umieszcza się na platformie, która uniemożliwia im dotarcie do źródła izofluranu. Dodaj świeży izofluran do słoika przed znieczuleniem każdej myszy.</li>
	<li>Delikatnie umieść mysz w słoiku zawierającym izofluran. Zakręć słoik i monitoruj efekty znieczulenia, delikatnie obracając słoik do przodu iz powrotem. Zwierzę jest znieczulane, gdy jest w stanie ustać o własnych siłach.</li>
	<li>Aby potwierdzić znieczulenie, wyjmij zwierzę ze słoika i mocno uszczypnij palec u nogi. Jeśli mysz nie reaguje na uszczypnięcie palca, przejdź do kroku 2.5.</li>
	<li>Jeśli mysz zareaguje na uszczypnięcie palca, powtórz kroki od 2.2 do 2.3.</li>
	<li>Umieść znieczulone zwierzę na blacie stołu w pozycji leżącej. Zwichnij szyjkę macicy myszy, mocno kładąc lewą rękę na szyjce macicy myszy. Prawą ręką chwyć ogon myszy i szybko pociągnij w górę pod kątem około 45°, aby zwichnąć szyjkę macicy.</li>
	<li>Przymocuj tuszę do powierzchni (płaskiego kawałka styropianu pokrytego ręcznikami papierowymi), wbijając każdą z czterech łap zwierzęcia w płaską powierzchnię za pomocą igieł podskórnych o rozmiarze 25.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych rozetnij środkową część myszy i szybko usuń trzustkę z myszy. Użyj kleszczy, aby przytrzymać trzustkę i odetnij ją od śledziony i jelita cienkiego za pomocą nożyczek sprężynowych. Uważaj, aby nie rozciągać trzustki podczas wyjmowania z myszy. Przerwanie tkanki może spowodować uwolnienie rybonukleazy. Uwaga: Czas potrzebny na usunięcie trzustki z myszy ma kluczowe znaczenie. Wprawna osoba powinna być w stanie wypreparować trzustkę w około 1 minutę lub krócej.</li>
	<li>Umieść całą trzustkę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 8 ml lodowatego odczynnika do lizy. Zakryj probówkę i krótko wstrząśnij, aby zanurzyć tkankę w odczynniku i niezwłocznie przejdź do następnego kroku. Stosunek odczynnika do lizy do tkanki ma kluczowe znaczenie. Patrz sekcja Wyniki, aby zapoznać się z porównaniem integralności RNA wyizolowanego przy użyciu różnych objętości odczynnika do lizy.</li>
	<li>Homogenizować przez 5 sek. Ważne jest, aby docisnąć łopatki homogenizatora do dna probówki wirówkowej, aby umożliwić wciągnięcie tkanki do ostrzy w celu wydajnej homogenizacji.</li>
</ol>
3. Usuwanie niestrawionej tkanki
Uwaga: Po homogenizacji, małe kawałki tkanki pozostaną w odczynniku do lizy. Ważniejsza jest szybka liza tkanki, pozostawiając część tkanki niestrawioną, niż nadmierna homogenizacja i ryzyko degradacji RNA.
<ol>
	<li>Przenieść 2 ml odczynnika do lizy zawierającego trzustkę poddaną lizie do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Zebrać dwie probówki mikrowirówkowe z homogenatem na izolację. Pozostały homogenat należy wyrzucić lub przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłych badań.</li>
	<li>Odwirować w temperaturze 4 °C, 12 000 × g przez 5 minut w celu granulowania niestrawionej tkanki. Jest to krytyczny krok, ponieważ przeniesienie niestrawionej tkanki do kolejnych roztworów RNA prawdopodobnie zanieczyści próbkę rybonukleazą (krok 5.13).</li>
	<li>Przenieść 1 ml supernatantu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml. Natychmiast należy przystąpić do izolacji i przechowywać probówkę z kontrpróbą w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości. Umieść wszystkie probówki zawierające homogenat na mokrym lodzie, przechodząc do następnego kroku.</li>
	<li>Pozostały odczynnik do lizy należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne.</li>
</ol>
4. Czyszczenie ostrzy homogenizatora
<ol>
	<li>Przed przystąpieniem do kolejnej izolacji należy oczyścić łopatki homogenizatora, umieszczając je w 10 ml 70% etanolu. Aktywuj homogenizator na około 20 sekund, aby usunąć wszelkie kawałki tkanki, które mogą zostać uwięzione w ostrzach.</li>
	<li>Użyj końcówki do pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć wszelkie kawałki, które pozostały w łopatkach homogenizatora.</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.1 w wodzie, ogólnej inaktywatorze Rnazy i 70% etanolu. Osusz wałek homogenizatora czystą chusteczką Kim.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.1 dla izolacji trzustki pozostałych zwierząt, pozostawiając RNA wyizolowane od każdego zwierzęcia oddzielnie, zamiast łączyć RNA.</li>
</ol>
5. Izolacja RNA
Poniższa sekcja jest identyczna z protokołem zestawu do oczyszczania. Zaletą zestawu do oczyszczania jest to, że izoluje całkowity RNA, w tym małe RNA.
<ol>
	<li>W przypadku użycia zamrożonego roztworu homogenatu rozmrozić na mokrym lodzie i odstawić w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
	<li>Dodać 200 μl chloroformu, zakryć probówkę i energicznie wstrząsać ręcznie przez 15 sekund. Pozostaw rurkę w pozycji RT na 2-3 minuty.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g, 4 °C.</li>
	<li>Przenieś górną warstwę wodną do probówki do mikrowirówki. Dodać 1,5 objętości izopropanolu i dokładnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Przenieść do 700 μl próbki do kolumny wirowej, którą umieszcza się w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Zamknąć pokrywę i odwirować przy 8 000 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.5-5.6, używając pozostałej części próbki.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu RWT do kolumny wirowej. Wirować przez 15 sekund przy 8 000 x g. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Odpipetować 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej. Wirować przez 15 sekund przy 8 000 x g w celu umycia kolumny. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu RPE do kolumny wirowej. Wirować przez 2 minuty przy 8 000 x g w celu wysuszenia kolumny.</li>
	<li>Przenieść kolumnę wirową do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odmierzyć pipetę 80 μl wody wolnej od rybonukleazy bezpośrednio na membranę kolumny wirowej. Wirować przez 1 minutę przy 8 000 x g w celu elucji RNA.</li>
	<li>Dodać 1 μl inhibitora Rnazy do roztworu RNA. Przechowywać w temperaturze -80 °C lub kontynuować do 5.13.</li>
	<li>Aby zweryfikować integralność RNA, najpierw oblicz stężenie RNA i stosunek 260/280 za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Rozcieńczyć część roztworu RNA do około 500 ng/μl wodą klasy biologii molekularnej.</li>
	<li>Określ integralność RNA (tj. RIN) za pomocą analizy elektroforezy kapilarnej. Do analizy wystarczy około 5 μl roztworu RNA.</li>
	<li>Podwielokrotnić roztwór RNA (patrz rysunek 2) i przechowywać w temperaturze -80 °C. </li>
</ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wyizolowanie RNA z tkanek bogatych w rybonukleazę stanowi wielkie wyzwanie dla eksperymentów biologii molekularnej. W handlu dostępne są różne odczynniki i zestawy, które są oparte głównie na metodzie ekstrakcji RNA fenolu i guanidyny. Tiocyjanian guanidyny denaturuje białko, a tym samym zmniejsza aktywność rybonukleazy. Jednak sama wielkość rybonukleazy w trzustce wymaga dodatkowych modyfikacji standardowych protokołów izolacji RNA. Opisano tutaj protokół, który opiera się na standardowej metodzie tiocyjanianu guanidyny...

Izolacja RNA o wysokiej integralności jest wymagana do rutynowych eksperymentów biologii molekularnej, takich jak northern blotting 9, qRT-PCR 1 lub profilowanie ekspresji genów 5. Większość współczesnych metod izolacji RNA opiera się na modyfikacjach protokołów tiocyjanianu guanidyny 2, 3. Tiocyjanian guanidyny jest silnym denaturantem białka i skutecznie zakłóca aktywność rybonukleazy w większości warunków. Popularna metoda Chomczyńskiego i Sacchiego 3 polegała na połączeniu fenolu z roztworem lizy tiocyjanianu guanidyny, skracając czas izolacji do około 4 godzin. Wiele dostępnych na rynku odczynników do ekstrakcji RNA opiera się na metodzie Chomczyńskiego i Sacchiego 3.
Tkanki bogate w rybonukleazę, takie jak ludzka lub mysza trzustka, stanowią dodatkowe wyzwanie dla wyizolowania RNA. Trzustka myszy może zawierać do 75 mg rybonukleazy 6, z których część zostanie uwolniona podczas przerwania tkanki trzustkowej, co spowoduje autolizę tkanek. Modyfikacje protokołów tiocyjanianu guanidyny zostały z powodzeniem wykorzystane do wyizolowania RNA z trzustki o wysokiej integralności 2, 4, 7, 10. Wlew odczynnika stabilizującego RNA do trzustki myszy ułatwił izolację RNA o wysokiej integralności 4, 7, 10, jednak wlew roztworów do trzustki wymaga dużych umiejętności, może wymagać specjalistycznych narzędzi, takich jak mikroskop preparacyjny, a zaburzenie architektury tkanki podczas zabiegu może spowodować lizę komórek. Perfuzja tkanki za pomocą odczynnika stabilizującego RNA może zakłócać inne zastosowania, w tym izolację białek i barwienie histologiczne. Co więcej, technika ta nie nadaje się do izolowania RNA z ludzkiej trzustki. Inne protokoły wymagają przygotowania określonych rozwiązań przez badacza 2.
Zgłaszamy protokół izolacji RNA z trzustki myszy o wysokiej integralności. Protokół wykorzystuje elementy wcześniej opublikowanych metod i jest w dużej mierze oparty na standardowych protokołach odczynników do lizy na bazie fenolu/tiocyjanianu guanidyny. Nie wymaga przygotowania specjalistycznych roztworów, ani nie wymaga infuzji odczynników do trzustki. Kluczowe etapy udanej izolacji RNA obejmują wysoki stosunek odczynnika do lizy na bazie fenolu/guanidyny do tkanki, usunięcie niestrawionej tkanki przed separacją faz i włączenie inhibitora rybonukleazy do otrzymanego roztworu RNA. Korzystając z tych i innych modyfikacji, zazwyczaj izolujemy RNA z RIN większym niż 7, aby użyć go do rutynowej analizy ekspresji genów.

<table><tbody><tr><td>Generacja mocy 500&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-03&nbsp;</td><td>Homogenizator</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Chłodzony mikrocentyfug</td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Odczynnik do lizy</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Student Vannas</td><td>Fisher</td><td>91500-09&nbsp;</td><td>Służy do wycinania trzustki z przyczepionych tkanek</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne, 6 cali</td><td>Fisher</td><td>08-951-20</td><td>Służy do wycinania kości myszy</td></tr><tr><td>Kleszcze z końcem</td><td>Fisher</td><td>1381239</td><td>Służy do trzymania trzustki podczas preparowania</td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td><td>Anesthetic</td></tr><tr><td>Rnase out (40 U/&micro; l)</td> <td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Inhbitor</td></tr><tr><td>Rnazy Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>Ogólny inaktywator Rnazy</td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td>Do mycia ostrzy homogenizatora</td></tr><tr><td>Woda klasy biologii molekularnej</td><td>Hyclon</td><td>SH30538.03</td><td>Elucja RNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini zestaw</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Zestaw</td></tr> <tr><td>do oczyszczaniaProbówki do mikrowirówek 2 ml, certyfikowane Rnazy Wolne od dnazy</td><td>USA Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100%</td> etanolu <td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l Końcówki do pipet</td><td>Rainin</td><td>GPL200F</td><td>Do czyszczenia ostrzy homogenizatora</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td><td>Spektrofotometr</td></tr><tr><td>Bioanalizator</td><td>Analizator elektroforezy kapilarnej</td><td>Agilent</td><td></td> do pomiaru integralności</tr><tr><td>RNA RNAlater</td><td>Odczynnik stabilizacji RNA</td> <td>Ambion</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>RNeasy&nbsp; Kolumny obrotowe&nbsp;</td><td>Kolumny przędzalnicze Qiagen</td><td></td><td>&nbsp; jako część zestawu miRNeasy Mini</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Chales River</td><td>Strain C57BL/6</td><td>Ich wiek wahał się od 4 do 12 miesięcy. &nbsp;</td></tr><tr><td>Myszy&nbsp;</td><td>Szczep Jackson Lab</td><td>129</td><td>Ich wiek wahał się od 4 do 12 miesięcy. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

izolacja rna z trzustki myszy: tkanka bogata w rybonukleazę

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

Izolacja wysokiej jakości RNA z tkanek bogatych w rybonukleazy, takich jak trzustka myszy, stanowi wyzwanie. Ponieważ podstawową funkcją trzustki jest wspomaganie trawienia, trzustka myszy może zawierać aż 75 mg rybonukleazy. Informujemy o modyfikacjach standardowych protokołów odczynnika do lizy tiocyjanianu fenolu / guanidyny w celu wyizolowania RNA z trzustki myszy. Tiocyjanian guanidyny jest silnym denaturantem białka i skutecznie zakłóca aktywność rybonukleazy w większości warunków. Jednak krytyczne modyfikacje standardowych protokołów są konieczne, aby skutecznie wyizolować RNA z tkanek bogatych w rybonukleazę. Kluczowe etapy obejmują wysoki stosunek odczynnika do lizy w tkankach, usunięcie niestrawionej tkanki przed separacją faz oraz włączenie inhibitora rybonukleazy do roztworu RNA. Korzystając z tych i innych modyfikacji, rutynowo izolujemy RNA o liczbie integralności RNA (RIN) większej niż 7. Wyizolowane RNA jest odpowiedniej jakości do rutynowej analizy ekspresji genów. Adaptacja tego protokołu do izolacji RNA z tkanek bogatych w rybonukleazę poza trzustką powinna być łatwo osiągalna.

Całkowita wydajność RNA z 1 ml homogenatu lizacyjnego wynosi 20-40 µg. Stosunki OD 260/280 zazwyczaj oscylują wokół 2,0, a wartości RIN są konsekwentnie wyższe niż 7,0. Jeśli wartość RIN wynosi ≤6, izolację należy powtórzyć. Okazyjnie uzyskuje się wartość RIN wyższą niż 8,0.
Dwie najczęściej stosowane metody uśmiercania myszy przed pobraniem trzustki to duszenie CO2 lub inhalacja izofluranem. Obie techniki są uzupełniane przez zwichnięcie stawów kręgów szyjnych. Ponieważ istnieje mo...

Opisujemy procedurę izolowania RNA o wysokiej integralności z bogatej w rybonukleazy trzustki myszy.

Izolacja RNA z trzustki myszy: tkanka bogata w rybonukleazę

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie RNA o wysokiej integralności z trzustki myszy z grzbietem rybonukleazy. Osiąga się to poprzez szybkie usunięcie trzustki z tuszy myszy poddanej eutanazji. Następnie trzustka zanurza się w odczynniku do lizy, a tkanka jest homogenizowana.Po odwirowaniu RNA izoluje się od supernatantu przy użyciu standardowych protokołów, a roztwór inhibitora RNA dodaje się do końcowego roztworu RNA. Ostatnim krokiem jest dokładne oczyszczenie łopatek homogenizatora poprzez usunięcie wszelkich kawałków tkanki uwięzionych w ostrzach, a następnie wykonanie serii płukań etanolem i wodą. Ostatecznie procedura ta pozwala na wyizolowanie RNA dla trzustki myszy o liczbie integralności RNA większej niż siedem, która ma być wykorzystana do rutynowej analizy ekspresji genów.Nazywam się Tom Schmid i pracuję z RNA od ponad 20 lat i przez cały ten czas nie doświadczyłem niczego tak trudnego, jak wyizolowanie RNA o wysokiej integralności dla trzustki myszy. Technika, którą zamierzamy wam pokazać, została opracowana dla trzustki myszy, ale tak naprawdę nie ma powodu, dla którego nie mogłaby być stosowana do wielu innych tkanek, w tym tkanek z komórek ludzkich, linii komórkowych lub innych tkanek myszy, w tym tkanek bogatych w nukleazy żeber, takich jak śledziona. Korzystanie z sugestii zawartych w tym protokole pozwoli Ci wyizolować RNA z trzustką myszy z wysoką integralnością.Można to wykorzystać w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak QPCR, macierze ekspresji genów lub sekwencja RNA. Ola Elgamal. Starszy student w moim laboratorium zademonstruje tę technikę po eutanazji myszy, jak opisano w protokole tekstowym.Zabezpiecz tuszę, wbijając każde ze zwierząt czterema łapami w płaską powierzchnię za pomocą igieł podskórnych o rozmiarze 25 przy użyciu sterylnych narzędzi chirurgicznych. Rozetnij środkową część myszy i szybko usuń trzustkę z myszy. Użyj kleszczy, aby przytrzymać trzustkę i odetnij ją od śledziony i jelita cienkiego za pomocą nożyczek sprężynowych.Uważaj, aby nie rozciągać trzustki podczas wyjmowania z myszy. Przerwanie tkanki może spowodować uwolnienie rybonukleazy. Umieść całą trzustkę w probówce o pojemności 50 centymetrów sześciennych zawierającej osiem mililitrów lodowatego odczynnika do lizy.Zakryj probówkę i krótko wstrząśnij, aby zanurzyć tkankę w odczynniku i natychmiast przejdź do następnego kroku. Następnie homogenizuj trzustkę przez pięć sekund. Ważne jest, aby docisnąć łopatki homogenizatora do dna probówki wirówkowej, aby umożliwić wciągnięcie tkanki do ostrzy w celu wydajnej homogenizacji.Aby usunąć niestrawioną tkankę, przenieś dwa mililitry odczynnika do lizy zawierającego zlizowaną trzustkę do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Zebrać dwie mikroprobówki wirówkowe z homogenatem na wirówkę izolacyjną w temperaturze czterech stopni Celsjusza, 12 000 razy G przez pięć minut, aby granulować niestrawioną tkankę. Jest to krytyczny krok, ponieważ przeniesienie niestrawionej tkanki do kolejnych roztworów RNA prawdopodobnie zanieczyści próbkę rybonukleazą.Wyczyść łopatki homogenizatora, umieszczając je w 10 mililitrach 70% etanolu. Aktywuj homogenizator na około 20 sekund, aby usunąć wszelkie kawałki tkanki, które mogą zostać uwięzione w ostrzach. Następnie użyj końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby usunąć wszelkie kawałki, które pozostały w łopatkach homogenizatora.Ponownie oczyść łopatki homogenizatora w wodzie, ogólnym aktywatorze RNA syn i 70% etanolu. Na koniec osusz trzon homogenizatora czystą chusteczką Kim. Przenieś jeden mililitr SNA do dwumililitrowej mikroprobówki wirówkowej.Umieść wszystkie probówki zawierające homogenat na mokrym lodzie, przechodząc do następnego kroku. Natychmiast przystąp do izolacji RNA i przechowuj probówkę z kontrpróbą w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Pozostały odczynnik do lizy należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady chemiczne.W poniższej sekcji użyto zestawu do oczyszczania RNA. Zaletą zestawu do oczyszczania jest to, że wyizoluje całkowite RNA, w tym małe RNA. Izolację należy rozpocząć od dodania 200 mikrolitrów chloroformu do roztworu homogenatu.Zakręć tubkę i energicznie potrząsaj ręką przez 15 sekund. Następnie pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na dwie do trzech minut po odwirowaniu przez 15 minut w temperaturze 12 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Przenieś górną warstwę wodną do mikroprobówki wirówkowej.Dodać 1,5 objętości izopropanolu i dokładnie wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Przenieś do 700 mikrolitrów próbki do kolumny wirowej, która jest umieszczona w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Zamknij pokrywę i odwiruj przy 8 000 razy G przez 15 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie wylej przepływ.Następnie dodaj 700 mikrolitrów buforu RWT do kolumny wirowej i wirówki. Tak jak poprzednio, wyrzuć przepływ przez pipetę 500 mikrolitrów buforu RPE do kolumny wirującej i ponownie odwiruj, aby umyć kolumnę. Po odrzuceniu przepływu, dodać kolejne 500 mikrolitrów buforu RPE do wirówki kolumny wirowej na dwie minuty po 8 000 razy G.To wysuszyć kolumnę, przenieść kolumnę wirującą do 1,5 mililitra mikrorurki wirówkowej pipeta 100 mikrolitrów wolnej od jądra żebrowego wody bezpośrednio na wirówkę membranową kolumny wirowej przez jedną minutę o 8, 000 razy G, aby wymyć RNA.Następnie dodaj jeden mikrolitr inhibitora RNA do roztworu RNA i przystąp do określania integralności RNA za pomocą analizy elektroforezy kapilarnej, jak opisano w protokole tekstowym, porównanie liczby integralności RNA lub RIN RNA wyizolowanego z trzustki myszy ujawnia bezpośrednią korelację między objętością odczynnika do lizy użytego w homogenizacji a integralnością RNA. Wyniki wskazują, że należy użyć ośmiu mililitrów odczynnika do lizy W tym protokole inhibitor rybonukleazy dodano do wodnego roztworu RNA i porównano integralność RNA po rozmrożeniu. RIN dla roztworu RNA z inhibitorem wynosił 7,3 plus minus 0,15 w porównaniu do 2,9 plus minus 0,65 dla roztworu, który nie zawierał inhibitora, w celu zbadania możliwości, że wielokrotne rozmrażanie przez zamrożenie spowoduje denaturację inhibitora rybonukleazy, czyniąc go nieskutecznym.Badano roztwór RNA zawierający inhibitor rybonukleazy. Roztwory RNA, które zostały zamrożone i rozmrożone do pięciu razy, nadal wytwarzały RIN równy siedmiu lub wyższy. Podczas gdy te roztwory, które zostały zamrożone i rozmrożone sześć razy lub więcej, wytworzyły RIN poniżej siedmiu losowych liczb pierwszych, CDNA zsyntetyzowano z RNA, a ekspresję trzech genów porządkowych mierzono za pomocą QPCR.Korzystając ze standardowych technik, dane potwierdzają udane zastosowanie mysiego RNA trzustki w standardowej technice biologii molekularnej. Po odpowiednim przeszkoleniu studenci i doktoranci powinni być w stanie wykonać tę technikę w około 30 minut. Opowiem wam trochę o tym, jak go używamy.Badamy transgeniczne mysie modele raka trzustki i używamy tej techniki do izolacji RNA. A potem, kiedy otrzymamy RNA, będziemy badać ekspresję genów mikro RNA u tych zwierząt.

rna-isolation-from-mouse-pancreas-a-ribonuclease-rich-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja wysepek trzustkowych myszy

Szczegółowy opis izolacji wysepek trzustkowych myszy został przedstawiony z wykorzystaniem techniki kanulacji przewodu trzustkowego in situ oraz perfuzji mieszaniną oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej.

Izolacja wysepek Langerhansa myszy z wykorzystaniem kombinacji oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Opisujemy metodę izolacji komórek endokrynnych z embrionalnej, noworodkowej i postnatalnej trzustki, a następnie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Metoda ta pozwala na analizę rozwoju linii endokrynnej trzustki, heterogeniczności komórek i dynamiki transkryptomicznej.

Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Tutaj opisujemy immunoprecypitację rybosomów i związanego z nimi RNA z wybranych populacji dorosłych męskich komórek rozrodczych myszy za pomocą systemu RiboTag. Strategiczna hodowla i staranna immunoprecypitacja skutkują czystymi, powtarzalnymi wynikami, które informują o translatomie komórek rozrodczych i dostarczają wglądu w mechanizmy zmutowanych fenotypów.

Immunoprecypitacja RiboTag w komórkach rozrodczych samca myszy

Czystość i integralność izolowanego RNA jest kluczowym krokiem w testach zależnych od RNA. Tutaj przedstawiamy praktyczną, szybką i niedrogą metodę ekstrakcji RNA z niewielkiej ilości nieuszkodzonej tkanki trzustki.

Szybka i ekonomiczna ekstrakcja RNA tkanki trzustki szczura

Ten protokół opisuje izolację komórek śródbłonka myszy z całej trzustki.

Izolacja komórek śródbłonka trzustki myszy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Naucz się izolować RNA o wysokiej integralności z trzustki myszy bogatej w rybonukleazy. Ta metoda zapewnia RNA o liczbie integralności powyżej siedmiu, nadające się do analizy ekspresji genów.

Izolacja RNA z trzustki myszy: tkanka bogata w rybonukleazę

Przeglądaj więcej filmów