Oznaczanie oddziaływań białko-ligand za pomocą różnicowej fluorymetrii skaningowej

Ogólnym celem tej procedury jest oszacowanie stałej dysocjacji dla oddziaływania liganda białkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie mieszanin białka o różnych stężeniach liganda wraz z barwnikiem wskaźnikowym. Drugim krokiem jest podgrzanie tych próbek przy jednoczesnym rejestrowaniu fluorescencji wskaźnika w celu monitorowania rozwijania się białka.

Następnie krzywe rozwijania białek są przekształcane w szereg temperatur topnienia. Ostatnim krokiem jest dopasowanie tych danych do odpowiedniego modelu w celu oszacowania stałej dysocjacji. Ostatecznie różnicowa fluorometria skaningowa jest wykorzystywana do lepszego zrozumienia interakcji białka z jego ligandami.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak izotermia, miareczkowanie, kalorymetria i powierzchniowy rezonans plazmy, jest to, że metodę tę można wykonać w ciągu kilku godzin, używając tylko umiarkowanych ilości próbki w urządzeniu, które jest już dostępne w większości instytutów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chemii białek, takie jak powinowactwo ligandów do białek i względna siła oddziaływań. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, miałyby trudności, ponieważ wybór próbek do wykorzystania i analiza danych mogą być trudne.

Przed rozpoczęciem tej procedury przygotuj następujące roztwory. Mieszanina zawierająca odczynniki wyszczególnione w niniejszej tabeli oraz zapasy liganda będącego przedmiotem zainteresowania w najwyższym dostępnym stężeniu, jak również sześć dziesięciokrotnych rozcieńczeń tego stężenia. Jeżeli przybliżona stała dysocjacji jest znana z wcześniejszych danych, należy przygotować co najmniej dwa stężenia powyżej i poniżej kd.

Przykładowa tabela znajduje się tutaj. Podaniec 18 mikrolitrów mieszaniny do każdego z ośmiu dołków. W płytce A-Q-P-C-R dodaj dwa mikrolitry rozpuszczalnika do pierwszego dołka do każdej z pozostałych siedmiu studzienek, dodaj dwa mikrolitry każdego elementu serii rozcieńczania ligandów.

Umieść uszczelkę A-Q-P-C-R na płycie, aby uzyskać dobre uszczelnienie płyty. Umieść aplikator ręczny na środku płytki, wygładź uszczelkę z jednej strony, a następnie powtórz na drugiej połowie płytki. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez dwie minuty, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Następnie umieść płytkę w aparacie QPCR kroku pierwszego. Wybierz opcję krzywej topnienia, którą filtrują skały, i wybierz dużą prędkość narastania. Przeprowadzić denaturację termiczną po zakończeniu pracy urządzenia.

Kliknij przycisk analizy na ekranie. Zapisz plik wynikowy. Otwórz oprogramowanie do przesunięcia termicznego białka.

Utwórz nowe badanie w zakładce właściwości. Nadaj mu nazwę, a w zakładce warunki wyszczególnij ligandy. Przejdź do karty plików eksperymentu i zaimportuj zapisany plik z wynikami.

Ustaw zawartość każdego z nich. Cóż, przejdź do zakładki analizy i naciśnij przycisk analizy, aby przeanalizować wyniki. Sprawdzić, czy białko w obecności samego rozpuszczalnika daje wynik podobny do pokazanego na tym rysunku.

Następnie zbadaj temperatury topnienia obserwowane w wynikach w powtórzonym bólu. Upewnij się, że pokazuje to wyraźny wzrost temperatury topnienia wraz ze wzrostem stężenia ligandów. Dane te zostaną wykorzystane do zapewnienia przybliżonej wartości stałej dysocjacji, jak opisano w załączonym artykule.

Roztwory te są wymagane do procedury określania stałej dysocjacji, mieszanki głównej A, jak wyszczególniono w tej tabeli, oraz zapasów liganda w 15 różnych stężeniach, które zostaną rozcieńczone dziesięciokrotnie. W ostatnim eksperymencie. Najlepiej uwzględnić stężenia ligandów, co najmniej dwa rzędy wielkości powyżej i poniżej szacowanego kd, i wyśrodkować stężenia na szacowanym kd.

Przykładowa seria rozcieńczeń jest pokazana tutaj. Skoncentruj się na siedmiu punktach w rzędzie wielkości szacowanej wartości KD, a kolejne cztery punkty po obu stronach. Jeśli istnieje wybór, dołącz więcej punktów do wartości, które są nasycone.

Dodaj 120 mikrolitrów mieszanki głównej do każdego z ośmiu dołków w 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U, aby działała jako zbiornik do wygodnego dozowania mieszanki głównej. Następnie za pomocą ośmiokanałowej pipety dozuj 18 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do jednej kolumny płytki PCR. Powtórz dla kolejnych pięciu kolumn, aby uzyskać w sumie 48 wypełnionych studzienek w układzie sześć na osiem na talerzu.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów łodyg liganda lub rozpuszczalnika do każdej z ośmiu studzienek. Na innej 96-dołkowej płytce z dnem U: Za pomocą ośmiokanałowej pipety odessać dwa mikrolitry ośmiu różnych ligandów lub rozpuszczalników i dodać je do jednej kolumny płytki PCR, która została wypełniona mieszanką wzorcową. Powtórz z tymi samymi ośmioma zapasami ligandów lub rozpuszczalników.

W przypadku dwóch kolejnych kolumn odessać dwa mikrolitry pozostałych ośmiu ligandów lub rozpuszczalników i dodać je do czwartej kolumny na płytce. Powtórz to dla dwóch kolejnych kolumn. W ten sposób otrzymamy trzy próbki dla wszystkich 16 próbek ligandów i rozpuszczalników.

Umieść uszczelkę A-Q-P-C-R na płycie. Odwirować płytkę w temperaturze 500 razy G przez dwie minuty. Umieścić płytkę w przyrządzie do QPCR i przeprowadzić denaturację termiczną przy użyciu parametrów określonych wcześniej na zakończenie pracy urządzenia.

Kliknij przycisk analizy na ekranie. Zapisz plik wynikowy. Otwórz oprogramowanie do przesunięcia termicznego białka.

Utwórz nowe badanie w zakładce właściwości. Nadaj mu nazwę i w zakładce warunki wyszczególnij ligandy. Przejdź do zakładki plików eksperymentu, zaimportuj zapisany plik z wynikami i ustaw zawartość każdego z nich.

Cóż, przejdź do zakładki analizy i naciśnij przycisk analizy. Wybierz kartę replik z menu po lewej stronie ekranu, aby wyświetlić wyniki. W trzech egzemplarzach.

Oceń wiarygodność danych na podstawie tego, jak ciasne są trójki. Jeśli potrójne egzemplarze wykazują słabą odtwarzalność. Przyjrzyj się dokładnie surowym danym.

Analizuj dane zarówno przy użyciu metody boltmana, jak i metody pochodnej. Aby ocenić temperaturę topnienia, wybierz zakładkę wyników replikacji i na wykresie wyników replikacji przełącz wykres według przycisku między pochodną tm, boltzmann i TM. Należy wybrać metodę, która zapewnia większą odtwarzalność próbki.

W przypadku próbek, które wykazują wiele przejść, prawie zawsze najlepiej jest użyć metody pochodnej w trybie wielokrotnego topnienia. Wyeksportuj wyniki do dalszego badania za pomocą programu Excel przy użyciu karty eksportu. Rozpocznij tę analizę od utworzenia tabeli w Excelu ze stężeniami ligandów i temperaturą topnienia.

Otwórz oprogramowanie pryzmatu GraphPad i utwórz tabelę XY. Wprowadź dane za pomocą kolumny X dla stężeń ligandów i kolumny Y dla wyników temperatury topnienia. Na karcie analizy wybierz opcję dopasowania krzywej regresji nieliniowej.

Aby wprowadzić poprawny model, wybierz Nowy i utwórz nowe równanie. Wstaw odpowiednie równanie jako jednomiejscowe wiązanie liganda. Zaznacz pole Reguły dla wartości początkowych i wprowadź reguły dla wartości początkowych.

Ogranicz parametr P jako stałą równą, aby wprowadzić końcowe stężenie białka. Wybierz opcję Analizuj, aby przeprowadzić analizę, dodatkową analizę w celu dopasowania danych do modelu kooperacyjnego lub dopasowania danych do krzywych. Binarne przesunięcia temperatury topnienia są opisane w dołączonym tekście protokołu.

Metodę tę zastosowano do pomiaru interakcji heksokinazy z glukozą. Wstępne badanie przesiewowe sugeruje prawdopodobny KD od 0,2 do 1,7 milimola. Wyniki z większego ekranu pokazują dobre dopasowanie do modelu dla pojedynczego zdarzenia wiązania z KD 1,2 plus minus 0,1 milimola, przypuszczalna transferaza HETO SQUA L WCBM wykazuje silne przesunięcie termiczne przy wiązaniu z GTP.

Wstępne badanie przesiewowe sugerowało KD od 200 do 500 mikromolowych. Szczegółowy eksperyment sugeruje pozorne KD na poziomie 120 plus minus 20 mikromolowych. Jednakże, gdy dla osi X używana jest skala logarytmiczna, występuje znaczna rozbieżność między modelem a analizą danych tych samych danych, przy czym model kooperatywny wykazuje doskonałe dopasowanie do danych, co sugeruje, że WCBM jest antykooperatywny w swoim powiązaniu z GTPA, dość nietypowy wynik obserwuje się przy przypuszczalnym PKB 60, oxy Beta D mano, Heur dwa oh, ACE WCBI.

Bez liganda i przy wysokich stężeniach ligandów obserwuje się prosty monofazowy wzór topnienia. Jednak przy pośrednich stężeniach ligandów obserwuje się dwa wyraźne piki topnienia. Przejście między tymi dwoma zestawami pików jest zależne od dawki w pełnym zakresie stężeń, modelując topnienie dwufazowe.

Jako suma proporcji ligandu, wyniki wolnego i wysokiego ligandu dają dobre dopasowanie do danych. To dopasowanie poprawia się poprzez ekstrapolację wyniku zaobserwowanego dla wysokiego stężenia ligandów do pełnego obłożenia. Dane uzyskane dla proporcji WCBI związanego z ligandem wykazują doskonałe dopasowanie do prostego modelu wiązania.

Z KD wynoszącym 58 plus minus dwa mikromole Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu czterech lub pięciu godzin, w tym powtórzenia, jeśli jest wykonywana prawidłowo Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak fluorescencja żył tiptop i kalorymetria miareczkowa izotermiczna, mogą być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zależność od temperatury i geometria STA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić oszacowanie stałej dysocjacji interakcji za pomocą różnicowego skanowania grypy.