Name: Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Poznaj nową technikę transferu genów in vivo i protokoły hodowli komórkowej in vitro do badania osteoklastogenezy. Metoda obejmuje hydrodynamiczną dostawę DNA i różnicowanie makrofagów szpiku kostnego myszy oraz PBMC człowieka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania były częściowo wspierane przez granty badawcze NIH R01 AR062173 i SHC 250862 dla IEA. ES jest laureatem stypendium przeddoktoranckiego NIH T32 CTSC.

1. Hydrodynamiczne dostarczanie sRANKL MC DNA
<ol>
	<li>Dostarczanie hydrodynamiczne przez żyłę ogona myszy
	<ol>
		<li>Zważ mysz przed wstrzyknięciem żyły ogonowej. Rozcieńczyć sRANKL lub białko zielonej fluorescencji (GFP) MC w roztworze Ringera (wstępnie ogrzanym w temperaturze 37 °C) w całkowitej objętości ~10% masy ciała myszy.</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem należy rozgrzać mysz w klatce przez 10 minut, aby rozszerzyć naczynia krwionośne i uwidocznić żyły boczne (LV). Uważnie monitoruj mysz, aby uniknąć odwodnienia i hipertermii.</li>
		<li>Gdy tylko LV są rozszerzone i widoczne, przenieś mysz do ogranicznika i włóż wtyczkę wystarczająco głęboko do lufy, aby ograniczyć ruch. Monitoruj mysz pod kątem normalnej aktywności, takiej jak oddychanie. W razie potrzeby wyreguluj wtyczkę ogranicznika.</li>
		<li>Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia w odległości 3/4 od czubka ogonka wacikiem nasączonym alkoholem. Użyj igły 27-30 G do wstrzykiwania żyły ogona myszy. Przytrzymaj mocno ogon jedną ręką i włóż igłę do żyły ogonowej. Uciskać strzykawkę i zakończyć wstrzyknięcie w ciągu 5-7 sekund.</li>
		<li>Wyjąć igłę z żyły ogonowej i przyłożyć wacik do miejsca wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie. Monitoruj mysz przez 15-30 minut, a następnie przenieś mysz z powrotem do wiwarium, gdy częstość oddechów zmniejszy się do normalnego tempa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdzenie układowej ekspresji sRANKL u myszy i oznaczanie ilościowe TRACP5b w surowicy myszy po transferze genów
	<ol>
		<li>Rozgrzej mysz w klatce przez 5-10 minut, aby rozszerzyć naczynia krwionośne i uwidocznić LV. Uważnie monitoruj mysz, aby uniknąć odwodnienia i hipertermii.</li>
		<li>Wykonaj małe nacięcie ostrzem ogona myszy w miejscu oddalonym o jeden krok od czubka ogona.</li>
		<li>Zebrać około 100 μl krwi do probówek do separacji surowicy.</li>
		<li>Inkubować probówki do separacji surowicy w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 10 000 x g przez 5 minut i zebrać surowicę. Przechowywać surowicę w temperaturze -80 °C do dalszej analizy.</li>
		<li>Wykonaj test sRANKL ELISA i test TRACP5b w surowicy myszy na próbkach surowicy przy użyciu dostępnego na rynku zestawu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Generacja osteoklastów in vitro z mysich BMM
<ol>
	<li>Izolacja i hodowla BMM
	<ol>
		<li>Izolacja kości piszczelowej i udowej: Poddaj mysz dawcy eutanazji za pomocą CO2 i zdezynfekuj nogi 70% etanolem. Wypreparuj od kości łonowej do kości piętowej, aby usunąć nienaruszone kości udowe i piszczelowe.</li>
		<li>Ostrożnie usuń skórę i mięśnie, nie uszkadzając kości. Przetworzoną kość udową i piszczelową umieścić na szalce Petriego zawierającej sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
		<li>Usunięcie szpiku kostnego: Odciąć końcówkę po jednej stronie kości udowej i piszczelowej i wypłukać szpik kostny do probówki o pojemności 50 ml za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 25 G, załadowanej α-MEM zawierającym 1% penicyliny/streptomycyny (pożywka do hodowli osteoklastów/OCM).</li>
		<li>Przetwarzanie szpiku kostnego: Wymieszaj i przenieś zawiesinę szpiku kostnego do nowej probówki o pojemności 50 ml, przepuszczając ją przez sitko do komórek nylonowych o średnicy 70 μm. Odwirować komórki przy 300 x g i ponownie zawiesić w α-MEM zawierającym 1% penicyliny/streptomycyny i 10% FBS (pożywka do hodowli osteoklastów/OCM (+)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla makrofagów
	<ol>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
		<li>Płytka 1 x 106 komórek na basenik w przypadku płytki 6-dołkowej lub 3 x 105 komórek do szkiełek nakrywkowych (5 mm) lub plastrów zębiny umieścić na płytce 96-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Odessać wszystkie podłoża zawierające nieprzylegające komórki i inkubować komórki w temperaturze 37 °C świeżym OCM (+) zawierającym 25 ng/ml mysiego M-CSF przez 48 godzin.</li>
		<li>Odessać wszystkie pożywki i inkubować komórki w temperaturze 37 °C za pomocą świeżej pożywki OCM (+) zawierającej 25 ng/ml mysiego M-CSF i 30 ng/ml mysiego sRANKL w celu zainicjowania osteoklastogenezy. W razie potrzeby uzupełniaj pożywkę co 3 dni.</li>
		<li>Hoduj komórki przez około 6-8 dni, aby utworzyć gigantyczne komórki wielojądrowe zdolne do resorpcji kości. Gdy tylko pojawią się komórki wielojądrowe, wykonaj barwienie TRAP (kwaśna fosfataza odporna na winian) za pomocą dostępnego na rynku zestawu, a gdy osiągną pełną dojrzałość, wykonaj testy funkcjonalne. Wizualizuj pierścienie F-aktyny na szkiełkach nakrywkowych za pomocą barwienia falloidyną i zobrazuj komórki przyczepione do plastrów zębiny za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), jak opisano wcześniej19.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wytwarzanie osteoklastów in vitro z ludzkich PBMC
<ol>
	<li>Izolacja ludzkich PBMC
	<ol>
		<li>Dodać 10 ml wstępnie podgrzanego Histopaque-1077 do probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Pusty filtr leukocytów uzyskany z banku krwi ze sterylnym PBS do probówki o pojemności 50 ml (stosunek 1:1 krwi z PBS). Rozcieńczoną krew należy nakładać warstwami na roztwór histopatyczny bardzo powoli, upewniając się, że krew nie miesza się z histopakiem.</li>
		<li>Odwirować próbki o masie 1000 x g przez 20 minut w temperaturze 18 °C. Po odwirowaniu ostrożnie wyizolować warstwę białego kożucha zawierającą białe krwinki i przenieść do nowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki PBS i ponownie odwirować przy 650 x g przez 5 minut w celu zebrania komórek.</li>
		<li>Usuń supernatant i ponownie zawieś komórki na pożywce OCM (-) i zlicz komórki za pomocą licznika komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiewanie i hodowla PBMC
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce OCM (+) i płytce 8 x 106 komórek/ml na studzienkę na płytce 6-dołkowej lub 1 x 106 komórek/ml na basenik w płytce 96-dołkowej. Komórki płytki na szklanych szkiełkach nakrywkowych (5 mm) zgodnie z wymaganiami do obrazowania immunofluorescencyjnego, jak również na wycinkach kostnych odpowiednich do testów resorpcji kości, jak opisano wcześniej20.</li>
		<li>Zmieniaj pożywkę hodowlaną, uzupełniając komórki ludzkim M-CSF co 2-3 dni lub w razie potrzeby. Następnie przejdź do etapu różnicowania w 5 dniu, dodając 30 ng / ml ludzkiego sRANKL wraz z 25 ng / ml ludzkiego M-CSF w pożywce OCM (+), aby zainicjować osteoklastogenezę.</li>
		<li>Hoduj komórki przez około 14 do 21 dni, aby utworzyć gigantyczne komórki wielojądrowe. Gdy tylko pojawią się komórki wielojądrowe, komórki te można następnie oznaczyć jako TRAP, a gdy osiągną pełną dojrzałość, można przeprowadzić testy funkcjonalne. Pierścienie F-aktyny można uwidocznić na szkiełkach nakrywkowych za pomocą barwienia falloidyną. Morfologię komórek można badać w komórkach przyczepionych do plastrów zębiny za pomocą SEM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+of+musculoskeletal+diseases%3A+impact+of+work+disability+and+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+rheumatology.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li>
<li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoclast%2C+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li>
<li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+%28sODF%29+exhibit+severe+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li>
<li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li>
<li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+tissue+international%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li>
<li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trabecular+bone+turnover%2C+bone+marrow+cell+development%2C+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li>
<li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+medicine%22%5BJournal%5D)">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li>
<li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+menopausal+transition%3A+analysis+of+LH%2C+FSH%2C+estradiol%2C+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li>
<li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li>
<li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenotropic%2C+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors%3A+dissociation+from+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li>
<li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li>
<li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li>
<li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+deficiency+and+bone+loss%3A+an+inflammatory+tale%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li>
<li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li>
<li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li>
<li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+%28ODF%29+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+researc.%2C+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).</li>
<li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis%2C+osteoporosis%2C+cancer%2C+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li>
<li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+osteoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li>
<li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+design%2C+development+and+therapy%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li>
<li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li>
<li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b%3A+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis%2C+osteoclast+formation%2C+and+maintenance+of+bone+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li>
<li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+%28RANK%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li>
<li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicin%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li>
<li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology%3A+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li>
<li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Choroby układu mięśniowo-szkieletowego są główną przyczyną zachorowalności i niepełnosprawności i obejmują ponad 150 chorób i zespołów; dotyka dziś około 90 milionów Amerykanów. Zapalenie stawów i zniszczenie kości są dominującymi cechami schorzeń układu mięśniowo-szkieletowego, w tym zapalenia stawów i osteoporozy. Osteoporoza to stan, który osłabia integralność kości, często prowadząc do złamań kości. Zapalenie stawów jest przewlekłą, wyniszczającą chorobą charakteryzującą się zapaleniem stawów, które stają się opuchni...

Choroby układu mięśniowo-szkieletowego dotykają miliony ludzi w Stanach Zjednoczonych i mają poważne konsekwencje dla krajowych i lokalnych systemów opieki zdrowotnej1. Zaburzenia te charakteryzują się utratą funkcji kości i stawów, która wymaga intensywnego leczenia i długich okresów rekonwalescencji. Zwykle obserwuje się względny wzrost liczby i/lub aktywności osteoklastów, komórek wyspecjalizowanych w resorpcji kości, w osteoporozie i zapaleniu stawów2. W warunkach fizjologicznych liczba i aktywność osteoklastów jest regulowana przez aktywator receptora liganda czynnika jądrowego κ-B (RANKL), który jest wytwarzany przez osteoblasty. Osteoprotegeryna (OPG), receptor wabik dla RANKL, jest również wytwarzana przez osteoblasty3. Modele zwierzęce in vivo, które obejmują ogólnoustrojową nadekspresję sRANKL lub delecję OPG, są bardzo cenne w badaniach nad osteoporozą; Metody te wymagają jednak wyhodowania myszy transgenicznych4,5. W tym miejscu opisano nowatorską alternatywną metodę nadekspresji sRANKL do badania zaburzeń związanych z układem mięśniowo-szkieletowym. W szczególności wykorzystano technologię minicircle DNA (MC) i metody dostarczania hydrodynamicznego, aby osiągnąć transfer genów sRANKL in vivo i ogólnoustrojową nadekspresję sRANKL u myszy6.
Ta metoda jest również komplementarna do innych modeli osteoporozy in vivo, takich jak hormonalna modulacja osteoklastów po wycięciu jajników7 i interwencja dietetyczna poprzez dietę niskowapniową8. Modele te są bardzo przydatne do badania różnych aspektów zaburzeń związanych z układem mięśniowo-szkieletowym, jednak wymagają zabiegów chirurgicznych i mogą trwać nawet kilka miesięcy, co wiąże się ze znacznymi kosztami9. Model gryzoni po owariektomii (OVX) jest eksperymentalnym modelem zwierzęcym, w którym usunięcie jajników prowadzi do niedoboru estrogenu, naśladując w ten sposób ludzką osteoporozępo menopauzie. Osteoporoza pomenopauzalna u ludzi, stan, w którym niedobór estrogenów prowadzi do zwiększonego ryzyka złamań kości, a osteoporoza dotyka około ośmiu milionów kobiet w samych Stanach Zjednoczonych. Chociaż model OVX jest przydatny w przypadku osteoporozy pomenopauzalnej, oferuje ograniczone korzyści w badaniu osteoporozy w ogóle. Estrogen hamuje utratę masy kostnej, indukując osteoklasty i hamując apoptozę osteoblastów, dlatego przy jego braku obserwuje się zwiększoną aktywność osteoklastów10-12. Obserwuje się również nierównowagę proporcji RANKL-OPG, która sprzyja resorpcji kości13. Jednak niedoborowi estrogenów in vivo towarzyszy również obniżony poziom transformującego czynnika wzrostu β (TGF β), zwiększony poziom interleukiny-7 (IL-7) oraz TNF, IL-1 i IL-614,15. Ponieważ cytokiny te mają znane funkcje modulacyjne przebudowy kości niezależne od szlaku RANKL, niemożliwe jest przypisanie jakiejkolwiek aktywacji osteoklastów wyłącznie osi RANKL-RANK. Model opisany w tej pracy umożliwia naukowcom badanie in vivo osi RANKL-RANK w osteoklastogenezie i utracie masy kostnej bez cytokin prozapalnych w porównaniu z modelami gryzoni OVX.
Dodatkowo, techniki osteoklastogenezy in vitro są niezbędnymi narzędziami do badania aktywacji osteoklastów dla potencjalnych terapii chorób układu mięśniowo-szkieletowego. Wcześniejsze badania wykazały również, że hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy (BMM) z mysim czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i mysim sRANKL może prowadzić do różnicowania osteoklastów3,16,17. W tym miejscu opisano protokoły generowania wielojądrowych komórek podobnych do osteoklastów ze szpiku kostnego myszy, a także z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) in vitro18. Pokrótce opisano również testy komórkowe wymagane do zdefiniowania dojrzałego, terminalnie zróżnicowanego i w pełni funkcjonalnego osteoklastu. Te techniki in vitro uzupełniają nowatorskie podejście in vivo i razem służą jako potężne narzędzia badawcze do badania różnicowania i aktywacji osteoklastów. Korzystając z tych systemów, naukowcy są w stanie generować osteoklasty in vivo i in vitro oraz definiować bodźce i sygnały niezbędne do ich proliferacji i aktywacji, a także testować skuteczność inhibitorów farmakologicznych i biologicznych.

<table><tbody><tr><td>Technologie życia alpha-MEM</td><td>&nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Mysz M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki RANK-Ligand - rozpuszczalny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Mysz RANK-Ligand - rozpuszczalny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik żył ogonowych dla myszy</td><td>Braintree</td><td>TV-150 Mysz STD</td><td></td></tr><tr><td>TRANCE/RANK L/TNFSF11 Zestaw Quantikine ELISA&nbsp;</td><td>R& D systems</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza kwasowa, leukocyty (TRAP) Zestaw</td><td>Test Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP&nbsp;</td><td>systemy immunodiagnostyczne</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Różnicowanie i aktywacja osteoklastów odgrywają kluczową rolę w rozwoju chorób układu mięśniowo-szkieletowego, ponieważ komórki te są przede wszystkim zaangażowane w resorpcję kości. Osteoklasty mogą być wytwarzane in vitro z komórek prekursorowych monocytów/makrofagów w obecności określonych cytokin, które sprzyjają przeżyciu i różnicowaniu. Zademonstrowano tu zarówno techniki in vivo, jak i in vitro, które pozwalają naukowcom badać różne wkłady cytokin w różnicowanie, sygnalizację i aktywację osteoklastów. System transferu genów dostarczający DNA w minikręgu stanowi alternatywną metodę tworzenia modelu związanego z osteoporozą, która jest szczególnie przydatna do badania skuteczności różnych inhibitorów farmakologicznych in vivo. Podobnie, protokoły hodowli in vitro do wytwarzania osteoklastów z ludzkich komórek prekursorowych w obecności specyficznych cytokin umożliwiają naukowcom badanie osteoklastogenezy w komórkach ludzkich do zastosowań translacyjnych. W połączeniu techniki te mogą przyspieszyć prace nad odkrywaniem leków celowanych terapii specyficznych dla osteoklastów, które mogą przynieść korzyści milionom pacjentów z osteoporozą i zapaleniem stawów na całym świecie.

W niniejszym materiale opisano nowatorską technikę transferu genów w celu różnicowania osteoklastów in vivo oraz protokoły hodowli komórkowych do różnicowania komórek prekursorowych w osteoklasty in vitro jako metodę badania wpływu cytokin na osteoklastogenezę. Na Rysunku 1 przedstawiono reprezentatywne wyniki pomyślnego transferu genów GFP oraz mysiego sRANKL MC u myszy. Na Rysunku 2 pokazano reprezentatywne obrazy z mikroskopii w świetle przechodzącym, przedstawiające...

Różnicowanie komórek prekursorowych w osteoklasty jest regulowane przez cytokiny i czynniki wzrostu. W tym artykule opisano nową technikę transferu genów do różnicowania osteoklastów in vivo oraz protokoły hodowli komórkowych do różnicowania komórek prekursorowych w osteoklasty in vitro jako metodę badania wpływu cytokin na osteoklastogenezę.

Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Ogólnym celem jest przedstawienie nowej techniki transferu genów do różnicowania osteoklastów in vivo. Opisujemy również protokoły hodowli komórkowych do różnicowania makrofagów ludzkiego pbmc w szpiku kostnym myszy w osteoklast. Ten film zostanie podzielony na trzy części.Jeden, hydrodynamiczne dostarczanie mini koła porostów rangowych, DNA, dwie generacje osteoklastów in vitro od myszy, makrofagów szpiku kostnego i trzy generacje osteoklastów in vitro od ludzkiego pbmc. Część pierwsza, hydrodynamiczne dostarczanie mini koła porostów rangowych, DNA. Poniższa animacja przedstawia krótki przegląd dostarczania hydrodynamicznego za pomocą iniekcji żyły ogonowej myszy.Najpierw umieść mysz pod mapą cieplną na 10 minut przed wstrzyknięciem. To rozszerza naczynia krwionośne i sprawia, że żyły boczne są bardziej widoczne. Następnie zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia i kontynuuj wstrzyknięcie, upewniając się, że wstrzyknięcie zostało zakończone w ciągu pięciu do siedmiu sekund.Następna część tego filmu pokaże bardziej szczegółowe opisy procedur związanych z hydrodynamicznym dostarczaniem przez żyłę ogona myszy. Zebrać materiał do wstrzyknięcia. Mysz należy rozgrzać w klatce przez 10 minut prz

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przeprowadzono podłużną analizę ubytku kostnego w kościach udowych i piszczelowych u dorosłych myszy po urazie rdzenia kręgowego, wykorzystując sekwencyjne skanowanie rentgenowskie w niskiej dawce. Ubytek kostny w obrębie kości piszczelowych stwierdzono przez cały okres trwania badania, natomiast ubytek w kości udowej wykryto dopiero 40 dni po urazie.

Podłużna ocena utraty masy kostnej kończyn tylnych myszy po urazie rdzenia kręgowego z wykorzystaniem nowej metodologii in vivo

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do badania przerzutów nowotworowych do kości. W niniejszym protokole opiszemy dwie powszechne metody inokulacji guza w badaniach nad przerzutami do kości oraz krótko omówimy niektóre z analiz stosowanych do monitorowania i ilościowego określania tych modeli.

Modele przerzutów do kości

Ilościowy pomiar funkcji progenitora kości w gojeniu złamań wymaga technologii obrazowania seryjnego o wysokiej rozdzielczości. W tym miejscu przedstawiono protokoły wykorzystujące mikroskopię przyżyciową i śledzenie linii kostnych w celu sekwencyjnego obrazowania i ilościowego określenia migracji, proliferacji i różnicowania endogennych osteogennych komórek macierzystych / progenitorowych w procesie naprawy złamań kości.

Sekwencyjne obrazowanie in vivo osteogennych komórek macierzystych/progenitorowych podczas naprawy złamań

Połączone obrazowanie optyczne i μCT w mysim modelu infekcji implantu ortopedycznego, wykorzystujące bioluminescencyjny zmodyfikowany szczep Staphylococcus aureus, zapewniło możliwość nieinwazyjnego i podłużnego monitorowania dynamiki infekcji bakteryjnej, jak również odpowiadającej jej reakcji zapalnej i zmian anatomicznych w kości.

Połączone obrazowanie optyczne in vivo i μCT w celu monitorowania infekcji, stanu zapalnego i anatomii kości w zakażeniu implantu ortopedycznego u myszy

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Opisujemy protokół in vivo do pomiaru zgięcia grzbietowego stopy po stymulacji nerwu strzałkowego i skurczu przedniego przedziału podudniowego kończyny tylnej szczura. Takie pomiary są niezastąpionym narzędziem translacyjnym do oceny patologii mięśni szkieletowych i podejść inżynierii tkankowej do naprawy i regeneracji mięśni.

Zastosowania testów funkcjonalnych in vivo kości piszczelowej szczura przedniego do oceny naprawy mięśni szkieletowych za pomocą inżynierii tkankowej

Małe ryby laboratoryjne stały się popularnymi modelami do badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw zaburzeń kości u ludzi oraz do badań przesiewowych leków modulujących kości. W niniejszym raporcie opisano protokół oceny wpływu alendronianu na komórki kostne larw medaka ze zmianami osteoporotycznymi.

Leczenie farmakologiczne i obrazowanie in vivo interakcji osteoblast-osteoklast w modelu osteoporozy ryb Medaka

Celem tego protokołu jest wygenerowanie modelu złamania kompresyjnego kręgów związanego z osteoporozą u nagich szczurów, który może być oceniany in vivo za pomocą półautomatycznej ilościowej analizy strukturalnej opartej na mikrotomografii komputerowej.

Półautomatyczna ilościowa analiza strukturalna oparta na mikrotomografii komputerowej nagiego szczura Model złamania kręgów związanego z osteoporozą

Proponowany protokół zakłada globalne podejście do oceny procesu tworzenia się kości w kontekście regeneracji kości za pomocą analiz multimodalnych. Ma on na celu dostarczenie jakościowych i ilościowych informacji na temat tworzenia się nowych kości, zwiększenie rygoru i trafności badań podstawowych i przedklinicznych.

Kompleksowa charakterystyka mineralizacji tkanek w modelu ex vivo

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

W tym miejscu przedstawiamy podejście do terapii genowej, które dostarcza chitozan pokryty ABE bezpośrednio do szpiku kostnego poprzez wstrzyknięcie doszpikowe.

Ulepszone dostarczanie i ekspresja genów za pomocą dokostnego wstrzykiwania nanocząstek chitozanu Enkapsulowane plazmidy edytora zasad adeninowych

Poznaj nową technikę transferu genów in vivo i protokoły hodowli komórkowej in vitro do badania osteoklastogenezy. Metoda obejmuje hydrodynamiczną dostawę DNA i różnicowanie makrofagów szpiku kostnego myszy oraz PBMC człowieka.

Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego (Wideo) | JoVE Journal

Nowatorska technika transferu genów in vivo i testy komórkowe in vitro do badania utraty masy kostnej w zaburzeniach układu mięśniowo-szkieletowego

Przeglądaj więcej filmów