Ex vivo Preparaty nienaruszonego narządu lemieszowo-nosowego i dodatkowej opuszki węchowej

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie preparatu ex vivo funkcjonalnie połączonego narządu nosowego myszy lub VNO, dodatkowej opuszki węchowej lub OB. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw zgrubnej sekcji czaszki myszy w celu wyizolowania pojedynczej półkuli pyska i opuszki węchowej. W drugim etapie delikatne aksony VNO i OB są poddawane wtórnej sekcji w komorze perfuzyjnej tkanek. Na koniec do VNO wprowadza się cienką kaniulę, przez którą można wprowadzić zapach i bodziec.

Ostatecznie zapisy elektrofizjologiczne można wykorzystać do pomiaru aktywności neuronalnej w obrębie A OB podczas stymulacji VNO. Przewaga tej techniki nad istniejącymi technikami, takimi jak elektrofizjologia warstw in vitro, polega na tym, że dzięki tej technice narząd zmysłu i dalsze obwody nerwowe pozostają funkcjonalnie połączone. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ istnieje wiele delikatnych etapów sekcji, których trudno się nauczyć, a błędy na którymkolwiek z tych etapów mogą skutkować nieudaną sekcją Aby rozpocząć pierwotną sekcję, najpierw użyj kleszczy Addin, aby usunąć kości ciemieniowe i czołowe czaszki myszy, uważając, aby nie zetknąć się z opuszkami węchowymi.

Następnie za pomocą skalpela wykonaj nacięcie koronalne przez płat czołowy, dwa milimetry rozpieszczaj zatoki, a następnie usuń rozpieszczanie mózgu do cięcia. Użyj prostych nożyczek, aby usunąć odsłonięte rozpieszczone aspekty brzusznej czaszki, pozostawiając zatoki i pozostałą tkankę nerwową. Usuń łuk jarzmowy i mięśnie twarzy po anatomicznej prawej stronie czaszki, a następnie obróć pysk brzuszną stroną do góry.

Aby odsłonić podniebienie, należy natychmiast włożyć końcówkę ostrza skalpela pod paletę równolegle do podniebienia, a następnie przesunąć ostrze w kierunku siekaczy. Chwyć uwolnioną krawędź rostralną palety kleszczami i usuń podniebienie, ciągnąc za rozpieszczo. Następnie po anatomicznej lewej stronie czaszki włóż tylko końcówkę ostrza skalpela w puste przestrzenie w pobliżu zębów trzonowych i obróć nadgarstek, aby delikatnie wysunąć otwór podniebienny.

Zaczynając od małego otworu w pobliżu zębów trzonowych, użyj czubka ostrza skalpela, aby kontynuować cięcie od otworu podniebiennego przez siekacze, zaczynając od rostralu do anatomicznego lewego VNO z wieloma cięciami punktowymi. Następnie obróć tkankę tak, aby czaszka grzbietowa była skierowana do góry i ustaw prostą żyletkę pionowo i równolegle do linii środkowej na krawędzi rozpieszczonej preparatu na brzusznej krawędzi tkanki, dotknij krawędzi tnącej żyletki bezpośrednio na lewo od linii środkowej i delikatnie kołysz ostrzem poruszając się wzdłuż lewego podniebienia dla Raymonda, Trzymając ostrze równolegle do skały linii środkowej. Żyletka powoli z naciskiem w kierunku przedniej części tkanki, zatrzymując się natychmiast po przełamaniu oporu na płytce cribriform.

Chwyć odsłonięte półkule w pobliżu boków rozpieszczania palcami w rękawiczkach i delikatnie obracaj je na boki i do przodu, aby oddzielić tkanki. Teraz nałóż od 50 do 100 mikrolitrów kleju tkankowego na cienką plastikową deskę. Chwyć tkankę kleszczami i osusz preparat ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wilgoci z jej bocznej strony.

Użyj kleszczy, aby delikatnie umieścić boczną krawędź prawej półkuli na kleju. Następnie umieść kroplę smaru próżniowego o średnicy od trzech do pięciu milimetrów i głębokości dwóch milimetrów w środku wtórnej komory preparacyjnej i mocno przyłóż stronę deski przeciwną do tkanki przy smarze. Natychmiast napełnij komorę preparacyjną schłodzonym rozwarstwieniem, sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym lub płynem mózgowo-rdzeniowym i przenieś komorę do obszaru drobnej sekcji.

Następnie rozpocznij obfitowanie komory z natlenionym wzorcem A CSF, orientując deskę tak, aby opuszka węchowa znajdowała się bezpośrednio w strumieniu świeżo natlenionego płynu do wykonania. Wtórne rozwarstwienie Rozpocznij od użycia cienkich kleszczy, aby usunąć widoczną przeciwległą opuszkę węchową lub tkankę korową. Z preparatu zlokalizuj białą oponę twardą wzdłuż grzbietowej przyśrodkowej powierzchni opuszki węchowej, a następnie za pomocą dwóch par cienkich kleszczyków rozerwij oponę twardą, chwytając ją w najbielszej części i rozsuwając kleszcze.

Następnie, powoli i ostrożnie, oderwij korę czołową za pomocą cienkich kleszczy, nie uszkadzając leżących pod nią opuszków węchowych. Po oddzieleniu kory czołowej przeciąć i usunąć tkankę brzuszną i tylną do A OB, uważając, aby nie uszkodzić warstwy kłębuszkowej. Następnie przeprowadź pojedynczy punkt cienkich kleszczyków między chrząstką przegrody a skrzydłem VNO, cienkim kawałkiem tkanki kostnej, który biegnie wzdłuż grzbietowej krawędzi obu VN Os.To ostrożnie usuń przeciwległe VNO po całkowitym usunięciu VNO, użyj cienkich kleszczyków, aby wykonać nacięcie na brzusznej krawędzi chrząstki przegrody, gdzie zwęża się do białej jałowej biegnącej wzdłuż brzusznej krawędzi kości przegrody.

Ściśnij cienkie kleszcze, aby uzyskać częściowo punkt i włóż kleszcze zaciskowe bocznie do cięcia. Następnie powoli odsuń chrząstkę od tkanki przegrody międzywarstwowej, postępując stopniowo i bez naruszania leżącej poniżej tkanki przegrody. Chwyć kość kleszczami i delikatnie przesuwaj kość do przodu ido tyłu, aż pęknie w pobliżu płytki reformy łóżeczka.

Teraz podłącz kaniulę poliamidową do urządzenia do szybkiej perfuzji i rozpocznij przepływ roztworu Ringera z prędkością od 0,1 do 0,3 mililitra na minutę przez kaniulę poliamidową. Zmierz natężenie przepływu za pomocą wbudowanego przepływomierza o małej objętości. Na koniec ustaw kaniulę równolegle do wejścia VNO.

Gdy kaniula jest na swoim miejscu, obserwuj, jak ciśnienie wylotowe powoduje nadmuchiwanie VNO, co prowadzi do ewakuacji naczynia krwionośnego. Następnie natychmiast włóż kaniulę do VNO, utrzymując stały kąt kaniuli, tak aby pozostał równoległy do otworu VNO i rozpocznij ocenę funkcji fizjologicznej. Dużym źródłem zmienności między preparatami jest gęstość i kruchość kości czaszki i pyska zwierząt doświadczalnych.

Nierzadko zdarza się, że tkanki przegrody pozostają przyczepione do przeciwległej półkuli, szczególnie w pobliżu punktów przyczepu do kości grzbietowych pyska. Inne częste błędy preparacyjne pojawiają się podczas wtórnego drobnego rozwarstwienia, podczas którego aksony nerwu nosowego RO mogą zostać uszkodzone w tkance przegrody w pobliżu VNO lub w pobliżu OB. Te i podobne zdarzenia spowodują niepełną łączność między neuronami czuciowymi nosa RO a renderowaniem A OB. Preparaty nie nadają się do użycia po pomyślnym zakończeniu zabiegu.

Łączność funkcjonalną można zweryfikować za pomocą testu fizjologicznego, takiego jak elektrofizjologiczne zapisy aktywności neuronalnej pojedynczej jednostki w odpowiedzi na stymulację VNO za pomocą substancji zapachowych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować spokój i robić krótkie przerwy. Jeśli poczujesz się zmęczony, małe błędy w wykonaniu tej techniki mogą uszkodzić te delikatne struktury nerwowe.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać sekcje ex vivo wczesnego systemu fabrycznego akcesoriów do badań elektrofizjologicznych lub obrazowych.