Name: Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę Northern Blot do wykrywania małych cząsteczek RNA w Drosophila melanogaster. Protokół obejmuje ekstrakcję RNA, elektroforezę na żelu akrylamidowym oraz autorradiografię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg, Hôpital de Strasbourg, Association pour la Recherche sur le Cancer, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche i Région Alsace.
Pietro Laneve został wsparty przez Fondation pour la Recherche Médicale. Obecnie jest stypendystą Istituto Italiano Tecnologia (IIT). Koszty publikacji są wspierane przez sieć Neurex (TriNeuron – Program Interreg IV Górny Ren)

1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Odłączyć półprzylegające 2 komórki Schneidera (średnio 1-5 x 106 komórek) przez pipetowanie i zebrać je przez odwirowanie (100 x g przez 1 min). W przypadku komórek adherentnych hodowanych in vitro, trypsynizuj je w standardowych warunkach lub bezpośrednio zbieraj z płytek do odpowiedniej ilości odczynnika do ekstrakcji RNA, za pomocą skrobaka do komórek.</li>
	<li>W celu pobrania zarodków hoduj szczepy Drosophila w klatkach na muchy i pozwól zarodkom gromadzić się na płytkach do składania jaj. Zetrzeć zarodki pędzlem w wodzie destylowanej (dH2O), wyrzucić zanieczyszczenia przez filtrowanie sitowe, spłukać i odzyskać zarodki w fiolce48.</li>
	<li>Jako alternatywną technikę należy ręcznie wypreparować tkanki/narządy. Wyizoluj jądra (preferencyjny system do analizy piRNA) z odwłoka Drosophila w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) pod mikroskopem stereoskopowym (20-krotne powiększenie), używając igieł do preparowania lub kleszczy, jak pokazano w Sullivan i wsp. 49.</li>
	<li>Tłuczek homogenizuje próbki po uzależnieniu 0,5 objętości odczynnika do ekstrakcji RNA.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja/analiza RNA
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, wykonaj izolację RNA za pomocą dostępnych w handlu odczynników. ostrożność! Środki do ekstrakcji RNA są zwykle toksyczne i. Alternatywnie zastosuj protokół oparty na proteinazie K do izolacji RNA50 w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć próbki do 400 μl Stop Mix i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Odzyskiwanie składników hydrorozpuszczalnych przez standardowe ekstrakcje fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego i chloroformu oraz przez wytrącanie/mycie etanolem (EtOH). Próbki należy wysuszyć na powietrzu i ponownie zawiesić w podwójnie destylowanym (dd)H2O, poddanym działaniu ditylowęglanianu (DEPC).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń stężenie RNA za pomocą pomiaru spektrofotometrycznego UV. Upewnij się również, że czystość RNA jest wysoka, bliska 2,0, w oparciu o odczyt A260/A280.</li>
	<li>Sprawdź przygotowanie RNA na denaturującym żelu agarozowym w następujący sposób:
	<ol>
		<li>W czystej zlewce rozpuścić 1,2 g agarozy w 82 ml DEPC-ddH2O, ciągle mieszając. Gotować do całkowitego rozpuszczenia.</li>
		<li>Pozostawić roztwór żelu do ostygnięcia; gdy temperatura osiągnie 60 °C, dodać 10 ml buforu 10X 4-morfolinopropanosulfonowego (MOPS) do 1X końcowego stężenia (FC) i 8 ml 37% formaldehydu do 3% FC. ostrożność! Formaldehyd jest czynnikiem rakotwórczym.</li>
		<li>Wlej żel do poziomej celi elektroforetycznej. Pozostaw żel do zestalenia się pod kapturem przez co najmniej 1 godzinę. Po zestaleniu zanurz żel w MOPS 1X.</li>
		<li>Podwielokrotność 2 μg próbki RNA i 1 μg próbki Ladder (użyj markera RNA, gdy wymagana jest dokładna ocena). Dodaj 3 objętości barwnika ładującego agarozę (ALD) do RNA i do drabiny. Ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 5 minut i natychmiast schłodzić na lodzie. UWAGA! Zawartość ALD (bromek etydyny i formamid, patrz Materiały) jest odpowiednio mutagenna i.</li>
		<li>Załaduj próbki i uruchom żel pod napięciem 50 V przez około 1 godzinę z okazjonalnym recyklingiem buforowym. Sprawdź wzór frakcjonowania RNA za pomocą wizualizacji UV lub obrazowania żelowego. Rozpoznaj dyskretne prążki odpowiadające 28S i 18S rRNA oraz tRNA (patrz rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do testu północnego lub przechowuj RNA w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Preparat żelu akrylowego denaturującego
<ol>
	<li>Do tego etapu frakcjonowania należy użyć małego pionowego aparatu elektroforetycznego (rozmiar płytki około 8 cm x 9 cm, grubość grzebienia 0,75 mm).</li>
	<li>Zmontuj czyste okulary razem w ramie odlewniczej.</li>
	<li>Przygotować 10 ml 10% roztworu akrylamidu/bis-akrylamidu (19:1) w MOPS 1X, 7 M moczniku. Bezpośrednio przed nalewaniem dodać 100 μl 10% nadsiarczanu amonu i 10 μl TEMED i szybko wymieszać roztwór. ostrożność! Akrylamid jest neurotoksyczny i rakotwórczy.</li>
	<li>Wlej żel między szklane płytki i ostrożnie włóż grzebień studzienki, aby uniknąć pęcherzyków. Pozwól żelowi polimeryzować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 45 minut przed użyciem. Alternatywnie, przechowuj żel O/N, zawinięty w nasączone wodą bibuły filtracyjne i szczelnie zamknięty w folii saran.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Podwielokrotność 0,5-20 μg całkowitego RNA dla każdej próbki. Jeśli objętość przekracza 3–4 μl, wysuszyć próbkę w suszarce próżniowej.</li>
	<li>W celu określenia wielkości należy przeprowadzić podwielokrotność (20-30 cps) znakowanej radioizotopowo drabinki niskiego zasięgu równolegle do próbek, jako marker (patrz sekcja 4.3 i 4.4 w celu przygotowania). Traktuje się go równolegle do próbek, jak opisano w kroku 4.5.</li>
	<li>Drabina: uruchomić reakcję fosforanową do przodu przy użyciu 0,1 μg drabiny o długości 10 pz. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut i zatrzymać reakcję przez dodanie kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do 20 mM FC.</li>
	<li>Oczyścić przez wytrącanie/płukanie EtOH, wysuszyć na powietrzu i ponownie zawiesić w ddH2O (około 100 μl). ostrożność! Rozdział 32P jest źródłem promieniotwórczym.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać równą objętość niebieskiego barwnika akrylowego (ABD). Denaturację należy przeprowadzić przez ogrzewanie w temperaturze 80 °C przez 5 minut i schłodzić na lodzie do momentu załadunku. ostrożność! Formamid (zawartość w ABD) jest.</li>
</ol>
5. Frakcjonowanie elektroforetyczne
<ol>
	<li>Zdejmij szklane płytki ze wspornika odlewu i prawidłowo zamontuj je w komorze elektroforetycznej. Napełnij zarówno komorę wewnętrzną, jak i zewnętrzną wystarczającą ilością buforu roboczego (RB).</li>
	<li>Delikatnie wyjmij grzebień i wstępnie uruchom żel pod napięciem 200 V przez 10 minut. Przed załadowaniem próbek zmyj osady mocznika ze studzienek, wstrzykując trochę RB przez strzykawkę.</li>
	<li>Użyj płaskich końcówek, aby ostrożnie rozwarstwić próbki z kroku 4.5 na dnie każdej studzienki. Sprawdź połączenia anody i katody, aby uniknąć pracy odwróconej. Po wprowadzeniu próbek do żelu pod napięciem 100 V przez 5 minut, zwiększ napięcie do 200 V.</li>
	<li>W przypadku frakcjonowania o długości około 7 cm wystarczy 45-minutowy bieg. Unikaj błękitu bromofenolowego (pigmentu śledzącego w ABD), aby przelać żel.</li>
	<li>Wizualizacja na żelu frakcjonowanych długich RNA za pomocą barwienia bromkiem etydyny (EtBr) jako opcjonalny krok:
	<ol>
		<li>Odciąć 2 cm od wierzchu żelu i krótko opłukać plasterek w ddH2O.</li>
		<li>Inkubować plasterek żelu w temperaturze pokojowej przez 15 minut, delikatnie zanurzając go w RB, EtBr 0,5 μg/ml FC.</li>
		<li>Odbarwić żel przez 15 minut w RB, uwidocznić długie rRNA za pomocą promieniowania UV lub obrazowania żelowego. Sprawdź obciążenie i jakość RNA (patrz Rysunek 1, Panel 7). ostrożność! Bromek etydyny jest substancją mutagenną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W międzyczasie przystąp do osuszania dolnej części żelu zawierającej małe gatunki RNA.</li>
</ol>
6. Żucie
<ol>
	<li>Wytnij 6 kawałków bibuły, aby pasowały do obszaru bibuły i równoważnego kawałka nienaładowanej nylonowej membrany. Zwilż arkusze papieru, membranę i 2 bibułki w RB. Upewnij się, że całkowicie nasącz podkładki, wielokrotnie ściskając je w RB.</li>
	<li>Wyjmij żel z aparatu i otwórz okulary za pomocą szpatułki. Użyj czystego noża, aby usunąć studzienki. Umieść arkusz mokrego papieru Whatman na żelu i delikatnie go podnieś.</li>
	<li>Umieść nylonową membranę na wolnej powierzchni żelu. Zaznacz róg, aby ustawić filtr zgodnie z obciążeniem próbki. Uzupełnij "kanapkę" (3 kawałki papieru z każdej strony). Zwiń plastikowy pręt po powierzchni plamy, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Umieść blot między dwiema podkładkami do bibuły, a następnie w kasecie bibułki. Zamontuj kasetę w module bibuły, napełnij komorę płynem stałym i sprawdź prawidłową orientację (nylonowa membrana musi pozostać między żelem a dodatnim końcem).</li>
	<li>Przelew pod napięciem 20 V przez 20 minut. Uwaga: aby zapewnić jednorodne warunki, po 10 minutach otwórz moduł bibułki i obróć kanapkę o 180° przed zakończeniem przenoszenia.</li>
</ol>
7. Sieciowanie membranowe
<ol>
	<li>Przygotuj 6 ml świeżego roztworu sieciującego (XLS). Nasącz kawałek bibuły o wymiarach 10 cm x 10 cm (większy niż membrana nylonowa) za pomocą XLS. ostrożność! HCl (składnik XLS) jest silnie.</li>
	<li>Zdemontuj blot i umieść membranę na mokrej bibule filtracyjnej 3MM. Uwaga: RNA nie może mieć bezpośredniego kontaktu z nasyconym papierem. Umieść filtr i papier między dwiema szklanymi płytkami i zawiń w saran-wrap.</li>
	<li>Ogrzewać membranę w temperaturze 60 °C przez 2 godziny, a następnie przepłukać ddH2O. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przystąpić do hybrydyzacji.</li>
</ol>
8. Prehybrydyzacja membranowa
<ol>
	<li>Jeśli obciążenie RNA zostało sprawdzone (opcjonalny krok 5.5), należy bezpośrednio przejść do hybrydyzacji. Lub inaczej, odetnij 1 cm od górnej części nylonowego filtra, aby uniknąć hybrydyzacji krzyżowej sondy do frakcjonowanych długich RNA.</li>
	<li>Rozgrzać 10 ml roztworu do hybrydyzacji (HS) w temperaturze 37 °C. Denaturować 1 mg nasienia łososia w temperaturze 95 °C przez 5 minut, ostudzić na lodzie i dodać do HS.</li>
	<li>Inkubować filtr w HS w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę, obracając się w piecu do hybrydyzacji. Sprawdź, czy strona RNA filtra jest skierowana w stronę HS.</li>
</ol>
9. Synteza sondy
<ol>
	<li>Ustawić reakcję przewodzenia fosforanu na 10 pmol specyficznego oligonukleotydu antysensownego, jak opisano w 4.3.</li>
	<li>Dodać 5 objętości buforu Tris-EDTA-NaCl (TEN) do reakcji i oczyścić znakowany starter z nieinkorporowanych nukleotydów za pomocą chromatografii wykluczającej żel na kolumnach G-25 Sephadex (lub również przez wytrącanie EtOH). Aktywność sondy można ocenić za pomocą licznika scyntylacji cieczy.</li>
</ol>
10. Hybrydyzacja membranowa
<ol>
	<li>Zastąpić wyczerpaną HS świeżą 10 ml podwielokrotnością (przygotowaną i uzupełnioną w sposób opisany powyżej). Podgrzej sondę w temperaturze 95 °C przez 10 minut, ostudź na lodzie i dodaj do nowego HS. Inkubować filtr w temperaturze 37 °C ON.</li>
</ol>
11. Mycie membran
<ol>
	<li>Odzyskać roztwór hybrydyzacyjny i przechowywać go w temperaturze -20 °C w pojemniku chroniącym przed promieniochronnością.</li>
	<li>Wypłucz filtr w buforze myjącym (WB) i dokładnie myj go przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Użyj detektora Geigera Muellera do sprawdzenia resztkowej radioaktywności w rogach filtra. Gdy emisja tła wynosi około 5 cps, przejdź do ekspozycji membranowej.</li>
</ol>
12. Wykrywanie sygnału
<ol>
	<li>Naświetl filtr na kliszach autoradiograficznych lub na ekranie obrazowania molekularnego WŁĄCZONY. Ujawniaj sygnały poprzez obróbkę fotograficzną lub konwersję cyfrową.</li>
	<li>Analizuj intensywność pasma za pomocą dedykowanego oprogramowania do kwantyfikacji (ImageJ lub Optiquant).</li>
</ol>
13. Zdejmowanie membrany
<ol>
	<li>Aby usunąć sygnały pierwotne, zanurzyć membranę w 500 ml wrzącego roztworu do strippingu, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Przejść do nowej (wstępnej) hybrydyzacji lub przechowywać filtr w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Chociaż nasze uznanie dla wyrafinowanego splotu, za pomocą którego RNA reguluje neurogenezę, stale rośnie, mechanistyczne implikacje obwodów opartych na RNA wpływających na biologię neuronalnych komórek macierzystych, różnicowanie neuronów/integrację funkcjonalną, rozwój patologii nerwowych i nowotwory pozostają niezbadane. Utrzymywanie takich sieci poprzez królestwa sprawia, że potencjał systemów genetycznych, takich jak Drosophila melanogaster , odgrywa zasadniczą rolę w odkrywaniu niezbadanych szlaków komórko...

Biochemia RNA doświadczyła spektakularnego postępu w ostatnich latach1. Nasze zrozumienie potencjału RNA w kontroli ekspresji genów zostało poszerzone dzięki identyfikacji silnych niekodujących ryboregulatorów2, odkryciu nowych mechanizmów regulacyjnych opartych na RNA3,4 oraz głębszej charakterystyce już znanych zdarzeń potranskrypcyjnych5. Wszystkie te badania pozwoliły biologii RNA na radykalne pojawienie się na scenie, stając się głównym tematem badań w obecnym krajobrazie naukowym. W szczególności w ostatnich latach dostrzegamy wszechobecny wpływ "świata RNA" naneurobiologię molekularną6, jedną z najbardziej dynamicznych dziedzin badań we współczesnych naukach przyrodniczych. W ostatniej dekadzie ubiegłego stulecia ogólny scenariusz naukowy został zrewolucjonizowany przez odkrycie interferencji RNA7,8 i małych regulatorowych RNA9,10, ze szczególnym uwzględnieniem mikroRNA11, endogennie eksprymowanych małych niekodujących RNA, zaangażowanych w kontrolę prawie wszystkich funkcji komórkowych jako plejotropowe i kombinatoryczne regulatory ekspresji genów.
Prawie 10 lat po początkowym odkryciu miRNA u Caenorhabditis elegans przez laboratoria Ambrosa i Ruvkuna, ponownie zwrócono uwagę na tę dziedzinę, gdy zidentyfikowano dużą liczbę miRNA u Drosophila oraz w komórkach ludzkich12-15. Od tego czasu, dzięki wszechstronnym metodom transgenicznym, Drosophila melanogaster wyróżnia się jako cenny kontekst biologiczny dla zagłębiania się w biosyntezę i aktywność miRNA. MiRNA Drosophila ujawniły odrębne funkcje w specyficznych dla owadów lub ewolucyjnie konserwatywnych procesach, od starzenia się po metabolizm, szlaki sygnałowe, zachowanie i, oczywiście, neurogenezę. Idąc w tym kierunku, niedawno odkryliśmy nowe ogniwo16 w intrygującej korelacji zachodzącej między głównym genem gcm/glide a szlakiem RNA. Czynnik transkrypcyjny muchy Gcm / Glide17-19 stanowi unikalny przykład determinantu losu komórki, który dyktuje wybór losu glejowego i neuronalnego u multipotencjalnych prekursorów neuronalnych much20. Dwudziestoletnie badania na ten temat wyraźnie podkreśliły występowanie wielu i nakładających się na siebie danych wejściowych regulacji ekspresji genów, zbiegających się w gcm / glide21-28 w celu ustalenia poziomów progowych wymaganych do zrównoważenia delikatnego stosunku między neuronalnymi i glejowymi odpowiednikami podczas rozwoju neuronalnego.
Odkryliśmy, że regulacja za pomocą celowania Dmel-miR279 stanowi kolejny poziom kontrolny, przyczyniając się do potranskrypcyjnego dostrojenia ekspresji gcm/glide 16. Na całym świecie te linie badawcze wymagały konkretnych ulepszeń metodologicznych: na przestrzeni lat kilka technologii pierwotnie opracowanych do analizy tradycyjnych RNA zostało przekształconych w celu ilościowego oznaczania małych niekodujących RNA, takich jak testy ochrony RNAza, macierze cDNA29-31, metody PCR w czasie rzeczywistym32-35 i sekwencjonowanie36,37. Z drugiej strony, rekalibracja podejść technicznych przyczyniła się do ciągłego postępu w tej dziedzinie.
Test Northern Blot (NB, lub test na plamy w żelu RNA) stanowi reprezentatywny przykład: jest on w dużej mierze wykorzystywany do profilowania akumulacji RNA, ponieważ zapewnia zarówno ilościowe określanie poziomu ekspresji, jak i określanie wielkości. Jednak wewnętrzna słaba czułość metody jest ograniczona, gdy ma być stosowana do precyzyjnych dostrajaczy o niskiej ekspresji genów, takich jak krótkie RNA. Niekorzystną konsekwencją jest wymóg dużych ilości całkowitego RNA, co utrudnia jego zastosowanie do określonych próbek biologicznych. Z tych powodów opracowano specyficzne warianty NB do wykrywania małych RNA38-40: skorzystaliśmy z ulepszonej procedury NB41 (ENB, Enhanced Northern Blot), wyjaśniając jednocześnie wspomnianą wyżej zależność między Dmel-miR279 a gcm/glide.
Ta metoda opiera się na chemicznym etapie sieciowania opartym na aktywności pochodnej karbodimidu [1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu, EDC] w celu wiązania kwasu nukleinowego na stałych nośnikach. Karbodimid jest wszechstronnym środkiem sieciującym, o którym wiadomo, że katalizuje tworzenie wiązań amidowych między aktywowanymi grupami karboksylowymi lub fosforanowymi a grupami aminowymi42. Właściwość tę można wykorzystać do kowalencyjnego łączenia małych RNA za pośrednictwem ich mono-fosforylowanej grupy 5′-hydroksylowej z grupami aminowymi na powierzchni błon nylonowych. Uzyskana konfiguracja przyłączania zwiększa dostępność unieruchomionego kwasu nukleinowego, a co za tym idzie, wydajność hybrydyzacji sonda-cel, co skutkuje niezwykłym ulepszeniem wykrywalności43.
Technika nabiera szczególnego znaczenia w badaniach molekularnych Drosophila, dzięki którym pojawia się występowanie nowych i charakterystycznych klas małych niekodujących RNA44. Wśród nich rasiRNA45,46 stanowią specyficzny podtyp RNA oddziałujących z piwi (piRNAs47), biorący udział w wyciszaniu genów specyficznych dla sekwencji. Szczegóły operacyjne tej metody są w pełni opisane i zwizualizowane poniżej, w odniesieniu do analizy mikroRNA Dmel-miR279 i Dmel-miR286 oraz, po raz pierwszy, jednego rasiRNA, rasi4. Posunęliśmy się do skrajności w tej metodzie, która pozwoliła nam ujawnić słabo wyrażone cele z minimalnych ilości RNA (mniej niż 1 μg).

<table><tbody><tr><td>OSTATECZNY SKŁAD/NAZWA</td> KATALOG <td>FIRMOWY</td><td>(Stock)</td><td>UWAGI</td></tr><tr><td colspan="4">WYMAGANIA OGÓLNE</td></tr><tr><td>Wirówka, 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Odkażanie, RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>Nakładać na szkło/plastik, wytrzeć i spłukać</td></tr><tr><td>inhibitor RNazy, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Niebezpieczny //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4">PRZYGOTOWANIE PRÓBKI</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy, M60</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X Bufor</td><td></td><td></td><td></td>PBS</tr><tr><td>137 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>2,7 mM KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&nbsp;</td></tr><tr><td>10 mM Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&nbsp;</td></tr><tr><td>1,8 mM KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">EKSTRAKCJA/ANALIZA RNA</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VIS</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imager, ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforeza pozioma, Mini-Sub Cell GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji RNA, TRIzol Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td>Niebezpieczne</td></tr><tr><td>PCA (25:24:1), 1:1 do ekstrakcji</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>Chlorophorm, 1:1 do ekstrakcji</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH, 2,5 obj. do strącania, 70% do mycia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59844</td><td>64-17-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Gene Ruler 1Kb DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Stop Mix</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc, pH 5,5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1x RSB Roztwór</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2% dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Nigdy nie schładzaj SDS, aby uniknąć opadów //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 mg/ml Proteinaza K</td><td>Roche Applied Science</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10X Standardowy bufor retikulocytów (RSB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Tris-Cl, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>30 mM MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr>Żel <td></td><td></td><td></td><td>agarozowy denaturujący</td></tr><tr><td>1,2% Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Pozwól żelowi zestalać się przez co najmniej 1 godzinę //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10X MOPS Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M MOPS sól sodowa, pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>Nie należy mylić soli sodowej MOPS z solą sodową MOPS MOPS //// 71119-22-7</td></tr><tr>Barwnik <td></td><td></td><td></td><td>obciążający agarozą</td></tr><tr><td>1x MOPS Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3% formaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Niebezpieczne //// 50-00-0</td></tr><tr><td>50% formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Niebezpieczne //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Bromek etydyny (EtBr) 30 &mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Niebezpieczne //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">MAŁE FRAKCJONOWANIE RNA</td></tr><tr><td>Płaskie końcówki do ładowania żelu</td><td>Life Technologies</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Savant SpeedVac</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>Elektroforeza pionowa, Mini-PROTEAN Tetra Cell&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr>Żel <td></td><td></td><td></td><td>akrylowy do denaturacji</td></tr><tr><td>10% akrylamid/bis-akryloamid (19:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3449</td><td>Niebezpieczne. Pozwól żelowi polimeryzować przez 45 minut przed użyciem</td></tr><tr><td>1x Bufor TBE (lub 1x Bufor MOPS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 M mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>0,1% nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&nbsp;</td></tr><tr><td>0,1% TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Linijka genowa Drabinka DNA ultra niskiego zasięgu (krok 10 pz)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>Etykieta 0,1 &mu; g, zgodnie z opisem w reakcji "znakowania sondą"</td></tr><tr><td>Akryloamid Blue Dye&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Niebezpieczny //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor roboczy (RB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor MOPS&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alternatywa RB: 1x Bufor TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Bufor</td><td></td><td></td><td></td>TBE</tr><tr><td>5X TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 mM Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>445 mM kwas borowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Żelowy roztwór</td><td></td><td></td><td></td>barwiący</tr><tr><td>Bromek etydyny 0,5 &mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Niebezpieczne //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1x RB</td><td></td><td></td><td>Bejca na 15 min z EtBr, odbarwianie przez 15 min bez EtBr</td></tr><tr><td colspan="4">BLOTTING</td></tr><tr><td>3MM Papier Whatman</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>Neutralna membrana nylonowa, Hybond NX</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>RPN203T</td><td>Światłoczuły</td></tr><tr><td colspan="4">SIECIOWANIE</td></tr><tr><td>Roztwór sieciujący (XLS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 1-metyloimidazol (v/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>Zawsze przygotuj świeżą porcję XLS //// 616-47-7</td></tr><tr><td>12,5 mM HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Niebezpieczne //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>3,1% EDC (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>25952-53-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(PRE)-HYBRYDYZACJA</td></tr><tr><td>Licznik scyntylacji cieczy&nbsp;</td><td>Beckmann</td><td>LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>Nasienie łososia z nożycami, 0,1 mg/ml&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>rasi4 sonda antysensowna</td><td></td><td></td><td>5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA</td></tr> <tr><td>sonda</td><td></td><td></td> antysensowna <td>5'-CAACACACGGGTGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279</td></tr> <tr><td>sonda</td><td></td><td></td> antysensowna <td>5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286</td></tr> <tr><td>sonda antysensowna</td><td></td><td></td><td>5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Zestaw</td></tr> <tr><td>do oczyszczania, ilustracja kolumn MicroSpin G-25</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>(Pre)-Roztwór hybrydyzacyjny (HS)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>0,5% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&nbsp;</td></tr><tr><td>5x Roztwór</td><td></td><td></td><td></td>Denhardta</tr><tr><td>20X SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0,2 M fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>7601-54-9&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>20 mM EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS&</td><td>nbsp; 60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>50x Roztwór</td><td></td><td></td><td></td>Denhardta</tr><tr><td>1% Ficoll 400 (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>1% Poliwinylopirolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>1% BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1X Bufor</td><td></td><td></td><td></td>TEN</tr><tr><td>10 mM Tris-Cl (pH 8,0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1 mM EDTA (pH 8,0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Etykietowanie sondy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,4 i mu; Oligonukleotyd</td><td></td><td></td><td></td>M</tr><tr><td>1,5 &mu; l Ci/&mu; l [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>Niebezpieczny //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1x bufor kinazy polinukleotydowej T4</td><td>Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4 0,5 jednostki /&mu; l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4">MYCIE</td></tr><tr><td>Detektory Geigera Muellera</td><td>Canberra Industries</td><td>MCB2/CPS &ndash; </td><td></td>EM77021</tr><tr><td>Bufor myjący (WB), 2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rygorystyczne</td><td></td><td></td><td></td>myjące</tr><tr><td>0.2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2x SSPE, 0.5% SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">WYKRYWANIE SYGNAŁU</td></tr><tr><td>PharosFX Plus System</td><td>Biorad</td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>Obraz J</td><td>Swobodnie dostępny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ilość Jedna</td> Filmy rentgenowskie <td>Biorad</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>BioMax XAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5888</td><td>Światłoczuły</td></tr><tr><td>wywoływacz do filmów rentgenowskich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalacz do filmów rentgenowskich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">USUWANIE IZOLACJI</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td></td>do usuwania</tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8,8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>5 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0,1% SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Dodaj SDS po ugotowaniu, aby uniknąć pienienia //// 151-21-3</td></tr></tbody></table>

ulepszone wykrywanie małych gatunków rna w northern blot u drosophila melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Ostatnie dziesięciolecia były świadkami eksplozji naukowego zainteresowania mechanizmami kontroli ekspresji genów na poziomie RNA. Ta gałąź biologii molekularnej została w znacznym stopniu wzmocniona przez odkrycie niekodujących RNA jako głównych graczy w regulacji posttranskrypcyjnej. Takiej rewolucyjnej perspektywie towarzyszył i uruchamiał rozwój potężnych technologii profilowania ekspresji krótkich RNA, zarówno na poziomie wysokoprzepustowym (identyfikacja całego genomu), jak i jako analiza pojedynczego kandydata (akumulacja określonych gatunków w stanie ustalonym). Chociaż obecnie dostępnych jest kilka najnowocześniejszych strategii dawkowania lub wizualizacji takich uciekających cząsteczek, test Northern Blot pozostaje odpowiednim podejściem w biologii molekularnej do natychmiastowej i dokładnej oceny ekspresji RNA. Stanowi ona pierwszy krok w kierunku zastosowania bardziej wyrafinowanych, kosztownych technologii i w wielu przypadkach pozostaje preferencyjną metodą łatwego uzyskania wglądu w biologię RNA. W tym miejscu przedstawiamy skuteczny protokół (Enhanced Northern Blot) do wykrywania słabo eksprymowanych mikroRNA (lub innych małych gatunków regulatorowego RNA) z całych zarodków Drosophila melanogaster, ręcznie wypreparowanych tkanek larwalnych/dorosłych lub komórek hodowanych in vitro. Wymagana jest bardzo ograniczona ilość RNA i można również rozważyć wykorzystanie materiału z komórek izolowanych metodą cytometrii przepływowej.

Postępując zgodnie z ogólną procedurą opisaną w tekście i przedstawioną schematycznie na Rysunku 1, oceniliśmy ekspresję małych RNA z kompleksowych próbek RNA różnego pochodzenia. W doświadczeniu przedstawionym na Rysunku 1 RNA wyizolowano z komórek Schneidera muchy Drosophila metodą ekstrakcji Proteinazą K, sprawdzono jego integralność (opcjonalny etap: frakcjonowanie na denaturującym żelu agarozowym) i naniesiono w dwóch powtórzeniach. Jedną połowę żelu przeniesiono na membran...

Celem tej publikacji jest wizualizacja i dyskusja na temat etapów działania protokołu Enhanced Northern Blot na RNA ekstrahowanym z zarodków, komórek i tkanek Drosophila melanogaster. Protokół ten jest szczególnie przydatny do skutecznego wykrywania małych gatunków RNA.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Ogólnym celem tej procedury jest umożliwienie wykrycia małej ekspresji RNA z zarodków Deano gaster lub tkanek lub komórek. Osiąga się to poprzez ekstrakcję RNA z wybranych źródeł biologicznych. Drugim krokiem jest frakcjonowanie RNA przez elektroforezę wzdłuż żelu akrylowego w celu rozwiązania wzorców migracji o niskiej masie cząsteczkowej.Następnie gatunki RNA są przenoszone i chemicznie sieciowane do neutralnego stałego nośnika. Ostatnim krokiem jest znakowanie cząsteczek kandydujących poprzez wyżarzanie ich za pomocą określonych sond antysensownych. Ostatecznie radiografia automatyczna służy do ujawniania sygnałów, które odzwierciedlają ekspresję analizowanych cząsteczek.Ta metoda bloku północnego bez odpowiedzi nie może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii RNA, takie jak poziomy w stanie stacjonarnym w pełni wyrażonych cząsteczek RNA. Aby rozpocząć, hoduj dwie komórki Drosophila Schneidera do gęstości od jednego do pięciu razy 10 do szóstej na mililitr. Następnie odłączyć częściowo przylegające komórki przez pipetowanie i odwirować komórki w ilości 100 GS na minutę.Alternatywnie gromadź zarodki na płytkach do składania jaj. Zetrzyj zarodki pędzlem i wodą desty

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Opisujemy uwrażliwioną metodę identyfikacji postembrionalnych regulatorów ekspresji i lokalizacji białek w C. elegans, wykorzystującą genomowy screening oparty na RNAi oraz zintegrowany transgen kodujący funkcjonalne białko znakowane fluorescencyjnie.

Przesiewanie RNAi w celu identyfikacji fenotypów postembrionalnych u C. elegans

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji, wykrywania, analizy i śledzenia endogennego transportu mRNA w żywej komorze jajowej Drosophila melanogaster za pomocą latarni molekularnych, mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem i oprogramowania do analizy open-source.

Wizualizacja i śledzenie endogennych mRNA w żywych komorach jajowych Drosophila melanogaster

Ta metoda demonstruje użycie techniki północnej hybrydyzacji do wykrywania miRNA z całkowitego ekstraktu RNA.

Analiza plam RNA w celu wykrywania i kwantyfikacji mikroRNA roślin

Drosophila to sprawdzony model do badania kluczowych cząsteczek regulujących miogenezę. Jednak obecne metody są niewystarczające do określenia dynamiki transkrypcji mRNA i dystrybucji przestrzennej w obrębie syncytii. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy metodę hybrydyzacji in situ fluorescencji RNA, która umożliwia wykrywanie i kwantyfikację mRNA w skali pojedynczej cząsteczki.

Badanie dynamiki transkrypcji mięśni w skalach jednocząsteczkowych u Drosophila

Iteracyjna hybrydyzacja in situ wspomagana ekspansją (EASI-FISH) to solidna technika, która łączy mikroskopię ekspansywną z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji wielu genów w grubej tkance. Protokół ten przedstawia ostatnie postępy w metodzie i jej adaptacji do znakowania nienaruszonego ośrodkowego układu nerwowego Drosophila.

Multipleksowe wykrywanie ekspresji genów w nienaruszonym mózgu Drosophila przy użyciu iteracyjnej fluorescencji in situ wspomaganej ekspansją

Protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ z uwzględnieniem polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP-FISH) w celu rozróżnienia transkryptów rybosomalnego RNA pochodzących z locus rybosomalnego DNA chromosomu X lub Y u Drosophila melanogaster.

Wykrywanie rybosomalnego RNA specyficznego dla polimorfizmu pojedynczego nukleotydu FISH u Drosophila melanogaster

Artykuł opisuje efektywny protokół rozwarstwiania dysku wyobrażalnego i barwienia przeciwciał, który jest ekonomiczny pod względem odczynników i ułatwia obsługę dysków wyobrażających w małych ilościach.

Małoskalowe rozwarstwienie i barwienie przeciwciał na dyskach wyimaginowanych oczno-czułowych i skrzydłowych Drosophila melanogaster

Poznaj ulepszoną metodę Northern Blot do wykrywania małych cząsteczek RNA w Drosophila melanogaster. Protokół obejmuje ekstrakcję RNA, elektroforezę na żelu akrylamidowym oraz autorradiografię.

Ulepszone wykrywanie małych gatunków RNA w Northern Blot u Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów