Przeszczep rogówki u myszy: model do badania najczęstszej formy przeszczepu narządów litych

Ogólnym celem poniższej procedury jest wprowadzenie modelu ostrego odrzucania alloprzeszczepu rogówki. Osiąga się to poprzez usunięcie najpierw rogówki dawcy. Kolejnym etapem zabiegu jest przygotowanie łoża przeszczepu biorcy i zszycie rogówki dawcy na miejsce.

Następnie testowana jest integralność przeszczepu, a jeśli nie ma wycieków, powieka jest zszywana na zamknięty. Po tygodniu ocenia się zmętnienie przeszczepu rogówki w celu zmierzenia odrzucenia przeszczepu allogenicznego. Ostatecznie model może być wykorzystany, może testować różne strategie terapeutyczne w celu zdefiniowania najważniejszych czynników związanych z odrzuceniem przeszczepu allogenicznego przeszczepów narządów litych.

Przeszczep rogówki jest najbardziej powszechny w Stanach Zjednoczonych. Do tej procedury dostępnych jest kilka modeli zwierzęcych, ale najczęściej używane są myszy. Model ten został wykorzystany do zdefiniowania czynników, obejmujących zarówno odrzucenie, jak i akceptację przeszczepu rogówki.

Po znieczuleniu myszy dawcy i biorcy i potwierdzeniu ich stanów znieczulenia przez uszczypnięcie palca u nogi, nałóż czystą maść lubrykantową na oczy, które nie są poddawane operacji. Następnie przymocuj głowę z okiem dawcy poziomo do solidnego, ruchomego wspornika za pomocą paska taśmy na szyi. Teraz za pomocą zęba o średnicy dwóch milimetrów, którego końcówka została zabarwiona błękitem metylowym, obrysuj centralne miejsce przeszczepu rogówki.

Następnie za pomocą ostrza noża okulistycznego pod kątem 15 stopni wbij się w rogówkę, aby uniknąć uszkodzenia leżącej pod spodem soczewki. Wstrzyknąć roztwór lepkosprężysty do komory przedniej, aby komora stała się głębsza. Teraz wytnij przeszczep dawcy nożyczkami weneckimi i przenieś przeszczep do naczynia z HBSS na lodzie, aż do użycia w celu uzyskania madres, podaj kilka kropli 1% tpic aide i 2,5% chlorowodorku efryny do oka biorcy.

Następnie za pomocą 1,5-milimetrowego zęba obrysuj miejsce przeszczepu, jak opisano wcześniej, używając ostrza noża okulistycznego pod kątem 15 stopni, wniknij w rogówkę i wstrzyknij lepkosprężysty roztwór do przedniej komory, aby ją pogłębić. Aby zachować przestrzeń między rogówką dawcy a soczewką, zmniejsza to ryzyko uszkodzenia leżącej pod spodem soczewki i śródbłonka dawcy. Za pomocą nożyczek Venice usuń zarysowany centralny guzik rogówki z odbiorcy i wyrzuć.

Dodaj lepkosprężystą pożywkę do obszaru opróżnionego przez usunięcie guzika rogówki, aby chronić komórki śródbłonka rogówki przed uszkodzeniem przez bezpośredni kontakt z soczewką. Teraz umieść rogówkę dawcy na łożu przeszczepu za pomocą mikrokleszczyków z bardzo cienką końcówką. Umieść pierwszy kęs nylonowego szwu 11.0 po stronie dawcy przez rogówkę dawcy do około 90% pełnej grubości.

Następnie po stronie biorcy na tej samej głębokości, a następnie zwiąż. Kontynuuj zabezpieczanie przeszczepionej rogówki za pomocą szwów przerywanych w środku kardynalnej. W sumie wystarczy od ośmiu do 10 szwów.

Teraz zreformuj i umyj przednią komorę wstrzyknięciem soli fizjologicznej. Alternatywnie, wstrzyknij powietrze do przedniej komory, aby ją zreformować. Po wstrzyknięciu należy delikatnie sprawdzić integralność przeszczepu za pomocą gąbki celulozowej.

Na koniec oceń oko. Określ, czy źrenica jest okrągła i czy przednia komora wydaje się normalna. Jeśli przeszczep wydaje się dobry, nałóż maść z antybiotykiem i opcjonalnie zamknij powiekę za pomocą biegnącego szwu jedwabnego 7.0 po operacji.

Monitoruj mysz, aż całkowicie się obudzi, a następnie kontynuuj obserwację w klatce domowej przez dwa dni. Usuń szwy ze znieczulonej myszy między czterema a siedmioma dniami po operacji. Po zdjęciu szwów obserwuj mysz przez kilka dni.

Korzystając ze skali zmętnienia, oceń każdą rogówkę z wynikiem od zera do pięciu. Zero oznacza brak krycia. Wynik jeden odpowiada minimalnemu powierzchownemu zmętnieniu.

Wynik dwa wskazuje na łagodne lub głębsze zmętnienie z dostrzegalną dolną źrenicą. A tęczówka to znak o nachyleniu trzech do rogówek z przezroczystością zrębu, w której tęczówki nie widać szczegółowo, z wyjątkiem brzegów źrenic. Jeśli występuje gęste zmętnienie zrębu i nie widać żadnych leżących pod nim struktur, przyznaj przeszczepowi wynik cztery.

Jeśli występuje całkowite zmętnienie z intensywnym obrzękiem zrębu, a zarówno źrenica, jak i tęczówka są całkowicie zasłonięte, należy ocenić przeszczep na piątkę. Protokół tekstowy sugeruje również skalę od zera do ośmiu dotyczącą infiltracji naczyń krwionośnych. Za pomocą modelu przeszczepu można wykonać wiele różnych manipulacji.

Na przykład komórki śledziony mogą zostać dodane do przedniej komory od myszy dawcy. Po eutanazji dawcy należy usunąć śledzionę i przenieść ją do sitka komórkowego za pomocą trzymililitrowego tłoka strzykawki, rozbić śledzionę, a następnie umyć komórki śledziony w 10 mililitrach HBSS, ponownie zawiesić umyte komórki w 10 mililitrach HBSS i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Utrzymuj ogniwa w temperaturze pokojowej, dopóki nie zostaną wykorzystane później.

Przed wykonaniem przeszczepu rogówki wstrzyknąć komórki do przedniej komory w przeciwległym oku za pomocą mikroskopu preparacyjnego, wstrzyknąć 1 milion komórek śledziony w pięciu mikrolitrach HBSS z igły o rozmiarze 33. Model wykorzystano do zbadania, czy tolerancja uogólnionego alloantygenu T na antygeny allo wyrażane przez alloprzeszczep rogówki dawcy może poprawić przeżywalność przeszczepu. Myszy BC były tolerowane na czarne antygeny 10 allo C 57 przez wstrzyknięcie komórek śledziony B 10 do komory przedniej.

Nie poprawiło to akceptacji alloprzeszczepu rogówki. Badania wykazują, że ustalenie swoistej dla antygenu tolerancji na allo antygen, mierzonej odpowiedziami DTH, nie wpływa na wynik alloprzeszczepów skóry ani rogówki. Podobne badanie wykazało, że gdy ustalono tolerancję DTH u myszy BAB c w kierunku antygenów B 10 allo, przeszczep skóry oszczędzający niektóre lub wszystkie antygeny B 10 allo nie zwiększył przeżycia.

W związku z tym jelito C z ustalonym DTH specyficznym dla antygenu nie odniosło mierzalnych korzyści z alloprzeszczepów rogówki lub skóry. Jak widać z dzisiejszego eksperymentu, przeszczep rogówki jest procedurą wymagającą technicznie. Jest to jednak najlepszy model do badania komórek i czynników, które decydują o sukcesie lub niepowodzeniu wykresu.