Name: In vivo (in vivo)Obrazowanie specyficznej dla Dauera przebudowy neuronów u C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj metodę obrazowania przebudowy neuronów sensorycznych u C. elegans w fazie dauer przy użyciu feromonu i fluorescencji GFP. Technika ta umożliwia badanie neuroplastyczności w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękuję dr Maureen Barr, pod której nadzorem wstępnie scharakteryzowano fenotyp przebudowy dauer IL2. Podziękowania dla dr C. Britt Carlson za krytyczną lekturę manuskryptu. Finansowanie w laboratorium Barr pochodziło z NIH (5R01DK59418) i stypendia podoktorskie z USDA (2010-65106-20587) i New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Obecne fundusze na te prace pochodzą z grantu University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE.

1. Produkcja surowych feromonów Dauer
<ol>
	<li>Hodować OP50 E. coli z pojedynczej kolonii O/N w temperaturze 37 °C, wstrząsając 100 ml bulionu LB przy 200 obr./min. UWAGA: Ta kultura O/N może być przygotowana z wyprzedzeniem i przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Uprawiaj N2 C. elegans na 15 - 20 6 cm szalkach Petriego z agarem NGM (patrz przepis w tabeli 1) wysiewanym 50 μl OP50 E. coli, aż bakterie będą prawie wyczerpane19.</li>
	<li>Przygotować 5 x 250 ml pożywki S (patrz przepis w Tabeli 1) w 1 l kolbach Erlenmeyera19. UWAGA: To rozwiązanie można wykonać z wyprzedzeniem.</li>
	<li>Wyhodować kulturę OP50 E. coli w 4 litrach bulionu LB O/N poprzez zaszczepienie 1 ml OP50 w E. coli i wytrząsanie w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Przemyć nicienie z płytek (etap 1.2) 1 ml roztworu podstawowego S (patrz przepis w tabeli 1) i przenieść nicienie z 4-5 płytek do każdej z 4 kolb Erlenmeyera o pojemności 1 l z pożywką S przygotowaną w kroku 1.3 (4-5 płytek na każdą kolbę)19.</li>
	<li>Odwirować OP50 z kroku 1.4 przy 650 x g przez 10 minut i usunąć supernatant. Zawiesić każdy osad bakteryjny w 10 ml roztworu podstawowego S. Przenieść równe ilości zawieszonych bakterii do każdej kolby nicieni.</li>
	<li>Umieścić kolby na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej (20 - 25 °C) i 100 - 150 obr./min przez 4-5 dni, aż roztwór zacznie się klarować, wskazując na wyczerpanie pokarmu.</li>
	<li>Gdy pokarm się wyczerpie, wyhoduj kolejną kulturę O/N OP50 E. coli w 4x 1 l bulionu LB. Odwirować bakterie przy 650 x g przez 10 minut i dodać osad z jednej kolby do każdej z kolb z pożywką S z nicieniami. Umieścić kolby z pożywką S z powrotem w wytrząsarce orbitalnej, jak w kroku 1.7, przez dodatkowe 3-4 dni, aż pokarm ponownie się wyczerpie.</li>
	<li>Pobrać ~1 ml podwielokrotności roztworu z każdej kolby i oszacować stężenie nicieni, pobierając podpróbki 1 μl z każdej podwielokrotności 1 ml i licząc liczbę nicieni. UWAGA: Populacja nicieni powinna wynosić 50 000 - 75 000 nicieni/ml. Przy tym stężeniu większość nicieni to nicienie.</li>
	<li>Wyrzucić wszelkie zanieczyszczone kolby. UWAGA: Zanieczyszczenie często objawia się strzępkami grzybów widocznymi w kroku 1.9.</li>
	<li>Odwirować nicienie w temperaturze 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić osad nicienia i zachować supernatant. Alternatywnie, zapoznaj się z dyskusją na temat używania tych zwierząt do wytwarzania feromonów o niskiej mocy.</li>
	<li>Przefiltruj supernatant przez #1 Bibułę filtracyjną Whatman. UWAGA: Kolba próżniowa przyspieszy ten proces.</li>
	<li>Następnie przefiltruj supernatant przez sterylne jednostki filtracji próżniowej 0,45 μm. UWAGA: Filtrat można utrzymywać w temperaturze O/N w temperaturze 4 °C lub przejść do 1.14.</li>
	<li>Dodać filtrat do 2-litrowej zlewki z mieszadłem. Umieścić w dygestorium na płycie do podgrzewania. Mieszając doprowadzić do wrzenia i odparować do około 200 ml. Przenieść roztwór do zlewki o pojemności 500 ml. Kontynuuj gotowanie, aż pozostanie około 50 ml. UWAGA: Na tym etapie należy zachować ostrożność, ponieważ możliwe jest wykipienie roztworu. Kolor ostatnich 50 ml jest ciemnobrązowy. W dowolnym momencie procesu gotowania można wyłączyć ogrzewanie, a filtrat przechowywać O/N w temperaturze RT lub 4 °C.</li>
	<li>Ostudzić i odwirować przez 5 minut przy 1 000 x g. Wlać supernatant do zlewki o pojemności 100 ml i wyrzucić osad.</li>
	<li>Ugotować supernatant do brązowej skórki. Zdejmij z ognia i rozbij skórkę szpatułką. Dodaj wystarczającą ilość 200-procentowego etanolu, aby pokryć skórkę. Przykryj zlewkę Parafilm i pozostaw ją w temperaturze O/N w temperaturze pokojowej. Odlej etanol do czystej zlewki i odłóż na bok. Dodaj świeży etanol, aby przykryć skórkę. Powtórz ekstrakcje O/N 3 razy. Połącz ekstrakty.</li>
	<li>Użyj pompy próżniowej do wysuszenia ekstraktów etanolu. Jeżeli pompa próżniowa nie jest dostępna, dodać ekstrakt etanolowy do czystej zlewki i ogrzać do 50 °C, mieszając w wyciągu. UWAGA: Po odparowaniu etanolu powinna pozostać lepka pozostałość o jasnobrązowym kolorze. W przypadku ogrzewania należy uważać, aby nie spalić roztworu przez zbyt długie ogrzewanie.</li>
	<li>Pozostałość rozpuścić w 10 ml destylowanej sterylnej wody. Filtrować, wysterylizować ten roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i przechowywać w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach 1 ml. UWAGA: 1 ml wody służy do rozpuszczenia pozostałości na każde 100 ml oryginalnej płynnej kultury nicieni. Na przykład, jeśli jedna z płynnych kolb hodowlanych zostanie wyrzucona z powodu zanieczyszczenia, należy dostosować ilość wody użytej do rozpuszczenia pozostałości.</li>
</ol>
2. Określenie reakcji na dawkę feromonu
<ol>
	<li>Przygotować feromon dauer, sporządzając 6 x 5 ml pożywki NGM z agarem Noble, bez peptonu i uzupełniony 50 μg/ml siarczanu streptomycyny i szeregiem feromonów dauer (patrz przepis w tabeli 1)4, 19. Wymieszaj składniki w szklanej probówce hodowlanej o wymiarach 13x100 mm, zagotuj na palniku Bunsena, a następnie przelej do 3 cm szalek Petriego.</li>
	<li>Zważyć probówkę do mikrowirówki. Dodać 1 ml kultury O/N E. coli OP50 do probówki i odwirować przy ~17 000 x g w probówce do mikrowirówki. Usunąć cały supernatant. Ponownie zważyć probówkę i określić wagę osadu bakteryjnego. Zawiesić osad za pomocą buforu M9 (patrz przepis w tabeli 1) dla końcowego stężenia 4% (w/v). Podwielokrotność 10 μl zawiesiny bakteryjnej na środek każdej płytki feromonowej4. Przechowywać tabliczki O/N w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zbierz 10-15 grawitacyjnych hermafrodytów N2 typu dzikiego dzień po wylinkowaniu do dorosłościna płytki feromonowe 4. Przechowywać płytki w temperaturze 25 °C przez 3 - 4 godziny.</li>
	<li>Zlikwiduj wszystkie dorosłe hermafrodyty. Zapisz liczbę jaj złożonych na każdej tabliczce. Uszczelnij płytki Parafilmem i wróć do temperatury 25 °C na 3 dni17.</li>
	<li>Policz procent dauerów (Rysunek 2). Uwaga: W przypadku obu metod ważne jest, aby pamiętać, że dauery (i w mniejszym stopniu nie-dauery) będą wspinać się po ściankach i na pokrywę szalek Petriego. Dlatego ważne jest, aby zbadać wszystkie powierzchnie naczynia pod kątem nicieni.</li>
	<li>Dopasuj dane do krzywej dawka-odpowiedź i oszacuj stężenie feromonu EC90 (feromon wystarczający do wywołania 90% zwierząt do wytworzenia barwników), jak pokazano na rysunku 3. Uwaga: Zazwyczaj używamy modelu regresji logistycznej do oszacowania EC90, ale różne pakiety oprogramowania statystycznego mogą mieć alternatywne metody, które dają podobne oszacowania.</li>
</ol>
3. Obrazowanie na żywo neuronów Dauer IL2
<ol>
	<li>Przygotować płytki z feromonami dauera jak w protokole 2, stosując wartość EC90 określoną w kroku 2.6.</li>
	<li>Indukuj dauers za pomocą metod opisanych w protokole 2 ze szczepem przenoszącym zintegrowany transgen reporterowy IL2 (myIs13[Pklp-6::gfp], myIs14[Pklp-6::gfp], myIs16[Pklp-6::tdTomato] lub qIs56[Plag-2::gfp])12, 20, 21. UWAGA: Jeśli używany jest qIs56, ekspresja GFP nie będzie widoczna w IL2Q do kilku godzin po linieniu dauer, a niektóre z początkowych zdarzeń przebudowy nie będą widoczne. Dodatkowo, podczas gdy sygnał fluorescencyjny z transgenu Plag-2::gfp jest ostatecznie jaśniejszy w IL2 podczas dauer niżreportery fluorescencyjne Pklp-6, transgen P lag-2::gfp również ulega słabej ekspresji w mięśniach głowy, które mogą maskować drobne gałęzie IL2.</li>
	<li>Po złożeniu jaj usunąć dorosłe hermafrodyty, uszczelnić płytki Parafilmem i inkubować przez 34 godziny w temperaturze 25 °C17. UWAGA: Czas do wylinkowania dauer różni się nieznacznie u poszczególnych osób. Najszybszy okres arboryzacji dendrytów rozpoczyna się 4 - 5 godzin po rozpoczęciu linienia dauer (39 - 44 godziny po złożeniu jaj w temperaturze 25 °C)12.</li>
	<li>Dzień przed obrazowaniem należy uzupełnić roztwór 10% (m/v) agarozy w buforze M9 z feromonem dauer o stężeniu EC90. Porcję około 100 μl agarozy nanieść na szkiełko mikroskopowe i szybko, ale delikatnie, umieścić na niej kolejne szkiełko, aby uzyskać płaską powierzchnię agarozy. Po zestaleniu się agarozy zawiń szkiełka w saran wrap i przechowuj w komorze wilgotnościowej (pudełko z końcówkami do pipet z mokrymi ręcznikami papierowymi).</li>
	<li>Po 34-godzinnym okresie inkubacji zbadaj płytki feromonowe pod kątem nicieni, które przestały pompować gardło. Oddziel szkiełka w taki sposób, aby tylko jedna powierzchnia jednego szkiełka miała na sobie agarozę. Zbierz jeden lub więcej nicieni na 10% wacikach agarozowych i 1 μl kulek polistyrenowych o grubości 0,1 mikrona22. UWAGA: Przy dobrze zsynchronizowanej populacji większość nicieni na płytce będzie wchodzić w linienie od L2d do dauer. Mogą jednak występować różnice między osobami. Dlatego ważne jest, aby zwrócić uwagę na dodatkowe cechy (niedrożność stomii, przebudowa gardła), aby oszacować czas, przez jaki zwierzęta przebywały w okresie linienia (patrz na przykład reprezentatywne wyniki).</li>
	<li>Określ orientację (lewa/prawa, grzbietowa/brzuszna) nicienia. Przechwytuj obrazy stosu Z dendrytu IL2Q przy 100-krotnym powiększeniu z najniższą możliwą intensywnością fluorescencji co 15 minut lub w zależności od potrzeb konkretnego eksperymentu. Kontynuuj robienie zdjęć, dopóki nicienie nie oddzielą się od naskórka L2d i unieruchomienie nie będzie możliwe lub jeśli zwierzę wyzdrowieje z dauer (gardło zacznie pompować). Gdy nie obrazujesz aktywnie, umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej. UWAGA: Używamy mikroskopu epifluorescencyjnego z zmotoryzowanym stolikiem i optyką z kontrastem interferencyjnym różnicowym (DIC).</li>
</ol>

<ol><li>West-Eberhard, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWest-Eberhard%2C+MJ+%22Developmental+Plasticity+and+Evolution%22">Developmental Plasticity and Evolution</a>. , Oxford University Press. (2003).</li>
<li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dauerlarva%2C+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).</li>
<li>Riddle, D. L., Albert, P. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22C.+elegans+II%22">C. elegans II</a>. Riddle , D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. 739-768 (1998).</li>
<li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva%3A+developmental+effects+of+pheromone%2C+food%2C+and+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans dauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature.</a> Dev. Biol. 102, 368-378 (1984).</li>
<li>Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22The+Nematode+C.+elegans%22">The Nematode C. elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. 393-412 (1988).</li>
<li>Fielenbach, N., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+dauer+formation+and+the+molecular+basis+of+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">C. elegans dauer formation and the molecular basis of plasticity.</a> Genes Dev. 22, 2149-2165 (2008).</li>
<li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+PJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-19 (2007).</li>
<li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218, 578-580 (1982).</li>
<li>Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+pheromones+that+control+dauer+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Chemical Biology. 3, 420-422 (2007).</li>
<li>Jeong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433, 541-545 (2005).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454, 1115-1118 (2008).</li>
<li>Schroeder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dauer-Specific+dendrite+arborization+in+C.+regulated+by+KPC-1%2FFurin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dauer-Specific dendrite arborization in C. regulated by KPC-1/Furin.</a> Curr. Biol. 16, 1527-1535 (2013).</li>
<li>Procko, C., Lu, Y., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+delimit+shape+changes+of+sensory+neuron+receptive+endings+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia delimit shape changes of sensory neuron receptive endings in C. elegans.</a> Development. 138, 1371-1381 (2011).</li>
<li>Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+alterations+in+sensory+neuroanatomy+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva.</a> J. Comp. Neurol. 219, 461-481 (1983).</li>
<li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+chemosensory+control+of+dauer+formation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 130, 105-123 (1992).</li>
<li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+chemosensory+defects+in+daf-11+and+daf-21+mutants+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiple chemosensory defects in daf-11 and daf-21 mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 303-316 (1994).</li>
<li>Ailion, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dauer+formation+induced+by+high+temperatures+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dauer formation induced by high temperatures in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 156, 1047-1067 (2000).</li>
<li>Neal, S. J., Kim, K., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeal%2C+SJ+%22Pheromone+Signaling%22">Pheromone Signaling</a>. , Springer. 273-283 (2013).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Ouellet, J., Li, S., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+is+required+for+both+dauer+maintenance+and+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans.</a> Development. 135, 2583-2592 (2008).</li>
<li>Blelloch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gon-1+gene+is+required+for+gonadal+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, (2012).</li>
<li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> J. Exp. Zool. 231, 45-56 (1984).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Singh, R., Sulston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Badanie neuroplastyczności specyficznej dla dauera i innych zmian morfologicznych związanych z dauerem wymaga kontrolowanego i niezawodnego tworzenia dauerów albo poprzez mutację genetyczną (tj. mutanty daf-c ), albo przez ekspozycję zwierząt typu dzikiego na feromony. Chociaż zastosowanie mutacji genetycznej do wywołania dauers jest wygodne, może zafałszować wyniki. W związku z tym dane zebrane z mutacjami daf-c powinny być następnie potwierdzone na zwierzętach typu dzikiego indukowanych do we...

Plastyczność fenotypowa, w tym plastyczność rozwojowa i behawioralna, jest ważna dla adaptacji do niekorzystnych warunków środowiskowych i jest uważana za siłę napędową ewolucji1. C. elegans jest organizmem modelowym często wykorzystywanym do badań nad rozwojem i neurobiologią. W idealnych warunkach C. elegans rozwija się w czterech stadiach larwalnych przed wejściem w dorosłe stadium rozrodcze. Jednak w warunkach niskiej dostępności pożywienia i dużej gęstości zaludnienia C. elegans może przejść przełącznik rozwojowy i wejść w długotrwałe i odporne na stres stadium2. Dauery wykazują kilka morfologicznych i behawioralnych różnic w stosunku do osób niebędących dauerami, które prawdopodobnie pośredniczą w tej odporności na stres. Sygnały środowiskowe i szlaki genetyczne regulujące wnikanie dauera zostały obszernie opisane3, 4, 5, 6, 7. Jednak mechanizmy molekularne kontrolujące poszczególne zmiany fenotypowe, które zachodzą podczas powstawania dauera, są słabiej poznane.
Badanie fenotypów specyficznych dla dauer wymaga produkcji zwierząt dauer. Można to osiągnąć na trzy sposoby: 1) Wybieranie z wygłodzonej kultury C. elegans, 2) Użycie mutantów konstytutywnych tworzenia dauer (daf-c), 3) Indukcja tworzenia dauer poprzez oczyszczony feromon. Stosunkowo łatwo jest wybrać dauery ze standardowej płytki NGM z populacją C. elegans, która wyczerpała swoje bakteryjne zapasy pokarmu. W naszych rękach standardowa płytka NGM pierwotnie wysiana 50 μl Escherichia coli OP50, pozostawiona do wzrostu przez 3 dni, a następnie zaszczepiona 3 - 4 dorosłymi hermafrodytami trzymanymi w temperaturze 25 °C, wyczerpie zapas żywności w ciągu jednego tygodnia i wyprodukuje kilka tysięcy dauers w ciągu dodatkowych 3 dni (oprócz wielu wygłodzonych nie-dauerów). Metoda ta jest jednak niezadowalająca do badania procesów zachodzących podczas linienia do dauer. Trudno określić, które z kilku tysięcy zwierząt znajdujących się na typowym wygłodzonym talerzu wchodzą do dauer. Co więcej, użycie zagłodzonej płytki nie daje możliwości synchronizacji. Zastosowanie mutantów daf-c pozwala na synchronizację i niezawodne generowanie dauerów. Nie ma jednak gwarancji, że konkretna mutacja daf-c nie wpłynie na inne fenotypy specyficzne dla dauera samodzielnie lub w połączeniu z dodatkowymi mutacjami.
Obecność feromonu dauer została najpierw zasugerowana przez Cassadę i Russella, a później zademonstrowana przez Goldena i Riddle'a. Od tego czasu feromon dauer został scharakteryzowany chemicznie2, 8, 9, 10. Oczyszczony feromon składa się ze złożonej mieszanki askarozydów, które w różnych formach regulują zarówno procesy behawioralne, jak i rozwojowe9, 11. Zastosowanie surowego ekstraktu z feromonów dauer pozwala na niezawodną, kontrolowaną indukcję zsynchronizowanych dauerów na tle dzikiego typu.
Układ nerwowy i związane z nim komórki glejowe przechodzą przebudowę podczas formowania się larw dauer12, 13, 14. Niektóre z tych zmian są nieodwracalne, jak na przykład przebudowa komórek glejowych podczas dauer13, 14. Jednak inne zdarzenia związane z przebudową są odwracalne po powrocie do sprzyjających warunków środowiskowych. Na przykład zestaw czterech neuronów IL2Q ulega szybkiej i odwracalnej przebudowie neuronów podczas tworzenia dauer, w tym: arboryzacji dendrytów, przejściu z pojedynczych neuronów dendrytycznych na wielodendrytyczne i przebudowie aksonów12. Przedstawione metody pozwalają na wiarygodne obrazowanie in vivo neuroplastyczności wywołanej stresem w organizmie modelowym. Przedstawione metody produkcji i badania surowego feromonu dauer zostały wcześniej opisane i opracowane na podstawie kilku źródeł4, 8, 15, 16, 17, 18.

<table><tbody><tr><td>N2 C. elegans Bristol szczep</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III</td><td>Na żądanie z laboratorium Schroeder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V</td><td>Na żądanie z laboratorium</td><td></td><td></td>Schroeder</tr><tr><td>JK2868 qIs56[Plag-2:: gfp] V</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petriego szalki Petriego</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Różne</td><td></td><td>3 g NaCl, 17 g agar, 2,5 g pepton w 975 ml H2O autoklawowane schłodzone do 55&deg; C, a następnie 1 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu, 25 ml 1 M buforu KPO4 (pH 6,0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4</td></tr><tr><td>S Media</td><td>Różne</td><td></td><td>podłoża S składają się z roztworu podstawowego S (1,46 g NaCl, 0,25 g K2HPO4, 1,5 g KH2PO4, 0,25 ml 5 mg/ml cholesterolu w etanolu i H2O do 250 ml. Autoklawowane.) Do roztworu podstawowego S dodać 2,5 ml cytrynianu potasu o pH 6,0 (2 g monohydratu kwasu cytrynowego, 29,4 g monohydratu cytrynianu tripotasu, H2O do 100 ml, autoklawowano), 2,5 ml roztworu metali śladowych (1,86 g EDTA disodowego, 0,69 g FeSO4&nbsp; i byka; 7 H2O, 0,2 g MnCl2&bull; 4 H2O, 0,29 g ZnSO4&nbsp; i byka; 7 H2O, 0,025 g CuSO4&nbsp; i byka; 5 H2O, H2O do 1 L. Autoklawizowane i przechowywane w ciemności), 0,75 ml 1 M CaCl2 i 0,75 ml 1 M MgSO4.</td></tr><tr><td>Płytki feromonowe Dauera do oznaczania dawka-odpowiedź</td><td>Różne</td><td></td><td>Mix 0,085 g Szlachetny agar, 0,5 ml 0,513 M NaCl i 5 &mikro; l 5 mg/ml cholesterolu rozpuszczonego w etanolu w każdej z 6 probówek hodowlanych po 15 ml. Dodaj wystarczającą ilość surowego feromonu do każdej probówki, aby uzyskać różne stężenia. Dodać H2O, aby zwiększyć objętość do 4,725 ml.&nbsp; Gotować na palniku Bunsena, aż agar się rozpuści, a następnie ostudzić do 55 stopni C. Dodać 125 &mikro; l 1 M bufor KPO4 (pH 6,0), 50 &mikro; l 0,1 M CaCl2, 50 &mikro; l 0,1 M MgSO4 oraz 50 &mikro; l 5 mg/ml siarczanu streptomycyny do każdej probówki. Wsypać zawartość każdej probówki na szalkę Petriego o średnicy 35 mm. Pozwól agarowi zestalić się w temperaturze pokojowej przez noc (jeśli jest dłuższy, przechowuj w zamkniętym pojemniku, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu).</td></tr><tr><td>Koraliki mikrosferyczne 0,1 mikrona</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>Bufor M9</td><td>Różne</td><td></td><td>Mieszaniny 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 litra. Sterylizacja w autoklawie</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo)obrazowanie specyficznej dla dauera przebudowy neuronów u c. elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Mechanizmy kontrolujące plastyczność fenotypową wywołaną stresem u zwierząt są często skomplikowane i trudne do zbadania in vivo. Klasycznym przykładem plastyczności wywołanej stresem jest stadium dauer C. elegans. Dauery są alternatywnym stadium rozwojowym powstającym w warunkach niskich stężeń pokarmu bakteryjnego i wysokich stężeń feromonu dauer. Dauery wykazują dużą plastyczność rozwojową i behawioralną. Na przykład zestaw czterech neuronów wewnętrznego kwadrantu wargowego (IL2Q) ulega rozległej odwracalnej przebudowie podczas tworzenia dauera. Wykorzystując dobrze znane szlaki środowiskowe regulujące wnikanie dauera, zademonstrowano wcześniej ustaloną metodę produkcji surowego feromonu dauer z płynnych kultur nicieni na dużą skalę. Dzięki tej metodzie stężenie 50 000 - 75 000 nicieni/ml płynnej kultury jest wystarczające do wytworzenia bardzo silnego surowego feromonu dauer. Moc surowych feromonów określa się za pomocą testu biologicznego dawka-odpowiedź. Na koniec opisano metody stosowane do obrazowania poklatkowego in vivo IL2Q podczas tworzenia dauera.

Produkcja surowego feromonu dauer skutkuje otrzymaniem żółtego płynu (Rysunek 1), który jest stabilny zarówno w wysokiej, jak i niskiej temperaturze. Alikwoty surowego feromonu przechowuje się w temperaturze -20 °C bezterminowo, bez wyraźnej utraty aktywności. Po otrzymaniu feromonu pojedynczy bioassay zależności dawka-odpowiedź jest wystarczający do wstępnej oceny mocy. Jednak w większości eksperymentów konieczne jest powtórzenie bioassay 2 - 3 razy i wyciągnięcie średniej z każdego doświadczenia. Repre...

Po ekspozycji na specyficzne stresory środowiskowe, nicień Caenorhabditis elegans przechodzi intensywną plastyczność fenotypową, aby wejść w odporne na stres stadium młodociane. Przedstawiono metody kontrolowanej indukcji i obrazowania neuroplastyczności w okresie dauera.

In vivo (in vivo)Obrazowanie specyficznej dla Dauera przebudowy neuronów u C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie specyficznej dla posagu przebudowy neuronów czuciowych w morskiej elegancji. Osiąga się to poprzez ekstrakcję surowego, ponurego feromonu z płynnej kultury. Drugim krokiem jest zmierzenie siły działania surowego feromonu.Następnie feromon jest używany do wywołania powstawania ponurego uczucia u zwierzęcia, wykazując ekspresję GFP w dwóch neuronach IL. Ostatnim krokiem jest zamontowanie zwierzęcia na szkiełku mikroskopowym podczas etapu DMT i wykonanie obrazowania na żywo w celu pokazania arborycji dendrytów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuroplastyczności, takie jak to, w jaki sposób neurony przebudowują się w odpowiedzi na warunki środowiskowe.Chociaż ta metoda może zapewnić wgląd w przebudowę IL two, może być również stosowana do innych zdarzeń specyficznych dla daer, takich jak przebudowa gardła. Aby rozpocząć tę procedurę, wyhoduj OP 50 e coli z pojedynczej kolonii przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając 100 mililitrami bulionu funtowego przy 200 obr./min. Następnie hoduj N two C elegancji na 15 do 26 centymetrowych szalkach Petriego z agarem NGM osadzonym z 50 mikrolitrami E coli

in-vivo-imaging-of-dauer-specific-neuronal-remodeling-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Opracowano proste urządzenie mikrofluidyczne do obrazowania in vivo bez użycia środków znieczulających dla C. elegans, nienaruszonych larw Drosophila oraz larw rybek danio. Urządzenie wykorzystuje odkształcalną membranę z PDMS do unieruchomienia tych organizmów modelowych w celu wykonania obrazowania poklatkowego licznych procesów, takich jak bicie serca, podział komórkowy i podkomórkowy transport neuronalny. Prezentujemy zastosowanie tego urządzenia i pokazujemy przykłady różnych typów danych...

Proste urządzenia mikrofluidyczne do in vivo Obrazowanie C. elegans, Muszka owocówka oraz danio pręgowany

Źródło: Doser, R., et al. Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Ten film pokazuje obrazowanie in vivo subkomórkowego strumienia wapnia w neuronach brzusznego rdzenia nerwowego transgenicznych szczepów Caenorhabditis elegans. Stosowane są dwa różne wskaźniki wapnia: wskaźnik cytoplazmatyczny w jednym szczepie i wskaźnik mitochondrialny w innym. Neurony obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu monitorowania zmian intensywności fluorescencji w...

Obrazowanie subkomórkowej dynamiki wapnia w neuronach Caenorhabditis elegans

Dzięki małemu, przezroczystemu ciału, dobrze udokumentowanej neuroanatomii i mnóstwu podatnych technik genetycznych i odczynników, C. elegans stanowi idealny organizm modelowy do obrazowania neuronów in vivo przy użyciu stosunkowo prostych, tanich technik. Tutaj opisujemy obrazowanie pojedynczego neuronu u nienaruszonych dorosłych zwierząt przy użyciu genetycznie kodowanych fluorescencyjnych wskaźników wapnia.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia neuronów u C. elegans

Obrazowanie zachowania i aktywności neuronalnej w długich skalach czasowych bez unieruchomienia zwierzęcia jest warunkiem wstępnym do zrozumienia zachowania. Obrazowanie komór mikroprzepływowych z agarozą (AMI) może być wykorzystywane do obrazowania aktywności i zachowania neuronów na wszystkich etapach życia Caenorhabditis elegans.

Mikrokomory agarozowe do długoterminowego obrazowania wapnia Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

Kolce dendrytyczne są ważnymi cechami komórkowymi układu nerwowego. W tym miejscu opisano metody obrazowania na żywo służące do oceny struktury i funkcji kolców dendrytycznych u C. elegans. Podejścia te wspierają rozwój zmutowanych badań przesiewowych dla genów, które definiują kształt lub funkcję kolców dendrytycznych.

Obrazowanie kolców dendrytycznych u Caenorhabditis elegans

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Protokół opisuje prosty mikroprzepływowy układ scalony i metodologię mikroprodukcji używaną do hodowli C. elegans w obecności ciągłego dostarczania pożywienia przez okres do 36 godzin. Urządzenie do wzrostu i obrazowania umożliwia również przerywane, długotrwałe obrazowanie procesów komórkowych i subkomórkowych w wysokiej rozdzielczości podczas rozwoju przez kilka dni.

Prosty chip mikroprzepływowy do długoterminowego wzrostu i obrazowania Caenorhabditis elegans

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Poznaj metodę obrazowania przebudowy neuronów sensorycznych u C. elegans w fazie dauer przy użyciu feromonu i fluorescencji GFP. Technika ta umożliwia badanie neuroplastyczności w czasie rzeczywistym.

In vivo (in vivo)Obrazowanie specyficznej dla Dauera przebudowy neuronów u C. elegans

Przeglądaj więcej filmów