Połączenie sortowania magnetycznego komórek macierzystych i testów fluktuacji w celu analizy niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych u Saccharomyces cerevisiae
16 października 2014
Szybkość mutacji w młodych komórkach Saccharomyces cerevisiae mierzona za pomocą testów fluktuacyjnych służy do przewidywania częstości mutacji dla komórek macierzystych w różnym wieku replikacji. Sortowanie magnetyczne i cytometria przepływowa są następnie wykorzystywane do pomiaru rzeczywistej częstości mutacji i wieku komórek macierzystych w celu zidentyfikowania wszelkich odchyleń od przewidywanych częstości mutacji.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ustalenie, czy zmiany w częstości mutacji ze zwiększoną replikacją. Wiek komórek drożdży jest spowodowany po prostu dodatkowymi rundami podziału komórek lub specyficznymi dla wieku zmianami w tempie akumulacji mutacji. Osiąga się to poprzez pierwszy pomiar częstości i szybkości mutacji w młodych komórkach poprzez rozprowadzenie komórek na selektywnych i nieselektywnych pożywkach w celu obliczenia przewidywanej częstotliwości mutacji dla komórek w rosnącym wieku z powodu akumulacji mutacji z każdą rundą podziału komórki.
Następnie populację komórek drożdży znakuje się biotyną wyhodowaną w płynnej hodowli, a oryginalnie znakowane komórki są odzyskiwane przez sortowanie magnetyczne w celu uzyskania starzejących się komórek macierzystych, które przeszły kilka podziałów komórkowych. Następnie starzejące się komórki macierzyste są albo odrastane, aby zwiększyć ich wiek, a następnie ponownie sortowane lub barwione na blizny pośladkowe, a następnie rozprowadzane na selektywnych i nieselektywnych pożywkach w celu określenia ich średniego wieku replikacyjnego i częstości mutacji, uzyskuje się wyniki, które pokazują, czy występują jakiekolwiek specyficzne dla wieku wzrosty lub spadki akumulacji mutacji w oparciu o porównanie eksperymentalnie zaobserwowanej częstości mutacji z przewidywaną częstością mutacji dla komórek obserwowany średni wiek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się, takie jak to, czy zmiany w tempie narastania uszkodzeń genetycznych przyczyniają się do normalnego starzenia się, czy też zmieniają długość życia skutki różnych czynników genetycznych i środowiskowych, częściowo ze względu na zmiany w tempie mutacji.
Melissa Patterson, doktorantka w moim laboratorium, zademonstruje tę procedurę, aby ustalić podstawowy współczynnik mutacji na pokolenie komórek za pomocą testów fluktuacji dla komórek hodowanych w standardowych warunkach hodowli. Dla każdej kontrpróby kultury rozcieńczyć komórki od jednego do 2000 i rozprowadzić od jednego do czterech mikrolitrów na nieselektywnej pożywce, aby określić jednostki tworzące kolonie na mililitr. Pozostałe komórki należy granulować w temperaturze 2 400 G przez jedną minutę w mikrowirówce i użyć 100 mikrolitrów wody do ich ponownego zawieszenia przed rozprowadzeniem na selektywnej pożywce w celu identyfikacji mutantów.
Po inkubacji płytek w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni, policz kolonie, określ początkową szybkość i częstotliwość mutacji zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym, aby oznaczyć urokliwe CCI biotyną Zacznij od smugowania kultury z bulionu glicerolu na pożywce YPD i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni. Za pomocą sterylnej końcówki pipety przenieś komórki z płytki do co najmniej jednego mililitra wody. Należy pamiętać, że od jednego do półtora centymetra gęsto wyrośniętej części smugi da około 10 do ośmiu komórek.
Użyj hemocytometru, aby określić dokładną gęstość komórek dla każdego szczepu lub stanu leczenia. Użyj pięciomilimolowego zapasu odczynników do biotyny, aby oznaczyć od 10 do ośmiu komórek na punkt pobrań zgodnie ze standardową procedurą producenta. Wykonuj wszystkie etapy wirowania przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po ostatnim umyciu.
Użyj wody, aby zawiesić znakowane komórki do końcowego stężenia od 10 do ośmiu komórek na mililitr, aby sprawdzić żywotność komórek, rozcieńczyć 10 mikrolitrów komórek z 23 mikrolitrami wody i 67 mikrolitrami 0,4% błękitu triamowego w jednym XPBS, inkubować komórki przez 40 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem cytometru hemologicznego do oceny żywych lub niebarwionych i martwych lub barwionych komórek. Po zmierzeniu wartości wyjściowych dla wieku komórki i częstości mutacji, zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś komórki znakowane biotyną do 20 mililitrów pożywki YPD. Udawaj, że masz osiem komórek.
Hoduj kultury przez 16 do 18 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza do około 10 do ośmiu komórek na mililitr. Nie pozwól, aby komórki osiągnęły fazę stacjonarną i jeśli to konieczne, utrzymuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka godzin, aby zoptymalizować czas okresu wzrostu i zbierania. Po określeniu gęstości komórek i granulowaniu komórek w temperaturze czterech stopni Celsjusza, umyj komórki, dodając 30 mililitrów etykietowania kulek, buforowania i wirowania, a następnie odkręć zawiesinę i odlej supernatant.
Po drugim praniu zawieszamy komórki w 50 mikrolitrach bufora do etykietowania perełek. Udawaj, że masz łącznie osiem komórek, wirując. Dodaj dwa mikrolitry kulek magnetycznych, udawaj, że masz łącznie osiem komórek i po krótkim wirowaniu inkubuj na lodzie przez 10 minut, okresowo odwracając.
Następnie użyj 30 mililitrów bufora do etykietowania kulek, aby trzykrotnie umyć komórki. Następnie dodaj 0,5 mililitra bufora do etykietowania perełek. Udawaj, że masz do siebie łącznie osiem komórek i krótko wiruj osad na podłożu, aż komórki zostaną ponownie zawieszone.
Przelej zawiesinę przez sitko o średnicy 40 mikronów do 50-mililitrowej probówki, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki komórek. W razie potrzeby pozostaw komórki na lodzie na jedną do dwóch godzin przed załadowaniem na kolumnę. Postępuj zgodnie z zalecanym przez producenta protokołem dla kolumn magnetycznych, używając do dwóch razy 10 do dziewięciu całkowitych komórek na.
Uważaj, aby usunąć wszelkie elementy wentylacyjne podczas ładowania kolumn oraz wyjmij i wymień kolumnę na separatorze między praniami, aby zapobiec uwięzieniu komórek między kulkami. W przypadku stosowania separatorów wielokolumnowych do przetwarzania wielu kolumn tej samej próbki, należy je wszystkie eluować do tej samej probówki zbiorczej, aby skrócić czas obsługi i w razie potrzeby zmniejszyć utratę komórek. Zachowaj przepływ z etapów wiązania i mycia, aby przeanalizować młode komórki wytwarzane przez komórki macierzyste po zagęszczeniu komórek przez wirowanie w 3000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odessać cały bufor oprócz jednego mililitra.
Udawaj, że masz osiem oryginalnych komórek znakowanych biotyną. Następnie krótko wiruj, aby zawiesić komórki w pozostałym buforze. Użyj błękitu triamowego do wybarwienia podwielokrotności rozcieńczonych komórek i użyj cytometru hemologicznego, aby określić gęstość i żywotność komórek.
Następnie oblicz całkowitą liczbę odzyskanych komórek. Jeśli liczba komórek jest znacznie wyższa niż oczekiwano, przepuść próbkę elucji przez inną kolumnę, aby spróbować usunąć zanieczyszczające młode komórki. Jeśli liczba komórek jest znacznie mniejsza niż oczekiwano, przepuść przez nią zapisany przepływ.
W razie potrzeby należy pobrać próbkę z innej kolumny, aby spróbować poprawić wydajność komórek macierzystych. Odrastanie komórek w celu zwiększenia wieku replikacyjnego i podążanie za etykietowaniem i sortowaniem koralików bez znakowania biotyną. Aby określić wiek replikacyjny, przenieś 25 mikrolitrów odzyskanych komórek do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i użyj jednego mililitra jednego XPBS do dwukrotnego przemycia komórek, aby oznaczyć blizny po pąkach na powierzchni komórek.
Użyj 180 mikrolitrów jednego XPBS i 20 mikrolitrów fluorescencyjnie sprzężonego WGA do ponownego zawieszenia komórek, przykryj 1,5 mililitrową probówkę wirówkową folią i inkubuj z delikatnym kołysaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut po inkubacji. Użyj jednego XPBS, aby umyć ogniwa trzy razy. Następnie do mikroskopii fluorescencyjnej użyj odczynnika Antifa, aby zamontować komórki na szkiełkach, aby uniknąć ruchu komórek podczas obrazowania.
Całkowicie utwardź szkiełka w ciemności przez okres do kilku dni. Policz blizny po pąkach na co najmniej 50 komórkach na próbkę, aby uzyskać reprezentatywną miarę wieku komórek. Alternatywnie, po zawieszeniu komórek w jednym XPBS należy wykonać cytometrię przepływową przy użyciu ustawień opisanych w protokole tekstowym: wykres blizny pąków na młodych komórkach i starzejących się komórkach zliczone pod mikroskopem na osi Y w stosunku do znormalizowanej średniej geometrycznej sprzężonej fluorescencji WGA z tych samych populacji komórek na osi x.
Na koniec uzyskaj równanie liniowej linii trendu dla tej zależności Dla późniejszego podstawienia, znormalizowana średnia geometryczna WGA sprzężona intensywność fluorescencji populacji komórek dla X w równaniu i rozwiąż dla Y, aby określić średni wiek komórki próbki. Ten wykres ilustruje, że szybkość mutacji w genie puszki jednej była podobna przed i po znakowaniu biotyny: W niezależnych populacjach młodych drożdży częstość mutacji była również podobna w młodych komórkach przed i po znakowaniu biotyny, gdy były hodowane w temperaturze 20 stopni Celsjusza lub 30 stopni Celsjusza. Pokazany tutaj wykres pokazuje, co można zaobserwować podczas liczenia odzyskanych komórek po znakowaniu biotyną i sortowaniu komórek niepoddanych działaniu biotyny lub komórek potraktowanych jednym milimolowym nadtlenkiem wodoru po pierwszym sortowaniu.
Liczba komórek może wydawać się wyższa niż oczekiwano po pierwszym sortowaniu, a przy dalszym sortowaniu spodziewana jest niewielka postępująca utrata komórek. Wiek replikacyjny określono przez ręczne liczenie znakowanych fluorescencyjnie, ale blizn na komórkach, jak pokazano tutaj, jak widać na tym rysunku. Fluorescencyjny, ale bliznowaty sygnał z cytometrii przepływowej porównano z ręcznym zliczaniem w celu uzyskania liniowej zależności, która umożliwia określenie replikacyjnego wieku populacji komórek macierzystych i kontrolnych za pomocą cytometrii przepływowej.
Wykresy te pokazują przykłady podobnych lub podwyższonych obserwowanych częstości mutacji w starzejących się komórkach macierzystych w porównaniu z przewidywanymi częstościami obliczonymi na podstawie średniego wieku komórek macierzystych oraz częstości i częstości mutacji uzyskanych dla populacji młodych komórek. W zależności od lokalizacji genomowej może jeden gen Po tej procedurze. Można zastosować inne metody, takie jak barwienie reaktywnych form tlenu lub morfologii ularnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zmiany w fizjologii komórki związane z zmianami w akumulacji mutacji związanymi z wiekiem.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje częstość mutacji w młodych komórkach Saccharomyces cerevisiae oraz sposób, w jaki częstotliwości te zmieniają się wraz z wiekiem replikacyjnym komórek macierzystych. Wykorzystując testy fluktuacyjne, sortowanie magnetyczne i cytometrię przepływową, badanie ma na celu porównanie przewidywanych częstości mutacji z rzeczywistymi pomiarami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Biologia komórki
- Badania nad starzeniem
Wprowadzenie
- Szybkość mutacji może wpływać na starzenie się i funkcje komórkowe.
- Zrozumienie kumulacji mutacji jest kluczowe dla uzyskania wiedzy na temat procesów starzenia.
- Drożdże służą jako organizm modelowy do badania mutacji genetycznych.
- Testy fluktuacyjne stanowią metodę szacowania częstości mutacji.
Cel badania
- Aby ustalić, czy zmiany częstości mutacji wynikają z podziałów komórkowych czy z akumulacji mutacji specyficznej dla wieku.
- Aby wyznaczyć podstawową częstość mutacji dla młodych komórek drożdży.
- Aby porównać przewidywane i zaobserwowane częstości mutacji w starszych komórkach matecznych.
Zastosowane metody
- Testy fluktuacyjne w celu pomiaru częstotliwości mutacji w młodych komórkach.
- Sortowanie magnetyczne w celu izolacji starszych komórek macierzystych.
- Cytometria przepływowa w celu oceny wieku komórek i częstotliwości mutacji.
- Liczenie kolonii na podłożach selektywnych i nieselektywnych w celu określenia częstotliwości mutacji.
Główne wyniki
- Zaobserwowane częstotliwości mutacji porównano z wartościami przewidywanymi.
- Zidentyfikowano zależne od wieku zmiany w tempie mutacji.
- Zastosowana metodologia skutecznie odróżniła komórki młode od starych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia uszkodzeń genetycznych w procesie starzenia.
Wnioski
- Akumulacja mutacji jest zależna od wieku replikacyjnego komórek drożdży.
- Zmiany w tempie mutacji mogą przyczyniać się do procesu starzenia.
- Badanie to stanowi podstawę dla przyszłych analiz w zakresie starzenia i genetyki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia działom B&R w sektorze biofarmaceutycznym kwantyfikację zmian w akumulacji mutacji związanych z wiekiem, wykorzystując drożdże jako model istotny z punktu widzenia patologii do mechanistycznego ograniczania ryzyka w badaniach nad mechanizmami niestabilności genomicznej. Dzięki połączeniu sortowania magnetycznego komórek macierzystych z testami fluktuacyjnymi, metoda ta zapewnia wiarygodność prognostyczną w rozróżnianiu akumulacji mutacji zależnej od replikacji od procesów mutacyjnych specyficznych dla wieku, co wspiera walidację celów w szlakach związanych ze starzeniem się. Podejście to dostarcza ilościowych, powtarzalnych pomiarów, które pomagają w wyborze modeli przedklinicznych oraz w odkrywaniu biomarkerów translacyjnych dla interwencji w zakresie stabilności genomu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących tego, czy zwiększone obciążenie mutacyjne wraz z wiekiem wynika z dodatkowych podziałów komórkowych, czy ze zmienionych szybkości mutagenezy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wielkoskalową izolację starych komórek macierzystych za pomocą sortowania magnetycznego, co pozwala pokonać ograniczenia tradycyjnej mikromanipulacji w wykrywaniu rzadkich zdarzeń.
- Wartość prognostyczna: Wykorzystuje dane z testu fluktuacji dla młodych komórek do przewidywania częstotliwości mutacji, co pozwala ocenić, czy obserwowane zmiany odzwierciedlają rzeczywistą, specyficzną dla wieku mutagenezę.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymywanie standaryzowanych, powtarzalnych populacji komórek macierzystych o określonym wieku replikacyjnym do późniejszego przesiewania fenotypowego.
- Wynik ilościowy: Generuje dane dotyczące częstotliwości mutacji poprzez testy fluktuacyjne, umożliwiając analizę zależności dawka-odpowiedź lub perturbacji genetycznych w modelach starzenia.
- Skalowalność: Sortowanie magnetyczne pozwala na odzyskanie wystarczającej liczby komórek dla zapewnienia mocy statystycznej w testach fluktuacyjnych, co wspiera powtarzalność analizy w różnych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Wykorzystanie S. cerevisiae jako konserwowanego modelu do badania mechanizmów odpowiedzi na uszkodzenia DNA, które można przenieść na proces starzenia się ludzi oraz predyspozycje nowotworowe.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Rozróżnienie między pasywną akumulacją mutacji a aktywną, zależną od wieku mutogenezą, co pozwala na właściwy dobór celów w obrębie szlaków stabilności genomu.
- Ciągłość translacyjna: Powiązanie wieku replikacyjnego (poprzez ilościowe określanie blizn po pączkowaniu) z funkcjonalnymi odczytami mutogenezy, co wspiera przedkliniczną walidację zgodną z biomarkerami.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w etapy od wczesnego odkrywania do procesów przedklinicznych, dostarczając genetycznie podatny system do oceny wpływu starzenia się na tempo mutacji, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac nad celami w zakresie naprawy DNA, regulacji chromatyny lub wierności mitozy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących tego, czy szlaki długowieczności wpływają na mutagenezę niezależnie od historii replikacji.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki częstości mutacji do przesiewania bibliotek związków lub bibliotek genetycznych w komórkach o różnym wieku.
- Analityka: Tempo mutacji pochodzące z testu fluktuacyjnego umożliwia statystyczne porównanie warunków, pomagając zespołom priorytetyzować wyniki o efektach specyficznych dla wieku.
- Badania translacyjne: Łączy replikacyjne starzenie się drożdży z konserwatywnymi mechanizmami mutagenezy, wspierając ekstrapolację na przedkliniczne modele ssaków.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Sortowanie magnetyczne i testy fluktuacyjne tworzą modularną platformę możliwą do zastosowania w badaniach nad nokautem genów, stresem środowiskowym lub działaniem związków w procesach starzenia.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad starzeniem poprzez oddzielenie akumulacji mutacji zależnej od replikacji od mutacji specyficznych dla wieku.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację komórek macierzystych oraz kwantyfikację wieku, co poprawia powtarzalność między laboratoriami i seriami eksperymentalnymi.
- Wartość strategiczna: Umożliwia efektywne kosztowo ustalanie priorytetów dla celów terapeutycznych poprzez weryfikację, czy związki przeciwstarzeniowe wpływają na mutagenezę poza efektami proliferacyjnymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój celów związanych ze stabilnością genomu w oparciu o dowody mechanistyczne dotyczące związanych z wiekiem przesunięć mutacyjnych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu genetyki drożdży, magnetycznego sortowania komórek oraz metodologii testu fluktuacyjnego.
- Metoda jest zależna od infrastruktury cytometrii przepływowej lub mikroskopii w celu ilościowego określenia wieku na podstawie blizn pączkowania.
- Konieczna jest standaryzacja znakowania biotyną oraz separacji za pomocą kulek magnetycznych, aby zminimalizować zanieczyszczenie młodymi komórkami.
- Adaptacja do systemów innych niż drożdżowe może wymagać alternatywnych strategii znakowania powierzchniowego i detekcji starzenia.
- Ograniczeniem jest konieczność wykluczenia fazy stacjonarnej i utrzymania wzrostu logarytmicznego w celu dokładnego sortowania według wieku.
