Połączenie sortowania magnetycznego komórek macierzystych i testów fluktuacji w celu analizy niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych u Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ustalenie, czy zmiany w częstości mutacji ze zwiększoną replikacją. Wiek komórek drożdży jest spowodowany po prostu dodatkowymi rundami podziału komórek lub specyficznymi dla wieku zmianami w tempie akumulacji mutacji. Osiąga się to poprzez pierwszy pomiar częstości i szybkości mutacji w młodych komórkach poprzez rozprowadzenie komórek na selektywnych i nieselektywnych pożywkach w celu obliczenia przewidywanej częstotliwości mutacji dla komórek w rosnącym wieku z powodu akumulacji mutacji z każdą rundą podziału komórki.

Następnie populację komórek drożdży znakuje się biotyną wyhodowaną w płynnej hodowli, a oryginalnie znakowane komórki są odzyskiwane przez sortowanie magnetyczne w celu uzyskania starzejących się komórek macierzystych, które przeszły kilka podziałów komórkowych. Następnie starzejące się komórki macierzyste są albo odrastane, aby zwiększyć ich wiek, a następnie ponownie sortowane lub barwione na blizny pośladkowe, a następnie rozprowadzane na selektywnych i nieselektywnych pożywkach w celu określenia ich średniego wieku replikacyjnego i częstości mutacji, uzyskuje się wyniki, które pokazują, czy występują jakiekolwiek specyficzne dla wieku wzrosty lub spadki akumulacji mutacji w oparciu o porównanie eksperymentalnie zaobserwowanej częstości mutacji z przewidywaną częstością mutacji dla komórek obserwowany średni wiek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie starzenia się, takie jak to, czy zmiany w tempie narastania uszkodzeń genetycznych przyczyniają się do normalnego starzenia się, czy też zmieniają długość życia skutki różnych czynników genetycznych i środowiskowych, częściowo ze względu na zmiany w tempie mutacji.

Melissa Patterson, doktorantka w moim laboratorium, zademonstruje tę procedurę, aby ustalić podstawowy współczynnik mutacji na pokolenie komórek za pomocą testów fluktuacji dla komórek hodowanych w standardowych warunkach hodowli. Dla każdej kontrpróby kultury rozcieńczyć komórki od jednego do 2000 i rozprowadzić od jednego do czterech mikrolitrów na nieselektywnej pożywce, aby określić jednostki tworzące kolonie na mililitr. Pozostałe komórki należy granulować w temperaturze 2 400 G przez jedną minutę w mikrowirówce i użyć 100 mikrolitrów wody do ich ponownego zawieszenia przed rozprowadzeniem na selektywnej pożywce w celu identyfikacji mutantów.

Po inkubacji płytek w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni, policz kolonie, określ początkową szybkość i częstotliwość mutacji zgodnie z dołączonym protokołem tekstowym, aby oznaczyć urokliwe CCI biotyną Zacznij od smugowania kultury z bulionu glicerolu na pożywce YPD i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni. Za pomocą sterylnej końcówki pipety przenieś komórki z płytki do co najmniej jednego mililitra wody. Należy pamiętać, że od jednego do półtora centymetra gęsto wyrośniętej części smugi da około 10 do ośmiu komórek.

Użyj hemocytometru, aby określić dokładną gęstość komórek dla każdego szczepu lub stanu leczenia. Użyj pięciomilimolowego zapasu odczynników do biotyny, aby oznaczyć od 10 do ośmiu komórek na punkt pobrań zgodnie ze standardową procedurą producenta. Wykonuj wszystkie etapy wirowania przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza po ostatnim umyciu.

Użyj wody, aby zawiesić znakowane komórki do końcowego stężenia od 10 do ośmiu komórek na mililitr, aby sprawdzić żywotność komórek, rozcieńczyć 10 mikrolitrów komórek z 23 mikrolitrami wody i 67 mikrolitrami 0,4% błękitu triamowego w jednym XPBS, inkubować komórki przez 40 minut w temperaturze pokojowej przed użyciem cytometru hemologicznego do oceny żywych lub niebarwionych i martwych lub barwionych komórek. Po zmierzeniu wartości wyjściowych dla wieku komórki i częstości mutacji, zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś komórki znakowane biotyną do 20 mililitrów pożywki YPD. Udawaj, że masz osiem komórek.

Hoduj kultury przez 16 do 18 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza do około 10 do ośmiu komórek na mililitr. Nie pozwól, aby komórki osiągnęły fazę stacjonarną i jeśli to konieczne, utrzymuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka godzin, aby zoptymalizować czas okresu wzrostu i zbierania. Po określeniu gęstości komórek i granulowaniu komórek w temperaturze czterech stopni Celsjusza, umyj komórki, dodając 30 mililitrów etykietowania kulek, buforowania i wirowania, a następnie odkręć zawiesinę i odlej supernatant.

Po drugim praniu zawieszamy komórki w 50 mikrolitrach bufora do etykietowania perełek. Udawaj, że masz łącznie osiem komórek, wirując. Dodaj dwa mikrolitry kulek magnetycznych, udawaj, że masz łącznie osiem komórek i po krótkim wirowaniu inkubuj na lodzie przez 10 minut, okresowo odwracając.

Następnie użyj 30 mililitrów bufora do etykietowania kulek, aby trzykrotnie umyć komórki. Następnie dodaj 0,5 mililitra bufora do etykietowania perełek. Udawaj, że masz do siebie łącznie osiem komórek i krótko wiruj osad na podłożu, aż komórki zostaną ponownie zawieszone.

Przelej zawiesinę przez sitko o średnicy 40 mikronów do 50-mililitrowej probówki, aby usunąć wszelkie pozostałe grudki komórek. W razie potrzeby pozostaw komórki na lodzie na jedną do dwóch godzin przed załadowaniem na kolumnę. Postępuj zgodnie z zalecanym przez producenta protokołem dla kolumn magnetycznych, używając do dwóch razy 10 do dziewięciu całkowitych komórek na.

Uważaj, aby usunąć wszelkie elementy wentylacyjne podczas ładowania kolumn oraz wyjmij i wymień kolumnę na separatorze między praniami, aby zapobiec uwięzieniu komórek między kulkami. W przypadku stosowania separatorów wielokolumnowych do przetwarzania wielu kolumn tej samej próbki, należy je wszystkie eluować do tej samej probówki zbiorczej, aby skrócić czas obsługi i w razie potrzeby zmniejszyć utratę komórek. Zachowaj przepływ z etapów wiązania i mycia, aby przeanalizować młode komórki wytwarzane przez komórki macierzyste po zagęszczeniu komórek przez wirowanie w 3000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odessać cały bufor oprócz jednego mililitra.

Udawaj, że masz osiem oryginalnych komórek znakowanych biotyną. Następnie krótko wiruj, aby zawiesić komórki w pozostałym buforze. Użyj błękitu triamowego do wybarwienia podwielokrotności rozcieńczonych komórek i użyj cytometru hemologicznego, aby określić gęstość i żywotność komórek.

Następnie oblicz całkowitą liczbę odzyskanych komórek. Jeśli liczba komórek jest znacznie wyższa niż oczekiwano, przepuść próbkę elucji przez inną kolumnę, aby spróbować usunąć zanieczyszczające młode komórki. Jeśli liczba komórek jest znacznie mniejsza niż oczekiwano, przepuść przez nią zapisany przepływ.

W razie potrzeby należy pobrać próbkę z innej kolumny, aby spróbować poprawić wydajność komórek macierzystych. Odrastanie komórek w celu zwiększenia wieku replikacyjnego i podążanie za etykietowaniem i sortowaniem koralików bez znakowania biotyną. Aby określić wiek replikacyjny, przenieś 25 mikrolitrów odzyskanych komórek do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej i użyj jednego mililitra jednego XPBS do dwukrotnego przemycia komórek, aby oznaczyć blizny po pąkach na powierzchni komórek.

Użyj 180 mikrolitrów jednego XPBS i 20 mikrolitrów fluorescencyjnie sprzężonego WGA do ponownego zawieszenia komórek, przykryj 1,5 mililitrową probówkę wirówkową folią i inkubuj z delikatnym kołysaniem w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut po inkubacji. Użyj jednego XPBS, aby umyć ogniwa trzy razy. Następnie do mikroskopii fluorescencyjnej użyj odczynnika Antifa, aby zamontować komórki na szkiełkach, aby uniknąć ruchu komórek podczas obrazowania.

Całkowicie utwardź szkiełka w ciemności przez okres do kilku dni. Policz blizny po pąkach na co najmniej 50 komórkach na próbkę, aby uzyskać reprezentatywną miarę wieku komórek. Alternatywnie, po zawieszeniu komórek w jednym XPBS należy wykonać cytometrię przepływową przy użyciu ustawień opisanych w protokole tekstowym: wykres blizny pąków na młodych komórkach i starzejących się komórkach zliczone pod mikroskopem na osi Y w stosunku do znormalizowanej średniej geometrycznej sprzężonej fluorescencji WGA z tych samych populacji komórek na osi x.

Na koniec uzyskaj równanie liniowej linii trendu dla tej zależności Dla późniejszego podstawienia, znormalizowana średnia geometryczna WGA sprzężona intensywność fluorescencji populacji komórek dla X w równaniu i rozwiąż dla Y, aby określić średni wiek komórki próbki. Ten wykres ilustruje, że szybkość mutacji w genie puszki jednej była podobna przed i po znakowaniu biotyny: W niezależnych populacjach młodych drożdży częstość mutacji była również podobna w młodych komórkach przed i po znakowaniu biotyny, gdy były hodowane w temperaturze 20 stopni Celsjusza lub 30 stopni Celsjusza. Pokazany tutaj wykres pokazuje, co można zaobserwować podczas liczenia odzyskanych komórek po znakowaniu biotyną i sortowaniu komórek niepoddanych działaniu biotyny lub komórek potraktowanych jednym milimolowym nadtlenkiem wodoru po pierwszym sortowaniu.

Liczba komórek może wydawać się wyższa niż oczekiwano po pierwszym sortowaniu, a przy dalszym sortowaniu spodziewana jest niewielka postępująca utrata komórek. Wiek replikacyjny określono przez ręczne liczenie znakowanych fluorescencyjnie, ale blizn na komórkach, jak pokazano tutaj, jak widać na tym rysunku. Fluorescencyjny, ale bliznowaty sygnał z cytometrii przepływowej porównano z ręcznym zliczaniem w celu uzyskania liniowej zależności, która umożliwia określenie replikacyjnego wieku populacji komórek macierzystych i kontrolnych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykresy te pokazują przykłady podobnych lub podwyższonych obserwowanych częstości mutacji w starzejących się komórkach macierzystych w porównaniu z przewidywanymi częstościami obliczonymi na podstawie średniego wieku komórek macierzystych oraz częstości i częstości mutacji uzyskanych dla populacji młodych komórek. W zależności od lokalizacji genomowej może jeden gen Po tej procedurze. Można zastosować inne metody, takie jak barwienie reaktywnych form tlenu lub morfologii ularnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zmiany w fizjologii komórki związane z zmianami w akumulacji mutacji związanymi z wiekiem.