Name: Nowa metoda podawania leków wielu danio pręgowanemu (Danio rerio) i kwantyfikacja odstawienia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj nową metodę podawania etanolu grupom danio pręgowanego (Danio rerio) w badaniach zachowań odstawiennych. Technika umożliwia precyzyjne dawkowanie i analizę lęku za pomocą testu jasno-ciemno.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wszystkie procedury i testy behawioralne zostały zatwierdzone przez Radę Etyki Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu MacEwan na podstawie protokołu o numerze 06-11-12, który jest zgodny z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych.
1. Przygotuj zbiorniki dozujące, roztwory i harmonogram podawania
<ol>
	<li>Należy przygotować harmonogram podawania w taki sposób, aby zwierzętom podawano dawkę w tym samym środowisku i o tej samej porze dnia, aby uniknąć zakłóceń czasowych lub stronniczości w stosunku do bodźców wzrokowych.</li>
	<li>Zdobądź tyle identycznych, przezroczystych polipropylenowych zbiorników tarłowych o pojemności 1,5 l, ile jest konieczne dla liczby wielkości grup. Używaj grup po 8 ryb w zbiorniku, co pozwala na badanie 2 grup ryb dziennie w dalszej części procedury (patrz krok 3). Użyj jednego zbiornika retencyjnego i jednego zbiornika dozującego na grupę (2x całkowita liczba grup).
	<ol>
		<li>Umieść wkładki tarłowe o średnicy 400 μm we wszystkich zbiornikach retencyjnych. Napełnij zbiorniki wodą siedliskową lub wodą z odwróconej osmozy o odpowiedniej temperaturze (dla danio pręgowanego 25-28 °C), która jest zgodna z temperaturą, w której ryby są zwykle trzymane. 
		UWAGA: Mogą wystąpić niepożądane interakcje chemiczne między niektórymi lekami a składnikami chemicznymi buforowanej wody siedliskowej. W takiej sytuacji należy użyć wody z odwróconej osmozy buforowanej minimalną ilością soli akwariowych lub bez soli akwariowych do podawania leków, a także dla grup kontrolnych.</li>
		<li>Upewnij się, że zbiorniki znajdują się w neutralnym środowisku, aby uniknąć kondycjonowania ryb na zewnętrzne bodźce wizualne podczas dawkowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwór leku. Wymieszaj odpowiednią ilość leku z wodą siedliskową w zbiornikach tarłowych. Przygotować 0,2% roztwór etanolu, łącząc 3 ml etanolu wysokiej jakości (95% etanolu nieskażonego) z 1,497 ml wody. Przygotować 1,4% roztwór etanolu, łącząc 21 ml etanolu z 1,479 ml wody.</li>
</ol>
2. Procedura podawania siatek dla ryb i etanolu
<ol>
	<li>Ostrożnie wyjąć ryby ze zbiorników siedliskowych i przenieść je do odpowiedniego zbiornika retencyjnego zawierającego wkładkę tarłową. Najlepiej umieścić ryby we wkładzie tarłowym, aby całkowicie wyeliminować siatkę.</li>
	<li>Gdy wszystkie ryby znajdują się w odpowiednich zbiornikach, delikatnie wyjmij wkładkę tarłową ze zbiornika retencyjnego i umieść ją w odpowiednim zbiorniku z roztworem leku (Rysunek 1A).
	<ol>
		<li>Zapisz czas dozowania zgodnie z wymaganiami. Użyj 30 minut w roztworze etanolu do opisanej tutaj procedury.</li>
		<li>Jeśli to możliwe, poproś asystentów o pomoc w przenoszeniu wszystkich grup eksperymentalnych do roztworu leku jednocześnie, aby zapewnić precyzyjny czas dawkowania. Alternatywnie, należy przenosić jedną grupę na raz i śledzić czasy dawkowania poszczególnych grup (Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod koniec wymaganego okresu dawkowania wyjąć ryby z roztworu etanolu, ostrożnie wyjmując wkładkę tarłową z roztworu leku i delikatnie umieszczając ją z powrotem w zbiorniku retencyjnym.</li>
	<li>Delikatnie ułóż ryby w sieci w zbiornikach przetrzymywanych i umieść je z powrotem w ich siedliskach do następnego zaplanowanego czasu dawkowania lub umieść wkładkę tarłową z powrotem w zbiorniku retencyjnym, aby wyeliminować siatkę.</li>
	<li>Jak wspomniano wcześniej, jeśli to możliwe, w ramach parametrów wyposażenia pomieszczeń dla zwierząt, zwierzęta powinny być trzymane w tym samym zbiorniku i wkładce tarłowej, które są używane jako zbiornik trzymany. Pozwoli to całkowicie wyeliminować kompensowanie podczas procedury administracyjnej.</li>
</ol>
3. Testy behawioralne
<ol>
	<li>Uzyskaj jasną/ciemną arenę o szerokości 9,5 cm, długości 55 cm i głębokości 9,5 cm z białą wodoodporną podłogą (Rysunek 1B). Przymocuj biały i wodoodporny papier nieodblaskowy do wewnętrznych ścian areny za pomocą rzepów, tak aby połowa areny była pokryta na biało, a połowa na czarno. Napełnij arenę do głębokości 5 cm wodą z siedliska o temperaturze 25-28 °C. Utrzymuj tę temperaturę przez cały czas trwania testów.</li>
	<li>Zminimalizuj zewnętrzne bodźce wzrokowe, konstruując białą trójstronną obudowę, w której ma być usytuowana arena. Upewnij się, że obszar testowy ma rozproszone oświetlenie górne, które nie powoduje odbić na powierzchni wody, a jednocześnie jest wystarczająco jasne dla oprogramowania do śledzenia ruchu lub ręcznej kwantyfikacji post-hoc na podstawie obrazów wideo.</li>
	<li>Umieść arenę w obudowie i ustaw parametry nagrywania i analizy ruchu w oprogramowaniu do śledzenia zachowań. Ustaw czas trwania próby na 5-15 minut, w zależności od pytania badawczego. 
	UWAGA: Tutaj wykorzystaliśmy 5 min.</li>
	<li>Przetransportuj grupę ryb, które mają być badane, na obszar badawczy w zbiorniku siedliskowym i umieść je poza ogrodzeniem areny. Aklimatyzować ryby przez 10 minut.</li>
	<li>Delikatnie złap rybę z odpowiedniej grupy i umieść ją na środku jasnej/ciemnej areny, pamiętając, aby wypuścić rybę, gdy jest ustawiona równolegle do długiej osi areny, aby uniknąć odchylenia ryby do jasnej lub ciemnej strefy.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie zachowania natychmiast po wypuszczeniu zwierzęcia. Uważaj na wszelkie problemy z oprogramowaniem podczas śledzenia ryb lub skakanie lub zawieszanie się ryb. Obróć arenę o 180° po przetestowaniu połowy badanych, aby zapobiec wszelkim zakłóceniom wynikającym z uprzedzeń wynikających z tego, który koniec areny jest zorientowany w kierunku otwartego końca obudowy.</li>
	<li>Po zakończeniu próby delikatnie zasiać siatkę i przenieść rybę z areny do zbiornika retencyjnego lub zbiornika siedliskowego.</li>
</ol>
4. Analiza
<ol>
	<li>Zbadaj czas spędzony w jasnych i ciemnych strefach. Dla każdej grupy i każdej ryby uzyskaj względny czas spędzony w jasnych i ciemnych strefach i przeanalizuj za pomocą testu t dla jednej próbki (lub testu rang podpisanego Wilcoxona dla danych nieparametrycznych; różnica od (połowa całkowitego czasu próby) 150 sekund), aby określić, czy grupy znacząco preferują jeden obszar nad drugim.</li>
	<li>Aby porównać preferencje, oblicz indeks preferencji, odejmując czas spędzony w jasnej strefie od czasu spędzonego w ciemnej strefie i porównaj różnice między grupami. Testy t mogą być używane do porównywania dwóch grup. Porównaj wiele grup za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji, wykorzystując test post hoc HSD Tukeya, jeśli to konieczne (lub test Kruskala-Wallisa z testem post hoc wielokrotnego porównania Dunna dla danych nieparametrycznych).</li>
	<li>Porównaj prędkość, liczbę przejść stref, meandrowanie i bezruch w grupach. W razie potrzeby należy użyć jednokierunkowej analizy wariancji z wykorzystaniem testu post hoc HSD Tukeya (lub testu Kruskala-Wallisa z testem post hoc Dunna z wielokrotnym porównaniem dla danych nieparametrycznych).</li>
</ol>

<ol><li>Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+and+ecology+of+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.</a> Biological Reviews. 83 (1), 13-34 (2008).</li>
<li>Langheinrich, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+new+model+on+the+pharmaceutical+catwalk%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A new model on the pharmaceutical catwalk.</a> BioEssays. 25 (9), 904-912 (2003).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
<li>Miller, N., Greene, K., Dydinski, A., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nicotine+and+alcohol+on+zebrafish+%28+Danio+rerio%29+shoaling%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Effects of nicotine and alcohol on zebrafish ( Danio rerio) shoaling.</a> Behavioural brain research. , (2012).</li>
<li>Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buspirone%2C+chlordiazepoxide+and+diazepam+effects+in+a+zebrafish+model+of+anxiety%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Buspirone, chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 94 (1), 75-80 (2009).</li>
<li>Holcombe, A., Howorko, A., Powell, R. A., Schalomon, M., Hamilton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed+Scototaxis+during+Withdrawal+after+Daily-Moderate%2C+but+Not+Weekly-Binge+Administration+of+Ethanol+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Reversed Scototaxis during Withdrawal after Daily-Moderate, but Not Weekly-Binge Administration of Ethanol in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 8 (5), (2013).</li>
<li>Mathur, P., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+of+acute+versus+chronic+ethanol+exposure+on+anxiety-like+behavioral+responses+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Differences of acute versus chronic ethanol exposure on anxiety-like behavioral responses in zebrafish.</a> Behavioural Brain Research. 219 (2), 234-239 (2011).</li>
<li>Dlugos, C., Rabin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+effects+on+three+strains+of+zebrafish%3A+model+system+for+genetic+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Ethanol effects on three strains of zebrafish: model system for genetic investigations.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. , (2003).</li>
<li>Maximino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scototaxis+as+anxiety-like+behavior+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Scototaxis as anxiety-like behavior in fish.</a> Nature Protocols. 5 (2), 209-216 (2010).</li>
<li>Gerlai, R., Lee, V., Blaser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+and+chronic+ethanol+exposure+on+the+behavior+of+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of acute and chronic ethanol exposure on the behavior of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 85 (4), 752-761 (2006).</li>
<li>Egan, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+behavioral+and+physiological+phenotypes+of+stress+and+anxiety+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish.</a> Behavioural brain research. 205 (1), 38-44 (2009).</li>
<li>Gebauer, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anxiolytics+in+zebrafish%3A+Similarities+and+differences+between+benzodiazepines%2C+buspirone+and+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Effects of anxiolytics in zebrafish: Similarities and differences between benzodiazepines, buspirone and ethanol.</a> Pharmacology Biochemistry and Behavior. 99 (3), 480-486 (2011).</li>
<li>Serra, M. C., Mattioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+preference+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+for+a+dark+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Braz+J+Med+Biol+Res%22%5BJournal%5D)">Natural preference of zebrafish (Danio rerio) for a dark environment.</a> Braz J Med Biol Res. 32 (12), 1551-1553 (1999).</li>
<li>Maximino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+neurochemical+changes+in+the+zebrafish+leopard+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Brain+Behav%22%5BJournal%5D)">Behavioral and neurochemical changes in the zebrafish leopard strain.</a> Genes Brain Behav. 12 (5), 576-582 (2013).</li>
<li>Levin, E. D., Bencan, Z., Cerutti, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anxiolytic+effects+of+nicotine+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Anxiolytic effects of nicotine in zebrafish.</a> Physiology & Behavior. 90 (1), 54-58 (2007).</li>
<li>Gerlai, R., Chatterjee, D., Pereira, T., Sawashima, T., Krishnannair, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+alcohol+dose%3A+population+differences+in+behavior+and+neurochemistry+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic alcohol dose: population differences in behavior and neurochemistry of zebrafish.</a> Genes, Brain and Behavior. 8 (6), 586-599 (2009).</li>
<li>Mathur, P., Berberoglu, M. A., Guo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+ethanol+in+zebrafish+following+a+single+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Preference for ethanol in zebrafish following a single exposure.</a> Behavioural Brain Research. 217 (1), 128-133 (2011).</li>
<li>Renninger, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+genetics+of+visual+processing%2C+function+and+behaviour+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Investigating the genetics of visual processing, function and behaviour in zebrafish.</a> Neurogenetics. 12, 97-116 (2011).</li>
<li>Crawshaw, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+withdrawal+in+goldfish+exposed+to+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Tolerance and withdrawal in goldfish exposed to ethanol.</a> Physiology & Behaviour. 87 (3), 460-468 (2006).</li>
<li>Hamilton, T. J., Holcombe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tresguerres%2C+M.CO2-induced+ocean+acidification+increases+anxiety+in+rockfish+via+alteration+of+GABAA+receptor+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Tresguerres, M.CO2-induced ocean acidification increases anxiety in rockfish via alteration of GABAA receptor functioning.</a> Proceedings of the Royal Society B. , (2014).</li>
<li>Ramsay, J. M., Feist, G. W., Varga, Z. M., Westerfield, M., Kent, M. L., Schreck, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+cortisol+response+of+zebrafish+to+acute+net+handling+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Whole-body cortisol response of zebrafish to acute net handling stress.</a> Aquaculture. 297 (1-4), 157-164 (2009).</li>
<li>Hamilton, T. J., Paz-Yepes, J., Morrison, R. A., Palenik, B., Tresguerres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+bloom-like+concentrations+of+two+marine+Synechococcus+cyanobacteria+%28strains+CC9311+and+CC9902%29+differentially+alters+fish+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exposure to bloom-like concentrations of two marine Synechococcus cyanobacteria (strains CC9311 and CC9902) differentially alters fish behaviour.</a> Conservation Physiology. 2 (1), (2014).</li>
</ol>

Autorzy dziękują Joshui Gallupowi za korzystanie z jego sprzętu fotograficznego użytego na rysunku 1. Prace te były wspierane przez grant Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada Discovery (dla T.J.H.).

Wcześniejsze badania dotyczące podawania leków danio pręgowanemu polegały po prostu na siatce ryb w celu przetransportowania ich z ich domowego zbiornika do roztworu leku12,16. Zakładanie sieci nie zawsze jest spójne i często trwa dłużej niż oczekiwano ze względu na reakcję ucieczki danio pręgowanego, który charakteryzuje się znaczną zmiennością osobniczą. Tradycyjne metody przenoszenia, choć przydatne, można ulepszyć, zmniejszając całkowity czas spędzany przez ryby poza wodą, a także zmniejszając zmienność cz...

Danio rerio (Danio rerio) to mały gatunek teleost pochodzący z Indii, który jest użytecznym organizmem modelowym do badań behawioralnych1 i medycznych2,3. Danio pręgowany jest również powszechnie stosowany w testowaniu różnych substancji farmakologicznych w celu scharakteryzowania ich wpływu na zachowanie. Do zbadania zachowania danio pręgowanego po podaniu związków takich jak stymulanty4, przeciwlękowe5 i etanol6-8 zastosowano różne dawki i schematy podawania leków.
Nasze laboratorium zbadało wpływ różnych schematów podawania etanolu na lęk i lokomocję danio pręgowanego w dobrze zweryfikowanym teście światło/ciemność 9,20, powszechnie nazywanym również testem scototaksyjnym. Opracowano nową metodę podawania etanolu w celu zwiększenia skuteczności w przypadku powtarzalnego, codziennego podawania przez długi okres czasu (21 dni)6. Wcześniej stosowane metody były praktyczne, jednak staraliśmy się opracować metodę, która ograniczyłaby stosowanie sieci i związane z tym koszty czasowe i umożliwiła jednoczesne, precyzyjnie określone w czasie podawanie interesującego leku dużej liczbie ryb. W tradycyjnych badaniach z użyciem etanolu danio pręgowany jest sadzany w sieć i przenoszony z jednego zbiornika do drugiego zawierającego odpowiednią mieszaninę etanolu i wody10-12. Chociaż metoda ta jest powszechnie akceptowana, chwytanie sieciami danio pręgowanego może zwiększyć zmienność czasu potrzebnego do wprowadzenia i usunięcia ryby z roztworu leku. W związku z tym dokładna ekspozycja na związek będący przedmiotem zainteresowania może się różnić w trakcie eksperymentu obejmującego wielokrotne dawkowanie. Pożądana jest zatem metoda, która ogranicza źródła błędów wynikające ze zmienności czasu transportu. Dzięki naszej metodzie jesteśmy w stanie przemieścić wszystkie ryby jednocześnie, co skutkuje identycznym czasem dozowania każdej ryby. Po ekspozycji na etanol (opisanej tutaj) danio pręgowany może być testowany w dowolnej liczbie testów behawioralnych, w tym tych, które oceniają lęk. Dozowanie grup ryb przy użyciu nowej metody ma praktyczne zastosowania wykraczające poza możliwość dokładnego odtworzenia i standaryzacji dawkowania między osobami badanymi i między grupami ryb. Pojawienie się nowego oprogramowania, które pozwala na śledzenie wielu ryb jednocześnie, może sprawić, że naukowcy będą wykorzystywać nasze metody, aby zapewnić powtarzalność i dokładność swoich eksperymentów. Biorąc pod uwagę powszechne zastosowanie danio pręgowanego jako organizmu modelowego w neuronauce behawioralnej, metoda ta zwiększy skuteczność i praktyczność w przyszłych badaniach farmakologicznych.
W obecnym paradygmacie zastosowano powtarzający się schemat dawkowania, który w przybliżeniu odzwierciedla harmonogramy picia u ludzi. Ryby zostały losowo przydzielone do jednej z trzech grup: kontrolna, codziennie-umiarkowana lub cotygodniowa-objadanie się. Schemat dawkowania wynosił 21 dni, wybrany ze względu na to, że znacznie przekraczał czas ekspozycji w poprzednich badaniach7. Ryby kontrolne otrzymywały zero alkoholu, ryby codziennie umiarkowane otrzymywały 0,2% alkoholu raz dziennie, a ryby objadające się raz w tygodniu otrzymywały 1,4% alkoholu. Zadanie jasne/ciemne wykorzystano do oceny lęku po 2 dniach odstawienia. Jest to stosunkowo prosty do przeprowadzenia test, który wykorzystuje prostokątną arenę, w której ściany po jednej stronie są białe, a po drugiej ciemne9. Dorosłe rybo pręgowany zdecydowanie preferują ciemną stronę areny w warunkach kontrolnych6,9,13. Zwiększony niepokój jest operacyjnie definiowany jako znacznie więcej czasu spędzonego w strefie ciemnej, a zmniejszony niepokój można założyć, gdy ryba spędza stosunkowo więcej czasu w strefie jasnej. Dzięki oprogramowaniu do śledzenia ruchu można również określić ilościowo inne zmienne informacyjne, w tym prędkość średnią, bezruch, meandrowanie i przejścia stref14.
Metoda dawkowania opracowana w naszym laboratorium może mieć zastosowanie do każdego badania, w którym rozpuszczalne w wodzie związki są podawane jednemu lub więcej danio pręgowanym. Wiele innych środków farmakologicznych, które mogą skorzystać z tej metodologii, jest obecnie testowanych na danio pręgowanym. Powszechnie testowane związki to nikotyna, chlordiazepoxide, buspiron i skopolamina, które rozpuszczają się w podobny sposób jak etanol; poprzez zmieszanie odpowiedniej ilości substancji chemicznej z wodą. W związku z tym ogólny zakres tej procedury jest znacznie szerszy i nie ogranicza się do etanolu. Co więcej, po wielokrotnym dawkowaniu narkotyków, zadanie jasne/ciemne jest tylko jednym z wielu testów behawioralnych, które można zastosować. Po podaniu leku lub podczas odstawienia, inne popularne testy, które można wykorzystać, obejmują nowatorski test nurkowania w butli15 i testy zachowań społecznych, takie jak płycizna16. Poniższa procedura nakreśli skuteczną metodę wielokrotnego przenoszenia grup ryb lub pojedynczych ryb do roztworów zawierających interesujący związek farmakologiczny. Dodatkowo opisany zostanie proces testowania lęku za pomocą testu światło/ciemność w grupach ryb, które są w stanie odstawienia po ekspozycji na długie harmonogramy podawania alkoholu.

<table><tbody><tr><td>Trzystrefowy system obudowy laboratoryjnej</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik do tarła 1.5 L z przegrodą 400 &amp;mu;m</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Czysty etanol zbożowy</td><td><a href="http://www.luxco.com/brands/vodka-neutral-spirits-neutral-spirits-everclear" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Luxco, INC</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do śledzenia ruchu Ethovision XT</td><td><a href="http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Noldus Information Technology</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td><a href="http://eshop.eppendorf.ca/categories/1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf Canada</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arena jasna/ciemna</td><td>Własny produkt</td><td></td><td>Wykonać zgodnie z opisem procedury. Szerokość 9.5 cm, głębokość 9.5 cm, długość 55 cm.</td></tr></tbody></table>

nowa metoda podawania leków wielu danio pręgowanemu (danio rerio) i kwantyfikacja odstawienia

A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish (Danio rerio) and the Quantification of Withdrawal

Testy lękowe u danio pręgowanego są często badane w połączeniu z zastosowaniem substancji farmakologicznych. W tych badaniach ryby są rutynowo łowione w sieci i transportowane między domowymi akwariami a zbiornikami dozującymi. Aby ułatwić podawanie związków, opracowano nowatorską metodę przenoszenia ryb między zbiornikami w celu podawania leków. Wkładki, które są przeznaczone do tarła, zostały użyte do przeniesienia grup ryb do roztworu leku, umożliwiając dokładne dozowanie wszystkich ryb w grupie. Zwiększa to precyzję i skuteczność dawkowania, co staje się bardzo ważne w przypadku długich harmonogramów wielokrotnego podawania leków. Wdrożyliśmy tę procedurę do wykorzystania w badaniu oceniającym zachowanie danio pręgowanego w teście jasnym/ciemnym po podaniu etanolu w różnych 21-dniowych harmonogramach. U ryb narażonych na dzienne umiarkowane ilości alkoholu stwierdzono istotną różnicę w preferencjach lokalizacyjnych po 2 dniach od odstawienia w porównaniu z grupą kontrolną. Nie zaobserwowano jednak istotnej różnicy w preferencjach lokalizacyjnych w grupie narażonej na cotygodniowe podawanie w napadach objadania się. 
Ten protokół można uogólnić do stosowania ze wszystkimi rodzajami związków, które są rozpuszczalne w wodzie i może być stosowany w każdej sytuacji, gdy badane jest zachowanie ryb podczas lub po długich okresach podawania leków. Test jasny/ciemny jest również cenną metodą oceny zmian lękowych wywołanych odstawieniem.

Aby zachować dokładność i kontrolę w badaniach farmakologicznych z wykorzystaniem rybek zebra, ważne jest, aby czas trwania podawania etanolu był spójny i precyzyjny, zgodnie z powyższym opisem. Nasza procedura może zwiększyć łatwość i przepustowość procesu dawkowania. Podawanie etanolu w schemacie tygodniowego napadu (weekly-binge) lub codziennego umiarkowanego (daily-moderate) doprowadziło do zmiany poziomu lęku, mierzonego testem jasne/ciemne, w porównaniu z grupami kontrolnymi. Podczas testów przeprowadzonych dwa dni...

Wyjaśniono nowatorską metodę zmniejszania zmienności podczas wystawiania ryb na działanie narkotyków. Stwierdzono, że ryby wystawione na różne wzorce ekspozycji na etanol miały zmieniony poziom lęku podczas odstawienia w teście skotoksji jasnej/ciemnej.

Nowa metoda podawania leków wielu danio pręgowanemu (Danio rerio) i kwantyfikacja odstawienia

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely ...

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne i skuteczne dawkowanie grupom ryb etanolu w celu oceny wpływu wielokrotnego dawkowania na zachowanie podczas odstawienia. Osiąga się to poprzez uprzednie podanie dawki rybie danio pręgowanej, przy użyciu nowej metody, która została opracowana, aby umożliwić jednoczesną ekspozycję całych grup ryb na lek przez określony czas. Drugim krokiem jest kontynuowanie dozowania ryb zgodnie z harmonogramem, który pozwala na testowanie określonych skutków odstawienia etanolu.Następnie, podczas odjęcia, ryby są indywidualnie testowane w jasnym i ciemnym zadaniu za pomocą oprogramowania do śledzenia ruchu w celu zarejestrowania ruchu. Ostatnim krokiem jest analiza danych w celu zbadania wpływu odstawienia etanolu na zachowanie danio pręgowanego. Ostatecznie wielokrotne dozowanie etanolu przy użyciu opisanej procedury powoduje przejściowy, ale wyraźny wpływ na zachowanie zebry po dwóch dniach odstawienia.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na jednoczesne podawanie leków dużym grupom ryb i jest idealna do badań obejmujących powtarzającą się ekspozycję na leki, narkotyki lub toksyny przez długi czas. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurofarmakologii, takie jak kwantyfikacja zachowań związanych z odstawieniem. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy podawać etanol wielu rybom w tym samym czasie i stwierdziliśmy, że siatka była zarówno niedokładną, jak i nieprecyzyjną metodą podawania leków.Zaczynać. Należy przygotować harmonogram podawania w taki sposób, aby zwierzętom podawano dawkę w tym samym środowisku i o tej samej porze dnia, aby uniknąć zakłóceń czasowych lub stronniczości w stosunku do bodźców wzrokowych. Następnie zdobądź tyle identycznych 1,5-litrowych przezroczystych polipropylenowych zbiorników tarłowych, ile jest konieczne dla liczby wielkości grup, aby umożliwić testowanie dwóch grup ryb dziennie.Konieczne jest stosowanie grup po osiem ryb na zbiornik, jeden zbiornik retencyjny i jeden zbiornik dozujący na grupę. W związku z tym liczba zbiorników jest dwa razy większa niż liczba grup. Następnie umieść wkładki tarłowe o średnicy 400 mikronów we wszystkich zbiornikach retencyjnych.Napełnij zbiorniki wodą siedliskową, wodą lub wodą z odwróconej osmozy o odpowiedniej temperaturze. W przypadku danio pręgowanego stosuje się od 25 do 28 stopni Celsjusza. Upewnij się, że zbiorniki znajdują się w neutralnym środowisku, aby uniknąć kondycjonowania, ryby na zewnętrzne bodźce wizualne podczas dawkowania.Następnie przygotuj roztwór leku, mieszając odpowiednią ilość leku z wodą siedliskową w zbiornikach dozujących, tutaj przygotowuje się 0,2% roztwór etanolu i 1,4% roztwór etanolu, łącząc wysokiej jakości etanol z wodą w zbiorniku. Ostrożnie wyjąć ryby ze zbiorników siedliskowych i przenieść je do odpowiedniego zbiornika retencyjnego zawierającego wkładkę tarłową. Idealnie byłoby, gdyby ryby były umieszczane we wkładzie tarłowym, aby całkowicie wyeliminować siatkę ze wszystkimi rybami w ich odpowiednich zbiornikach retencyjnych.Delikatnie wyjmij wkładkę tarłową ze zbiornika retencyjnego i umieść ją w odpowiednim zbiorniku z roztworem leku. Jeśli to możliwe, należy uzyskać pomoc w przenoszeniu wszystkich grup do roztworu leku jednocześnie, aby zapewnić dokładny czas dawkowania. Zapisz czas dozowania zgodnie z wymaganiami.30 minut w roztworze etanolu stosuje się do opisanej tutaj procedury pod koniec wymaganego okresu dawkowania. Wyjmij rybę z roztworu etanolu, ostrożnie wyjmując wkładkę tarłową z roztworu leku i delikatnie umieszczając ją z powrotem w zbiorniku retencyjnym. Uzyskaj jasną, ciemną arenę o szerokości dziewięciu i pół centymetra, długości 55 centymetrów i głębokości dziewięciu i pół centymetra z białą wodoodporną podłogą.Przymocuj biało-wodoodporny nieodblaskowy papier do wewnętrznych ścian areny za pomocą rzepów, tak aby połowa areny była pokryta na biało, a połowa pokryta na czarno, wypełnij arenę na głębokość pięciu centymetrów wodą siedliskową o temperaturze od 25 do 28 stopni Celsjusza. Utrzymuj tę temperaturę przez cały czas testowania, minimalizuj zewnętrzne bodźce wizualne, konstruując białą, trójstronną obudowę, w której zostanie umieszczona arena. Upewnij się, że obszar testowy ma rozproszony narzut.Oświetlenie, które nie powoduje odbić od powierzchni wody, a jednocześnie jest wystarczająco jasne dla oprogramowania do śledzenia ruchu lub ręcznej kwantyfikacji post hoc na podstawie obrazów wideo. Następnie ustaw parametry rejestracji i analizy ruchu oprogramowania do śledzenia zachowań o czasie trwania próby od pięciu do 15 minut, w zależności od pytania badawczego, przetransportuj grupę ryb, które mają być badane, na obszar badawczy w zbiorniku siedliskowym i umieść je poza areną. Załącznik. Pozwól rybie zaaklimatyzować się przez 10 minut.Delikatnie złap rybę z odpowiedniej grupy i umieść na środku jasnociemnej areny, wypuszczając każdą rybę, gdy jest ustawiona równolegle do długiej osi areny. Aby uniknąć uprzedzeń ryb do jasnej lub ciemnej strefy, zacznij rejestrować zachowanie natychmiast po wypuszczeniu zwierzęcia. Uważaj na wszelkie problemy z oprogramowaniem do śledzenia ryb lub na skaczące lub zamarzające ryby po zakończeniu próby, delikatnie zasiaj sieć i usuń rybę z areny do zbiornika retencyjnego lub zbiornika siedliskowego.Obróć arenę o 180 stopni po przetestowaniu połowy badanych, aby zapobiec wszelkim zakłóceniom wynikającym z uprzedzeń wynikających z tego, który koniec areny jest zorientowany w kierunku otwartego końca obudowy. Rozpocznij analizę od zbadania czasu spędzonego w jasnych i ciemnych strefach dla każdej grupy i dla każdej ryby, uzyskaj względny czas spędzony w jasnych i ciemnych strefach i przeanalizuj za pomocą testu T dla jednej próby, aby określić, czy grupy znacznie preferują jeden obszar nad drugim. Aby porównać preferencje, oblicz indeks preferencji, odejmując czas spędzony w jasnej strefie od czasu spędzonego w ciemnej strefie i porównaj różnice między grupami.Korzystając z testu T, porównaj wiele grup za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji z wykorzystaniem dwóch kluczowych, uczciwych istotnych różnic post hoc, w razie potrzeby dla nieparametrycznych zestawów danych. Użyj testu resco Wallace'a z wielokrotnym porównaniem post hoc Dunna, a następnie porównaj prędkość, liczbę przejść stref, meandrowanie i bezruch w grupach. Korzystając z jednoczynnikowej analizy wariancji, ponownie wykorzystaj dwa klucze, uczciwy test post hoc znaczącej różnicy tam, gdzie to konieczne.Podawanie etanolu w tygodniowym lub codziennym umiarkowanym harmonogramie skutkowało zmienionym poziomem lęku, mierzonym testem jasnociemnym, w porównaniu z grupą kontrolną. Pokazano tutaj reprezentatywne wykresy śladów pojedynczej kontrolnej ścieżki przemieszczania się zebry w trakcie pięciominutowej próby w ciemności dla każdego warunku. Ten sam wykres śladu danio pręgowanego jest reprezentowany jako mapa cieplna, która jest kolorową reprezentacją ruchu danio pręgowanego podczas całego badania.Na podstawie czasu, jaki ryba spędziła w lokalizacji reprezentowanej przez każdy piksel. Podczas testów dwa dni po ostatniej dawce, danio pręgowany w grupie kontrolnej wykazywał oczekiwany wzorzec zachowania, przy czym ryby kontrolne spędzały znacznie więcej czasu po ciemnej stronie areny. Podobnie jak naiwne ryby danio pręgowane w innych badaniach, ryby w grupie tygodniowego objadania się nie wykazywały preferencji ani dla jasnych, ani ciemnych stref w zadaniu, gdy były testowane dwa dni po ostatnim podaniu etanolu.Co ciekawe, ryby w codziennej grupie umiarkowanej znacznie preferowały jasne miejsce areny. W przeciwieństwie do grupy kontrolnej, indeks preferencji wykazał istotną różnicę między grupą kontrolną a grupą codzienną umiarkowaną. Nie stwierdzono istotnych różnic w prędkości pływania lub bezruchu między grupami, a zatem efekt ten nie był spowodowany deficytem motorycznym ryb.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o podawaniu interesującego nas związku farmakologicznego o tej samej porze dnia, przed lub po karmieniu ryb. Tak więc zgodnie z tą procedurą wykonaną z etanolem lub innymi związkami farmakologicznymi, można przeprowadzić inne testy zachowania danio pręgowanego, aby ocenić takie rzeczy, jak uzależnienie i odstawienie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie i dokładnie dozować grupy danio pręgowanego do testów behawioralnych.Przestrzeganie tej procedury, szczególnie przy użyciu wkładek tarłowych, jest doskonałym sposobem na zapewnienie precyzji podczas dozowania ryb.

a-novel-method-drug-administration-to-multiple-zebrafish-danio-rerio

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film opisuje test preferencji jasnego i ciemnego w celu zbadania zachowania związanego z lękiem u danio pręgowanego po ekspozycji na etanol.

Test preferencji jasno-ciemnej: metoda badania zachowań związanych z lękiem u danio pręgowanego

Danio pręgowany jest ważnym organizmem modelowym do badania homeostazy energetycznej.  Wykorzystując czuły na NADH2 wskaźnik redoks, alamar Blue, opracowaliśmy test, który mierzy tempo metabolizmu larw danio pręgowanego w formacie 96-dołkowej płytki i może być stosowany do odkrywania leków lub genów.

Wysokoprzepustowy test wydatku energetycznego Danio Rerio

Celem tego protokołu jest zmierzenie czasu przejścia fluorescencyjnie znakowanego pokarmu przez jelita larw danio pręgowanego w sposób wysokoprzepustowy.

Wysokoprzepustowy pomiar czasu pasażu jelitowego przy użyciu larw danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje prostą metodę behawioralnego pomiaru stresu u dorosłego gryba. Podejście to wykorzystuje wrodzoną tendencję do tego, że danio pręgowany preferuje dolną połowę zbiornika, gdy jest w stanie stresu. Opisano również metody sprzężenia testu z farmakologią.

Behawioralne podejścia do badania wrodzonego stresu u danio pręgowanego

Zarodki danio pręgowanego są używane do oceny toksyczności związków chemicznych. Rozwijają się zewnętrznie i są wrażliwe na chemikalia, co pozwala na wykrycie subtelnych zmian fenotypowych. Eksperyment wymaga jedynie niewielkiej ilości związku, który jest bezpośrednio dodawany do płytki zawierającej zarodki, dzięki czemu system testowy jest wydajny i opłacalny.

Szybka ocena toksyczności związków chemicznych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

Opisano nową metodę iniekcji dootrzewnowej (IP) u dorosłych ryb pręgowanych. W przypadku stosowania związków toksycznych, takich jak doksorubicyna, procedura ta jest bardziej skuteczna niż dwie wcześniej opisane metody IP. Technika ta została zaprojektowana tak, aby mogła być łatwo zaadoptowana przez badaczy z ograniczonym doświadczeniem w modelowaniu danio pręgowanego.

Technika iniekcji dootrzewnowej u dorosłych danio pręgowanego, która minimalizuje uszkodzenia ciała i związaną z nimi śmiertelność

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Niniejsze badanie przedstawia metodę karmienia opartą na żelatynie, która umożliwia precyzyjne, nieinwazyjne podawanie leków doustnych u dorosłych rybek zebra z uwzględnieniem masy ciała. Protokół wykazuje niezawodną akceptację pokarmu i, jako dowód zasady, pomyślne podanie MK-801, które zaowocowało oczekiwanymi efektami behawioralnymi.

Proste i precyzyjne podejście oparte na karmieniu doustnego podawania leków rybom

Poznaj nową metodę podawania etanolu grupom danio pręgowanego (Danio rerio) w badaniach zachowań odstawiennych. Technika umożliwia precyzyjne dawkowanie i analizę lęku za pomocą testu jasno-ciemno.

Nowa metoda podawania leków wielu danio pręgowanemu (Danio rerio) i kwantyfikacja odstawienia

Przeglądaj więcej filmów