Name: Neurony węchowe uzyskane przez biopsję nosa w połączeniu z mikrodysekcją laserową: potencjalne podejście do badania odpowiedzi na leczenie w zaburzeniach psychicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Poznaj izolację neuronów węchowych z biopsji nosa przy użyciu mikrodysekcji laserowej i analizę ekspresji genów metodą QPCR. Ta technika umożliwia badanie odpowiedzi na leczenie litowym w zaburzeniach dwubiegunowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty USPHS MH-091460 (E.N.), MH-084018 (A.S.), MH-094268 Silvo O. Conte center (A.S.), MH-069853 (A.S.), MH-085226 (A.S.), MH-088753 (A.S.), MH-092443 (A.S.) i MH-096208 (K.I.), granty od DANA (E.N.), Stanley (A.S.), RUSK (A.S.), S-R foundations (A.S.), NARSAD (A.S. i K.I.), oraz Fundusz Badań nad Komórkami Macierzystymi w Maryland (A.S. i K.I.).
Szczerze doceniamy wysiłki i wkład Pearl Kim, Marii Papapavlou, Nao Gamo, Youjin Chung, Yukiko Lemy i Marka Christie w koordynację procesu biopsji.

UWAGA: Wszyscy ochotnicy biorący udział w tym badaniu otrzymali dokumenty świadomej zgody zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu Howarda i Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa. Do badania zostali włączeni tylko uczestnicy, którzy wyrazili zgodę, podpisując dokumenty świadomej zgody. Baza badawcza do tej analizy składała się z: 20 osób (12 BD i 10 kontrolnych; 30% mężczyzn) i średni wiek (s.d.) 38,2 (14,1) lat. 
UWAGA: Spryskaj wszystkie powierzchnie RNase Zap, aby usunąć zanieczyszczenia RNazą z powierzchni szklanych i plastikowych.
1. Procedura biopsji
<ol>
	<li>Rozpyl miejscowo płyn lidokainy (ksylokainy) 4% i oksymetazolinę HCl 0,05% w jamie nosowej uczestnika badania i pozostaw na 15 minut odrętwienia.</li>
	<li>Namocz bawełniane folie chirurgiczne o wymiarach 1/2 x 3 cale w mieszaninie lidokainy i oksymetazoliny, a następnie włóż do jamy nosowej wzdłuż górnej części przegrody nosowej i pozostaw na 15 minut.</li>
	<li>Używając sztywnego endoskopu nosowego pod kątem 30°, aby zlokalizować górną część jamy nosowej, usuń błonę śluzową nosa za pomocą szczypiec do nosa z górnej części przegrody nosowej, pobierając kilka małych próbek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie bloków tkanek
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed biopsją należy napełnić krioformy o standardowych rozmiarach pożywką do zamrażania tkanek.</li>
	<li>Za pomocą autoklawowanej pęsety umieść świeżą tkankę w zamrażarce i zamroź na suchym lodzie. Napełnij pozostałą część kriobloku medium zamrażającym, zamroź krioblok na suchym lodzie i przechowuj bloki w temperaturze -80ºC.</li>
</ol>
3. Kriosekcja
<ol>
	<li>Przygotować szkiełka szklane z naftalanu etylenu (PEN) bezpośrednio przed kriosekcją. Spryskaj szkiełka roztworem RNase Zap przez 5 min. Następnie opłucz szkiełka w wodzie z węglanu dietylu (DEPC) i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Aktywuj wysuszone szkiełka w świetle UV na 30 minut.</li>
	<li>Kriosekcja każdego bloku w całości przy 30 μm. Utrzymuj szkiełka na suchym lodzie, a sekcje zamrożone tak bardzo, jak to możliwe. Po zakończeniu przechowywać szkiełka w temperaturze -80 ºC.</li>
</ol>
4. Mikrodysekcja laserowa
<ol>
	<li>Zacznij od odwodnienia szkiełek bezpośrednio przed mikrodypreparacją. Pozostaw zamrożone szkiełka do rozmrożenia przez 10 sekund, a następnie nałóż następujące serie etanolu na każde szkiełko: 60% (2 ml, 15 sekund), 80% (2 ml, 15 sekund), 95% (3 ml, 25 sekund), 100% (7 ml, 60 sekund).</li>
	<li>Włącz mikroskop fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej (PALM) i ustaw go w następujących warunkach: Dla 10-krotnego powiększenia ustaw energię na 82, ostrość na 74, a prędkość na 25 - 30. Aby uzyskać 20-krotne powiększenie, ustaw energię na 63, ostrość na 67, a prędkość na 5-6. Dostosuj w razie potrzeby, aby uzyskać optymalne wyniki cięcia.</li>
	<li>Wizualnie identyfikuj neurony za pomocą 20- lub 10-krotnego powiększenia. Odróżnienie cienkiej powierzchni warstwy neuronu węchowego od leżącej pod nią błony podśluzowej pod mikroskopem bez użycia procedury barwienia. Obserwuj neurony jako gęsty wygląd kolumnowy18.</li>
	<li>Korzystając z funkcji ołówka w wyżej wymienionym mikroskopie w kroku 4.2, obrysuj warstwę neuronalną. Śledź nieco z dala od neuronów, aby zapobiec spaleniu neuronów przez laser. Jest to niezbędne do uzyskania wysokiej jakości RNA. Następnie rozpocznij cięcie sterowane laserowo.</li>
	<li>Podnieś wypreparowane skrawki za pomocą kleszczy do mikrodyfuzji z cienką końcówką i umieść tkankę w mikroprobówce zawierającej 100 μl buforu do lizy na lodzie. Powtórz tę czynność dla wszystkich odcinków neuronów uzyskanych z jednej próbki. Całkowity czas preparacji próbki nie powinien przekraczać 50 minut.</li>
	<li>Po zakończeniu sekcji natychmiast odwirować lizaty próbki i przechowywać na suchym lodzie. Przechowuj próbki w temperaturze -80ºC w celu całkowitej izolacji RNA.</li>
</ol>
5. Izolacja całkowitego RNA i analiza kontroli jakości
<ol>
	<li>Rozmrozić próbkę lizatów na lodzie. Przeprowadź całkowitą izolację RNA za pomocą RNAqueous Micro Kit z inaktywacją DNazy-I, postępując zgodnie z protokołem producenta bez modyfikacji (patrz rysunek 1). Całkowita objętość elucji wynosi około 20 μl.</li>
	<li>Zmierz stężenie RNA i oceń jakość RNA za pomocą numeru integralności RNA (RIN) za pomocą Bioanalyzera. Próbki, które spełniają kryteria kontroli jakości przedstawione na rysunku 2, mogą być wykorzystane do syntezy cDNA.</li>
</ol>
6. Synteza cDNA
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj cDNA przy użyciu zwalidowanego zestawu komercyjnego (patrz Tabela odczynników). Etap wyżarzania należy wykonać, łącząc 0,1 - 1,0 ng RNA (w zależności od dostępności) i wody wolnej od RNaz do całkowitej objętości 8 μl na probówkę. Następnie dodać 1 μl startera oligo d(T)20 i 1 μl mieszanki 10 mM dNTP na probówkę, uzyskując całkowitą objętość 10 μl.</li>
	<li>Delikatnie wirować i odwirować próbki i próbki wyżarzane w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Po zakończeniu reakcji należy natychmiast schłodzić próbki na lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwór mieszanki wzorcowej zgodnie ze specyfikacjami w tabeli 1. Następnie do każdej probówki dodać 9,5 μl mieszanki wzorcowej i 0,5 μl komercyjnie przygotowanej odwrotnej transkryptazy (RT). Dodaj 0,5 μl wody wolnej od RNaz do probówki kontrolnej zamiast RT.</li>
	<li>Przeprowadzić reakcję RT z pierwszą inkubacją w temperaturze 50 °C przez 50 minut, następnie 85 °C przez 5 minut i końcowym utrzymaniem w temperaturze 4 °C, bez cykli.</li>
	<li>Rozcieńczyć wszystkie próbki 5-krotnie wodą i podwielokrotnością. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
7. Real Time PCR – Potwierdź wzbogacenie neuronów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór mieszanki wzorcowej zgodnie ze specyfikacjami w tabeli 2. Stosuj kontrolę wewnętrzną, taką jak GAPDH. Porównaj ekspresję białka markera węchowego (OMP) w mikrowypreparowanej tkance z ekspresją OMP w tkance niewypreparowanej, aby określić wzbogacenie neuronów. 
	UWAGA: OMP jest markerem neuronów węchowych. 
	Sekwencja OMP: do przodu, 5'-CTGTCGGACCTGGCCAAG-3' 
	rewers, 5'-CACCCTCGCCAAAGGTGA-3' 
	Sekwencja GAPDH: do przodu, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3' 
	rewers, 5'-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3'.</li>
	<li>Ustawić płytkę PCR, dodając 7 μl mieszanki głównej do każdej studzienki i 3 μl cDNA.</li>
	<li>Płytka wirowa przez 5 minut przy 300 x g (1 300 obr./min). Uruchom reakcję Real Time-PCR przy użyciu domyślnych warunków cyklu termicznego określonych dla komercyjnych supermiksów, takich jak SYBR GreenER qPCR.</li>
	<li>Przeanalizuj dane (patrz rysunek 2, aby zapoznać się ze specyfikacjami).</li>
</ol>
8. Real Time PCR – Ekspresja genów będących przedmiotem zainteresowania
<ol>
	<li>Wykonuj na próbkach, które wykazują wzbogacenie neuronów 2-krotnie lub więcej.</li>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową na lodzie dla każdej sondy (sondy z oznaczeniem FAM i GAPDH z oznaczeniem VIC) w oddzielnych probówkach zgodnie ze specyfikacjami w Tabeli 3.</li>
	<li>Ustaw płytkę PCR z 8 μl mieszanki głównej w każdym dołku i 2 μl cDNA.</li>
	<li>Odwirować płytkę przez 5 minut przy 300 x g (1 300 obr./min). Przeprowadź reakcję Real Time-PCR przy użyciu domyślnych warunków cykli termicznych, zgodnie z protokołem głównej mieszanki ekspresji genów dostarczonym przez producenta. Analizuj wyniki wyrażeń (patrz rysunek 2, aby zapoznać się ze specyfikacjami).</li>
</ol>

<ol><li>Goodwin, F. K., Jamison, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodwin%2C+FK+%22Manic-depressive+illness%22">Manic-depressive illness</a>. , Oxford University Press. (1990).</li>
<li>Einat, H., Manji, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+cascades%3A+genes-to-behavior+pathways+in+animal+models+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity cascades: genes-to-behavior pathways in animal models of bipolar disorder.</a> Biol Psychiatry. 59 (12), 1160-1171 (2006).</li>
<li>Severino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacogenomics+of+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">Pharmacogenomics of bipolar disorder.</a> Pharmacogenomics. 14 (6), 655-674 (2013).</li>
<li>Beech, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-expression+differences+in+peripheral+blood+between+lithium+responders+and+non-responders+in+the+Lithium+Treatment-Moderate+dose+Use+Study+%28LiTMUS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Gene-expression differences in peripheral blood between lithium responders and non-responders in the Lithium Treatment-Moderate dose Use Study (LiTMUS).</a> Pharmacogenomics J. 14 (2), 182-191 (2013).</li>
<li>Horiuchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+cells+via+nasal+biopsy+reflect+the+developing+brain+in+gene+expression+profiles%3A+utility+and+limitation+of+the+surrogate+tissues+in+research+for+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Olfactory cells via nasal biopsy reflect the developing brain in gene expression profiles: utility and limitation of the surrogate tissues in research for brain disorders.</a> Neurosci Res. 77 (4), 247-250 (2013).</li>
<li>Dryer, L., Graziadei, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+the+olfactory+bulb+in+an+elasmobranch+fish%2C+Sphyrna+tiburo%3A+segregation+of+inputs+in+the+telencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Projections of the olfactory bulb in an elasmobranch fish, Sphyrna tiburo: segregation of inputs in the telencephalon.</a> Anat Embryol (Berl. 190 (6), 563-572 (1994).</li>
<li>Hahn, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+neurogenesis+in+human+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro neurogenesis in human olfactory epithelium.</a> J Comp Neurol. 483 (2), 154-163 (2005).</li>
<li>Cascella, N. G., Takaki, M., Lin, S., Sawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodevelopmental+involvement+in+schizophrenia%3A+the+olfactory+epithelium+as+an+alternative+model+for+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Neurodevelopmental involvement in schizophrenia: the olfactory epithelium as an alternative model for research.</a> J Neurochem. 102 (3), 587-594 (2007).</li>
<li>Sawa, A., Cascella, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+olfactory+system+for+clinical+and+basic+psychiatry%3A+a+promising+entry+point+to+the+mystery+of+brain+mechanism+and+biomarker+identification+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral olfactory system for clinical and basic psychiatry: a promising entry point to the mystery of brain mechanism and biomarker identification in schizophrenia.</a> Am J Psychiatry. 166 (2), 137-139 (2009).</li>
<li>Mor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-382+expression+is+elevated+in+the+olfactory+neuroepithelium+of+schizophrenia+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-382 expression is elevated in the olfactory neuroepithelium of schizophrenia patients.</a> Neurobiol Dis. 55, 1-10 (2013).</li>
<li>Kano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+multiple+histone+methylations+in+olfactory+cells%3A+further+implications+for+cellular+susceptibility+to+oxidative+stress+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of multiple histone methylations in olfactory cells: further implications for cellular susceptibility to oxidative stress in schizophrenia.</a> Mol Psychiatry. 18 (7), 740-742 (2013).</li>
<li>Toritsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficits+in+microRNA-mediated+Cxcr4%2FCxcl12+signaling+in+neurodevelopmental+deficits+in+a+22q11+deletion+syndrome+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deficits in microRNA-mediated Cxcr4/Cxcl12 signaling in neurodevelopmental deficits in a 22q11 deletion syndrome mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17552-17557 (2013).</li>
<li>Evgrafov, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+neuroepithelium-derived+neural+progenitor+cells+as+a+model+system+for+investigating+the+molecular+mechanisms+of+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Psychiatr+Genet%22%5BJournal%5D)">Olfactory neuroepithelium-derived neural progenitor cells as a model system for investigating the molecular mechanisms of neuropsychiatric disorders.</a> Psychiatr Genet. 21 (5), 217-228 (2011).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+dynamics+are+altered+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion dynamics are altered in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 74 (6), 418-426 (2013).</li>
<li>Ishizuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+symptoms+of+schizophrenia+correlate+with+impairment+on+the+University+of+Pennsylvania+smell+identification+test%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Negative symptoms of schizophrenia correlate with impairment on the University of Pennsylvania smell identification test.</a> Neurosci Res. 66, 106-110 (2010).</li>
<li>Sattler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+olfactory+epithelium+as+a+dynamic+marker+for+CNS+therapy+development%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Human nasal olfactory epithelium as a dynamic marker for CNS therapy development.</a> Exp Neurol. 232 (2), 203-211 (2011).</li>
<li>Rimbault, M., Robin, S., Vaysse, A., Galibert, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+profiles+of+rat+olfactory+epithelia%3A+individual+and+age+related+variations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA profiles of rat olfactory epithelia: individual and age related variations.</a> BMC Genomics. 10, 572(2009).</li>
<li>Tajinda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+biomarkers+from+patients+with+mental+illnesses%3A+a+novel+method+through+nasal+biopsy+combined+with+laser-captured+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Neuronal biomarkers from patients with mental illnesses: a novel method through nasal biopsy combined with laser-captured microdissection.</a> Mol Psychiatry. 15 (3), 231-232 (2010).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li>
<li>Fink, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+RT-PCR+after+laser-assisted+cell+picking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative RT-PCR after laser-assisted cell picking.</a> Nat Med. 4 (11), 1329-1333 (1998).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Nurnberger, J. I. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+interview+for+genetic+studies.+Rationale%2C+unique+features%2C+and+training%5BTitle%5D)+AND+%22NIMH+Genetics+Initiative.+Arch+Gen+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic interview for genetic studies. Rationale, unique features, and training.</a> NIMH Genetics Initiative. Arch Gen Psychiatry. 51 (11), 849-859 (1994).</li>
<li>Montgomery, S. A., Asberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+depression+scale+designed+to+be+sensitive+to+change%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A new depression scale designed to be sensitive to change.</a> Br J Psychiatry. 134, 382-389 (1979).</li>
<li>Young, R. C., Biggs, J. T., Ziegler, V. E., Meyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rating+scale+for+mania%3A+reliability%2C+validity+and+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A rating scale for mania: reliability, validity and sensitivity.</a> Br J Psychiatry. 133, 429-435 (1978).</li>
</ol>

Autorzy nie informują o żadnych powiązaniach finansowych z interesami komercyjnymi.

Zaprezentowano nową platformę do uzyskiwania wzbogaconych węchowych warstw neuronalnych poprzez połączenie biopsji nosa i LCM, która została zwalidowana w tym badaniu. Technika ta może mieć daleko idące konsekwencje. Może być stosowany w badaniach nad biomarkerami, w tym nad odpowiedzią na leczenie, oraz w pracach nad odkrywaniem leków na inne schorzenia neuropsychiatryczne, wywierając szerszy wpływ w tej dziedzinie.
Aby uzyskać wysokiej jakości neurony nadające się do dalszych zastosowań, nal...

Choroba afektywna dwubiegunowa (BD) jest ciężkim zaburzeniem neuropsychiatrycznym, charakteryzującym się patologicznymi zmianami nastroju, popędu i funkcji poznawczych1. W badaniach na zwierzętach wykazano, że lit stosowany w leczeniu ChAD zmienia poziomy mRNA dużej liczby genów w stanie stacjonarnym2, ale nie wiadomo, czy którakolwiek z tych cząsteczek jest związana z odpowiedzią kliniczną u ludzi2. Zrozumienie mechanizmu odpowiedzi litu wymagałoby zbadania zmian molekularnych wywołanych litem w tkankach neuronalnych. Niestety, nie jest praktyczne uzyskanie biopsji mózgu pacjentów z ChAD przed i po terapii litem w celu zidentyfikowania molekularnych sygnatur odpowiedzi litu. Pośmiertne tkanki mózgowe zostały wykorzystane do badania biomarkerów w ChAD, jednak nie można ich wykorzystać do oceny markerów molekularnych związanych z dynamicznymi zmianami w emocjach, poznaniu i popędzie; a trafność retrospektywnie stwierdzonej odpowiedzi na leczenie litem może być problematyczna4. Limfocyty i inne komórki krwi mogą być przydatne, ale zmiany molekularne w komórkach krwi mogą nie odzwierciedlać zmian neuronalnych3-5. Płyn mózgowo-rdzeniowy może być niewystarczający do uzyskania informacji na temat cząsteczek wewnątrzkomórkowych, które mogą odzwierciedlać zmiany wewnętrzne związane z chorobą i odwracalne przez leki.
Nabłonek węchowy (OE) jest unikalną częścią ośrodkowego układu nerwowego (OUN), embriologicznie związaną ze strukturami limbicznymi6; i jest łatwo dostępny dzięki biopsjom nosa. Składa się z komórek podporowych podobnych do gleju (tj. Sustentaccular), podstawowych komórek proliferacyjnych i neuronów receptorów węchowych na różnych etapach rozwoju7-9. W związku z tym OE daje unikalną możliwość przystępnego badania dynamicznych zmian w OUN u pacjentów z chorobami neuropsychiatrycznymi7. Badania wykazują przydatność OE jako tkanki zastępczej do badania zdarzeń związanych z chorobą, które odzwierciedlają te zachodzące w neuronach mózgowych8,9. Na przykład w badaniach wykorzystano OE do zbadania profili molekularnych związanych z chorobami psychicznymi10-14. Układ węchowy służy również do identyfikacji klinicznych endofenoytpe, takich jak deficyty węchu, które są związane z negatywnymi objawami schizofrenii15. Ponadto procesy neurorozwojowe zachodzą w OE przez całe życie, co stanowi użyteczną drogę do modelowania patofizjologii leżącej u podstaw stanów psychicznych8,9.
Jednakże, wadą korzystania z tej tkanki jest znaczne zanieczyszczenie biopsji węchowych komórkami nieneuronalnymi16. Na przykład całkowite RNA użyte do badań ekspresji genów w poprzednich badaniach OE zawierało RNA wyekstrahowane z całej tkanki poddanej biopsji nosa, w tym RNA z komórek nieneuronalnych17. W związku z tym dotychczasowe podejścia były ograniczone jakością komórek. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowano nowatorskie podejście do uzyskiwania wzbogaconych populacji komórek nerwowych poprzez połączenie biopsji nosa z mikrodysekcją laserową (LCM)18.
LCM to technika, która pozwala na selektywną izolację komórek za pomocą cięcia laserem UV w połączeniu z laserem podczerwonym19-21. Połączenie LCM z podejściem OE minimalizuje znaczne zanieczyszczenie OE przez komórki nieneuronalne, zwiększając w ten sposób wzbogacenie komórek neuronalnych18. Co więcej, warstwę neuronalną można odróżnić od warstwy podśluzówkowej pod mikroskopem, eliminując w ten sposób potrzebę barwienia. Typy komórek neuronalnych można dodatkowo odróżnić od innych populacji komórek za pomocą przeciwciał pierwotnych, które są wyrażane przez typ komórki będący przedmiotem zainteresowania7. W związku z tym procedura ta ustanawia łatwiejszą metodę wzbogacania prawie czysto neuronalnej populacji komórek, która może być wykorzystana do badań ekspresji genów, immunohistochemii i innych badań morfologicznych.
To badanie ma na celu stworzenie eksperymentalnej platformy do badania zmian molekularnych w neuronach węchowych związanych ze stanami chorobowymi i odpowiedzią na leczenie. Aby rozwiązać ten problem, niewielka grupa pacjentów niepalących, którzy spełniali kryteria diagnostyczne DSM-IV dla ChAD na podstawie Wywiadu Diagnostycznego do Badań Genetycznych (DIG)22, została zrekrutowana do poddania się dwóm biopsjom nosa: jednej biopsji przed leczeniem litem i drugiej biopsji, po 6 tygodniach codziennej doustnej terapii litem. Ponadto kwalifikujący się pacjenci z ChAD muszą: mieć objawy depresji, na podstawie punktacji ≥10 na 60 w skali oceny Montgomery'ego-Asberga (MADRS) podawanej przez klinicystę23; objawowe dla hipomanii lub manii, na podstawie wyniku ≥10 z 56 w skali oceny Young-Mania (YMRS) podawanej przez klinicystę24; lub ≥10 zarówno w przypadku MADRS, jak i YMRS. Współczynnik zgodności Rater-Inter-Rater między klinicystami dla obu skal wynosi >0,96. Po biopsjach neurony zostały wzbogacone z OE przez LCM. Po zastosowaniu dodatkowych środków kontroli jakości, w celu zapewnienia ekstrakcji wysokiej jakości RNA z tkanki i wzbogacenia neuronów, przeprowadzono Real Time RT PCR w celu zbadania poziomów ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania przed i po leczeniu. Kolejne sekcje zawierają opis walidacji tego podejścia, podkreślając optymalizację protokołu i strategie, które zostały zastosowane do rozwiązywania problemów z protokołem.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Przygotowanie tkanek</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Formy Cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kriosekcja</td></tr><tr><td>Membrane Slide 1.0 PEN (D)</td><td>Carl Zeiss Mikroskopia</td><td>415190-9041-000</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Jakość wody uzdatnionej</td><td>Biologiczna</td><td>351-068-131</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silna>Mikrodysekcja</silna></td></tr><tr><td>Mikroskop: System mikrolaserowy serii PALM</td><td>Carl Zeiss Model mikroskopowy</td><td></td><td>: Axiovert 200M 
Oprogramowanie: Robo v3.2</td></tr><tr><td>No. 5 Dumont Microdissction Kleszczyki</td><td>Roboz</td><td>RS-49085</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">RNA Ekstrakcja</td></tr><tr><td>RNAwodny zestaw</td> Micro <td>Kit Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">cDNA Synthesis Set</td></tr><tr><td>SuperScript III Zestaw do syntezy pierwszej nici</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">OMP qPCR</td></tr><tr><td>SYBR GreenER qPCR SuperMix</td><td>Invitrogen</td><td>11760-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Taqman qPCR</td></tr><tr><td>TaqMan Sondy do oznaczania ekspresji</td><td>Applied Biosystems</td><td>Różne</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr></tbody></table>

neurony węchowe uzyskane przez biopsję nosa w połączeniu z mikrodysekcją laserową: potencjalne podejście do badania odpowiedzi na leczenie w zaburzeniach psychicznych

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Choroba afektywna dwubiegunowa (BD) to ciężkie zaburzenie neuropsychiatryczne o słabo poznanej patofizjologii i zazwyczaj leczone stabilizatorem nastroju, węglanem litu. Badania na zwierzętach, a także badania genetyczne na ludziach wskazują, że lit wpływa na cele molekularne, które są zaangażowane we wzrost, przeżycie i dojrzewanie neuronów, a zwłaszcza na cząsteczki zaangażowane w sygnalizację Wnt. Biorąc pod uwagę wyzwanie etyczne związane z uzyskaniem biopsji mózgu w celu zbadania dynamicznych zmian molekularnych związanych z odpowiedzią litu w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), można rozważyć wykorzystanie neuronów uzyskanych z tkanek węchowych do osiągnięcia tego celu. Nabłonek węchowy zawiera neurony receptorów węchowych na różnych etapach rozwoju i komórki podporowe podobne do gleju. Daje to niepowtarzalną okazję do badania dynamicznych zmian w OUN u pacjentów z chorobami neuropsychiatrycznymi, z wykorzystaniem tkanki węchowej bezpiecznie uzyskanej z biopsji nosa. Aby przezwyciężyć wadę wynikającą ze znacznego zanieczyszczenia tkanki węchowej pobranej z biopsji komórkami nieneuronalnymi, opracowano nowatorskie podejście do uzyskiwania wzbogaconych populacji komórek neuronalnych poprzez połączenie biopsji nosa z mikrodysekcją laserową. W tym badaniu opracowano i zwalidowano system do badania dynamicznych zmian molekularnych w tkance neuronalnej związanych z leczeniem, wykorzystując małą próbkę pilotażową pacjentów z ChAD zrekrutowanych do badania molekularnych mechanizmów odpowiedzi na leczenie litem.

Protokół oraz strategia rozwiązywania problemów w badaniu sygnatur molekularnych zostały pomyślnie zoptymalizowane. Zestandaryzowano kryteria jakości RNA oraz wzbogacenia neuronalnego dla próbek, które mają zostać wykorzystane w dalszych analizach Real Time-PCR. RIN oraz stężenie RNA zbadano jako czynniki zakłócające wykryte poziomy ekspresji. Na podstawie analizy kilku próbek o wartościach RIN w zakresie od 1 do 10 ustalono, że minimalna wartość RIN na poziomie ~3,0 i powyżej jest wystarczająca do dalszych analiz w nini...

W tym badaniu opracowano i zweryfikowano nową platformę do badania wewnątrzneuronalnych sygnatur molekularnych odpowiedzi na leczenie w chorobie afektywnej dwubiegunowej (ChAD). Nabłonek węchowy od pacjentów z ChAD uzyskano za pomocą biopsji nosa. Następnie mikrodysekcję laserową połączono z Real Time RT PCR w celu zbadania sygnatury molekularnej odpowiedzi litu w ChAD.

Neurony węchowe uzyskane przez biopsję nosa w połączeniu z mikrodysekcją laserową: potencjalne podejście do badania odpowiedzi na leczenie w zaburzeniach psychicznych

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

Procedura ta szczegółowo opisuje zastosowanie mikrodysekcji wychwytywania laserowego w celu wyizolowania warstw neuronalnych z tkanki nabłonka węchowego, a także przedstawia niektóre dalsze analizy ekspresji genów. Zacznij od biopsji nosa w celu uzyskania tkanki nabłonka węchowego. Następnie wykonaj mikrodysekcję wychwytu laserowego, aby wyizolować warstwy neuronów.Następnie wyizoluj RNA z próbek. Odwrotna transkrypcja CDNA i analiza ekspresji genów za pomocą QPCR. Ostatecznie, mikrodysekcja wychwytywania laserowego jest wykorzystywana do wykazania, że wzbogaconą populację neuronów można wyizolować z tkanki nabłonka węchowego i zastosować do wielu dalszych zastosowań.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metalami, takimi jak hodowle komórek neuronalnych, jest to, że pozwala nam badać zarówno stan, jak i dynamiczne zmiany w kontekście neuronalnym. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tego projektu, gdy odkryliśmy potencjał połączenia mikrodysekcji laserowej z biopsjami węchowymi w celu uzyskania wzbogaconych populacji neuronów. Ta metoda została w ogóle ustalona i zademonstrowana przez TDA.Rozszerzyliśmy tę metodologię i połączyliśmy dalszą analizę Q-R-T-P-C-R u pacjentów i osób z grupy kontrolnej, demonstrując procedurę, będzie Chen Chung, technik z naszego zespołu na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa. Następujące procedury zostaną sfilmowane w obiektach Johns Hopkins Bezpośrednio przed mikropreparacją. Pozwól zamrożonym szkiełkom rozmrozić się przez 10 sekund, a następnie odwodnić tkankę za pomocą serii etanolu, używając czasów i objętości wskazanych w protokole tekstowym.Włącz mikroskop, aby uzyskać lokalizację aktywowaną zdjęciem. Mikroskopia ustaliła warunki dla 10-krotnego powiększenia jako energię 82, ostrości 74 i prędkości od 25 do 30 dla 20-krotnego powiększenia. Ustaw energię na 63, skup się na 67, a prędkość na pięć na sześć.Teraz wizualnie zidentyfikuj neurony za pomocą powiększenia 20 x lub 10 x. Odróżnij cienką warstwę neuronu węchowego od leżącej pod nią błony podśluzowej pod mikroskopem bez użycia procedury barwienia. Obserwuj neurony jako gęsty wygląd kolumnowy za pomocą funkcji ołówka.Śledź wokół warstwy neuronalnej, śledź nieco z dala od neuronów, aby zapobiec spaleniu neuronów z lasera, aby uzyskać wysokiej jakości RNA. Następnie rozpocznij cięcie sterowane laserowo. Podnieś wypreparowane skrawki za pomocą kleszczy do mikropreparacji z cienką końcówką i przenieś tkankę do mikroprobówki zawierającej 100 mikrolitrów buforu do lizy na lodzie.Powtórzyć sekcje dla wszystkich odcinków neuronów uzyskanych z pojedynczej próbki w ciągu 50 minut od całkowitego czasu po zakończeniu sekcji, natychmiast zwirować lizaty próbki i trzymać na suchym lodzie. Następnie przechowuj próbki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza w celu całkowitej izolacji RNA. Rozmrozić lizaty próbki na lodzie.Przeprowadzić całkowitą izolację RNA za pomocą wodnego zestawu mikro RN z jedną inaktywacją DNA, postępując zgodnie z protokołem producenta bez modyfikacji. Elute w łącznej objętości 20 mikrolitrów. Za pomocą bioanalizatora zmierz stężenie RNA i oceń jakość RNA za pomocą liczby integralności RNA.Wybierz próbki, które spełniają kryteria kontroli jakości syntezy CDNA, zsyntetyzuj CDNA przy użyciu zwalidowanego zestawu komercyjnego dla każdej probówki reakcyjnej. ANIL 0,1 do 1,0 nanogramów RNA w łącznej objętości ośmiu mikrolitrów RNA wolnej wody, jeden mikrolitr startera oligo DT i jeden mikrolitr 10 milimolowej mieszanki DNTP. Delikatnie wirować próbki, odwirować i anil w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut.Po zakończeniu reakcji natychmiast umieścić próbki na lodzie. Przygotować roztwór mieszanki wzorcowej zgodnie ze wskazaniami. Następnie dodaj 9,5 mikrolitra mieszanki wzorcowej i 0,5 mikrolitra komercyjnie przygotowanej odwrotnej transkryptazy do każdej probówki z próbką do probówki kontrolnej o zawartości 0,5 mikrolitra wolnej wody RNA.Zamiast enzymu RT przeprowadź reakcję RT z pierwszą inkubacją w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 50 minut. Następnie 85 stopni Celsjusza przez pięć minut. A ostatnie cztery stopnie Celsjusza się utrzymują.Rozcieńczyć wszystkie próbki pięciokrotnie wodą i podwielokrotnością, aby określić neuronalne wzbogacenie ekspresji białka markera węchowego. Przygotować roztwory mieszanki wzorcowej PCR, stosując kontrolę wewnętrzną G-A-P-D-H do każdego dołka płytki PCR. Dodaj siedem mikrolitrów mieszanki głównej i trzy mikrolitry CDNA.Następnie odwirować płytkę przez pięć minut w temperaturze 300 g. Uruchom reakcję PCR w czasie rzeczywistym, używając domyślnych warunków cykli termicznych określonych dla komercyjnej super mieszanki. Analizowanie wyników wyrażenia pod kątem wzbogacania składania.Wybierz próbki, które wykazują dwukrotne lub większe wzbogacenie neuronów. Następnie zaprojektuj PCR w czasie rzeczywistym do ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu sondy znakowanej FAM i sondy znakowanej vic G-A-P-D-H. Ustawić płytkę PCR z ośmioma mikrolitrami mieszanki wzorcowej w każdym dołku i dwoma mikrolitrami CDNA, odwirować płytkę przez pięć minut.W 300 gs. Uruchom reakcję przy użyciu domyślnych warunków cykli termicznych, zgodnie z protokołem głównej mieszanki ekspresji genów dostarczonym przez producenta. Teraz przeanalizuj wyniki wyrażenia.W eksperymencie tym wykorzystano wychwyt laserowy, mikro rozwarstwienie i R-T-P-C-R do pomiaru wpływu litu na poziomy ekspresji kinazy syntazy glikogenu three beta w nabłonku węchowym u tych dwóch pacjentów z chorobą afektywną dwubiegunową, analizy ekspresji przed i po leczeniu litem u tych dwóch pacjentów z BD wskazują na spadek ekspresji GSK three beta, podczas gdy osoby kontrolne nie wykazały znaczącej zmiany po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neuropsychiatrii do badania zmian molekularnych w komórkach neuronalnych pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykorzystać mikrodysekcję laserową do wyizolowania wzbogaconej populacji neuronów, które można następnie wykorzystać do dalszej analizy ekspresji genów.

olfactory-neurons-obtained-through-nasal-biopsy-combined-with-laser

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisujemy tutaj metodę pobierania biopsji błony śluzowej węchowej z jam nosowych szczura i człowieka. Biopsje te mogą być wykorzystane do identyfikacji anomalii molekularnych w chorobach mózgu lub do izolacji wielopotencjalnych dorosłych komórek macierzystych, które mogą zostać użyte do transplantacji komórkowej w zwierzęcych modelach urazów i chorób mózgu.

Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Neurony powstałe w wieku dorosłym w opalfaktorycznej cebulce mogą być kontrolowane optogenetycznie poprzez wstrzyknięcie lentiwirusa wykazującego ekspresję Channelrhodopsin2 do przedniego strumienia migracyjnego oraz przewlekłą fotostymulację za pomocą wszczepionej miniaturowej diody LED.

Selektywna transdukcja wirusowa neuronów węchowych pochodzenia dorosłego w celu chronicznej optogenetycznej stymulacji in vivo

Neurony receptorowe węchu (ORNs) przekształcają sygnały zapachowe najpierw w prąd receptorowy, który z kolei wywołuje potencjały czynnościowe przekazywane do neuronów drugiego rzędu w opłatce węchowej. W niniejszej pracy opisujemy technikę pipety ssącej służącą do jednoczesnego rejestrowania indukowanego substancją zapachową prądu receptorowego oraz potencjałów czynnościowych z ORNs myszy.

Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

Skuteczna ręczna metoda odkostniania w celu przygotowania nienaruszonej tkanki nosowej myszy z zachowaną organizacją anatomiczną

Ten protokół wprowadza lateralizowane wczesne uczenie się preferencji zapachowych u szczurów za pomocą ostrej pojedynczej okluzji naris. Lateralizowane uczenie się pozwala na badanie wyników behawioralnych i leżących u podstaw mechanizmów biologicznych u tych samych zwierząt, zmniejszając wariancję wywołaną przez projekty międzyzwierzęce. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wczesnego uczenia się zapachów.

Lateralizowany model uczenia się zapachu u nowonarodzonych szczurów do analizy obwodów neuronalnych leżących u podstaw tworzenia pamięci

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Ten protokół wyjaśnia, jak zbierać pojedyncze neurony, mikroglej i astrocyty z centralnego jądra ciała migdałowatego z dużą dokładnością i anatomiczną specyficznością za pomocą mikrodysekcji laserowej. Dodatkowo wyjaśniamy nasze zastosowanie mikroprzepływowego RT-qPCR do pomiaru podzbioru transkryptomu tych komórek.

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

Ten artykuł opisuje użycie olfaktometru zsynchronizowanego z oddechem do wyzwalania jedno- i dwucewkowej przezczaszkowej stymulacji magnetycznej (TMS) podczas prezentacji zapachu zsynchronizowanej z ludzkim oddechem przez nos. Ta kombinacja pozwala nam obiektywnie zbadać, jak przyjemne i nieprzyjemne zapachy wpływają na pobudliwość korowo-rdzeniową i efektywną łączność mózgową u danej osoby.

Połączenie olfaktometru zsynchronizowanego z oddechem z symulacją mózgu w celu zbadania wpływu zapachów na pobudliwość korowo-rdzeniową i efektywną łączność

W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

Poznaj izolację neuronów węchowych z biopsji nosa przy użyciu mikrodysekcji laserowej i analizę ekspresji genów metodą QPCR. Ta technika umożliwia badanie odpowiedzi na leczenie litowym w zaburzeniach dwubiegunowych.

Neurony węchowe uzyskane przez biopsję nosa w połączeniu z mikrodysekcją laserową: potencjalne podejście do badania odpowiedzi na leczenie w zaburzeniach psychicznych (Wideo) | JoVE Journal

Neurony węchowe uzyskane przez biopsję nosa w połączeniu z mikrodysekcją laserową: potencjalne podejście do badania odpowiedzi na leczenie w zaburzeniach psychicznych

Przeglądaj więcej filmów