Name: Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę pomiaru zmian wapnia cytozolowego w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia szybką analizę kinetyki sygnałów wapniowych przy użyciu fluorescencyjnych barwników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania w laboratoriach są finansowane przez Fundację Fritz-Bender, Monachium, Niemcy (do T.D.) oraz wewnętrzny grant badawczy Uniwersytetu Witten/Herdecke (do W.-K.L.). Chcielibyśmy podziękować prof. dr. Frankowi Thévenodowi (Instytut Fizjologii, Patofizjologii i Toksykologii, Uniwersytet w Witten/Herdecke) za pomocne sugestie.

1. Przygotowanie odczynników i roztworów
<ol>
	<li>Przygotować zmodyfikowany zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) (w mM: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na2HPO4, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, pH 7,2, bez czerwieni fenolowej). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 1,5 M roztwory podstawowe kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (pH 7,2) 1,5 M CaCl 2 i 2 M w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Przygotować 250 mM roztwór podstawowy probenecydu. W przypadku postaci wolnego kwasu (często określanej jako nierozpuszczalna w wodzie) rozpuścić probenecyd w proszku w 1 N NaOH, napełnić do trzech czwartych końcowej objętości wodą destylowaną i powoli miareczkować do pH 7,4 za pomocą 1 N HCl. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Rozpuścić przepuszczalny dla membrany fluorescencyjnej barwnik wiążący wapń w bezwodnym dimetylosulfotlenku (DMSO) do stężenia podstawowego 1 mM. Przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności.</li>
	<li>Przed każdym eksperymentem należy świeżo przygotować bufor topnika HBSS (PHF) zawierający probenecyd, łącząc zmodyfikowany HBSS z (w końcowych stężeniach) 1,5 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM probenecydem i 5,55 mM glukozy. Ogrzać do 37 °C.</li>
</ol>
2. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Płytka 2,5 x 105 komórek kanalików proksymalnych nerki (WKPT-0293 Cl.2) na studzienkę 6-dołkowej płytki lub szalki 35 mm w standardowej pożywce hodowlanej i rosną przez 2 dni, osiągając zbieżność około 70%.</li>
</ol>
3. Ładowanie barwnika wapniowego
<ol>
	<li>Dla każdej studzienki lub naczynia wymieszać 1 ml pożywki hodowlanej zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej, 4 μM przepuszczalny dla komórek barwnik wiążący wapń i 2 mM probenecyd.</li>
	<li>Zastąpić pożywkę hodowlaną 1 ml mieszaniny barwników do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 . Przykryj płytkę folią aluminiową, aby zapobiec wybielaniu wskaźnika fluorescencyjnego.</li>
</ol>
4. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Ogrzać 0,05% roztwór kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Odessać roztwór barwnika obciążającego wapń z każdej studzienki i dodać 1 ml trypsyny wzdłuż ściany studzienki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C aż do odłączenia wszystkich komórek.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml i osadu, odwirowując w mikrowirówce o masie 10 000 g przez 1 minutę.</li>
	<li>Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 1 ml buforu PHF i zawiesić ponownie, pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Granulki przez odwirowanie z prędkością 10 000 g przez 1 min.</li>
	<li>Powtórz kroki 4.6 i 4.7 jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w końcowej objętości 500 μl buforu PHF i użyć komórek do eksperymentów w ciągu 1 godziny.</li>
	<li>Opcjonalnie: policz komórki, aby określić stężenie komórek i użyj 5 x 104 – 1 x 105 komórek na pomiar.</li>
</ol>
5. Konfiguracja cytometru przepływowego
<ol>
	<li>Uruchom cytometr przepływowy, otwórz szufladę fluidyki i przestaw przełącznik zaworu odpowietrzającego, aby zwiększyć ciśnienie powietrza w zbiorniku płynu osłonowego.</li>
	<li>"Zalać" przyrząd, aby usunąć potencjalne pęcherzyki powietrza z wnętrza rurek wewnętrznych i komory przepływowej.</li>
	<li>W oprogramowaniu do cytometrii przepływowej otwórz dwa okna z wykresem punktowym.
	<ol>
		<li>Pierwszy wykres punktowy wymaga światła rozproszonego do przodu (FSC) dla parametru X i światła rozproszonego z boku (SSC) dla parametru Y w celu kontroli jakości komórek w próbce odpowiednio poprzez ich rozmiar i ziarnistość.</li>
		<li>Drugi wykres punktowy mierzy intensywność fluorescencji barwnika związanego z wapniem. Wybierz odpowiedni kanał detekcji fluorescencji dla parametru Y za pomocą skali logarytmicznej i czasu w sekundach dla parametru X na skali liniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw natężenie przepływu na "wysokie".</li>
</ol>
6. Pomiar cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Wykonaj pomiary w RT. Do probówki z próbką cytometrii przepływowej (11,5 x 75 mm) dodać 480 μl buforu PHF.</li>
	<li>Dodaj 20 μl zawiesiny komórkowej i krótko zmieszaj, aby wymieszać.</li>
	<li>Przesuń ramię podtrzymujące probówkę na bok i umieść probówkę z próbką nad rurką do wstrzykiwania próbki, aż powstanie szczelne uszczelnienie. Przywróć ramię nośne rury do pierwotnej pozycji wyśrodkowanej.</li>
	<li>Zoptymalizuj pomiar, dostosowując kanał fluorescencji tak, aby średnia intensywność fluorescencji próbki wynosiła około 102 na osi y. Zapisz i wykorzystaj do kolejnych eksperymentów.</li>
	<li>Aby rozpocząć eksperyment, powtórz kroki od 6.1 do 6.3.</li>
	<li>Rejestruj fluorescencję wyjściową przez 50 sekund.</li>
	<li>Wstrzymać pomiar, wyjąć probówkę z próbką, dodać interesujący związek, krótko przetrząsnąć i powrócić do probówki do wstrzykiwania próbki. Ten krok nie powinien zająć więcej niż 15 sekund.</li>
	<li>Wznów pomiar i kontynuuj przez łącznie 204,8 sek.</li>
	<li>Do kontroli dodatnich i ujemnych należy użyć jonoforu wapniowego, takiego jak jonomycyna (10 μM), oraz chelatora wapnia, takiego jak kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA), MnCl2 lub CoCl2 (2 mM).</li>
</ol>
7. Analiza danych
<ol>
	<li>Analizuj dane za pomocą dedykowanego oprogramowania do cytometrii przepływowej do analizy offline, takiego jak WinMDI (Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry), bezpłatny pakiet oprogramowania opracowany przez Joe Trottera w The Scripps Institute, Flow Cytometry Core Facility.</li>
	<li>Otwórz wykres punktowy z parametrami SSC i FSC.</li>
	<li>Wybierz region komórek do analizy za pomocą narzędzia "Regiony" (kliknij obraz prawym przyciskiem myszy), aby wykluczyć martwe komórki lub resztki komórek znajdujące się w lewym dolnym rogu z analizy danych (Rysunek 1).</li>
	<li>Analiza kwadrantowa (rysunek 2)
	<ol>
		<li>Otwórz wykres gęstości z czasem na osi x i intensywnością fluorescencji na osi y. Korzystaj ze wszystkich zdarzeń.</li>
		<li>Użyj tego samego regionu bramkowania, co w 7.3.</li>
		<li>Określ ilościowo dane za pomocą narzędzia "Kwadrant".</li>
		<li>Wyreguluj separatory kwadrantowe tak, aby linia pionowa była umieszczona w momencie dodawania związku, a linia pozioma była umieszczona w środku fluorescencji linii podstawowej w kontrolkach. Upewnij się, że położenie separatorów kwadrantowych jest równe we wszystkich próbkach.</li>
		<li>Procent komórek w każdym kwadrancie jest wyświetlany w każdym rogu (Rysunek 2). Porównaj prawy górny kwadrant (UR) między próbkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza histogramu (rysunek 3)
	<ol>
		<li>Otwórz dane kontrolne w oknie histogramu z intensywnością fluorescencji na osi x i zdarzeniami na osi y. Korzystaj ze wszystkich zdarzeń.</li>
		<li>Aby uzyskać przegląd obrazowy, dodaj dane testowe, które mają zostać porównane z wykresem kontrolnym, jako wykresy nakładkowe (przejdź do pozycji Plik → Otwórz plik → Wybierz plik → Nakładka).</li>
		<li>Do analizy ilościowej należy stosować pojedyncze okna histogramu. Bramka populacji komórek przy użyciu regionu R1 z kroku 7.3.</li>
		<li>W kontroli niepoddanej działaniu substancji należy użyć funkcji markera ("Markery") do oznaczenia obszaru do analizy, zaczynając od punktu środkowego między minimalną a maksymalną fluorescencją piku kontrolnego, a kończąc na maksymalnej intensywności fluorescencji. Obliczany jest procent komórek w tym obszarze.</li>
		<li>Pobieranie danych z okna statystyk. Powtórz te czynności dla pozostałych plików danych, używając tego samego zaznaczonego obszaru do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza intensywności fluorescencji (ryc. 4)
	<ol>
		<li>Otwórz wykres punktowy z czasem na osi x i intensywnością fluorescencji na osi y. Korzystaj ze wszystkich zdarzeń.</li>
		<li>Włącz "Tryb kinetyczny" i "Linia kinetyki nakładki". Na wykresie kropkowym pojawi się niebieska linia reprezentująca średnią intensywność fluorescencji.</li>
		<li>Określ ilościowo względny napływ wapnia, tworząc wiele prostokątnych obszarów. Każdy region powinien mieć szerokość około "50", co odpowiada "10 sekundom". Zdefiniuj maksymalnie 15 prostokątnych regionów.</li>
		<li>Pobierz kwantyfikację z okna statystyk i skopiuj ją do arkusza kalkulacyjnego.</li>
		<li>Do analizy należy użyć danych średniej y. Obliczyć średnią od R2 do R6, która odpowiada 20 do 50 sekundom. Jest to wartość bazowa.</li>
		<li>Wybierz odpowiedni przedział czasowy do analizy napływu wapnia (w zależności od początku, czasu trwania i intensywności).</li>
		<li>Oblicz sygnały wapnia z każdego regionu w tym przedziale czasu w stosunku do średniej wartości podstawowej, czyli sygnału fluorescencji przed dodaniem związku, który jest ustawiony na 100%. Określ średnią i odchylenie standardowe regionów po dodaniu związku; Jest to średni sygnał wapniowy wywoływany przez związek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+pumps+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li>
<li>Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+actions+of+calcium-mobilizing+messenger%2C+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate.</a> Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).</li>
<li>Putney, J. W., Ribeiro, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+between+the+plasma+membrane+and+endoplasmic+reticulum+calcium+stores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).</li>
<li>Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM+proteins%3A+dynamic+calcium+signal+transducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM proteins: dynamic calcium signal transducers.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).</li>
<li>Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium uptake.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).</li>
<li>Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channels+and+pumps+in+cancer%3A+changes+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences.</a> J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).</li>
<li>Roderick, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+the+heart%3A+when+it%27s+good%2C+it%27s+very+very+good%2C+but+when+it%27s+bad%2C+it%27s+horrid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid.</a> Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. , (2013).</li>
<li>Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+calcium+in+vital+cells+by+flow-cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry.</a> Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).</li>
<li>June, C. H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+immunopathology+research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li>
<li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+calcium+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization.</a> Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).</li>
<li>Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+Ca2%2B+flux+measurement+on+isolated+human+B+cells+that+uses+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).</li>
<li>Seidel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotransmitter+GABA+is+a+potent+inhibitor+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha+induced+migration+of+adult+CD133%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).</li>
<li>Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2-dependent+bestrophin-3+expression+prevents+ER-stress-induced+cell+death+in+renal+epithelial+cells+by+reducing+CHOP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).</li>
<li>Woost, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+characterization+of+proximal+tubule+cells+derived+from+kidneys+of+spontaneously+hypertensive+and+normotensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats.</a> Kidney Int. 50, 125-134 (1996).</li>
<li>Beyer, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benemid%2C%27+p-%28di-n-propylsulfamyl%29-benzoic+acid%3B+its+renal+affinity+and+its+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination.</a> Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).</li>
<li>Buckley, B. J., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li>
<li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations%2C+anions+and+zwitterions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li>
<li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+ATP-binding+cassette+%28ABC%29+transporter+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li>
<li>Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+P-glycoprotein+as+a+determinant+of+loading+with+fluorescent+calcium+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes.</a> Cytometry. 17, 343-348 (1994).</li>
<li>Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+multidrug+resistance+P-glycoprotein+via+nuclear+factor-kappaB+activation+protects+kidney+proximal+tubule+cells+from+cadmium-+and+reactive+oxygen+species-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis.</a> J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).</li>
<li>Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadmium+induces+Wnt+signaling+to+upregulate+proliferation+and+survival+genes+in+sub-confluent+kidney+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells.</a> Mol Cancer. 9, 102(2010).</li>
<li>Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li>
<li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wapń jest kluczowym wydarzeniem w wielu procesach komórkowych, działając jako druga cząsteczka sygnałowa przekaźnika, a także jako środek komunikacji między ER a mitochondriami. Możliwość pomiaru zmian w stężeniach wolnego cytozolowego wapnia jest przydatną techniką, która może mieć zastosowanie we wszystkich obszarach biologii komórki. Istnieją różne metody wykrywania cytozolowych sygnałów wapniowych. Klasycznie sygnały z ratiometrycznego wskaźnika wapnia, takiego jak Fura-2, są monitorowane w żywych komórkach za pomocą...

Wapń jest ważnym drugim przekaźnikiem odpowiedzialnym za przekazywanie komórkowych sygnałów fizjologicznych i patofizjologicznych1. Stężenia wapnia cytozolowego są utrzymywane na niskim poziomie dzięki aktywności pomp wapniowych i wymienników wapniowych. ATPaza wapniowa retikulum sarkoplazmatycznego/endoplazmatycznego (SERCA) uzupełnia zapas wapnia w retikulum endoplazmatycznym (ER) w ramach systemu "nieszczelności pompy", podczas gdy ATPaza wapniowa błony komórkowej (PMCA) wytłacza wapń do przedziału zewnątrzkomórkowego, w obu przypadkach w sposób zależny od ATP2. Przekaźniki fizjologiczne, takie jak hormony lub neuroprzekaźniki, przekazują swoje sygnały przez receptory sprzężone z białkiem G, aktywację fosfolipazy C, która hydrolizuje 4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytolu (PIP2) w błonie komórkowej w celu wytworzenia diacyloglicerolu i trifosforanu inozytolu (IP3)3. Podczas gdy diacyloglicerol pozostaje w błonie komórkowej, IP3 dyfunduje do cytozolu i wiąże się z receptorami IP3 (IP3Rs), które są kanałami wapniowymi aktywowanymi ligandami, znajdującymi się w błonie ER, a wapń jest uwalniany z magazynu światła ER, co prowadzi do wzrostu stężenia wapnia w cytozolu4. Alternatywną drogą dotarcia wapnia do cytozolu są kanały wapniowe i wymienniki obecne w błonie komórkowej. Opisano wzajemne oddziaływanie między tymi dwoma przedziałami: uwalnianie wapnia indukowane wapniem (CICR), w którym zewnątrzkomórkowy wapń indukuje uwalnianie wapnia z magazynów ER5, oraz wejście wapnia obsługiwane przez magazyn (SOCE), w którym opróżnianie zapasów ER jest wykrywane przez STIM i powoduje otwarcie kanałów wapniowych Orai w błonie komórkowej w celu ułatwienia ponownego wypełnienia zapasów ER6.
W warunkach patofizjologicznych komórkowa odpowiedź wapniowa jest rozregulowana, a cytozolowy wapń wzrasta przy braku stymulatorów fizjologicznych1. Odpowiedź wapniowa może być zaburzona na wiele sposobów: przedłużony sygnał wapniowy, opóźnione usuwanie wapnia z cytozolu, wyczerpanie zapasów wapnia lub miejscowe zmiany wapnia. Ponadto mitochondria odgrywają kluczową rolę w buforowaniu i uwalnianiu wapnia7. Długotrwały i/lub supramaksymalny wzrost cytozolowego wapnia prowadzi do śmierci komórki. W rzeczywistości wapń jest najczęściej zaangażowany w komórkową odpowiedź patofizjologiczną i jest kluczowym zdarzeniem w szerokim zakresie chorób, takich jak choroby neurodegeneracyjne, choroby serca, nowotwory, choroby kości i choroby nerek, które są głównie związane ze śmiercią komórek i utratą lub zmianą funkcji narządów lub tkanek8-10. Co więcej, zaburzenia sygnałów wapniowych są powiązane z adaptacją komórkową oraz zmianami w funkcjach i reakcjach komórkowych.
Tradycyjnie, sygnały wapniowe są mierzone za pomocą ujemnie naładowanego fluorescencyjnego wskaźnika wapniowego, który jest ładowany do komórek w postaci przepuszczalnego dla komórek estru acetoksymetylowego (AM). Po rozszczepieniu przez esterazy komórkowe wskaźniki fluorescencyjne pozostają w przedziale wewnątrzkomórkowym i zwiększają intensywność fluorescencji, gdy wapń jest związany. Najbardziej znanym i stosowanym wskaźnikiem wapnia jest ratiometryczny Fura-2 opracowany przez Rogera Tsiena i współpracowników11. Wskaźniki wapnia o różnym powinowactwie do wapnia pozwalają na monitorowanie różnych pul wapnia. Metody wykrywania obejmują obrazowanie żywych komórek, czytnik mikropłytek fluorescencyjnych i cytometrię przepływową. Stosunkowo szybka kinetyka sygnałów wapniowych (zwykle w ciągu kilku sekund do minut) sprawia, że obrazowanie żywych komórek jest najlepszą metodą uzyskania jak największej ilości informacji o charakterystyce sygnału wapniowego. Oprócz szybkiej kinetyki sygnałów wapniowych (w ciągu milisekund), obrazowanie żywych komórek jest lepszą metodą badania kompartmentalizacji komórkowej sygnalizacji wapniowej w pojedynczej komórce 12. Bezwzględne stężenia wapnia można obliczyć, określając minimalną i maksymalną fluorescencję wskaźnika wapnia poprzez dodanie odpowiednio chelatora wapnia i przepuszczalnie komórek, jak opisali Grynkiewicz i wsp. Rozdział 11.
Wykorzystanie cytometrii przepływowej do pomiaru sygnałów wapniowych zostało po raz pierwszy opracowane w latach 80. w komórkach immunologicznych, gdzie możliwość pomiaru wielu parametrów, takich jak integralność błony i separacja populacji komórek, oraz wymóg komórek w zawieszeniu w połączeniu z rozwojem wskaźników wapnia o pojedynczej długości fali sprawiły, że cytometria przepływowa stała się idealną i wygodną metodą wykrywania13-15. W komórkach przylegających obrazowanie żywych komórek dostarcza najwięcej informacji o sygnalizacji wapniowej, a przede wszystkim o kinetyce, ale wymaga skomplikowanej konfiguracji obejmującej mikroskop fluorescencyjny, system perfuzyjny, utrzymanie środowiska komórkowego, takiego jak temperatura, oraz specjalistyczne oprogramowanie mikroskopowe do pozyskiwania i analizowania danych. Alternatywne metody, takie jak czytnik mikropłytek fluorescencyjnych lub środki farmakologiczne z wykorzystaniem chelatatorów wapnia, są nieporównywalne pod względem uzyskanych informacji. Cytometria przepływowa staje się coraz szerzej stosowana do monitorowania cytozolowego wapnia w przylegających komórkach, chociaż w większości badań wykonuje się tylko pomiary punktu końcowego. Stosując metodę pierwotnie opracowaną przez Gergely'ego i wsp. w immunologicznych komórkach B16, zmiany stężenia wolnego wapnia w cytozolach za pomocą cytometrii przepływowej z kinetyką w czasie rzeczywistym i monitorowaniem intensywności fluorescencji w poszczególnych komórkach z populacji próbki zostały z powodzeniem zmierzone w komórkach nabłonka raka i hybrydach rakowych komórek macierzystych17. Metoda ta została następnie zaadaptowana do stosowania w przylegających komórkach nabłonka, które są trudne do obciążenia wskaźnikami wapnia 18.
Tutaj, używając unieśmiertelnionej przylegającej linii komórek nabłonkowych pochodzących z segmentu S1 kanalika proksymalnego nerki szczura (WKPT-0293 Cl.2)19, opisujemy zoptymalizowaną uproszczoną metodę pomiaru zmian stężenia wapnia w cytozolu za pomocą cytometrii przepływowej. Ponieważ wiele komórek nabłonkowych posiada szereg organicznych transporterów związków anionowych, obciążenie komórek wskaźnikiem wapnia może okazać się wyzwaniem. Aby zapobiec wypływowi wskaźników wapnia, probenecyd, prototypowy inhibitor transporterów anionów organicznych, pierwotnie opracowany w celu zmniejszenia wydalania penicyliny20 przez nerki, jest stosowany jednocześnie w pożywce inkubacyjnej. Komórki są utrzymywane w monowarstwach w celu obciążenia wskaźnikiem wapnia, wprowadzane do zawiesiny, a sygnały wapniowe mogą być wykrywane natychmiast po dodaniu związku.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3, AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-1241&nbsp;</td><td>Przepuszczalność komórek</td></tr><tr><td>Probenecyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8761</td><td>Nierozpuszczalny w wodzie, rozpuszcza się w 1 N NaOH</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA (1X)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Tunicamycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACSCalibur + Oprogramowanie CELLQuest</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td><td>Joe Trotter, The Scripps Institute</td><td></td><td>Należy pamiętać, że jest to starsza aplikacja 16-bitowa, która odczytuje pliki zgodne z FCS 2.0, ale nie rozpoznaje danych cyfrowych FCS 3.0.</td></tr><tr><td>WKPT-0293 Linia komórkowa kanalików proksymalnych nerki szczura Cl.2</td> Udostępnione przez dr Ulricha Hopfera (Zakład Fizjologii i <td></td><td></td><td> Biofizyka, Case Western Reserve University, Cleveland, OH)</td></tr></tbody></table>

cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Różnorodne procesy komórkowe, zarówno fizjologiczne, jak i patofizjologiczne, wymagają lub są regulowane przez wapń, w tym egzocytoza, funkcja mitochondriów, śmierć komórki, metabolizm komórkowy i migracja komórek, by wymienić tylko kilka. Wapń cytozolowy jest zwykle utrzymywany w niskich stężeniach nanomolowych; Występuje raczej w wysokich stężeniach mikromolowych do milimolowych w retikulum endoplazmatycznym, macierzy mitochondrialnej i przedziale zewnątrzkomórkowym. Po stymulacji przejściowy wzrost cytozolowego wapnia służy do sygnalizowania dalszych zdarzeń. Wykrywanie zmian w cytozolowym wapniu jest zwykle wykonywane przy użyciu obrazowania żywych komórek z barwnikami wiążącymi wapń, które wykazują albo wzrost intensywności fluorescencji, albo przesunięcie długości fali emisji po związaniu wapnia. Jednak zestaw do obrazowania żywych komórek nie jest swobodnie dostępny dla wszystkich badaczy. Alternatywne metody wykrywania zostały zoptymalizowane dla komórek immunologicznych z cytometrią przepływową oraz dla nieimmunologicznych komórek adherentnych z czytnikiem mikropłytek fluorescencyjnych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną, prostą metodę wykrywania zmian w komórkach nabłonka za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu barwnika wiążącego wapń o pojedynczej długości fali. Przylegające komórki nabłonka kanalików proksymalnych nerek, które zwykle są trudne do obciążenia barwnikami, obciążono barwnikiem wiążącym wapń przepuszczalnym dla komórek fluorescencyjnych w obecności probenecydu, wprowadzono do zawiesiny, a sygnały wapniowe monitorowano przed i po dodaniu thapsigarginy, tunikamycyny i jonomycyny.

Aby zwiększyć stężenie wapnia w cytozolu, do komórek kanalików proksymalnych nerek (WKPT-0293 Cl.2) obciążonych przenikalnym przez błony komórkowe barwnikiem wiążącym wapń, Fluo-3-AM, zastosowano dwa związki farmakologiczne. Nieleczone próbki kontrolne obciążono barwnikiem wiążącym wapń w obecności probenecydu i wymieszano, lecz bez dodawania jakichkolwiek związków. Tapsygargin (TG) jest klasycznym inhibitorem pompy SERCA, co prowadzi do wycieku wapnia z ER i w konsekwencji do wzrostu stężenia wapnia w cytozolu. Tunicamy...

Wapń bierze udział w licznych fizjologicznych i patofizjologicznych szlakach sygnałowych. Obrazowanie żywych komórek wymaga specjalistycznego sprzętu i może być czasochłonne. Zoptymalizowano szybką, prostą metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do określenia względnych zmian wapnia cytozolowego w przylegających komórkach nabłonka wprowadzonych do zawiesiny.

Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie zmian w cytozolowym wapniu w komórkach nabłonka nerkowego. Osiąga się to poprzez uprzednie obciążenie komórek fluorescencyjnym barwnikiem reagującym na wapń w obecności probitu inhibitora transportera anionów. Drugim krokiem jest wprowadzenie komórek w stan zawieszenia poprzez delikatną trypsynizację.Po odwirowaniu komórki przemyto w probycie zawierającym bufor HBSS. Ostatnim krokiem jest pomiar zmian wywołanych związkiem za pomocą cytometru przepływowego. Ostatecznie cytometria przepływowa służy do pokazania kinetyki zmian cytozolowego wapnia w komórkach nabłonka nerkowego.Tak więc główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie stylu życia, jest to, że jest łatwa do wykonania szybko i nadaje się do badań przesiewowych związków. Mięsień ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie sygnalizacji wewnątrzkomórkowej, umożliwiając osobom badanie roli wapnia w kontekście fizjologicznej i patofizjologicznej sygnalizacji komórkowej. Tę procedurę zademonstruje Sylvia Kyle, technik z naszej grupy.W tym eksperymencie wykorzystuje unieśmiertelnioną przylegającą linię komórek nabłonkowych pochodzą

cytosolic-calcium-measurements-renal-epithelial-cells-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule szczegółowo opisano protokół pomiaru aktywności kalpainy w komórkach utrwalonych i żywych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Pomiar aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Ten film opisuje test oparty na obrazowaniu opartym na mikroskopii konfokalnej, mierzący pobieranie wapnia przez mitochondria w hodowanych komórkach. Test wykorzystuje wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny Rhod-2/AM do pomiaru mitochondrialnego wapnia w permeabilizowanych komórkach hodowlanych.

Test napływu wapnia w celu pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w hodowanych komórkach

Zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia w podocytach są jednym z najważniejszych sposobów kontrolowania funkcji filtracji kłębuszków nerkowych. W tym miejscu wyjaśniamy podejście o wysokiej przepustowości, które umożliwia wykrywanie obchodzenia się z wapniem w czasie rzeczywistym i aktywności pojedynczych kanałów jonowych w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych.

Analiza jednokanałowa i obrazowanie wapnia w podocytach świeżo wyizolowanych kłębuszków nerkowych

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Prezentujemy protokoły zastosowania naszego ukierunkowanego, genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia (GECI) CatchER+ do monitorowania szybkich stanów przejściowych wapnia w retikulum endoplazmatycznym/sarkoplazmatycznym (ER/SR) HEK293 i komórkach C2C12 mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w czasie rzeczywistym. Omówiono również protokół pomiaru i kalibracji in situ Kd.

Monitorowanie uwalniania wapnia ER/SR za pomocą ukierunkowanego czujnika Ca2+ CatchER+

Zapewniając czułość pojedynczej komórki, cytometria przepływowa w czasie rzeczywistym jest wyjątkowo odpowiednia do ilościowego określania funkcji receptorów multimodalnych w żywych kulturach. Wykorzystując dorosłe nerwowe komórki progenitorowe, funkcję receptora P2X7 oceniano poprzez napływ wapnia wykrywany przez barwnik wskaźnikowy wapnia, tworzenie porów transbłonowych przez wychwyt bromku etydyny i fagocytozę za pomocą fluorescencyjnych kulek lateksowych.

Cytometria przepływowa żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania napływu wapnia, tworzenia porów i fagocytozy przez receptory P2X7 w dorosłych nerwowych komórkach progenitorowych

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Obrazowanie żywymi komórkami sygnalizacji wapnia jest szeroko wykorzystywane do badania mobilizacji wapnia w stabilnych liniach komórkowych hodowanych w monowarstwach. Protokół ten opisuje obrazowanie fluorescencji żywych komórek sygnalizacji wapnia z użyciem barwników komórek żywych na złożonych, pierwotnych tkankach, a także wykorzystuje oprogramowanie uczenia maszynowego do ilościowego określania intensywności fluorescencji tysięcy pojedynczych komórek jednocześnie, co usprawnia analizy.

Obrazowanie wapnia oparte na fluorescencji w pierwotnych hodowlach nabłonka dróg oddechowych z wykorzystaniem zautomatyzowanej segmentacji komórek

Poznaj metodę pomiaru zmian wapnia cytozolowego w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia szybką analizę kinetyki sygnałów wapniowych przy użyciu fluorescencyjnych barwników.

Cytozolowe pomiary wapnia w komórkach nabłonka nerek za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów