Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Nadrzędnym celem tej procedury jest identyfikacja białek, interakcji białkowych w obrębie danego proteomu w równoległy i bezstronny sposób, co nie jest możliwe w przypadku innych technologii. Osiąga się to poprzez pierwszą hybrydyzację i znacznik epitopem białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą wysoce oczyszczonej, funkcjonalnej biblioteki białek o pełnej długości zdeponowanej w płaszczyźnie współrzędnych na powierzchni szkiełka mikroskopowego. Gdy białko osiągnie równowagę z każdym z odpowiednich białek docelowych w macierzy, niezwiązana frakcja jest wypłukiwana, a interakcje białkowe są wykrywane za pomocą przeciwciała monoklonalnego przeciwko epitopowi sprzężonego z ugrupowaniem fluorescencyjnym za pomocą standardowego skanera mikromacierzy.

Uzyskane obrazy są przeplatane informacjami dotyczącymi intensywności każdej cechy w odniesieniu do związanego białka i sygnału fluorescencyjnego. Informacje te są ekstrapolowane za pomocą oprogramowania do analizy mikromacierzy w celu wygenerowania listy wartości intensywności dla każdej cechy w tablicy. Informacje dotyczące pary białko-białko mogą być eksportowane do dalszego oprogramowania do analizy bioinformatycznej w celu oceny danych specyficznych dla danej cechy i identyfikacji interakcji białek między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a białkami w mikromacierzy.

Surowe dane dotyczące intensywności sygnału są kompilowane na dwóch lub więcej mikromacierzach białkowych w celu uwzględnienia zmienności testu między i wewnątrz, a dane są normalizowane w celu oceny każdej z interakcji. Uzyskane w ten sposób dane wyjściowe generują docelową listę oddziałujących białek, która może być wykorzystana do kierowania dalszymi badaniami interakcji białek białkowych. Funkcjonalna mikromacierz białkowa in vivo została opracowana w laboratorium Michaela Snydera ponad 15 lat temu.

Od tego czasu pojawiło się wiele udanych zastosowań tej technologii ze względu na jej wszechstronność i biochemiczne testy proteomiczne. Technika ta ułatwia badanie interakcji białek i modułowych sieci sygnalizacyjnych, a także alternatywnej łączności i wcześniej znanych kaskad sygnałowych Aby wyhodować i oczyścić sondy kinazy fuzyjnej V pięć, użyj świeżo prążkowanego szczepu drożdży Y 2 58 zawierającego V pięć płytek białkowych fuzyjnych, drożdży na syntetycznym kompletnym uracylu, 2% agarze dekstrozowym i rosnąć w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni z zamrożonej kultury. Zaszczep kultury starterowe z jednej kolonii i rozbieraj przez noc w syntetycznym pełnym uracylu.

2% dekstrozy na platformie wytrząsającej lub kole w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego ranka zaszczepij 400 mililitrów syntetycznego kompletnego uracylu. 2% kultura rafinozy z kulturą starterową wystarczającą do osiągnięcia końcowej gęstości optycznej przy 600 nanometrach lub OD 600 0,1.

Wyhoduj inokulum do OD 600 0,6, a następnie indukuj ekspresję konstruktu fuzji V pięciu kinaz, dodając wystarczającą ilość trzech x ekstraktu drożdżowego. Ton pep uzupełniony 6% galaktozą w celu trzykrotnego rozcieńczenia pożywki indukcyjnej lub końcowego stężenia galaktozy 2%Indukuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez sześć godzin na platformie wstrząsającej. Użyj dwulitrowej kolby Erlenmeyera, aby zapewnić odpowiednie napowietrzenie.

Zbierz komórki, obracając 400 mililitrów zawiesiny komórek w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj komórki raz 50 mililitrami lodowatego buforu PBS i przenieś do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Ponownie umyj granulki w lodowatym buforze fosforanowym lub buforze PBS i przenieś do dwóch mililitrowych probówek z zatrzaskiem w celu lizy.

Po obracaniu komórek pod ciśnieniem 20 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usuń bufor za pomocą pipety i umieść probówki na lodzie. Lyce komórki z 0,5 milimetra kulek cyrkonu w objętości jeden do jednego do jednego osadu komórkowego do kulek do lizy PBS, buforu. Następnie trzykrotnie zmieszaj mieszaninę za pomocą platformy mieszającej w dwuminutowych odstępach w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odwiruj lizat 20 000 razy, G w stołowym mikro fuge przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść oczyszczony lizat do probówki zawierającej około 100 mikrolitrów wstępnie umytej żywicy o powinowactwie do niklu i inkubować na nutianie przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby wychwycić histaminę, sześć x oznaczone V pięć białek fuzyjnych osadza żywicę za pomocą wirówki stołowej przez pięć minut w temperaturze 1000 razy G i czterech stopniach Celsjusza po usunięciu supernatantu.

Przemyć żywicę buforem do przemywania przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mutatorze. Powtórz pranie jeszcze dwa razy ze świeżym buforem do mycia. Eluować białka za pomocą dwóch 100 mikrolitrowych objętości 200-milimolowego ole.

Dodaj glicerol do końcowego stężenia 30% próbek i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu wykorzystania w teście. Wykrywanie interakcji. Rozcieńczyć przeciwciało sprzężone V pięć fluoro-czterech do 260 nanogramów na mililitr w sondzie, buforować i dokładnie wymieszać przez wstrząsanie.

Następnie rozcieńczyć sondę białkową V five w zakresie stężeń od pięciu do 500 mikrogramów na mililitr. Następnie wyjmij mikromacierze białkowe z zamrażarki i wstaw do lodówki temperaturę czterech stopni Celsjusza tuż przed użyciem. Dodaj bufor blokujący bezpośrednio do uchwytu szkiełka zawierającego mikromacierze białkowe i przykryj górę paraformem, aby zapobiec wyciekom.

Zablokuj tablice w buforze blokującym na jedną godzinę, wstrząsając w temperaturze 50 RP na stoliku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zablokowaniu przenieś matryce do nawilżonej komory, wyłożonej kafelkami do czterech stopni Celsjusza i dodaj 90 mikrolitrów rozcieńczonej sondy bezpośrednio na powierzchnię matrycy. Nałożyć matryce na podniesiony szkiełko podnośnika i inkubować bez wstrząsania w wilgotnej komorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez półtorej godziny Po inkubacji dodać szkiełko do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej wystarczającą ilość wstępnie schłodzonego buforu sondy, aby całkowicie objąć szkiełko, pozwalając ślizgaczce podnoszącej delikatnie zsunąć się z mikromacierzy białkowej.

Umyj matryce trzy razy przez jedną minutę każdy w trzech stożkowych probówkach. Roztwór przeciwciała należy nałożyć bezpośrednio na matrycę natychmiast po zakończeniu mycia i nałożyć na niego usunięty poślizg podnośnika. Tak jak poprzednio, inkubuj matryce przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.

Wykonaj ten sam krok prania, co poprzednio, i wiruj w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów pod ciśnieniem 800 razy G w wirówce stołowej przez pięć minut. W temperaturze pokojowej wysusz matryce na powietrzu w uchwycie na szkiełka w ciemności przez 30 minut przed skanowaniem matrycy z prędkością 647 nanometrów. W tym eksperymencie badano aktywność wiązania TDA jeden na pięć.

Mikromacierze białek drożdży wykryte w dwóch egzemplarzach z około 4 200 pełnowymiarowymi białkami fuzyjnymi GST inkubowano z pustym kontrolerem wektorowym lub z sondami TDA jeden V pięć. Panele wstawkowe porównują identyczny region w obu tablicach. Na szczególną uwagę zasługuje RIM 11, który, co ciekawe, został również zidentyfikowany jako fosforylowany cel TDA one we wcześniej opublikowanym badaniu.

Po zidentyfikowaniu celów można je przetestować pod kątem aktywności biochemicznej i funkcjonalnej in vivo. Jeśli oglądasz ten film, powinieneś lepiej zrozumieć, jak używać funkcjonalnych mikromacierzy białkowych jako sposobu identyfikacji potencjalnych interakcji białek w celu dalszej walidacji i przesłuchania in vivo.