Name: Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Odkryj metodę sondowania funkcjonalnych mikromacierzy białkowych do wykrywania interakcji białko-białko w sposób równoległy i bezstronny. Technika ta umożliwia analizę tysięcy interakcji jednocześnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z NIH. Testy pokazane na rysunku 1 zostały przeprowadzone przez dr Josepha Fasolo. Dziękujemy dr Rui Chen za pomocne komentarze.

1. Przygotowanie sondy
<ol>
	<li>Hodowla i oczyszczanie sond kinazy fuzyjnej V5 używanych do badania interakcji z innymi białkami w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Użyj świeżo prążkowanego szczepu drożdży Y258 (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) zawierającego białko fuzyjne V5 (wyrażone z wektora GATEWAY pYES-DEST52). Użyj wyizolowanego białka jako sondy na mikromacierzach. Drożdże należy umieścić na syntetycznym kompletnym uracylu (Sc-Ura)/2% dekstrozie/agarze i hodować w temperaturze 30 °C przez 3 dni z zamrożonej kultury (-80 °C glicerolu).</li>
		<li>Zaszczepić kultury starterowe (5–20 ml) z pojedynczej kolonii i hodować przez noc w Sc-Ura/2% dekstrozie na platformie otrząsającej (220-250 obr./min) lub na kole w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Następnego ranka zaszczepić 400 ml kultury rafinozy Sc-Ura/2% z wystarczającą ilością kultury starterowej do końcowego OD600 0,1.</li>
		<li>Hodować inokulum do OD600 0,6, a następnie indukować galaktozę ekspresji konstruktu fuzyjnego kinazy V5 poprzez dodanie roztworu 3x ekstraktu drożdżowego / peptonu (YEP) uzupełnionego 6% galaktozą, dodając tyle, aby rozcieńczyć pożywkę indukcyjną przez współczynnik 3, tak aby końcowe stężenie galaktozy wynosiło 2%.</li>
		<li>Indukować komórki w temperaturze 30 °C przez 6 godzin na platformie wstrząsającej. Użyj kolby Erlenmeyera o pojemności 2 litrów, aby zapewnić odpowiednie napowietrzenie.</li>
		<li>Zbierać komórki za pomocą rotora JA-10 (lub podobnego), obracając 400 ml zawiesiny komórek o sile 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki raz 50 ml lodowatego buforu PBS i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Ponownie umyć osad w lodowatym buforze PBS (bez detergentów lub innych dodatków) używanym do lizy i przenieść do probówek zatrzaskowych o pojemności 2 ml w celu lizy.</li>
		<li>Wirować komórki w temperaturze 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C do postaci osadu i odpipetować bufor.</li>
		<li>Umieść probówki na lodzie i kontynuuj etap lizy.</li>
		<li>Poddać komórki lizie (250-350 μl osadu) za pomocą kulek cyrkonu o średnicy 0,5 mm w objętości 1:1:1 osadu komórkowego, kulek i buforu do lizy z buforem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wirować mieszaninę za pomocą platformy mieszającej 3 razy w odstępach 2-minutowych w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować lizat w sile 20 000 x g w stołowym mikrofugowaniu przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odpipetować supernatant do wysokoobrotowej probówki wirówkowej z poliwęglanu i sklarować przez odwirowanie przez 30 minut przy 150 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść oczyszczony lizat do probówki zawierającej wstępnie przemytą żywicę powinowactwa do Ni2+ (~100 μl) i inkubować na nutatorze przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu wychwycenia białka fuzyjnego V5 znakowanego histydyną(His)6X.</li>
		<li>Płukać żywicę trzy razy przez 10 minut w temperaturze 4 °C za pomocą buforu do mycia. Granulować żywicę za pomocą wirówki stołowej przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C i zassać supernatant. Dodaj świeży bufor do płukania do każdego prania i zwróć rurkę do nutatora w celu wymieszania podczas prania.</li>
		<li>Po zakończeniu etapów mycia nałóż umytą żywicę na świeżą kolumnę G-25 w celu elucji.</li>
		<li>Stopniowo nanosić 25 μl buforu elucyjnego, zaczynając od 100 mM imidazolu do 500 mM imidazolu w odstępach co 50 mM, co daje łącznie 9 frakcji.</li>
		<li>Oznaczyć zebrane frakcje za pomocą żelu poliakryloamidowego z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) i barwienia coomassie w celu zidentyfikowania najbardziej wzbogaconej frakcji (frakcji) do użycia w teście, a następnie dodać glicerol do 30% i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykorzystania w teście.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sondowanie tablic
UWAGA: Proszę zapoznać się z krokiem 2.6 tej sekcji, aby przygotować roztwór przeciwciała przed rozpoczęciem testu.
<ol>
	<li>Aby wykryć interakcje, rozcieńczyć przeciwciało sprzężone z V5-fluoroforem (tj. AlexaFluor 647 ) do 260 ng/ml w buforze sondy i dokładnie wymieszać przez wytrząsanie. 
	UWAGA: Przygotuj ten roztwór przeciwciała 30 minut przed użyciem i umieść probówkę na nutatorze lub pokole, aby zapewnić całkowite wymieszanie i jednorodną zawiesinę przeciwciała.</li>
	<li>Rozcieńczyć sondę białkową V5-fuzyjną w zakresie stężeń 5–500 μg/ml. 
	UWAGA: Zoptymalizowany dla każdego testu interakcji białko-białko, przy użyciu bufora sondy. Optymalizacja polega na dodaniu większej ilości sond do bufora sondy. Zazwyczaj jako punkt wyjścia przyjmuje się 10 μg/ml i odpowiednio dostosowuje się w zależności od siły sygnału.</li>
	<li>Wyjmij mikromacierze białkowe z zamrażarki (−20 °C) i doprowadź do 4 °C w lodówce tuż przed użyciem.</li>
	<li>Dodaj bufor blokujący bezpośrednio do uchwytu szkiełka zawierającego mikoracje białek i przykryj górę parafilmem, aby zapobiec wyciekom. Zablokować tablice w buforze blokującym na 1 godzinę przez wytrząsanie z prędkością 50 obr./min na stoliku w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po zablokowaniu przenieś matryce do nawilżonej komory schłodzonej do temperatury 4 °C i dodaj 90 μl rozcieńczonej sondy bezpośrednio na powierzchnię matrycy. Nałożyć matryce na podniesiony ślizg podnośnika i inkubować statycznie (bez wstrząsów) w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny.</li>
	<li>Przemyć matryce 3 razy po 1 minutę w buforze sondy w trzech stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dodaj szkiełko do stożkowych probówek zawierających wystarczającą ilość wstępnie schłodzonego buforu sondy, aby całkowicie pokryć szkiełko. Pozwól, aby podnośnik delikatnie zsunął się z mikromacierzy białkowej (nie należy jej zdejmować na siłę, ponieważ może to spowodować uszkodzenie powierzchni matrycy).</li>
	<li>Nałóż roztwór przeciwciała bezpośrednio na matrycę natychmiast po zakończeniu mycia (krok 2.5) i pokryj podniesionym ślizgiem podnośnika, tak jak poprzednio. Inkubować matryce przez 30 minut w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Wykonaj ten sam etap mycia, co poprzednio (3 razy po 1 minutę w buforze sondy) i wiruj w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przy 800 x g w wirówce stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Wysuszyć matryce na powietrzu w uchwycie szkiełkowym w ciemności przez 30 minut przed skanowaniem matrycy przy długości fali 647 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Fasolo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protein+kinase+interactions+identified+by+protein+microarrays+reveal+novel+connections+between+cellular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes.</a> Genes. 25, 767-778 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProCAT%3A+a+data+analysis+approach+for+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">ProCAT: a data analysis approach for protein microarrays.</a> Genome biology. 7, R110(2006).</li>
<li>Breitkreutz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+protein+kinase+and+phosphatase+interaction+network+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global protein kinase and phosphatase interaction network in yeast.</a> Science. 328, 1043-1046 (2010).</li>
<li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+yeast+proteome+by+systematic+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes.</a> Nature. 415, 141-147 (2002).</li>
<li>Jeong, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+of+monospecific+monoclonal+antibodies+using+a+human+proteome+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Rapid identification of monospecific monoclonal antibodies using a human proteome microarray.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li>
<li>Popescu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+calmodulin-related+proteins+to+their+targets+revealed+through+high-density+Arabidopsis+protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 4730-4735 (2007).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science. 293, 2101-2105 (2001).</li>
<li>Ptacek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+phosphorylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein phosphorylation in yeast.</a> Nature. 438, 679-684 (2005).</li>
<li>Haab, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays+in+cancer+research.+Molecular+%26+cellular+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays in cancer research. Molecular & cellular proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 4 (4), 377-383 (2005).</li>
<li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 39, 1305-1317 (2007).</li>
<li>Berrade, L., Garcia, A. E., Camarero, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%3A+novel+developments+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays: novel developments and applications.</a> Pharmaceutical research. 28, 1480-1499 (2011).</li>
<li>Balboni, I., Limb, C., Tenenbaum, J. D., Utz, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microarray+surfaces+and+arraying+parameters+for+autoantibody+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microarray surfaces and arraying parameters for autoantibody profiling.</a> Proteomics. 8, 3443-3449 (2008).</li>
<li>Gelperin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+genetic+analysis+of+the+yeast+proteome+with+a+movable+ORF+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Biochemical and genetic analysis of the yeast proteome with a movable ORF collection.</a> Genes & development. 19, 2816-2826 (2005).</li>
<li>Fasolo, J., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 548, 209-222 (2009).</li>
<li>Im, H., Snyder, M., et al. Preparation of recombinant protein spotted arrays for proteome-wide identification of kinase targets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIm%2C+H+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Coligan, J. E. 27, Unit 27 24(2013).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przedstawiony protokół został pierwotnie przeprowadzony przy użyciu 85 unikalnych białek fuzyjnych kinazy białkowej drożdży-V5 w celu porównania aktywności wiązania w różnych i pokrewnych rodzinach kinaz białkowych drożdży, co zaowocowało identyfikacją nowych sieci interakcji kinaz in vivo1. Jako nowa technologia profilowania proteomicznego, opracowanie wysokoprzepustowych (HTP) badań przesiewowych proteomów przy użyciu mikromacierzy białkowych opierało się na bibliotekach peptydów oraz eukariotycznyc...

Potrzeba przeprowadzenia globalnych analiz biochemii białek i aktywności wiązania in vivo zaowocowała opracowaniem nowych metod profilowania interakcji białko-białko (PPI) i potranslacyjnych modyfikacji całych proteomów1,3-8. Mikromacierze białkowe są wytwarzane jako funkcjonalne mikromacierze białkowe przy użyciu pełnowymiarowych białek funkcjonalnych4-6,8,9 lub analitycznych mikromacierzy białkowych zawierających przeciwciała10,11. Zostały one zaprojektowane tak, aby zawierały białka o dużej gęstości ułożone na szkiełkach mikroskopowych o różnych składnikach chemicznych powierzchni, aby ułatwić różnorodne warunki eksperymentalne wymagane do przeprowadzania szeroko zakrojonych analiz biochemicznych12. Chemia powierzchni nitrocelulozy i aldehydu do przyłączania chemicznego za pomocą metod przyłączania lizyny lub powinowactwa, takich jak szkiełka chelatowane niklem do przyłączania białek znakowanych Hisem i glutation do przyłączania powinowactwa między innymi13.
Użycie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych do wykrywania interakcji białko-białko wymaga dostępu do wysokiej jakości biblioteki funkcjonalnych białek14. S. cerevisiae jest podatny na stworzenie takiej biblioteki poprzez połączenie konstruktów białkowych znakowanych o wysokim powinowactwie z wysokoprzepustowymi technikami oczyszczania chromatograficznego. Zdecydowana większość genomu drożdży została zsekwencjonowana i prawie cały proteom może być wyrażony z plazmidu o wysokiej kopii w celu oczyszczania i analiz biochemicznych12. Po uzyskaniu białek i ułożeniu ich w formacie 384-dołkowym, są one drukowane na szkiełku mikroskopowym, co pozwala na szybką równoległą wieloparametryczną analizę biochemiczną i badanie bioinformatyczne8,14-16. Mikromacierze białkowe są wykorzystywane między innymi do testów enzymatycznych i interakcji z białkami, lipidami, małymi cząsteczkami i kwasami nukleinowymi. Dostępność białek na powierzchni macierzy proteomu sprawia, że są one podatne na różne rodzaje detekcji analitycznej, w tym powinowactwo immunologiczne, powierzchniowy rezonans plazmonowy, fluorescencję i wiele innych technik. Co więcej, pozwala na precyzyjną kontrolę warunków eksperymentalnych, w których może to być trudne do wykonania in vivo.
Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwego wykorzystania funkcjonalnych mikromacierzy białkowych do wykrywania interakcji białko-białko. Aplikacja ta umożliwia wysokoprzepustową, równoległą analizę biochemiczną aktywności wiązania białek przy użyciu wysoce oczyszczonego analitu (białka) będącego przedmiotem zainteresowania. Białko przynęty V5-fuzyjnej oznaczone C-końcem (karboksylowo-końcowym) jest wytwarzane z plazmidu o wysokiej kopii w szczepie drożdży zoptymalizowanym pod kątem oczyszczania białka. Znakowanie C-końca zapewnia, że białko o pełnej długości zostało przetranslowane. Białkiem użytym w tym badaniu jest kinaza białka fuzyjnego Tda1-V5, która jest oczyszczana przy użyciu żywicy o powinowactwie do niklu za pomocą znacznika His6X. Konstrukt fuzyjny Tda1-V5 jest oczyszczany przez seryjną elucję przy użyciu gradientu imidazolu w celu wymycia najbardziej wzbogaconej frakcji do zastosowania w teście.

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>NC-10747</td><td>lub porównywalne</td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży baktonowych</td><td>Difco</td><td>0217-17</td><td></td></tr><tr><td>Pepton baktonowy</td><td>Difco</td><td>0118-17</td><td></td></tr><tr><td>Agar baktonowy</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>rafinoza</td><td>Sigma</td><td>R0514</td><td></td></tr><tr><td>Galaktoza</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Sc-Ura Probówka odpadowa</td><td>MP Bio</td><td>114410622</td><td></td></tr><tr><td>Małe probówki do hodowli VWR</td><td>/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Duża kolba Erlenmeyera</td> Wirówka <td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka JA-10 z wirnikiem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe (500 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówka Falcon (50 ml)</td><td>VWR/Fisher</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki PBS</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Probówki FastPrep (tubka z nakrętką 2 ml)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastPrep Machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki cyrkonowe</td><td>BioSpec</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol (pH = 7,4)</td><td>Sigma</td><td>I5513&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów (bez EDTA)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy 1</td><td>sigma</td><td>P2850</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A1852&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem (30 & C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Niklowa żywica powinowactwa</td> Life <td>Technologies</td><td>R901-01</td><td></td></tr><tr><td>G25 kolumna</td><td>GE nauki przyrodnicze</td><td>27-5325-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR/Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE Żel (NuPage)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne V5</td><td>Technologie życia</td><td>R960-25</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 Tagged Przeciwciało monoklonalne V5</td><td>Technologie życia</td><td>451098</td><td></td></tr><tr><td>Mikromacierze białkowe Kit</td><td>Life Technologies</td><td>PAH0525013</td><td></td></tr><tr><td>Genepix Scanner</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lifter Slips</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/</td></tr> <tr><td>Bufor do lizy: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazol (pH 7,4), Kompletny koktajl inhibitorów proteazy &ndash; Wolny od EDTA, Inhibitor fosfatazy Koktajl 1, 1 mM PMSF&nbsp; (dodać tuż przed użyciem)</td><td></td><td></td><td>Dodaj odczynniki do 1x PBS (0,01 M bufor fosforanowy, 0,0027 M chlorek potasu, 0,137 M chlorek sodu; pH 7,4), aby uzyskać pożądaną objętość roztworu do lizy</td></tr><tr><td>Bufor blokujący: 1% albumina surowicy bydlęcej (BSA), 0,1% Tween-20</td><td></td><td></td><td>Dodaj odczynniki do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość buforu</td></tr> <tr><td>blokującegoBufor sondy: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 &mu; M ATP (dla kinaz), 1% BSA</td><td></td><td></td><td>Dodaj odczynnik do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość buforu sondy</td></tr><tr><td>Bufor do płukania: 0,1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM imidazol (pH 7,4), 2 mM MgCl2</td><td></td><td></td>Dodaj <td>odczynnik do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość bufora</td></tr> <tr><td>sondyBufor elucyjny: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 &ndash; 500 mM imidazol (pH 7,4), Kompletny koktajl inhibitorów proteazy &ndash; Bez EDTA, inhibitor fosfatazy Koktajl 1, 1 mM PMSF (dodać tuż przed użyciem)</td><td></td><td></td><td>Zanim zaczniesz, ważne jest, aby zwrócić uwagę na gradient stężenia imidazolu (50 &ndash; 500 mM) i utworzyć osobne probówki dla każdego stężenia (zaleca się tworzenie przedziału w odstępach co 50 mM). Dodaj odczynnik do 1x PBS, aby uzyskać żądaną objętość buforu sondy</td></tr><tr><td>3x YEP +6% galaktozy: Rozpuść 30 g ekstraktu drożdżowego i&nbsp; 60 g peptonu w 700 ml H2O i autoklaw. Dodać 300 ml filtra wysterylizowanego 20% galaktozy (wt/vol)</td><td></td><td></td><td>&nbsp; Galaktozy nie należy sterylizować w autoklawie</td></tr></tbody></table>

sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Mikromacierze funkcjonalnych białek o dużej gęstości zawierające ~4,200 rekombinowanych białek drożdży są badane pod kątem interakcji białko-białko kinazy kinazy za pomocą powinowactwa oczyszczonego białka fuzyjnego kinazy drożdżowej zawierającego znacznik V5-epitopu do odczytu. Oczyszczoną kinazę uzyskuje się poprzez hodowlę szczepu drożdży zoptymalizowanego pod kątem produkcji białek o wysokiej kopii zawierającego plazmid zawierający konstrukt fuzyjny kinazy-V5 pod indukowanym promotorem GAL. Drożdże są hodowane w restrykcyjnych pożywkach z neutralnym źródłem węgla przez 6 godzin, a następnie następuje indukcja z 2% galaktozą. Następnie zbiera się kulturę, a kinazę oczyszcza się przy użyciu standardowych technik chromatograficznych powinowactwa w celu uzyskania wysoce oczyszczonej kinazy białkowej do wykorzystania w teście. Oczyszczoną kinazę rozcieńcza się buforem kinazy do odpowiedniego zakresu dla testu, a mikromacierze białkowe są blokowane przed hybrydyzacją z mikromacierzą białkową. Po hybrydyzacji macierze są badane przeciwciałem monoklonalnym V5 w celu identyfikacji białek związanych przez białko kinazy-V5. Na koniec macierze są skanowane za pomocą standardowego skanera mikromacierzy, a dane są ekstrahowane do dalszej analizy informatycznej1,2 w celu określenia zestawu interakcji białkowych o wysokim poziomie ufności do dalszej walidacji in vivo.

Aktywność oddziaływań białko-białko obserwowano przy użyciu standardowego czytnika chipów w celu oceny konstruktu fuzyjnego kinazy białkowej Tda1-V5 jako białka przynęci w odniesieniu do funkcjonalnej mikromacierzy białek drożdżowych zawierającej około 4200 unikalnych białek fuzyjnych GST S. cerevisiae. Dalsza analiza z wykorzystaniem oprogramowania Genepix ujawniła liczne zdarzenia wiązania o różnym natężeniu. Powinowactwo oceniano na podstawie stopniowanego natężenia sygnału pochodzącego od przeciwciała monokl...

Korzystając z mikromacierzy białkowych zawierających prawie cały proteom S. cerevisiae, sonduje się szybkie, bezstronne badanie tysięcy równoległych interakcji białko-białko. Metoda ta może być stosowana do małych cząsteczek białek, modyfikacji potranslacyjnych i innych testów o wysokiej przepustowości.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Nadrzędnym celem tej procedury jest identyfikacja białek, interakcji białkowych w obrębie danego proteomu w równoległy i bezstronny sposób, co nie jest możliwe w przypadku innych technologii. Osiąga się to poprzez pierwszą hybrydyzację i znacznik epitopem białka będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą wysoce oczyszczonej, funkcjonalnej biblioteki białek o pełnej długości zdeponowanej w płaszczyźnie współrzędnych na powierzchni szkiełka mikroskopowego. Gdy białko osiągnie równowagę z każdym z odpowiednich białek docelowych w macierzy, niezwiązana frakcja jest wypłukiwana, a interakcje białkowe są wykrywane za pomocą przeciwciała monoklonalnego przeciwko epitopowi sprzężonego z ugrupowaniem fluorescencyjnym za pomocą standardowego skanera mikromacierzy.Uzyskane obrazy są przeplatane informacjami dotyczącymi intensywności każdej cechy w odniesieniu do związanego białka i sygnału fluorescencyjnego. Informacje te są ekstrapolowane za pomocą oprogramowania do analizy mikromacierzy w celu wygenerowania listy wartości intensywności dla każdej cechy w tablicy. Informacje dotyczące pary białko-białko mogą być eksportowane do dalszego oprogramowania do analizy bioinformatycznej w celu oceny danych specyficznych dla danej cechy i identyfikacji interakcji białek między białkiem będącym przedmiotem zainteresowania a białkami w mikromacierzy.Surowe dane dotyczące intensywności sygnału są kompilowane na dwóch lub więcej mikromacierzach białkowych w celu uwzględnienia zmienności testu między i wewnątrz, a dane są normalizowane w celu oceny każdej z interakcji. Uzyskane w ten sposób dane wyjściowe generują docelową listę oddziałujących białek, która może być wykorzystana do kierowania dalszymi badaniami interakcji białek białkowych. Funkcjonalna mikromacierz białkowa in vivo została opracowana w laboratorium Michaela Snydera ponad 15 lat temu.Od tego czasu pojawiło się wiele udanych zastosowań tej technologii ze względu na jej wszechstronność i biochemiczne testy proteomiczne. Technika ta ułatwia badanie interakcji białek i modułowych sieci sygnalizacyjnych, a także alternatywnej łączności i wcześniej znanych kaskad sygnałowych Aby wyhodować i oczyścić sondy kinazy fuzyjnej V pięć, użyj świeżo prążkowanego szczepu drożdży Y 2 58 zawierającego V pięć płytek białkowych fuzyjnych, drożdży na syntetycznym kompletnym uracylu, 2% agarze dekstrozowym i rosnąć w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni z zamrożonej kultury. Zaszczep kultury starterowe z jednej kolonii i rozbieraj przez noc w syntetycznym pełnym uracylu.2% dekstrozy na platformie wytrząsającej lub kole w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego ranka zaszczepij 400 mililitrów syntetycznego kompletnego uracylu. 2% kultura rafinozy z kulturą starterową wystarczającą do osiągnięcia końcowej gęstości optycznej przy 600 nanometrach lub OD 600 0,1.Wyhoduj inokulum do OD 600 0,6, a następnie indukuj ekspresję konstruktu fuzji V pięciu kinaz, dodając wystarczającą ilość trzech x ekstraktu drożdżowego. Ton pep uzupełniony 6% galaktozą w celu trzykrotnego rozcieńczenia pożywki indukcyjnej lub końcowego stężenia galaktozy 2%Indukuj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez sześć godzin na platformie wstrząsającej. Użyj dwulitrowej kolby Erlenmeyera, aby zapewnić odpowiednie napowietrzenie.Zbierz komórki, obracając 400 mililitrów zawiesiny komórek w temperaturze 1000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj komórki raz 50 mililitrami lodowatego buforu PBS i przenieś do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Ponownie umyj granulki w lodowatym buforze fosforanowym lub buforze PBS i przenieś do dwóch mililitrowych probówek z zatrzaskiem w celu lizy.Po obracaniu komórek pod ciśnieniem 20 000 razy G przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, usuń bufor za pomocą pipety i umieść probówki na lodzie. Lyce komórki z 0,5 milimetra kulek cyrkonu w objętości jeden do jednego do jednego osadu komórkowego do kulek do lizy PBS, buforu. Następnie trzykrotnie zmieszaj mieszaninę za pomocą platformy mieszającej w dwuminutowych odstępach w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odwiruj lizat 20 000 razy, G w stołowym mikro fuge przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść oczyszczony lizat do probówki zawierającej około 100 mikrolitrów wstępnie umytej żywicy o powinowactwie do niklu i inkubować na nutianie przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby wychwycić histaminę, sześć x oznaczone V pięć białek fuzyjnych osadza żywicę za pomocą wirówki stołowej przez pięć minut w temperaturze 1000 razy G i czterech stopniach Celsjusza po usunięciu supernatantu.Przemyć żywicę buforem do przemywania przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mutatorze. Powtórz pranie jeszcze dwa razy ze świeżym buforem do mycia. Eluować białka za pomocą dwóch 100 mikrolitrowych objętości 200-milimolowego ole.Dodaj glicerol do końcowego stężenia 30% próbek i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu wykorzystania w teście. Wykrywanie interakcji. Rozcieńczyć przeciwciało sprzężone V pięć fluoro-czterech do 260 nanogramów na mililitr w sondzie, buforować i dokładnie wymieszać przez wstrząsanie.Następnie rozcieńczyć sondę białkową V five w zakresie stężeń od pięciu do 500 mikrogramów na mililitr. Następnie wyjmij mikromacierze białkowe z zamrażarki i wstaw do lodówki temperaturę czterech stopni Celsjusza tuż przed użyciem. Dodaj bufor blokujący bezpośrednio do uchwytu szkiełka zawierającego mikromacierze białkowe i przykryj górę paraformem, aby zapobiec wyciekom.Zablokuj tablice w buforze blokującym na jedną godzinę, wstrząsając w temperaturze 50 RP na stoliku w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zablokowaniu przenieś matryce do nawilżonej komory, wyłożonej kafelkami do czterech stopni Celsjusza i dodaj 90 mikrolitrów rozcieńczonej sondy bezpośrednio na powierzchnię matrycy. Nałożyć matryce na podniesiony szkiełko podnośnika i inkubować bez wstrząsania w wilgotnej komorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez półtorej godziny Po inkubacji dodać szkiełko do 50-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej wystarczającą ilość wstępnie schłodzonego buforu sondy, aby całkowicie objąć szkiełko, pozwalając ślizgaczce podnoszącej delikatnie zsunąć się z mikromacierzy białkowej.Umyj matryce trzy razy przez jedną minutę każdy w trzech stożkowych probówkach. Roztwór przeciwciała należy nałożyć bezpośrednio na matrycę natychmiast po zakończeniu mycia i nałożyć na niego usunięty poślizg podnośnika. Tak jak poprzednio, inkubuj matryce przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wilgotnej komorze.Wykonaj ten sam krok prania, co poprzednio, i wiruj w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów pod ciśnieniem 800 razy G w wirówce stołowej przez pięć minut. W temperaturze pokojowej wysusz matryce na powietrzu w uchwycie na szkiełka w ciemności przez 30 minut przed skanowaniem matrycy z prędkością 647 nanometrów. W tym eksperymencie badano aktywność wiązania TDA jeden na pięć.Mikromacierze białek drożdży wykryte w dwóch egzemplarzach z około 4 200 pełnowymiarowymi białkami fuzyjnymi GST inkubowano z pustym kontrolerem wektorowym lub z sondami TDA jeden V pięć. Panele wstawkowe porównują identyczny region w obu tablicach. Na szczególną uwagę zasługuje RIM 11, który, co ciekawe, został również zidentyfikowany jako fosforylowany cel TDA one we wcześniej opublikowanym badaniu.Po zidentyfikowaniu celów można je przetestować pod kątem aktywności biochemicznej i funkcjonalnej in vivo. Jeśli oglądasz ten film, powinieneś lepiej zrozumieć, jak używać funkcjonalnych mikromacierzy białkowych jako sposobu identyfikacji potencjalnych interakcji białek w celu dalszej walidacji i przesłuchania in vivo.

probing-high-density-functional-protein-microarrays-to-detect-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

W niniejszym badaniu opisujemy ulepszony protokół wieloparametrycznego, wysokoprzepustowego mikrociągu przeciwciał z metodą detekcji lektynami, który może być wykorzystany do profilowania glikozylacji specyficznych białek. Protokół ten wprowadza nowe, niezawodne odczynniki i znacząco redukuje czas, koszty oraz zapotrzebowanie na sprzęt laboratoryjny w porównaniu do poprzedniej procedury.

Mikromacierze przeciwciał z blokowaniem chemicznym do multipleksowego wysokoprzepustowego profilowania specyficznej glikozylacji białek w próbkach złożonych

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje biotynylowane peptydy penetrujące komórki do wykrywania wewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko. Peptydy penetrujące komórki ułatwiają sprzężonemu peptydowi wnikanie do komórki i specyficzne wiązanie się z oddziałującymi z nią białkami. Biotyna, po związaniu się z awidyną, umożliwia oczyszczenie kompleksu białek oddziałujących z lizatu komórkowego.

Biotynylowana sonda peptydowa penetrująca komórki do wykrywania interakcji białko-białko

Ten film przedstawia wizualizację interakcji białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ) przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej (PLA). Po wyizolowaniu ścian ciała, oddziałujące białka są badane za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z PLA. Bliskość oddziałujących białek ułatwia ligację sond z oligonukleotydami konektorowymi, tworzącymi koliste DNA, które jest następnie amplifikowane przez amplifikację toczącego się koła. Sondy...

Wykrywanie interakcji białko-białko u larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Tutaj prezentujemy protokoły oczyszczania kompleksów białkowych i ich separacji za pomocą niebieskiej natywnej STRONY, a następnie profilowania korelacji białek za pomocą ilościowej spektrometrii mas bez etykiet. Ta metoda jest przydatna do przekształcania interaktomów w odrębne kompleksy białkowe.

Rozwiązywanie kompleksów białkowych oczyszczonych z powinowactwa za pomocą Blue Native PAGE i profilowania korelacji białek

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Pokrewne białka domeny J współpracują z opiekunem Hsp70, aby pomóc w niezliczonych procesach biologicznych, począwszy od fałdowania białek, a skończywszy na degradacji. W tym miejscu opisujemy test ligacji zbliżeniowej in situ, który umożliwia monitorowanie tych przejściowo utworzonych mechanizmów opiekuńczych w komórkach bakteryjnych, drożdżowych i ludzkich.

Monitorowanie in situ przejściowo utworzonych molekularnych zespołów opiekuńczych w bakteriach, drożdżach i komórkach ludzkich

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Odkryj metodę sondowania funkcjonalnych mikromacierzy białkowych do wykrywania interakcji białko-białko w sposób równoległy i bezstronny. Technika ta umożliwia analizę tysięcy interakcji jednocześnie.

Sondowanie funkcjonalnych mikromacierzy białkowych o dużej gęstości w celu wykrycia interakcji białko-białko

Przeglądaj więcej filmów